На правах рукописи

ГЛАЗОВА АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ БУМАЖНЫХ

УПАКОВОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ В ПРОДУКЦИЮ ДЛЯ

АГРОПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА

Специальность: 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щелково – 2013

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

доктор технических наук, профессор

Научный руководитель:

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: Воробьева Галина Ивановна доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией сельскохозяйственной биотехнологии ОАО «ГосНИИсинтезбелок»

Буреев Илья Артемьевич доктор технических наук, профессор, Заслуженный изобретатель РФ, ведущий научный сотрудник лаборатории конструирования препаратов ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии

Ведущая организация: Государственное научно-исследовательское учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится 29 ноября 2013 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д.17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийского научноисследовательского и технологического института биологической промышленности Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 25.10.2013 г.

Автореферат 22 октября 2013 г. размещен на сайте ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии www.vnitibp.ru и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Фролов Юрий Дмитриевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время во всем мире остро стоит проблема утилизации бытовых отходов. В Российской Федерации ежегодно образуется свыше 50 млн. т твердых бытовых отходов, из них 35% приходится на бумагу и картон. Комбинированная упаковка Тетра Пак представляет собой ценное вторичное сырье (75% картона, 21% полиэтилена, 4% алюминия), которое крайне нерационально, как с экономической, так и с экологической точек зрения, закапывать в землю и сжигать. Важным направлением современной биотехнологии является эффективное использование возобновляемых источников вторичного сырья (отходы целлюлозно-бумажной промышленности, сельского хозяйства и бытовые отходы) для получения ценных кормовых и пищевых продуктов и решения экологических проблем.

В то же время важнейшей проблемой современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами. Наряду с интенсификацией сельского хозяйства и освоением ресурсов Мирового океана, опыт показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза в решении этой проблемы.

Настоящая работа посвящена разработке комплексной технологии переработки картонной упаковки, позволяющей получить ряд продуктов, таких как ферментные препараты (например, целлюлазы), белково-углеводные концентраты для применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве, препараты-стимуляторы роста растений для сельского хозяйства.

Степень разработанности проблемы. Важный вклад в развитие методов микробиологического синтеза для решения проблемы дефицита белковых веществ при использовании целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности внесли Л.К. Эрнст, Л.А. Иванова, М.В. Гернет, Е.Г. Борисенко.

Г.И. Воробьевой, И.М. Грачевой, А.П. Синицыным, А.Г. Лобанком, Н.Б. Градовой разработаны способы эффективной переработки целлюлозосодержащего сырья, включающие комплексную переработку, получение ферментных препаратов, белоксодержащих продуктов кормового и пищевого назначения. Анализ имеющихся литературных данных выявил проблемы, существующие в данной области и позволил сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в разработке эффективной, научно обоснованной технологии комплексной переработки картонной составляющей упаковок Тетра Пак для получения кормовых белково-углеводных, пробиотических продуктов, пищевых белково-углеводных концентратов, ферментных препаратов и стимуляторов роста растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- оценка биохимического состава исходного сырья для определения его пригодности к переработке и определение эффективных условий его предобработки;

- разработка биотехнологии ферментного препарата целлюлазы, позволяющего осуществлять деградацию картона, на основе нового перспективного штамма микроорганизма, выделенного в результате скрининга;

- определение эфективных условий расщепления картона до легкоусваиваемых редуцирующих веществ с использованием полученного препарата целлюлазы;

- оптимизация режима глубинного культивирования богатых белком дрожжей с использованием полученных ферментолизатов картона в качестве источника углерода;

- разработка технологии белково-углеводного концентрата пищевого назначения на основе очистки дрожжевой биомассы, выращенной на гидролизатах картона, от липидов и нуклеиновых кислот;

- разработка режимов твердофазного культивирования микроскопических грибов на средах с картоном для получения кормового белково-углеводного концентрата;

- изучение возможности обогащения полученного ранее кормового белково-углеводного концентрата пробиотическими микроорганизмами;

- разработка технологии препарата - стимулятора роста растений на основе твердофазного культивирования микроорганизмов на средах с картоном.

Научная новизна работы. На основании исследования биохимического состава отходов картонной упаковки и проведенного скрининга микроорганизмов показана целесообразность утилизации картона методами биологической конверсии.

В результате направленного скрининга микроорганизмов отобран новый штаммпродуцент комплекса целлюлолитических ферментов. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик штамм идентифицирован как Aspergillus sp.Ч-2-10.

Впервые на основе лабораторных исследований и полученных зависимостей накопления новым штаммом Aspergillus sp.Ч-2-10 целлюлазной активности от условий культивирования этого штамма, параметров выделения и очистки ферментного препарата, дано научное обоснование технологии нового препарата целлюлазы.

Экспериментально обоснованы режимы предподготовки и ферментативного гидролиза отходов картонной упаковки с использованием полученного на основе культивирования Aspergillus sp.Ч-2-10 препарата целлюлазы.

Оптимизированы параметры глубинного культивирования дрожжей P. anomala 9a-48 на ферментолизате целлюлозосодержащего сырья. Экспериментально обоснованы эффективные условия экстракции липидов и нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей P. anomala 9a-48 с целью получения пищевого белково-углеводного концентрата.

На основе выявленных зависимостей накопления протеина консорциумом микроскопических грибов от условий культивирования и состава консорциума, разработана биотехнология обогащенного пробиотиками кормового белково-углеводного продукта.

Выявлено стимулирующее влияние консорциума микроскопических грибов, выращенных на картонсодержащих питательных средах, на рост и развитие растений.

Практическая значимость работы. Проведенные лабораторные исследования явились основой для создания новой комплексной технологии переработки отходов картонной упаковки с целью получения ряда препаратов биологически активных веществ. С использованием математических методов планирования экспериментов были оптимизированы основные значимые параметры процессов и разработаны технологии кормового и пищевого белковоуглеводных концентратов, ферментного препарата целлюлазы и препарата стимулятора роста растений на основе биоконверсии картонной составляющей упаковок Тетра Пак.

Разработанная комплексная технология позволяет не только получить полезные продукты, но и решить экологическую проблему утилизации трудноразлагаемых отходов.

На готовые продукты разработана следующая нормативно-техническая документация:

технические условия и лабораторные регламенты на изготовление кормового белковоуглеводного продукта, пищевого белково-углеводного концентрата, ферментного препарата целлюлазы Ч-2-10 Г10Х.

На основе наиболее продуктивного штамма Aspergillus sp.Ч-2-10, полученного в результате скрининга микроорганизмов-продуцентов целлюлаз, разработана биотехнология препарата целлюлаза Ч-2-10 Г10Х и произведена наработка опытной партии в ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко». Результаты подтверждены актом о наработке (утверждены заместителем генерального директора ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» 05.04.2013).

Произведена наработка опытной партии пищевого белково-углеводного концентрата в ООО «Юнайтед Бевериджис Груп». Результаты подтверждены актом о наработке (утвержден генеральным директором ООО «Юнайтед Бевериджис Груп» 26.05.2013).

Подана заявка № 2013143716 от 30.09.2013 на выдачу патента РФ «Способ получения биомассы микроорганизмов».

По результатам лабораторных испытаний определены основные направления практического применения разработанных продуктов: создание обогащенных белком пищевых и кормовых продуктов, препаратов стимуляторов роста растений.

В производственных условиях ООО «ТД «Акатуй» осуществлено изготовление хлебобулочных изделий с введением в их рецептуру пищевого белково-углеводного концентрата. Показана возможность двукратного повышения содержания протеина в хлебе без потери потребительских качеств. Результаты подтверждены актом испытаний (утвержден заведующим производством ООО «ТД «Акатуй»).

Методология и методы исследований. Исследования выполнены по стандартным методикам с использованием современных микробиологических, химических и физикохимических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология целлюлолитического ферментного препарата: новый перспективный целлюлазоактивный штамм гриба Aspergillus sp.Ч-2-10; оптимальный состав питательной среды для культивирования микроскопического гриба Aspergillus sp.Ч-2-10; эффективные условия получения препарата целлюлазы на основе культивирования микроскопического гриба Aspergillus sp.Ч-2-10; эффективные условия гидролиза упаковочного картона с использованием нового ферментного препарата целлюлазы.

2. Технология пищевого белково-углеводного концентрата из биомассы дрожжей, выращенных на ферментолизате картона: перспективный штамм дрожжей P. anomala 9a-48, способный накапливать биомассу с высоким содержанием белка на питательной среде с ферментолизатом картона; оптимизированный состав питательной среды для глубинного культивирования дрожжей P. anomala 9a-48; эффективные условия экстракции липидов и нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей; возможность применения пищевого белковоуглеводного концентрата из биомассы дрожжей в рецептурах пищевых продуктов.

3. Технология кормового белково-углеводного концентрата: консорциум грибов, активно разрушающий целлюлозу и накапливающий белок в биомассе; состав питательной среды для культивирования консорциума грибов; обогащенный пробиотическими микроорганизмами кормовой белково-углеводный концентрат.

Технология препарата-стимулятора роста растений: консорциум грибов, стимулирующих рост растений; эффективность применения стимулятора роста растений при выращивании сельскохозяйственных культур.

Степень достоверности результатов. Все измерения проводились не менее чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований обработаны с помощью Microsoft Office Excel 2007. В диссертационной работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения»

(Москва, 2011 г.); Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, г.); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2012 г.); Международной конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Москва, 2012 г.); конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2013 г.); Международной конференции «Vietnam National Workshop on Biotechnology» (Ханой, 2013).

воспроизводства, функционирования и целесообразного развития живых организмов и среды их обитания «БИОИНДУСТРИЯ 2012» результаты разработок отмечены золотой медалью.

За разработку «Стимулятор роста растений» на 1-й международной научнопрактической конференции-выставке "Планирование и обеспечение подготовки и переподготовки кадров для отраслей пищевой промышленности и медицины" получен Диплом I степени.

На XIII Всероссийской выставке Научно-технического творчества молодежи результаты разработок отмечены Дипломом.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 186 источников (в том числе 65 зарубежных), и 6 приложений. Работа изложена на 230 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы и 54 рисунка.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрено современное состояние проблемы переработки вторичного целлюлозосодержащего сырья в России. Оценены объемы ежегодно образующихся отходов, и отражены основные пути их утилизации. Освещена роль микробиологических способов конверсии целлюлозосодержащего сырья, рассмотрены основные продуценты целлюлолитических ферментов. Приведены примеры способов эффективной переработки целлюлозосодержащего сырья, включающие комплексную переработку, получение ферментных препаратов, белоксодержащих продуктов кормового и пищевого назначения, а также стимуляторов роста растений.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явился картон, отделяемый от комбинированных упаковок Тетра Пак, ранее использованных для розлива жидких пищевых продуктов.

На рис. 1 приведена общая схема проведенного исследования.

Микроорганизмы. В работе использованы микроорганизмы из лабораторной коллекции кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (грибы родов Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Fusarium, Penicillium, Trichoderma и др.; бактерии Bacillus subtilis B1640, Lactobacillus plantarum B1133 и др.; дрожжи Pichia anomala 9a), а также выделенные в результате скрининга из природных источников обитания.

Методы. Определение массовой доли влаги проводилось согласно ГОСТ Р 51479-99, золы - согласно ГОСТ 13979.6-69, сырой клетчатки - согласно ГОСТ Р 52839-2007, лигнина согласно ГОСТ 26177-84, жира - согласно ГОСТ 13496.15-97. Определение редуцирующих веществ (РВ) проводилось по методу Шомоди-Нельсона; нуклеиновых кислот - путем их перевода в неорганический фосфат. Определение количества фосфора производилось фотоколориметрически в соответствии с ГОСТ 9794-74. Массовую долю белковых веществ определяли по методу Кьельдаля согласно ГОСТ 13496.4-93, Несслера и Лоури. Определение аминокислотного состава осуществлялось в соответствии с ГОСТ 13496.21-87 и ГОСТ 13496.22-90. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) проводили по ГОСТ 10444.15-94; дрожжей и плесневых грибов - по ГОСТ 28805-90.

Скрининг целлюлазоактивных микроорганизмов из природного материала осуществляли согласно схеме, разработанной в соответствии с особенностями роста культур. Идентификация культуры проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 18S рРНК, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров.

Определение активности целлюлазы (ЦлА) проводилось модифицированным фотоколориметрическим методом согласно ГОСТ Р 53046-2008.

Ocaждeниe фepмeнтoв осуществлялось органическими растворителями с последующим отделением осадка путем центрифугирования.

Острая токсичность определялась биотестированием на инфузориях-стилонихиях в соответствии с ГОСТ Р 52337-2005.

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Исследование биохимического состава и свойств упаковочного картона В работе определен биохимический состав целлюлозосодержащей фракции упаковок Тетра Пак (табл.1).

Таблица 1 - Биохимический состав картонной фракции упаковок Тетра Пак.

На основании представленных результатов сделан вывод о том, что исследуемое сырье (далее – картон) на 91,46 % состоит из целлюлозы, что обосновывает необходимость использования различных методов обработки для ее конверсии в глюкозу и возможность получения на ее основе ценных продуктов.

3.2 Разработка технологии грибной целлюлазы Наиболее перспективным для гидролиза целлюлозосодержащего сырья является использование ферментных препаратов целлюлолитического действия, способных к глубокому разрушению субстрата и гидролизу целлюлозы до глюкозы. Замена известных химических способов обработки целлюлозосодержащих материалов на ферментативные уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде, и позволяет подойти к созданию безотходных технологий. В связи с этим одной из задач диссертационного исследования явилось изучение возможности создания биотехнологии ферментного препарата целлюлазы.

3.2.1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов целлюлаз В рамках диссертационной работы исследовано около 100 изолятов культур микроорганизмов. В результате скрининга установлено, что наибольшей целлюлазной активностью (7,68 ед/см3) обладает культуральная жидкость изолята Ч-2, который был отобран для дальнейших исследований.

3.2.2 Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков грибного изолята Ч- По результатам проведенных исследований морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков сделан вывод о принадлежности изучаемого изолята к роду Aspergillus.

осуществлялась в лаборатории ФГУП ГосНИИГенетика. Анализ филогенетического родства, построенный с использованием штаммов близкородственных микроорганизмов показал, что наиболее близкими к исследованному штамму являются виды Aspergillus flavus и Aspergillus oryzae.

3.2.3 Определение оптимальных условий культивирования Aspergillus sp. Ч-2 с целью получения активного фермента целлюлазы предусматривающим последовательное изучение влияния факторов и использование каждого полученного предыдущего уровня в качестве фона для изучения последующего.

При глубинном культивировании штамма-продуцента последовательно варьировали следующие факторы: вид и концентрации источников азота, фосфора, углерода, микроэлементов, твин-80 и молочной сыворотки в питательной среде (ПС), рН ПС (2-11), возраст (1-5 сут) и дозу (1-10%) посевного материала (ПМ), длительность культивирования (1сут).

Согласно полученным результатам, наиболее эффективным оказалось внесение в ПС в качестве источников азота и фосфора 3 г/дм3 мочевины и 2 г/дм3 КH2PO4, в качестве источника углерода - 15 г/дм3 картона.

Изучено влияние предварительного химического гидролиза картона, вносимого в ПС, на активность ферментов культуральной жидкости (КЖ) Aspergillus sp.Ч-2 (рис.2). Наиболее ЦлА, % от контрольного значения исследуемым грибом. Напротив, добавление 0,2 г Mg2+/дм3, 0,02 г Mn2+/дм3, 0,0063 г Ni2+/дм3 и 0,004 г Fe2+/дм3 благоприятно влияет на рост гриба и биосинтез целлюлаз, позволяя достичь ЦлА 17,94 ед/см3. Присутствие в ПС твина-80 в количестве 0,1 г/дм3 повысило ЦлА до 26, ед/см3, а 1% молочной сыворотки (лактозы 0,036%) - до 33,89 ед/см3.

5% к объему ПС. Оптимальное время культивирования Aspergillus sp. Ч-2 составило 6 сут.

Aspergillus sp. Ч-2-10, ЦлА в фугате КЖ которого составила 39,29 ед/см3.

культуральной жидкости фильтрата КЖ Aspergillus sp. Ч-2-10 происходит изопропанолом в соотношении 3:1 и рН 4,0, при этом выход сухого ферментного препарата (ФП) составил 11,51 г/дм3. Активность целлюлазы в высушенном ФП составила 2375,13 ед/г.

картона полученным ФП диапазоне 35-45оС. Максимальная скорость накопления РВ (2,07 г/дм3 в час) наблюдалась при рН 5,5, температуре 40оС, концентрации субстрата 100 г/дм3, ЦлА 100 ед/г субстрата.

3.3 Разработка технологии белково-углеводного концентрата пищевого назначения из биомассы дрожжей, выращенных на ферментолизатах картона В результате скрининга при культивировании на ПС, содержащей в качестве жидкой фазы и источника углерода ферментолизат картона, наивысшую продуктивность по биомассе показал штамм Pichia anomala 9а из лабораторной коллекции кафедры «Биотехнология»

МГУПП.

С целью повышения продуктивности отобранного в процессе скрининга штамма проведен индуцированный УФ-мутагенез, и наивысшее накопление биомассы (3,28 г/дм3) получено при культивировании мутанта Pichia anomala 9а-48, облученного в течение 48 мин.

3.3.2 Оптимизация условий культивирования P.anomala 9а-48 с целью повышения выхода биомассы При глубинном культивировании P.anomala 9а-48 последовательно варьировали следующие факторы: концентрация РВ в ферментолизате картона, вид и концентрации источников азота, фосфора, микроэлементов, твина-80 в ПС, рН ПС (2,5-7,5), дозу (1-10%) посевного материала (ПМ), длительность культивирования (1-10 сут).

Экспериментально установлено, что наиболее эффективно культивирование дрожжей на ПС с РВ 25 г/дм3, NH4NO3 в количестве 7,5 г/дм3 и КH2PO4 в количестве 2,5 г/дм3.

Максимум накопления биомассы наблюдался в интервале рН 4,0-4,5.

Показано, что при внесении в ПС (г/дм3) KCl – 0,75; ZnSО4•7Н2О – 0,03; MgSО4•7Н2О – 0,5; FeSО4•7Н2О – 0,1 продуктивность увеличилась на 31%.

Установлено, что в ПС дополнительно следует вносить отруби в количестве 9 г/дм3, накопление биомассы P.anomala 9a-48 при этом составило 11,95 г/дм3.

Отмечено, что при внесении в ПС 0,5 г/дм3 твина-80 биомасса дрожжей увеличилась на 6,2% относительно контроля и составила 12,74 г/дм3.

концентрата,г/дм Количество сухого Рисунок 3 - Динамика накопления биомассы длительности культивирования.

Для оптимизации состава ПС реализован полный факторный эксперимент (ПФЭ 23), при этом параметром оптимизации являлась накопленная абсолютно сухая биомасса, а в качестве факторов варьирования взяты отруби, KH2PO4 и NH4NO3. Расчет и результаты программы «крутого восхождения» позволили установить следующий оптимальный состав основных компонентов ПС (г/дм3): отруби – 8, KH2PO4 – 4,08, NH4NO3 – 9,70. Оптимизированная ПС позволила повысить выход АСБ в 1,32 раза, и он составил 16,95 г/дм3.

3.3.3 Исследование биохимического состава биомассы дрожжей P. anomala 9a- Определялся биохимический состав полученной биомассы дрожжей (табл.2).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что дрожжевая биомасса содержит высокое количество белка (48,6% от АСБ), что позволяет использовать её в качестве потенциального источника полноценного протеина.

Таблица 2 - Биохимический состав биомассы дрожжей P. anomala 9a-48, % 3.3.4 Определение эффективных условий экстракции липидов из биомассы дрожжей P. anomala 9a- С целью увеличения сроков хранения и улучшения характеристик продуктов необходимо избавляться от легко окисляемых и реакционноспособных компонентов, таких как липиды. Для удаления липидов из биомассы дрожжей выбран дешевый и безопасный, разрешенный в пищевой промышленности экстрагент - этанол.

Для определения наиболее эффективных условий проведения экстракции липидов из биомассы дрожжей P. anomala 9a-48 последовательно варьировались следующие факторы:

гидромодуль (1 - 7), концентрация этанола (40 - 96%), температура проведения экстракции (30 С), длительность (15-90 мин).

Наиболее экономически обоснованными следует считать следующие параметры экстракции: гидромодуль 2,5, концентрация этанола 60%, температура 55°С, продолжительность 60 мин, при этом количество удаленных липидов составило 70,4 %.

Проведение экстракции в две стадии по 30 мин с заменой экстрагента на свежий позволяет дополнительно извлечь 7,9% липидов. Остаточное количество липидов в биомассе составило 2,69% от АСБ.

дрожжевой биомассы Количество гидролизованных нуклеиновых кислот, % Рисунок 4– Влияние рН и длительности денуклеинизации на степень гидролиза 3.3.6 Получение и характеристика готового пищевого белково-углеводного концентрата биомассу высушивали конвективным методом. В готовом концентрате определялись содержание влаги, белка, золы, РВ, липидов, оценивалась общая микробная обсемененность (табл.3).

Полученный пищевой белково-углеводный концентрат (ПБУК) соответствует требованиям существующей нормативной документации на белковые композитные сухие смеси, получаемые из молочной сыворотки.

Выход ПБУК при переработке 1 кг картона составил около 200 г (влажность 8%).

Определение аминокислотного состава белка ПБУК проводилось в аналитической лаборатории Института естественных наук Thai Nguyen University в Ханое (СРВ). Выявлено, что содержание основных незаменимых аминокислот (кроме триптофана) в полученном ПБУК достигает 33%.

3.3.7 Оценка функциональных свойств белков ПБУК С целью изучения возможности применения ПБУК из дрожжевой биомассы P. anomala 9a-48 в пищевой промышленности определены функциональные свойства белков ПБУК.

Максимум растворимости ПБУК наблюдался при 40оС и рН 11,0 и составил 63,3%.

Набухаемость, водо- и жиросвязывающая способности ПБУК составили соответственно 4, см3/г, 2,89 и 0,74 г/г белка.

Высокая способность белков удерживать воду в пищевых продуктах повышает выход последних, удлиняет сроки хранения и улучшает текстуру. В связи с этим можно сделать вывод о возможности применения полученного ПБУК при введении в рецептуры пищевых продуктов.

3.3.8 Оценка сорбционной способности ПБУК по отношению к микроорганизмам Исследование сорбционной способности ПБУК по отношению к микроорганизмам (в т.ч.

патогенным и условно-патогенным) показало, что ПБУК обладает выраженной (свыше 80%) способностью адсорбировать палочко- и кокковидные бактерии различных форм патогенности, что позволяет вводить разработанную добавку в продукты питания с лечебнопрофилактической целью.

3.3.9 Аппаратурно - технологическое оформление процесса получения ПБУК из биомассы дрожжей На основании результатов исследований, представленных в разделе 3.3, разработана принципиальная технологическая блок-схема, а также предложена аппаратурнотехнологическая схема получения ПБУК (рис.5).

Рисунок 5 – Аппаратурно-технологическая схема получения ПБУК.

3.4 Разработка технологии кормового белково-углеводного концентрата (КБУК) из биомассы грибов Получение белка непосредственно на твёрдых растительных субстратах основано материалов и накапливать белок.

3.4.1 Скрининг целлюлазоактивных микроорганизмов – продуцентов белка В рамках диссертационного исследования произведен скрининг грибов, способных накапливать протеин при выращивании на сыпучих ПС, в которых варьировалось соотношение картона и пшеничных отрубей. Результаты для пяти наиболее продуктивных по сырому протеину (СП) грибов приведены на рис. 6.

Наивысшее накопление СП (24,33 %) отмечено в культуре гриба Trichoderma polysporum, выращенного на среде, состоящей из 100% отрубей. Принимая во внимание совокупность таких параметров, как скорость роста гриба, накопление культурой белка, количество утилизируемого картона, для дальнейшего культивирования выбрана среда с соотношением картон:отруби = 70:30.

Наивысшее содержание СП на выбранной ПС отмечено при культивировании штаммов Trichoderma polysporum (19,47%), Trichoderma viride (19,29%), Aspergillus oryzae (18,51%).

Для повышения выхода биомассы и степени конверсии субстрата используют смешанные культуры микроорганизмов. Произведено совместное культивирование отобранных штаммов. Наивысшее содержание СП (23,55 %) отмечено в смешанной культуре Trichoderma viride, Trichoderma polysporum, Aspergillus oryzae.

интенсификации биосинтеза белковых веществ грибами химическая и ферментативная предобработка картона, входящего в состав ПС при поверхностном культивировании грибов T. viride, T. polysporum, Asp. oryzae.

При предобработке картона 1% пероксомоносерной кислотой накопление СП в готовой культуре составило 24,16%. При обработке 0,4% NaOH с гидромодулем 20 в течение 60 мин при давлении 0,2 МПа содержание СП составило 25,65 %.

СП, % от АСБ Рисунок 7 – Зависимость содержания СП в готовых культурах от обработки быть утилизирован путем твердофазного 3.4.4 Интенсификация процесса накопления СП путем подбора наиболее эффективного состава ПС Для повышения степени конверсии целлюлозы в белок производилась подпитка солевыми растворами, молочной сывороткой, в картонно-отрубевую сыпучую ПС вносились плодовоовощные отходы.

При добавлении дигидрофосфата аммония в сочетании с нитратом калия в ПС (70% ферментированного картона + 30% отрубей) при культивировании смеси культур грибов содержание СП составило 26,63%.

Сыворотка в количестве 1-100% смешивалась с водопроводной водой, и полученной смесью увлажнялась ПС при культивировании грибного консорциума (рис.8).

Отмечено, что внесение 100% сыворотки для увлажнения ПС повышало СП в грибной СП, % от АСВ 26, Очистки мандариновые Очистки картофельные Жмых кукурузный Отруби пшеничные 3.4.5 Обогащение кормового препарата пробиотическими микроорганизмами микроорганизмами проводилось их внесение в полученную культуру консорциума грибов. Экспериментально подобран состав ПС для культивирования В. subtilis и L.

plantarum (г/дм3): (NH4)2SO4 – 5; KH2PO4 - 3; гидролизат рыбной муки - 5; NaCl - 3;

автолизат дрожжей – 1, ферментолизат картона с РВ 25 г/дм3 – до 1 дм3.Титры клеток бактерий при этом составили 6,1 * 109 и 5,6 * 109 соответственно.

культивирование грибов на сыпучих ПС, убивку; культивирование, бактерий на жидких ПС, отделение биомассы бактерий от культуральной жидкости путем центрифугирования, смешивание влажных концентрированных бактериальных масс с культурой грибов.

Исследование антагонистической активности бесклеточных КЖ бактерий показало их выраженный антагонизм по отношению к распространенным патогенам, а следовательно возможность внесения в качестве питья или в качестве увлажнителя корма животных.

токсичность Исследование готового обогащенного пробиотическими микроорганизмами кормового белково-углеводного концентрата (КБУК) на острую токсичность производилось с использованием суточной культуры инфузорий стилонихий.

Установлено, что разработанный продукт не обладает острой токсичностью.

3.4.7 Характеристика готового КБУК В готовом КБУК определяли содержание влаги, белка, золы, РВ, липидов, клетчатки (табл. 4).

клетчатки, % %а.с.в.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что полученный КБУК содержит достаточно высокое количество белка (27,1%), что позволяет использовать его в качестве потенциального источника протеина для добавки в корм скоту.

Определение аминокислотного состава проводилось в аналитической лаборатории Института естественных наук Thai Nguyen University в Ханое (СРВ) (табл. 5). Суммарная доля семи незаменимых аминокислот (кроме триптофана) в полученном КБУК составляет 33,5% от СП. КБУК обладает повышенной биологической ценностью и может быть рекомендован к использованию в качестве кормовой добавки.

3.5 Разработка технологии стимулятора роста растений из биомассы грибов Многие микроорганизмы способны стимулировать рост и развитие растений за счет образования фитогормонов, способности к азотфиксации, улучшения водного и минерального питания растений, а также предотвращения или уменьшения развития фитопатогенов [Цавкелова, 2006].

3.5.1 Скрининг микроорганизмов, стимулирующих рост растений Производилось изучение влияния культур микроскопических грибов на рост и развитие сельскохозяйственных растений. Твердофазные культуры грибов (биомасса с остатками питательной среды), выращенные на картонно-отрубевых средах, смешивались с торфом в различных соотношениях, и на таких субстратах производилось проращивание семян пшеницы. Как видно из диаграммы на рис.10, внесение биомасс Trichoderma viride, Aspergillus sp. Ч-2, Trichoderma polysporum и Trichoderma harzianum в почву положительно влияло на накопление СП в растениях пшеницы.

СП в надземной части пшеницы, % от АСБ Рисунок 10 – Зависимость накопления СП в надземной части растений пшеницы от вида и количества вносимой в субстрат культуры грибов.

Наибольшее содержание СП в надземной части растений пшеницы на 10-е сутки (11,05 и 10,99 % от АСБ) отмечено при внесении в торфосубстрат 30% биомасс грибов T. harzianum и T. viride соответственно.

3.5.2 Составление консорциумов из нескольких микроорганизмов Отобранные культуры были скомбинированы для получения консорциумов, выращены совместно на сыпучих картонно-отрубевых ПС и внесены в торф при проращивании пшеницы. Наибольшее действие на накопление пшеницей СП (11,47 % от АСБ) оказывало внесение в почву консорциума культур T. viride, T. polysporum, T.

harzianum в количестве 30%.

При увлажнении консорциума культур грибов T. viride, T. polysporum, T. harzianum смесью культуральных жидкостей бактерий Azotobacter sp., L. acidophilus и L.plantarum, выращенных на синтетических ПС, содержащих в качестве жидкой фазы и единственного источника углерода ферментолизат картона, удалось достичь содержания в надземной части растений пшеницы СП 13,29% от АСВ.

3.5.3 Получение сухого препарата-стимулятора роста растений Влажная бактериально-грибная культура высушивалась конвективным методом до остаточной влажности 8-10%. Определялся биохимический состав и активности ферментов готового препарата-стимулятора роста растений (табл. 6).

Таблица 6 - Характеристика препарата-стимулятора роста растений Использование микробиологических препаратов, обладающих комплексом полезных свойств, представляет собой большой интерес для повышения почвенного плодородия и продуктивности культурных растений, защиты их от фитопатогенов, повышения качества урожая, снижения норм внесения минеральных удобрений и пестицидов.

В соответствии с проведенными расчетами экономической эффективности разработанных технологий, себестоимость готовых препаратов составила: ФП целлюлаза Ч-2-10 Г10Х – 124,59 руб/кг, ПБУК – 69,30 руб/кг, КБУК – 24,49 руб/кг, что значительно ниже или сопоставимо с ценой ближайших конкурентных аналогов.

ВЫВОДЫ

1. Исследование биохимического состава картонной фракции отходов комбинированной упаковки Тетра Пак показало, что она на 91% состоит из целлюлозы, что обосновывает необходимость использования различных методов обработки для ее конверсии в глюкозу, усваиваемую всеми микроорганизмами.

2. Результаты скрининга микроорганизмов позволили выявить изолят, обладающий максимальной целлюлазной активностью, идентифицированный как Aspergillus sp. Ч-2, на основе культивирования которого разработана биотехнология спиртоосажденной целлюлазы Ч-2-10 Г10Х. Активность целлюлазы Ч-2-10 Г10Х составила 2375,13 ед/г.

3. Разработана технология получения растворов редуцирующих веществ путем ферментативного гидролиза картона с использованием нового ферментного препарата целлюлазы Ч-2-10 Г10Х.

4. Разработан режим глубинного культивирования дрожжей P.anomala 9a-48 на питательной среде, содержащей ферментолизат картона в качестве основного источника углерода.

5. На основе экспериментально установленных эффективных условий экстракции липидов и нуклеиновых кислот из дрожжевой биомассы разработана технология пищевого белково-углеводного концентрата. Показано, что ПБУК обладает хорошими функциональными качествами и может быть введен в рецептуры пищевых продуктов с целью повышения их биологической ценности (содержание незаменимых аминокислот превышает 30%).

6. Разработана малоотходная технология кормового белково-углеводного концентрата на основе твердофазного культивирования грибов на питательных средах, содержащих картон. Показано, что КБУК обладает повышенной биологической ценностью (содержание незаменимых аминокислот превышает 30%), что подтверждает возможность его применения в составе кормов.

7. Экспериментально установлена возможность обогащения КБУК пробиотическими микроорганизмами.

8. Разработана технология препарата-стимулятора роста растений на основе бактериально-грибного консорциума. Показано его выраженное положительное влияние на рост и развитие растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

Иванова Л.А. Утилизация отходов картонной упаковки путем биоконверсии в препарат-стимулятор роста растений / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, Н.В. Здоровило // Естественные и технические науки. - 2012. -№6. - C.105-106.

комбинированной упаковки «Тетра-Пак» / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, В.А.Репник, Н.В.Здоровило, Ю.В. Шелудько // Экология и промышленность России. - 2012. - №12. С.26- Глазова А.А. Оптимизация состава питательной среды при культивировании дрожжей на ферментолизатах упаковочного картона / А.А. Глазова, Л.А. Иванова // Естественные и технические науки. - 2013. -№. – C.306-308.

Статьи и материалы конференций:

упаковочных материалов / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, В.А.Репник, // Технология и производственный менеджмент / МГУПП - М., 2011, -С.230-237.

Глазова А.А. Биоконверсия целлюлозосодержащих материалов - экологичный подход к переработке отходов комбинированной упаковки / А.А. Глазова, В.А.Репник, Л.А. Иванова // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы IX международной научной конференции студентов и молодых ученых / МГУПП - М., 2011, -С.3-5.

Иванова Л.А. Использование промышленных и бытовых отходов в качестве сырья для получения грибных целлюлаз / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, В.А.Репник, Иванова Л.А. Разработка способа получения препарата-улучшителя почвы на основе твердофазной биоконверсии бумажных упаковочных материалов / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, Н.В. Здоровило // Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: материалы II Всероссийской научно-практической конференции (с международным участием) / ВСГУТУ. - Улан-Удэ, 2012. - С. 15-17.

Иванова Л.А. Разработка технологии переработки отходов картонной упаковки Тетра Пак в кормовые белковые препараты / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, Ю.В. Шелудько // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: материалы международной научно-практической конференции / ВНИТИБП, Щелково, 2012. - С.473-477.

Глазова А.А. Комбинированная упаковка Тетра Пак - перспективное сырье для биоконверсии / А.А. Глазова, Л.А.Иванова, Н.В.Здоровило, Ю.В. Шелудько // Биотехнология - состояние и перспективы развития: материалы VII Московского Международного Конгресса, часть 2 / М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им.

Д.И. Менделеева, 2013. - C.335- 10. Glazova A.A. Selection of microorganism for cardboard package residue bioconversion / A.A.Glazova, L.A.Ivanova, Y.V.Sheludko, N.V.Zdorovilo, E.S. Sokolova // National Workshop on Biotechnology 2013: Workshop Proceedings, Hanoi, 2013. – P.153-156.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

АСБ - абсолютно сухая биомасса;

БГКП – бактерии группы кишечной палочки;

КБУК – кормовой белково-углеводный концентрат;

КЖ – культуральная жидкость;

КМАФАнМ – количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов;

КОЕ – колониеобразующая единица;

ПБУК – пищевой белково-углеводный концентрат;

ПМ – посевной материал;

ПС – питательная среда;

ПФЭ – полный факторный эксперимент;

ПЦР – полимеразная цепная реакция;

РВ – редуцирующие вещества;

СП – сырой протеин;

ФП – ферментный препарат;

ЦлА – целлюлазная активность.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю д.т.н., профессору Ивановой Л.А. за всестороннее внимание, поддержку, руководство при выполнении и написании работы; заведующей кафедрой «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «МГУПП» д.б.н., профессору Бутовой С.Н., а также всем сотрудникам кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «МГУПП».