На правах рукописи

ФЕДУНЕНКО ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Экспериментальное обоснование комбинированного

применения биологически активного полиморфного гидрогеля

и диадинамотерапии в лечении язв роговицы

14.00.51.- восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная

медицина, курортология и физиотерапия

14.00.08 – глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва – 2007

Работа выполнена в ФГУ РНЦ ВМ и К Росздрава, ГУ НИИ глазных болезней РАМН, Городской Больнице скорой медицинской помощи № 2 Управления здравоохранения г. Ростова-на-Дону Научные руководители:

доктор медицинских наук Арутюнова Ольга Валентиновна доктор медицинских наук Давыдов Дмитрий Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Радзиевский Сергей Алексеевич доктор медицинских наук Киселева Татьяна Николаевна Ведущее учреждение: Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Защита состоится «24» апреля 2008 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д.208.060.01 при ФГУ Российский научный центр восстановительной медицины и курортологии Росздрава по адресу: г.

Москва, Борисоглебский пер. д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научного центра восстановительной медицины и курортологии Росздрава по адресу:

121069, Москва, Борисоглебский пер. д.9.

Автореферат разослан «21» марта 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор В.К.Фролков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Поиск и разработка оптимальных физиотерапевтических способов применения лекарственных препаратов, которые, позволяют провести полноценное восстановление зрительных функций после тяжелых воспалительных заболеваниях глаз и их последствий, является важной задачей для восстановительной медицины и офтальмологии (Разумов А.Н., Бобровницкий И.П. 2003, Арутюнова О.В.2004).

В то же время, активно развивается новое направление в совершенствовании местного лечения - разработка носителей лекарственных средств, которые представляют собой немедикаментозные биологически активные вещества, применение которых позволяет обеспечить оптимальный процесс заживления раневой поверхности путем создания условий адекватного тепло-, влаго- и газообмена приближенных к естественному заживлению, что способствует повышению функциональных результатов лечения.

Так, в хирургической практике была отмечена высокая эффективность полупроницаемых повязок с лекарственными веществами на основе биологически активного гидрогеля, клиническая эффективность которых значительно превышает эффективность стандартных методов лечения Адамян А.А. и соавт. 2001, 2006, Кузнецов Н.А. и соавт. 2006).

трофическое, обезболивающее, противовоспалительное и противоотечное действие доказали свою эффективность в лечении гнойных язв роговицы.

применения в острой фазе процесса (Г.С.Паламарчук 1983г., И.Н.Сосин, А.Г.Буявых 1998г.).

Актуальность проведения полноценной реабилитации пациентов с язвенным поражением роговицы различной этиологии обусловлена недостаточной эффективностью традиционных методов лечения даже при современном спектре антибиотиков из-за поливалентной устойчивости микроорганизмов к применяемым антимикробным препаратам, и в подавляющем числе случаев приводит к потере зрения той или иной степени, в 8-9% случаев к анатомической гибели глаза, в 17% случаях к удалению глаза. Исходы бактериальных язв роговицы составляют до 25% случаев инвалидности по зрению [Шаимова В.А., 1999, Майчук Ю.Ф., 2001, Южаков А.М.,2003].

Прежде всего, это относится к случаям с центральным расположением язвы, где процесс протекает более тяжело и требует более длительного лечения, а рубцевание в оптической зоне всегда приводит к образованию на месте язвы стойкого интенсивного помутнения – бельма, значительно снижающего зрительные функции глаза, что приводит к затруднению социальной адаптации пациентов работоспособного возраста, резкому снижению качества жизни пациентов (Джалиашвили О.А., Горбань А.И.

1999, Савельев В.Н. 2002, Майчук Ю.Ф. 2004, Лоскутов И.А. 2007,.).

По данным современной литературы, вероятность инфекционного поражения роговицы достаточно велика не только при травматических поражениях роговицы, но и у лиц, пользующихся контактными линзами, а так же как осложнение соматических заболеваний (после перенесенного инсульта: при парезе лицевого и тройничного нервов, ревматоидных артритах, болезни Съегрена), причем нередко персистирующий, эпителиальный дефект роговицы в последующем может приводить к перфорации, ведущей в ряде случаев к гибели глаза. L.Hirst и соавт. (1997) отмечают, что бактериальная язва роговицы в 49 % случаев была причиной нетравматической перфорации роговицы.

В связи с вышеизложенным, можно отметить, что данные о высокой клинической эффективности применения биологически активного гидрогеля в качестве носителя лекарственных препаратов в лечении раневых процессов различной этиологии в хирургической практике, а так же выраженное положительное влияние диадинамотерапии на регенеративные процессы роговицы позволяют рассматривать комбинированное применение данных методик как один из перспективных методов лечения пациентов с язвами роговицы, в том числе бактериальной этиологии, что и послужило основанием для проведения данной работы.

Целью данной работы являлись разработка и экспериментальное обоснование комбинированного применения биологически активного полиморфного гидрогеля и диадинамитерапии в лечения язв роговицы бактериальной этиологии 1. Разработать экспериментальную модель язвы роговицы на основании частоты встречаемости, особенностей этиологии и характера течения язвенного поражения роговицы в клинической практике.

лекарственных препаратов из биологически активной основы антимикробного геля «Апполо».

3. Оценить степень антимикробной активности биологически активной гелевой субстанции и гидрогелевой композиции (гелевая субстанция в сочетании с лекарственными препаратами) антимикробного геля «Апполо»

4. Разработать методику применения и изучить эффективность лечения бактериальных язв роговицы с применением биологически активного полиморфного гидрогеля «Апполо» в эксперименте биологически активного полиморфного гидрогеля «Апполо» и диадинамотерапии в лечении бактериальных язв роговицы различной этиологии в эксперименте на основании клинических и гистологических исследований Разработана экспериментальная модель язвы роговицы, позволяющая за счет увеличенной площади язвенного дефекта до 7,5 мм оценивать процессы регенерации и эпителизации роговицы на протяжении более длительного времени по сравнению с ранее используемыми в экспериментальных исследованиях моделями язвы роговицы диаметром от 3 до 5 мм.

Выявлена временная зависимость скорости выделения физиологически активных водорастворимых препаратов из биологически активной основы антимикробного геля «Апполо», которая выражается в пролонгируемом дозируемом выделении введенных в объем гидрогелевой основы водорастворимых физиологически активных веществ.

Доказано, что биологически активная гидрогелевая основа обладает сорбционными свойствами в отношении целого ряда бактериальных возбудителей (Staphylococcus aur., Escherichia coli, Proteus spp, Enterobakter aer., Psenolomonas aer., и Klebsiella spp). Показана высокая антимикробная активность гирогелевой композиции (гидрогелевая основа в сочетании с антисептическим препаратом) антимикробного геля «Апполо», позволяющая сохранить, а в ряде случаев существенно увеличить антимикробную антибактериальными препаратами.

Доказана высокая эффективность комбинированного применения антимикробного геля «Апполо» и диадинамотерапии в лечении язв роговицы бактериальной этиологии, которая выражается в существенном сокращении сроков эпителизации роговицы с образованием более нежного роговичного рубца.

биологически активного геля «Апполо» при патологии переднего отрезка глаза.

Проведена оценка эффективности применения препаратов на основе гидрогелевой композиции в отношении процессов репаративной регенерации при гнойных язвах роговицы в качестве одного из способов лечения.

Разработан способ применения антимикробного геля «Апполо» в качестве самостоятельного лечения язвы роговицы в эксперименте.

Разработан способ комбинированного применения антимикробного геля «Апполо» и диадинамотерапии в лечении бактериальных язв роговицы различной этиологии в эксперименте с последующей рекомендацией для исследования в клинических условиях в практике восстановительного лечения заболеваний роговицы.

Внедрение результатов в практику здравоохранения Разработанный метод восстановительного лечения пациентов с бактериальными язвами роговицы различной этиологии внедрен в практику ФГУ РНЦ ВМ и К Росздрава, ГУ НИИ глазных болезней РАМН, Городской Больницы скорой медицинской помощи № 2 Управления здравоохранения г.

Ростова-на-Дону. Результаты работы могут быть использованы в офтальмологических клиниках.

Разработанная экспериментальная модель язвы роговицы, с увеличенной площадью дефекта роговицы до 7,5мм позволяет в течение длительного времени изучать процессы эпителизации и структуризации слоев роговицы, что обусловлено тяжестью течения патологического процесса.

Биологически активная полиморфная гидрогелевая основа антимикробного геля «Апполо» обеспечивает дозируемый пролонгированный выход предварительно введенных в её объем водорастворимых физиологически активных веществ, а так же обладает выраженным антимикробным действием в отношении целого ряда бактериальных возбудителей.

диадинамотерапии в качестве метода лечения язвы роговицы стимулирует процессы репаративной регенерации способствуя формированию более нежных роговичных рубцов.

обсуждены на 1-ой научно-практической конференции офтальмологов Южного Федерального Округа, посвященной 130-летию со дня рождения основателя Ростовской школы офтальмологии профессора Константина Хрисанфовича Орлова, расширенной конференции кафедры глазных университета, на заседании Общества офтальмологов Ростовской области.

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 5 в центральной прессе, подана заявка на патент, и 2 рационализаторских предложения.

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 8 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав, заключения, выводов и библиографического указателя. Список использованной литературы включает в себя 213 источников, из которых 114 - отечественных, 99 – зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы экспериментальных исследований Экспериментальная часть работы выполнена на 60 глазах 30 кроликов породы Schinschilla массой 1,5-2,0 кг., у которых на двух глазах была проведена послойная трепанация роговицы (создана экспериментальная модель язвы роговицы), инфицирована впоследствии наиболее часто встречающимся в клинической практике возбудителем - лабораторным штаммом Staphylococcus aureus № 6538-р, полученным в ГНИИ им.

Тарасевича, г. Москва. Живую культуру наносили в стационарной фазе роста, разводили её бульоном до 105-106 Мт/мл. Для заражения язвенной поверхности роговицы использовали 1 мл культуры.

экспериментальной модели язвы роговицы, глаза кроликов были разделены на две опытные и контрольную группы по 10 кроликов (20 глаз в каждой группе). В I-ой опытной группе, спустя сутки от начала заражения в глаз кролика 2 раза в день закладывали 0,1мл гидрогеля «Апполо». Во II-ой опытной группе спустя сутки от начала заражения кроме 2-ух кратного диадинамотерапии области глаза по методике, предложенной Г.С.Паломарчук: электроды располагались на коже сомкнутых век глаза.

Ток двухкратный 1 мин, затем – короткие периоды синусоидального модулированного тока в течение 5-6 мин., ежедневно. Курс 10 процедур.

Сеансы диадинамотерапии проводилась на аппарате «Тонус-2», регистрационное удостоверение №ФС 022а2006/4323-06 от 28.12.2006г.

В контрольной группе спустя сутки от начала заражения проводили стандартное лечение: инстилляции 0,3% раствора офлоксацина (глазные капли - флоксал) и Корнерегеля три раза в день в течение всего периода наблюдения.

С учетом сроков наблюдения кролики были разделены на 5 групп. После начала лечения кроликов выводили из эксперимента на 1, 3, 7, 10 и 30 сутки путем декапитации. После энуклеации, глаза животных фиксировали в 10%ном растворе формалина, обезвоживали в спиртах, заливали в парафин, с последующим формированием срезов толщиной 5-7 мкм. Полученные срезы окрашивали по стандартной методике гематоксилин-эозином и по Ван Гизону. Анализ микропрепаратов проводили на световом микроскопе фирмы Carl Zeiss при увеличении 150, 200, 400 раз. Наблюдение проводилось ежедневно на протяжении всего срока эксперимента.

Для наблюдения за динамикой эпителизации и оценки площади дефекта эпителия роговицы оценивали с помощью фокального освещения, биомикроскопии, фоторегистрации (цифровой фотокамерой «Nicon»), флюоресцеинового теста. Характер и динамику течения язвенного процесса, а так же эффективность проведенного лечения оценивали по следующим клиническим параметрам: отсутствие воспалительной реакции, сроки исчезновения микрофлоры, отсутствие гнойного отделяемого, сроки начала и завершения эпителизации, степень помутнения роговицы, наличие в ней новообразованных сосудов, сроки выздоровления, количество и характер осложнений.

Для количественной оценки степени помутнения роговицы использовали 5-ти бальную шкалу (разработанную Т.Н. Вовк): 5 –грубое помутнение роговицы с наличием разветвленной сосудистой сети; 4 - выраженное помутнение роговицы, захватывающее оптическую зону и занимающее от до поверхности с выраженными сосудами; 3 – менее выраженное помутнение роговицы, охватывающее часть оптической зоны и не превышающее по площади поверхности с врастанием сосудов по перефирии; 2 – незначительное полупразрачное помутнение роговицы, охватывающее часть оптической зоны, врастание сосудов от зоны лимба до до 2-3 мм в одном или двух квадрантах; 1 – практически прозрачная роговица с единичными запустевшими сосудами у лимба.

Сроки исчезновения микрофлоры определяли методом забора отделяемого из конъюнктивальной полости и язвенного дефекта роговицы а дальнейшим посевом на дифференциально-диагностические среды и окончательной идентификацией микрофлоры по стандартным схемам с определением чувствительности к антибиотикам.

Переносимость препаратов, используемых в эксперименте, оценивали по общему состоянию экспериментальных животных (поведение, нарастание массы тела, наличие или отсутствие аппетита).

Характеристика применяемого в работе биологически активного гидрогеля и методика его исследования Для реализации методологии местного лечения раневых поверхностей в хирургии разработано и разрешено к медицинскому применению принципиально новый биологически активный антимикробный гель «Апполо» рег. удост. МЗ РФ №29/1111299/0869-00 от 29.08.2000) с обезболивающим и антимикробным действием.

Гель антимикробный "Апполо" представляет из себя гидрогель с введенными в его состав препаратами: мирамистином (антисептиком) и анилокаином (анестетиком). Гидрогелевая основа антимикробного геля «Апполо» содержит акриламид, и/или акрилат натрия, биологически активные вещества, поливинилпирролидон, глицерин, пропандиол и воду.

Гель упакован в пакетик или тубу из материала с высокими барьерными свойствами, стерилизован.

Определение кинетики выведения препаратов из гидрогеля определяли методом оценки временной зависимости выделения физиологически активных веществ (красителя конго красного) из гелевой субстанции при температуре 37С и исходной концентрации - Со= 0,08 мг/мл.

Изучение сорбционых свойств гидрогелевой основы и антимикробных свойств гидрогелевой композиции проводили путем определения скорости уничтожения бактериальных клеток через 1, 5 и 24 часа после инкубирования в термостате при Т 370С микробиологическим методом с последующим количественным подсчетом колоний микробов по стандартной методике.

Методика выявления распространенности возбудителей язвы роговицы С целью выявления распространенности различных видов возбудителей было обследовано 192 пациента в возрасте от 19 до 83 лет с язвами роговицы различной этиологии, с проведением лабораторной диагностики – посевов и мазков из конъюнктивальной полости на флору и чувствительность.

Методы статистической обработки результатов исследования При обработке полученных данных применены методы вариационной арифметической (), средней ошибки средней арифметической (m), определением критерия достоверности Стьюдента (t) и уровня значимости (р).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При создании экспериментальной модели нами использован роговичный трепан диаметром 7,5 мм, в отличие от ранее используемых моделей с диаметром 3, 4, 5 мм, при этом глубина язвенного дефекта составляла толщины роговицы. При этом значительная площадь раны позволяла изучать процессы эпителизации в течение длительного времени, давая возможность наблюдать процесс эпителизации дефекта, заживления и структуризации всех слоев роговицы в течение длительного времени.

распространенности выделенных возбудителей следует отметить, отметить определенную тенденцию к росту удельного веса таких возбудителей, как Pseudomonas aeruginosa (12,0%) и Enterobacter (8,9%), однако на первом месте остаются Staphylococcus epidermidis (18,2%) и Staphylococcus aureus (24,5%).

В связи с чем, эрозированную зону роговицы подопытных животных распространенности возбудителей у пациентов с язвой роговицы в клинических условиях.

Оценка временной зависимости скорости выделения водорастворимых физиологически активных веществ, в данном случае красителя (конго красный) из объема гелевой субстанции показала, что в первые 30 мин.

происходит достаточно быстрое выделение водорастворимого красителя из объёма гидрогелевой основы с последующим плавным нарастанием эффекта к 6-12 часам. Далее, происходит снижение скорости выделения красителя в течение нескольких суток, что обеспечивает пролонгированный дозируемый эфффект предварительно введенных в объем гидрогелевой основы повязки водорастворимых физиологически активных веществ (рис №1).

Рис.1 Зависимость скорости выделения красителя из C (mg/ml) антибактериальных препаратов в лечении бактериальной язвы роговицы нативном состоянии и препарата офлоксацин, к которому отмечается самая высокая чувствительность штамма Staphylococcus aureus (табл.№1).

Сравнительная характеристика антимикробной активности офлоксацина, мирамистина и биологически активного геля «Апполо»

Вид (тип) Кол-во Минимально ингибирующие концент возбудителя штаммов рации антимикробных ср-в, мкг/мл иммобилизованного в гидрогеле антисептика мирамистин (т.е. в препарате «Апполо»), превосходит его антимикробную активность в нативном состоянии, и что особенно важно, в большинстве случаев превосходит антимикробную активность антибактериального препарата офлоксацин.

Для выяснения причины обнаруженного повышения антимикробной активности антисептика мирамистин в гидрогелевой композиции были содержащей лекарственных веществ (рис.№2).

сорбционными свойствами в отношении микроорганизмов, зависящими как от времени контакта, так и от вида изученных возбудителей. Максимальный сорбирующий эффект биологически активной гелевой основы отмечен через 5 часов.

установлено, что гидрогелевая основа геля «Апполо» обладает выраженной Psenolomonas aer., и Klebsiella spp, в результате чего иммобилизация в гидрогель антисептика (мирамистин) позволяет не только сохранить, но в некоторых случаях существенно увеличить антибактериальную активность препаратами.

Полученные результаты, позволили использовать антимикробный гель «Апполо» в качестве основного метода лечения язвы роговицы в эксперименте (без дополнительного применения антибактериальных препаратов).

Клиническую картину течения язвенного процесса роговицы у экспериментальных животных оценивали ежедневно.

Через сутки после моделирования язвенного дефекта роговицы и заражения штаммом Staphylococcus aureus, в опытных и контрольной группах кроликов наблюдалась однотипная клиническая картина:

выраженная гиперемия конъюнктивы по всей поверхности, обильное гнойное отделяемое, при проведении флюоресцеиновой пробы – окрашивание дефекта эпителия диаметром 7,5 мм.

Однако на 3-и сутки после начала лечения в глазах у кроликов I и II опытных групп в подавляющем количестве случаев отсутствовало гнойное отделяемое в конъюнктивальной полости, незначительная гиперемия конъюнктивы. У кроликов контрольной группы, сохранялась выраженнная гиперемия конъюнктивы и обильное гнойное отделяемое.

Воспалительная реакция практически полностью купировалась в опытных группах в среднем на 9- 10 сутки, причем существенной разницы по данному показателю между опытными группами отмечено не было (р>0,05), В контрольной группе кроликов на 10-е сутки сохранялись признаки воспаления.

Сравнительная характеристика клинических проявлений течения язвы роговицы по группам показала существенное снижение сроков исчезновения гнойного отделяемого в опытных группах, которые составили 1,5±0,2 дня в I-ой основной группе и 1,3 ±0,1 дня во II-ой контрольной группе (p>0, между показателями в опытных группах) по отношению к контрольной