На правах рукописи

КАДЫРОВА ГУЗЕЛЬ ДАМИРОВНА

АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ

НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ЯДЕРНОГО И

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ГЕНОМОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

РОДА FAGOPYRUM

03.01.04 – Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань, 2011.

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН и в отделе сельскохозяйственной биотехнологии ГНУ ТатНИИСХ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кочиева Елена Зауровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовна доктор биологических наук Кудрявцев Александр Михайлович

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур

Защита состоится 9 июня 2011 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул.

Кремлевская д.18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.

Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета Автореферат разослан «»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гречиха является одной из важнейших продовольственных культур, обладающей высокой питательной и лечебнопрофилактической ценностью. Белки плодов гречихи по питательности полноценнее белка злаков и приближаются к белкам бобовых культур. Кроме того, плоды гречихи обладают высокими диетическими свойствами благодаря повышенному содержанию в составе крупы легкорастворимых фракций белка, незаменимых аминокислот, ненасыщенных жирных кислот, витаминов, особенно рутина, и минеральных солей.

Род Fagopyrum Mill. (Гречишные) относится к семейству Polygonaceae. Из 17 видов Fagopyrum культивируются только два: гречиха посевная (F. esculentum) и гречиха татарская (F. tataricum). Генофонд культурных видов Fagopyrum, отличается небольшим морфо-биологическим разнообразием [Fesenko et al., 2001,Yamane et al., 2004]. Он сравнительно слабо исследован и выявление генетического потенциала гречихи, в том числе по различным хозяйственно-ценным признакам (фармакологическим и адаптивным свойствам, экологической устойчивости) является особенно актуальным.

В связи с этим разработка биохимических методов идентификации полиморфизма ядерной и цитоплазматической ДНК последовательностей геномов и селекционно-значимых генов как культивируемых, так и дикорастущих видов имеет большую значимость для исследований прикладного характера, направленных на расширение биоразнообразия культивируемых видов гречихи с улучшенными качественными и урожайными свойствами. Данные, полученные при исследовании информативных участков ядерной и цитоплазматической ДНК, могут широко использоваться как при определении уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности нуклеотидных последовательностей, так и при создании видовых и сортовых ДНК-маркеров для паспортизации сортов и линий гречихи.

Помимо культивируемых видов, род Fagopyrum включает 15 диких видов, большинство из которых открыты и описаны лишь в конце 90-х годов прошлого столетия. Поэтому для некоторых видов до конца не определены филогенетические отношения и таксономический статус. Как известно, эволюционные исследования, таксономические классификации базируются последовательностей ДНК таксонов. Однако, что касается видов Fagopyrum, эта тема остается недостаточно изученной. Так, большая часть биохимических и молекулярных исследований генома была сфокусирована в основном на анализе культивируемых видов гречихи [Eggum et al., 1980, Kreft et al., 2002, Bourbouze et al., 2008], в то время как вариабельность ДНК последовательностей остальных видов исследована слабо.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выявление вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК геномов видов рода Fagopyrum.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Определить уровни межвидового и внутривидового полиморфизма ядерной ДНК представителей рода Fagopyrum методом AFLP анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей.

2. С использованием нескольких систем мультилокусного маркирования (RAPD, ISSR, AFLP) провести анализ внутривидового полиморфизма ядерной ДНК культурных видов гречихи F.esculentum и F.tataricum.

3. Провести SSR анализ полиморфизма отдельных микросателлитных ДНК-локусов образцов видов F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum. Определить аллельные варианты микросателлитных локусов и частоты их встречаемости у видов и образцов Fagopyrum.

4. Провести анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК гречихи. Охарактеризовать ранее не исследованные последовательности спейсерных участков (trnL-trnF, psbA-trnH, trnT-trnY) и интрона гена rpS16 хпДНК Fagopyrum и оценить возможность их использования в таксономических и филогенетических исследованиях.

';

5. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК (ген cox1 и b/c интрона гена nad1) видов Fagopyrum.

Определить уровни внутривидового и межвидового полиморфизма последовательностей анализируемых образцов.

6. На основе комплексного анализа нуклеотидных последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК провести сравнительную оценку филогенетических отношений анализируемых представителей рода Fagopyrum.

Научная новизна. Впервые с использованием нескольких систем мультилокусного маркирования проанализирована последовательность ядерной ДНК представителей Fagopyrum. Определены уровни внутривидового и межвидового полиморфизма дикорастущих и культурных видов гречихи, включая сорта отечественной селекции. Впервые исследовано внутрисортовое разнообразие F. esculentum и показан высокий уровень полиморфизма ДНК отечественных сортов, сравнимый с разнообразием дикорастущих форм этого вида. Получены видо-, образец- и сортоспецифичные ДНК фрагменты.

Анализ 11 микросателлитных ДНК-локусов гречихи показал высокую специфичность проанализированных праймерных пар к представителям идентифицированных аллельных вариантов, частотами их встречаемости у исследованной группы образцов и уровнем аллельного полиморфизма (PIC).

Для каждого исследованного сорта и образца рода Fagopyrum установлена микросателлитная формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генетического паспорта.

Впервые проведен анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей хлоропластной (спейсерные участки trnT-trnY, trnLtrnF, psbA-trnH, интрон гена rpS16) и митохондриальной (ген cox1 и b/c интрон гена nad1) ДНК гречихи. Для каждого вида были выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели, которые могут использоваться для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма представителей рода Fagopyrum на разных таксономических уровнях. Впервые на примере последовательностей интрона хлоропластного гена rpS16 и b/c интрона митохондриального гена nad1 определены вторичные структуры автосплайсирующихся интронов группы II у видов Fagopyrum; определены границы всех шести доменов интрона и их основные функционально-значимые мотивы.

Практическая значимость. Данные о межвидовых и межсортовых различиях нуклеотидных последовательностей могут быть использованы для подбора родительских форм в скрещиваниях и идентификации сортов, анализе гибридов и определении сортовой чистоты семенного материала.

Положения, выносимые на защиту:

1. межвидовой и внутривидовой полиморфизм последовательностей ядерной ДНК дикорастущих и культивируемых видов рода Fagopyrum.

2. аллельные варианты и частоты встречаемости микросателлитных локусов у представителей рода Fagopyrum.

3. вариабельность нуклеотидных последовательностей хлоропластной и митохондриальной ДНК геномов как критерий таксономической и филогенетической характеристики вида.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены и докладывались на IX Международном конгрессе по геномике растений PlantGEM (Istanbul, 2011), на 11-м международном симпозиуме по гречихе «Advances in buckwheat research» (Orel, 2010), на 2-м международном конгрессе «Molecular Phylogenetics» (Moscow, 2010), на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), на Всероссийской конференции «Инновационное развитие агропромышленного комплекса» (Казань, 2009), на Всероссийской конференции «Повышение эффективности растениеводства и животноводства – путь к рентабельному производству» (Казань, 2008), на научно-практической конференции «Генетика и селекция растений» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ из них 3 – в рецензируемых научных журналах Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на … печатных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего … наименований. Работа содержит … таблиц и … рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Была составлена коллекция 62 образцов Fagopyrum, представляющая видов и охватывающая основные ареалы произрастания и культивирования гречихи. Дикорастущие виды F. cymosum, F. homotropicum, F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F.pleioramosum, F. statice, F.gilesii, F.jinshaense, F. urophyllum были любезно предоставлены проф. О. Ониши Универстета Киото (Япония) и И.Н. Фесенко ГНУ ВНИИЗБК. Образцы культивируемых видов F. esculentum и F. tataricum получены из коллекции ГНУ ГНЦ РФ ВИР; сорта F. esculentum из ТатНИИСХ (Казань) и ВНИИЗБК (Орел). В анализ в качестве внешней группы был включен представитель рода Rheum L. семейства Polygonaceae.

Выделение тотальной растительной ДНК производили на основании стандартной методики [Edwards et al., 1991] с дополнительной депротеинезацией смесью фенол/хлороформ. AFLP-, RAPD- и ISSR-анализы проводили по стандартным методикам [Vos et al., 1995, Williams et al., 1990].

статистическую обработку данных проводили согласно Konishi et al., 2006.

Все амплифицированные фрагменты секвенировали с использованием как прямого, так и обратного праймера на ABI 310 cappilary DNA Analyzer (Центр «Биоинженерия» РАН). Выравнивание и анализ последовательностей проводили с помощью программы MEGA 3 [Kumar, 2004]. Статистический анализ проводили с использованием методов максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML), объединения соседей (Neighborhood-Joining, далее NJ) и максимальной парсимонии (Maximum Parsimony, далее MP) в программах MEGA 3 [Kumar, 2004] и PAUP 4.0b10 [Swofford, 2002], а также Байесовского подхода (Bayesian Inference, BI) в программе MrBayes v3.0b [Huelsenbeck, Ronquist, 2001], методом UPGMA с использованием коэффициента Nei-Li (TREECON). Эволюционные модели для анализов выбирали в программе Modeltest 3.04 [Posada, Crandal, 1998]. При BI анализе создавали 1 миллион генераций цепей Маркова, отбирая пробы каждой сотой генерации. Устойчивость филогенетических деревьев в NJ и MP анализах оценивали методом бутстрепа по 1000 репликам.

Молекулярный анализ ядерного генома Fagopyrum. Впервые для оценки вариабельности ядерной ДНК применен подход с использованием последовательностей (RAPD, ISSR, AFLP), позволяющих анализировать межвидовую и внутривидовую вариабельность функционально различных (уникальных, умерено- и высокоповторяющихся) областей генома.

AFLP маркирование генома Fagopyrum. В AFLP-анализ были взяты образцы ДНК 58 представителей рода Fagopyrum, двух филогенетических групп: cymosum (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum, F. giganteum) и urophyllum (F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F. urophyllum). Все исследуемые виды были представлены 1-23 образцами из различных мест произрастания. Были подобраны AFLP комбинации фермент/праймер, позволяющие выявлять полиморфизм ДНК образцов гречихи, и пригодные для использования при оценке генетического разнообразия видов Fagopyrum.

Наилучшие результаты дала комбинация эндонуклеаз EcoRI/MseI. Всего при использовании пяти комбинаций праймеров (Е12/М55, E35/M52, E35/M59, E35/M61, E41/M61) выявлено 746 полиморфных AFLP-фрагментов ДНК гречихи, что составило 99.1% от общего числа доступных для анализа фрагментов (рис. 1).

Рис.1. AFLP-спектры видов Fagopyrum с праймерной комбинацией E41/M61 (6% полиакриламидный гель). Обозначения: дорожки 1-6 виды филогенетической группы cymosum; 7-16 виды группы urophyllum (приведен фрагмент геля; стрелками указаны видоспецифичные фрагменты, прямоугольниками – фрагменты для комплекса видов).

В результате проведенного AFLP-анализа каждый вид и образец гречихи охарактеризован специфичным спектром AFLP-фрагментов, при этом было получено 245 видоспецифичных ДНК фрагментов и 5 фрагментов, характерных для комплексов видов.

последовательностей ядерного генома между видами филогенетических групп cymosum и urophyllum находились в пределах от 0. (F.cymosum/F.giganteum – F. urophyllum) до 0.33 (F. esculentum – F. rubifolium). Значения генетического различия для видов группы urophyllum находились в пределах от 0.15 (F. gracilipes – F. capillatum, F. callianthum – F.

macrocarpum) до 0.30 (F. rubifolium –F. leptopodum/F. lineare). Этот же показатель для группы cymosum был несколько ниже и находился в пределах от 0.01 (F. giganteum – F. cymosum) до 0.22 (F. esculentum – F. cymosum).

Дендрограмма, построенная на основании генетических различий последовательностей ядерной ДНК, выявила четкую дифференциацию всех анализируемых видов Fagopyrum на два кластера (рис.2). Первый кластер сформировали виды Fagopyrum, образующие филогенетическую группу cymosum (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum, F. giganteum), второй – виды группы urophyllum (F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F. urophyllum). Полученные данные подтвердили результаты Ohnishi О.

(1998) и Yamane et al. (2003), предложивших разделить виды Fagopyrum на две филогенетически-эволюционные группы cymosum и urophyllum.

Внутри кластера cymosum выделились два основных субкластера, Первый субкластер объединил виды F. tataricum/F. cymosum/F. giganteum, второй образовали видов F. esculentum и F. homotropicum. Формирование единой клады образцами видов F. tataricum и F. cymosum (100% ИБ) свидетельствует об их близком филогенетическом родстве, поддерживая предположение о возможности происхождения F. tataricum от F. cymosum [Yamane et al., 2003].Внутри группы urophyllum также можно выделить субкластеры F. gracilipes/F. capillatum/F. rubifolium; F. urophyllum/F. lineare и F. callianthum/F. macrocarpum/F. leptopodum (рис. 2).

urophyllum Рис. 2. Дендрограмма, отражающая различия видов Fagopyrum на основе данных AFLP-анализа с использованием метода UPGMA (TREECON) (в узлах обозначены индексы бутстрепа) Графики факторного анализа основных компонент (РСО) (рис. 3) соответствовали кластеризации на дендрограмме и выявили большую близость F. esculentum к F. homotropicum, а F. tataricum к F. cymosum\F. giganteum.

Рис. 3. 2-факторный (А) и 3-факторный (Б) PCO анализ основанный на данных AFLP маркирования и отражающий степень родства видов Fagopyrum (РСО описывает 76% (А) и 81% (Б) полиморфизма).

Интересно, что все анализируемые виды группы urophyllum показали большее генетическое родство с представителем рода Rheum, чем виды группы cymosum. Это, возможно, объясняется тем, что они менее интенсивно эволюционировали от общего предка гречихи. В то время как виды группы cymosum (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum), по всей видимости, выделились в отдельную группу намного раньше и начали эволюционировать достаточно интенсивно.

Молекулярный анализ полиморфизма ДНК последовательностей культивируемых видов гречихи. Помимо анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов гречихи и выявления филогенетических связей у представителей рода Fagopyrum, отдельный интерес представлял анализ внутривидового полиморфизма ДНК у представителей двух культивируемых видов гречихи посевной F. esculentum (8 дикорастущих образцов, 14 сортов отечественной селекции) и гречихи татарской F. tataricum (23 дикорастущих образца). Для выявления внутривидовой вариабельности ядерного генома применяли три метода мультилокусного анализа: AFLP, RAPD и ISSR.

При AFLP маркировании было получено 252 полиморфных фрагмента ДНК видов F. tataricum и F. esculentum. Анализируемые виды отличались по уровню полиморфизма. Так, для вида F. esculentum из 8 образцов, взятых в анализ, для трех были получены специфичные спектры. В случае F. tataricum индивидуальные AFLP спектры были получены для 7 из 23 образцов. Также, для 4 селекционных сортов (Скороспелая 86, Молва, Богатырь, Баллада) были получены специфичные AFLP фрагменты, которые могут быть преобразованы в SCAR маркеры данных сортов.

RAPD анализ 47 представителей Fagopyrum позволил детектировать полиморфных ДНК фрагмента гречихи длиной от 330 до 2000 п.н. В результате каждый образец был охарактеризован уникальным набором фрагментов. Всего было выявлено 12 фрагментов специфичных для представителей вида F. esculentum, 10 – для представителей вида F. tataricum.

Семь ДНК фрагментов отличали генотипы отдельных сортов. Выявленные уникальные фрагменты, также как и в случае AFLP, впоследствии могут быть использованы для разработки геномспецифичных ДНК маркеров сортов и видов гречихи.

Метод исследования микросателлитных и межмикросателлитных последовательностей (ISSR) приводил к амплификации 89 полиморфных фрагментов ДНК. Также для каждого образца были получены уникальные спектры и ряд родо- и образецспецифичных ISSR фрагментов На основе полученных RAPD, ISSR и AFLP данных были рассчитаны коэффициенты попарных генетических расстояний (GD), которые показали, что уровень межсортовых различий F. esculentum был весьма высок (0.06и соответствовал диапазону вариабельности ДНК дикорастущих образцов F. esculentum (0.10-0.28) из Японии, Китая, Непала, что говорит о широкой генетической основе отечественных сортов посевной гречихи.

Внутривидовой полиморфизм F. tataricum, представленного образцами из разных регионов мира, оказался более чем в два раза ниже (GD 0.01-0.17) и был сравним с данными анализа генома 11 популяций F. tataricum (GD 0.02исследованных ранее [Sharma et al., 2002].

Существование таких различий в уровнях вариабельности ДНК у двух культурных видов гречихи связано, по всей вероятности, с более узкой генетической основой F. tataricum, обусловленной самоопылением, а также возможно разницей во времени возникновения видов. Считается, что F. tataricum представляет собой сравнительно молодой вид, возникший в результате утраты системы самонесовместимости и быстрого формирования репродуктивной изоляции от предполагаемого предкового вида [Yamane et al., 2003]. Аллогамия, самонесовместимость и преобладание перекрестного опыления у F. esculentum, по всей видимости, способствовали поддержанию высокого уровня внутрипопуляционной и внутрисортовой гетерогенности, а локальность распространения стародавних сортов гречихи определили отмечаемый высокий уровень межсортового и популяционного разнообразия гречихи F. esculentum.

Анализ полиморфизма микросателлитных SSR локусов видов и сортов Fagopyrum. В дополнение к проведенному мультилокусному анализу, была определена вариабельность последовательностей отдельных микросателлитных локусов ядерной ДНК видов и образцов Fagopyrum. Было исследовано 11 SSR локусов гречихи, отобранных из микросателлитной библиотеки F. esculentum [Konishi et al., 2006]. Для семи SSR локусов (Fes 1303, Fes 1840, Fes 1368, Fes 1585, Fes 2644, Fes 3177, Fes 3331) при амплификации были получены фрагменты ожидаемой длины. Как и предполагалось, в связи с высокой специфичностью разработанных SSR праймеров, амплификация наблюдалась только у представителей видов группы cymosum.

Характеристика полиморфизма микросателлитных локусов.

Микросателлитный ДНК-локус Fes 1840 у видов группы cymosum был полиморфным и представлен 6 аллельными вариантами (рис.4).

Рис. 4. Аллельные варианты локуса Fes 1840 3 образцов F. homotropicum, 14 сортов и 8 образцов F. esculentum (6% полиакриламидный гель). Обозначения: A, B, C, D, E, F – аллельные варианты.

Анализ частот встречаемости каждого аллельного варианта микросателлитного локуса Fes 1840 определялся как отношение количества сортов и образцов, имеющих данный аллельный вариант, к общей выборке.

Наиболее представленный у анализируемых образцов был аллельный вариант А (36%), наиболее редкий – аллельный вариант F (4%) (табл.1).

Коэффициенты информативности PIC локуса Fes 1840 для полного набора образцов группы cymosum составил 0.77. PIC для образцов F. esculentum не превышал 0.71, для сортов отечественной селекции 0.77, а для образцов F. homotropicum значение PIC было на уровне 0.45, что соответствовало данным Konishi et al. (2006) для этого локуса. Полученные результаты электрофоретического анализа аллельных вариантов микросателлитов в 6% ПААГе были подтверждены секвенированием.

Табл.1. Полиморфизм последовательностей SSR-локусов 49 сортов и образцов Fagopyrum Локус Частота встречаемости аллельного варианта, % Было показано, что каждый из аллельных вариантов содержал ожидаемый микросателлит (ga)8, длина которого у исследованных образцов варьировала, и определялась числом повторяющихся единиц микросателлитной последовательности (рис. 5).

Рис. 5. Примеры вариабельности повтора (ga)6-9 в последовательности микросателлитного ДНК-локуса Fes 1840 видов Fagopyrum в программе Chromas 1. Анализ остальных отобранных микросателлитных ДНК-локусов Fes 1303, Fes 1368, Fes 1585, Fes 2644, Fes 3177, Fes 3331 проводили по аналогичной схеме.

Таким образом, анализ вариабельности отобранных нами семи микросателлитных локусов у 49 сортов и образцов гречихи выявил аллельных вариантов. Максимальное число аллельных вариантов было идентифицировано для локуса Fes 1303 (18), минимальное – для локуса Fes 1585 (4). Коэффициент PIC взятых в анализ SSR локусов для исследованных сортов и образцов рода Fagopyrum варьировал от 0. (Fes 3331) до 0.95 (Fes 1303). Для каждого исследованного сорта и образца рода Fagopyrum установлена SSR формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генетического паспорта.

Анализ полиморфизма последовательностей хлоропластной ДНК видов Fagopyrum. Для исследования нуклеотидных последовательностей пластома 17 видов гречихи был проведен детальный анализ и впервые охарактеризованы 4 ранее неисследованные области пластома, включающие нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров trnL-trnF, psbAtrnH, trnT-trnY и интрона гена rpS16.

Полиморфизм последовательностей спейсера trnL-trnF. В анализ межгенного участка trnL-trnF были взяты 29 образцов анализируемых видов Fagopyrum, а также образец Rheum australe, взятый в качестве внешней группы. В анализируемом наборе вариабельными оказались 67 нуклеотидных сайтов, что составило 16.1% от всей длины выровненной последовательности.

Длина спейсера варьировала от 406 п.н. (виды группы urophyllum, за исключением F. lineare) до 381-382 п.н (виды группы cymosum). Длина trnLtrnF участка у Rheum australe была наиболее короткой и составила 328 п.н.

(рис.6).

Рис.6. Результаты амплификации спейсерного участка trnL-trnF (М – ДНК маркер 1500 – 100 п.н.).

Внутренняя область спейсера всех анализируемых образцов рода Fagopyrum характеризовалась присутствием большого числа повторов, число и локализация которых варьировала у представителей разных видов (рис.7).

Так, например, пентануклеотид AAGAG у пяти видов (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum, F. giganteum), образующих группу cymosum встречается два раза, в то время как у представителей группы urophyllum эта же последовательность повторялась четырежды, причем, дважды в том же положении, что у образцов группы cymosum.

Также у видов cymosum были выявлены две протяженные делеции:

TATGAGTAATAATATGT в положении 156 и CTTGAAAA в положении 124.

Рис.7. Схема межгенного спейсера trnL-trnF у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции;

цифрами - положения нуклеотидов от начала спейсера) Интересно отметить, что обе они фланкированы короткими инвертированными повторами (GTAT и TTA соответственно), что, по всей вероятности, может говорить о рекомбинационном механизме образования этих делеций.

Помимо инделей, межгенные участки trnL-trnF анализируемых видов Fagopyrum были насыщены нуклеотидными заменами специфичными, как для отдельных видов, так и для групп видов cymosum и urophyllum.

Полиморфизм последовательностей спейсера psbA-trnH. Длина psbA-trnH спейсера варьировала от 435 п.н. (F. esculentum) до 473 п.н.

(F. macrocarpum). Длина участка psbA-trnH у представителя рода Rheum составила 460 п.н. Вариабельными были 123 нуклеотидных сайта (22.2 %).

Представители разных видов Fagopyrum характеризовались своими специфичными наборами инделей и замен (рис.8).

Рис.8. Схема межгенного участка psbA-trnH у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции;

цифрами - положения нуклеотидов от начала спейсера) Как и в случае последовательности спейсера trnL-trnF был выявлен ряд нуклеотидных замен, по которым различались группы видов cymosum и urophyllum. Помимо этого для представителя рода Rheum были выявлены нуклеотидные замены, которые были сходными либо с группой cymosum, либо с группой urophyllum Наибольшим количеством видоспецифичных точковых замен характеризовалась спейсерная область представителей видов F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, наименьшим – F. rubifolium.

Помимо нуклеотидных замен в последовательности данного спейсера у видов рода Fagopyrum были выявлены индели (рис. 8).

Так, у всех образцов Fagopyrum и Rheum tanguticum в положении 394п.н. находилась протяженная AT-богатая инсерция. Данная вставка по длине варьировала от 69 п.н. у представителей группы urophyllum рода Fagopyrum до 104 п.н. у Rheum tanguticum. При анализе вставки было показано, что инсерция по местоположению внутри psbA-trnH спейсера была одинакова и начиналась с 394 нуклеотида, но интересно то, что по первичной последовательности она различалась и, таким образом была специфичной для определенных видовых групп (рис.9).

Рис.9. Фрагмент, выровненной нуклеотидной последовательности спейсерного участка psbA-trnH у представителей видов Fagopyrum Кроме того, было показано, что хотя psbA-trnH спейсер пяти видов группы cymosym по последовательности и длине был сходен, но по двум инделям и по специфичным нуклеотидным заменам группа cymosum четко разделялась на две подгруппы: первая включала виды F. esculentum и F. homotropicum, вторая – F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum.

Полиморфизм последовательностей спейсера trnT-trnY. Размеры спейсера trnT-trnY варьировали от 665 п.н. (F. tataricum) до 871 п.н.

(F. callianthum), т.е. различия составляли 206 нуклеотидов, тогда как длина этого же участка у представителя рода Rheum достигала 1146 п.н. В анализируемом наборе вариабельными оказались 126 нуклеотидных сайтов, что составило 13.9% от всей длины выровненной последовательности.

Рис. 10. Схема межгенного участка trnT-trnY у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции;

цифрами - положения нуклеотидов от начала спейсера) Межгенный спейсер trnT-trnY у Fagopyrum оказался высоко полиморфным и характеризовался протяженными АТ–богатыми инсерциями, которые встречались по всей последовательности спейсера (56-843 п.н.) за исключением его 5' – и 3' – концевых участков (рис. 10).

При анализе нуклеотидной вставки в положении 276 было показано, что эта инсерция по последовательности отличалась у видов группы cymosum и urophyllum. Так, инсерция представителей группы urophyllum по длине составила 131 п.н., а виды группы cymosum характеризовались семинуклеотидной вставкой YTTATCA (рис. 11). Представитель рода Rheum так же характеризовался инсерцией (156 п.н.) в положении 276.

Рис. 11. Фрагмент выровненной нуклеотидной последовательности межгенного спейсера trnT-trnY у представителей видов Fagopyrum Кроме инсерций, некоторые виды характеризовались наличием видоспецифичных делеций. Так, у все образцов вида F. tataricum детектировалась делеция участка 456-501 п.н., которая присутствовала у всех остальных видов группы cymosum (рис. 11).

Помимо инсерций и делеций хпДНК все виды Fagopyrum характеризовались нуклеотидными видоспецифичными заменами. Хотелось бы особо отметить, что в результате анализа внутривидовой вариабельности спейсера trnT-trnY для видов F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum были впервые выявлены различные образецспецифичные гаплотипы хпДНК.

Полиморфизм последовательностей интрона гена rpS16. Размеры интрона rpS16 у представителей рода Fagopyrum варьировали от 744 п.н.

(F. macrocarpum) до 819 п.н. (F. homotropicum), при этом вариабельными оказались 68 нуклеотидных сайтов, что составило 8.2% от всей длины выровненной последовательности.

У всех видов Fagopyrum были выявлены свои специфичные наборы нуклеотидных замен, которые можно использовать в дальнейшем для характеризовались видоспецифичными инделями (рис. 12). Так, например, у всех представителей рода Fagopyrum в положении 661-732 по выровненной последовательности находилась инсерция, которая по длине варьировала от 20 п.н. у группы urophyllum до 67 п.н. у F. esculentum и F. homotropicum. При анализе этой вставки было показано, что ее первичная последовательность различна у различных видов гречихи (рис.12).

Рис. 12. Схема интрона rpS16 у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции; цифрами положения нуклеотидов от начала спейсера) Общая дендрограмма, построенная на основании анализа нуклеотидных последовательностей четырех областей хп ДНК показала, что все образцы, взятые в исследование, разделились на два четких кластера (рис.13).

Группа urophyllum Рис.13. МР(А)- и Bayes (Б) дендрограммы, построенные на основе данных анализа нуклеотидных последовательностей спейсеров trnL-trnF, psbA-trnH, trnT-trnY и интрона гена rpS16 хлоропластной ДНК, показывающие различия видов Fagopyrum (в узлах обозначены индексы бутстрепа (A), индексы Байеса (Б)) Представители видов F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum (группа cymosum) объединились в первый кластер.

Виды F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F. pleioramosum, F. statice, F. gilesii, F. jinshaense, F. urophyllum (группа urophyllum) образовали второй кластер. Внутри первого кластера выделились два четких субкластера, поддерживающиеся высокими значениями бутстрепа. Виды F. esculentum и F. homotropicum образовали первый субкластер, тогда как второй субкластер образовали виды F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum. Полученные нами данные совпадают с результатами, приведенными в работе Y. Yasui и O. Ohnishi (1998 a, b) по анализу последовательности хпДНК (спейсер rbcL-accD ) и ядерной ДНК ( последовательность ITS).

Внутри второго кластера, объединяющего виды группы urophylum отдельный субкластер образовали виды F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium. Также вместе кластеризовались F.pleioramosum/ F. lineare/F. urophyllum. Вид F.gilesii образовал отдельную ветвь.

последовательностей хлоропластной ДНК генома 29 образцов 17 видов Fagopyrum. Впервые были охарактеризованы последовательности спейсерных участков (trnL-trnF, psbA-trnH, trnT-trnY) и интрона гена rpS16. В среднем для каждого образца было проанализировано 3026 п.н. и, таким образом, всего было получено и проанализировано 75650 п.н.

хлоропластного генома представителей 17 видов гречихи. Для каждого вида гречихи были выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели, которые могут быть использованы для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма пластома Fagopyrum на разных таксономических уровнях. Для видов F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum были впервые выявлены гаплотипы.

Анализ вторичной структуры интрона rpS16 представителей Fagopyrum. Хлоропластный ген rpS16 кодирует рибосомный белок S16 и его интрон относится к группе интронов II типа, которые способны к автономному сплайсингу и считаются эволюционными предшественниками эукариотических интронов [Keating et al., 2010]. Хотя интрон rpS16 широко использовался в филогенетических исследованиях, функционально значимые для сплайсинга элементы первичной и вторичной структуры интрона описаны только для нескольких растений (Nicotiana tabacum, Aralia chinensis и Allium sp) [Michel et al., 1989, Downie and Katz-Downie, 1999, Ryzhova et al., 2009]. Поэтому представлялось интересным охарактеризовать вторичные структуры rpS16 у видов гречихи. В результате анализа вторичной структуры интрона rpS16 у представителей рода Fagopyrum были определены границы всех шести доменов интрона и их основные функционально-значимые мотивы (рис. 14). Последовательности доменов III и V были полностью консервативны у всех видов Fagopyrum, что согласуется с функциональным значеним этих областей для сплайсинга РНК. Наиболее вариабельными были домены I и IV. Так в последовательности домена IV, помимо нуклеотидных замен, были детектированы 8 инделей, различающихся по длине от 2 до нуклеотидов, при этом некоторые из них были ассоциированы с ATбогатыми повторами. В домене I была идентифицирована семи нуклеотидная делеция в С-петле у F. macrocarpum и F. capillatum. В последовательности домена II только у F.urophyllum была выявлена двухнуклеотидная делеция, в то время как остальные последовательности были инвариантны.

Риc. 14. Вторичная структура пре-мРНК интрона гена rpS16 у представителей рода Fagopyrum (цифрами обозначены основные домены, буквами – субдомены и мотивы, стрелками показана локализация делеций) Анализ полиморфизма последовательностей митохондриального генома видов Fagopyrum. В данной работе был также впервые проведен анализ вариабельности последовательностей митохондриальной ДНК гречихи, оценен внутривидовой, межвидовой и межродовой полиморфизм и на основе полученных данных выявлены межвидовые филогенетические отношения. Для исследования митохондриального генома гречихи был выбран ген cox 1 и b/c интрон гена nad1, относящийся к группе II интронов.

Для проведения сравнительного анализа в исследование были взяты те же образцов Fagopyrum, что и для анализа хпДНК.

Впервые была определена последовательность гена cox 1 Длина выровненной последовательности составила 555 п.н. В анализируемом наборе вариабельными оказались 27 нуклеотидных сайтов, что составило 4.9% от всей длины выровненной последовательности.

Впервые было показано, что ген cox1 у Fagopyrum не содержал интрон.

Также впервые была определена последовательность b/c интрона гена nad1. Размеры интрона варьировали от 1217 п.н. у представителей видов F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum до 1239 п.н. у образцов вида F. capillatum. Последовательность b/c интрона гена nad1 видов Fagopyrum была GA–богата и характеризовалась наличием небольшого количества нуклеотидных замен 17 нуклеотидных сайтов (1.4%). В результате анализа внутривидовой вариабельности b/c интрона nad1 мтДНК для вида F. esculentum были впервые выявлены митотипы.

Помимо нуклеотидных замен при анализе интрона nad1 у видов рода Fagopyrum и рода Rheum также были обнаружены индели (рис. 15).

Рис. 15. Схема интрона nad1 у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции; цифрами положения нуклеотидов от начала спейсера) У всех анализируемых видов рода Fagopyrum в положении 784 от начала интрона была обнаружена вставка (422 п.н.). Интересно, что у Rheum tanguticum в том же положении инсерция была вдвое короче (206 п.н.) и отличалась по первичной последовательности. Внутри этой вставки у видов Fagopyrum хотелось бы отметить последовательность AGAAA в положении 949. У всех видов группы cymosum данный пентануклеотид присутствовал в последовательности один раз. У всех анализируемых видов группы urophyllum последовательность AGAAA была повторена тандемно, кроме вида F. capillatum, у которого этот пентануклеотид повторялся трижды (рис. 15). Помимо инсерций для некоторых видов рода Fagopyrum были выявлены свои специфичные делеции. Так, виды F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum характеризовались делецией 6-нуклеотидной последовательности TTGAAC в позиции 707, тогда как у всех остальных анализируемых видов групп cymosum и urophyllum рода Fagopyrum и у Rheum tanguticum данная последовательность присутствовала (рис. 15).

На основе выявленного полиморфизма последовательности гена cox1 и b/c интрона nad1 мтДНК были построены дендрограммы, которые показали четкую кластеризацию видов на две группы.

Один кластер объединил все виды, относящиеся к группе cymosum, второй кластер образовали виды группы urophyllum. Анализ митохондриального генома так же, как анализ хлоропластного генома показал четкую дифференциацию группы cymosum на два субкластера: один субкластер объединил виды F. esculentum и F. homotropicum, второй F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum. В то же время группа urophyllum не разделилась на субкластеры, которые были выявлены при анализе хлоропластной ДНК. Таким образом, полученные данные позволили определить возможные направления эволюции мтДНК видов гречихи. Было показано, что последовательность b/c интрона nad1 может быть использована для таксономических и филогенетических исследований гречихи.

Анализ вторичной структуры последовательность b/c интрона гена nad1 представителей Fagopyrum. b/c интрон гена nad1, также как интрон rpS16, относится к группе интронов II типа.

Рис.16. Вариабнльность вторичной структуры домена I b/c интрон гена nad1 у представителей рода Fagopyrum. (буквами обозначены,– субдомены и мотивы).

Анализ вторичной структуры b/c интрона гена nad1 у видов Fagopyrum позволил определить границы всех доменов и основные функциональнозначимые мотивы. Также как и в случае интрона rps16, у всех видов Fagopyrum последовательности доменов III и V были полностью консервативны, что согласуется с их функциональной важностью. Наиболее вариабельными были домены I и IV. Так в последовательности домена I, последовательности -мотива у представителей F. urophyllum (рис. 16).

Домен IV был наиболее полиморфным и, помимо замен, было выявлено различных инделей, как видоспецифичных (делеция TCTAGAGAGG у F. lineare, инсерция AGAAAAGAAA у F. capillatum), так и специфичных для групп видов (инсерции AAAGAAGGAGG у группы urophyllum, AACTT – у группы cymosum).

Комплексный анализ полиморфизма последовательностей хлоропластной и митохондриальной ДНК видов Fagopyrum.

Заключительным этапом оценки внутривидового и межвидового полиморфизма хлоропластной и митохондриальной ДНК, выявления филогенетических отношений и определения возможных направлений эволюции ДНК последовательностей Fagopyrum явилось проведение комплексного анализа геномной ДНК гречихи. На основании данных о вариабельности хпДНК и мтДНК NJ-, MP- и ML методами были построены общие дендрограммы, которые в основном совпадали по типу кластеризации видов в целом (рис. 17). Все виды, взятые в анализ, на дендрограммах выделились в два четких кластера, первый кластер образовали виды группы cymosum (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum, F. giganteum). Второй кластер – виды группы urophyllum (F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F. pleioramosum, F. statice, F. gilesii, F. jinshaense, F. urophyllum).

Эти данные полностью подтвердили результаты Ohnishi О. (1998) и Yamane et al. (2003) по разделению всех видов рода Fagopyrum на две филогенетически-эволюционные группы cymosum и urophyllum.

Рис.17. Bayes- (А) и NJ -(Б) дендрограммы, построенные на основании данных анализа последовательностей хпДНК и мтДНК, показывающие различия видов Fagopyrum (в узлах обозначены, индексы Байеса (А) индексы бутстрепа (Б)) Кроме этого в каждом кластере выделилось по несколько субкластеров.

Так, виды первого кластера (группа cymosum) разделились на два субкластера. В первый субкластер объединились виды F. esculentum и F. homotropicum, а во второй F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum, что также подтвердило ранее полученные данные о делении видов группы cymosum на две эволюционные ветви [Ohnishi and Matsuoka, 1996; Yasui and O. Ohnishi, 1998]. На дендрограмме, построенной по объединенным данным анализа хп и мт ДНК, виды группы urophyllum формировали несколько подкластеров: первый – F. gracilipes/F. capillatum/F. rubifolium; второй – F. statice/F. leptopodum и третий – F. macrocarpum /F. pleioramosum /F. callianthum. Такой же тип деления на субкластеры показали T. Ohsako и O.Ohnishi (2000), изучая филогенетические отношения между видами группы urophyllum.

До сих пор остается непонятным систематическое положение трех видов - F. urophyllum, F.lineare и F.gilesii. Оценка филогении методом Байеса выявило вероятное родство видов F. urophyllum и F.lineare. В тоже самое время при использовании метода NJ эти виды, наоборот, образовывали отдельные кластеры, причем кластер F. urophyllum занимал базальное положение по отношению к другим видам группы urophyllum. Ранее O. Ohnishi и Y. Matsuoka (1996) отмечалось, что вид F. urophyllum, входя в состав филогенетической группы urophyllum по морфологическим признакам может занимать промежуточное положение между группами cymosum и urophyllum. Вид F.gilesii во всех случаях образовывал самостоятельную ветвь и не проявлял сходства с какими-либо видами группы urophyllum. Также хотелось бы отметить, что до 1991 года предком вида F. esculentum считался вид F. cymosum [Campbell, 1976, Nagatomo, 1984]. Однако эта гипотеза согласно данным проведенного маркирования ядерной и цитоплазматической ДНК, скорее всего, несостоятельна. Несмотря на морфо-биологическое сходство F. cymosum и F. esculentum рассчитанные нами коэффициенты генетических различий и сравнение последовательностей хп- и мтДНК показывают, что эти два вида лишь отдаленно родственны. Эти предположения совпадают с данными, приведенными в ряде работ [Kishima et al., 1995; Yasui et al., 1998], и подтверждают, что F. cymosum генетически более близок к виду F. tataricum, чем к F. esculentum, поддерживая возможность происхождения F. tataricum от F. cymosum [Yamane et al., 2003].

Таким образом, нами впервые был проведен комплексный анализ хпДНК и мтДНК видов рода Fagopyrum. Это позволило оценить уровни межвидовой изменчивости как хлоропластной, так и митохондриальной ДНК геномов гречихи. Был обнаружен ряд видоспецифичных нуклеотидных замен и инделей, которые весьма эффективно могут быть использованы для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма генома на разных таксономических уровнях.

ВЫВОДЫ

1. Методами мультилокусного анализа у видов Fagopyrum идентифицировано 746 полиморфных ДНК-фрагментов, определены уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности ДНК последовательностей гречихи из них 245 видоспецифичных фрагментов и 5 фрагментов, характерных для филогенетических групп. Уровень межвидового полиморфизма последовательностей варьирует в пределах 0.19-0.33.

Внутривидовой полиморфизм F. tataricum в два раза ниже, чем у F.

esculentum. Уровень межсортовых различий F. esculentum соответствует диапазону геномной вариабельности дикорастущих образцов F. esculentum 0.10-0.28.

2. Методом SSR маркирования у видов группы cymosum выявлено аллельных вариантов семи микросателитных локусов гречихи:

для каждого локуса определены аллельные варианты, частоты их встречаемости и коэффициенты информативности.

для каждого анализируемого генотипа установлена SSR формула, которая может быть использована для составления молекулярногенетического паспорта.

3. Охарактеризованы последовательности спейсерных участков (trnLtrnF, psbA-trnH, trnT-trnY) и интрона гена rpS16 хлоропластной ДНК Fagopyrum:

выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели.

выявлены гаплотипы хп ДНК для видов F. homotropicum, 4. Охарактеризованы последовательности гена cox1 и b/c интрона гена nad1 митохондриальной ДНК Fagopyrum и определены уровни внутривидового и межвидового полиморфизма:

показано отсутствие интрона в гене cox1.

идентифицированы видоспецифичные инсерции и делеции в последовательности интрона b/c гена nad1.

5. Определены вторичные структуры автосплайсирующихся интронов группы II у видов Fagopyrum хлоропластного гена rpS16 и b/c интрона митохондриального гена nad1:

определены границы шести доменов интрона, их основные функционально-значимые мотивы, выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели.

6. По результатам комплексного молекулярного анализа проведена сравнительная оценка филогений по ядерному, хлоропластному и митохондриальному геномам. Выявлена значительная дивергенция видов F.esculentum/F.homotropicum от F.tataricum/F.cymosum и подтверждена близкородственность видов F.statice – F. leptopodum и F. macrocarpum– F. pleioramosum- F. callianthum.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кадырова Г.Д., Кадырова Ф.З., Рыжова Н.Н., Кочиева Е.З. RAPDанализ геномного полиморфизма видов и сортов рода Fagopyrum // Экологическая генетика. – 2008. – Т.VI. – №3. – С. 3-10.

2. Кадырова, Г.Д., Кадырова Ф.З., Мартиросян Е.В., Рыжова Н.Н. Анализ геномного разнообразия образцов и сортов гречихи посевной и татарской ISSR- методом // Сельскохозяйственная биология. – 2010. – №5. – С.42-48.

3. Кадырова, Г.Д., Рыжова Н.Н., Кочиева Е.З. Филогенетические отношения у видов Fagopyrum, основанные на данных анализа b/c интрона гена nad1 // Вестник МГУ, 2010. – № 4. – С. 162-164.

4. Кадырова Г.Д., Рыжова Н.Н. Молекулярный анализ геномного и пластомного полиморфизма видов рода Fagopyrum // Материалы научнопрактической конф. «Генетика и селекция растений», 8-12 декабря М., 2008.

5. Кадырова Г.Д., Е.В. Мартиросян, Н.Н. Рыжова Оценка геномного полиморфизма культивируемых видов и сортов Fagopyrum с помощью молекулярных методов // V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров». – М., 21-28 июня 2009г. – часть I. – С. 238.

6. Kadyrova G.D., E.Z. Kochieva Phylogenetic relationships in Fagopyrum species based on nucleotide polymorphism of b/c intron of nad1 gene // 2nd Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics» (MolPhy-2), Moscow, May 18-21, 2010. – 2010. – P. 7. Kochieva EZ., Kadyrova GD., Ryzhova NN.. Variability of plastid and mitochondrial sequences in Fagopyrum species // Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat «Advances in buckwheat research», Orel, July 19-23 2010. – 2010. – P. 265-267.

8. Kadyrova G, Martirosyan E, Ryzhova N. Analysis of nucleotide polymorphism and secondary structure of the rps16 intron in Fagopyrum species // Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat «Advances in buckwheat research», Orel, July 19-23, 2010. – 2010. – P. 329-330.

9. Kadyrova G.D., Kochieva E.Z., Ryzhova N.N. Nucleotide polymorphism and secondary structure of the mitochondrion nad1i477 intron in Fagopyrum species. PLANTGEM Istanbul, May 4-7, 2011. Р.98.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу 420008, Казань, ул.

Кремлевская, д.18, КФУ, Отдел аттестации научных кадров, Диссертационный совет Д 212.081.08, Ученому секретарю З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-