«посвященная 100-летию со дня рождения профессора Эмилии Вениаминовны Фрисман и 45-летию основания специализации “Молекулярная биофизика” на физическом факультете Сборник тезисов Санкт-Петербург, 2011 Санкт Петербургский ...»

III Международная конференция

Современные проблемы

молекулярной биофизики

посвященная 100-летию

со дня рождения

профессора

Эмилии Вениаминовны Фрисман

и 45-летию основания специализации

“Молекулярная биофизика”

на физическом факультете

Сборник тезисов

Санкт-Петербург, 2011

Санкт Петербургский государственный университет

Физический факультет

Кафедра молекулярной биофизики Современные проблемы молекулярной биофизики 14-15 июня 2011 г Конференция, посвященная 100-летию со дня рождения профессора Эмилии Вениаминовны Фрисман, и 45-летию основания специализации “Молекулярная биофизика” на физическом факультете

СБОРНИК ТЕЗИСОВ

Санкт-Петербург, Наш адрес:

198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Ульяновская ул., д.1, НИИ Физики СПбГУ, кафедра Молекулярной биофизики http://molbioph.niif.spbu.ru Тезисы публикуются в авторской редакции © Кафедра Молекулярной биофизики физического факультета СПбГУ Эмилия Вениаминовна Фрисман (14.06.1911 – 8.12.1996) Программа конференции 14 июня (вторник) 9.00 – 10.00 Регистрация участников (холл, 2 этаж НИИФ физического факультета СПбГУ) 1 заседание, Конференц-зал НИИФ 10.00 Открытие конференции 10.05 – 10.25 "О жизненном пути Эмилии Вениаминовны Фрисман" Сибилева Майя Александровна кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 10.25 – 10.45 "Вклад Э.В. Фрисман в наук

у о полимерах" Касьяненко Нина Анатольевна, кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 10.45 – 11.05 "1971 год. Начало исследований взаимодействия ДНК с биологически кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 11-05 – 11-25 "Воспоминания об Э.В. Фрисман" Московский государственный областной университет 11-25 – 11-45 Э.В.Фрисман в воспоминаниях коллег и учеников 11.45 – 12.00 Перерыв 2 заседание, Конференц-зал НИИФ 12.00 – 12.30 "Растяжение полимерной глобулы" Институт высокомолекулярных соединений РАН 12-30 – 12-55 "Электрооптика изотропных расплавов жидкокристаллических Рюмцев Евгений Иванович, Полушин Сергей Георгиевич кафедра физики полимеров физического ф-та СПбГУ 12-55 – 13-15 "Влияние гидрофобности аминокислотных замен на способность апомиоглобина образовывать амилоидные структуры" 13-15 – 13-35 "Ближний ориентационный порядок и гидрофобные взаимодействия в Дадиванян Артем Константинович Московский государственный областной университет 13.35 – 13.55 "Молекулярная биофизика в вирусологии" Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН 13.55 – 14.15 "Самоорганизация молекулярного шаперона GroEL/GroES in vitro" Семисотнов Геннадий Васильевич, 14-15 – 15-00 Обед 3 заседание, Конференц-зал НИИФ 15-00 – 15-20 "Теоретическое исследование конформаций полиэлектролитных и кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 15-20 – 15-35 "Пренатальный биохимический скрининг в Санкт-Петербурге" НИИ Акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН 15-35 – 15-50 "Компенсация стабилизирующих и дестабилизирующих воздействий на ДНК, вызванных противоопухолевыми соединениями платины и Институт биоорганической химии НАН Беларуси 15-50 –16-05 "Photomechanical control over polymers: from topography change of the 16-05 – 16-15 Перерыв 4 заседание, Конференц-зал НИИФ, холл НИИФ 16-15 – 17-30 Представление стендовых докладов 17-30 – 18-30 Стендовая сессия 18-30 Банкет 15 июня (среда) 1 заседание, Конференц-зал НИИФ 10-00 – 10-15 "Негистоновые белки семейства HMGB как модуляторы структуры Поляничко Александр Михайлович, кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 10.15 – 10.30 "Роль линкерных гистонов семейства Н1 в структурной организации суперкомпактного хроматина" 10.30 – 10.45 "Влияние специфики растворимости белков на их динамическое и Институт биологии Карельского НЦ РАН 10.45 – 11.00 "Молекулярные механизмы влияния магнитных полей разной интенсивности на регуляцию уровня кальция в культивируемых Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН 11-00 – 11-10 "Сравнение методов очистки плазмалеммы клеток корней кукурузы" Биолого-почвенный факультет СПбГУ 11-10 – 11-20 "Актин: глобулярный или частично неупорядоченный белок?" 11-20 – 11-30 "Структурные переходы зеленого флуоресцентного белка, sfGFP, под действием гуанидинтиоцианата" 11-30 – 11-40 "D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок – как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие 11-40 – 11-50 "Влияние воды на проявления внутримолекулярных взаимодействий в Волгоградский государственный университет 11-50 – 12-00 Перерыв 2 заседание, Конференц-зал НИИФ 12-00 – 12-15 "Структурная динамика ретиналя в процессе активации родопсина" С.-Петербургская Государственная Педиатрическая Медицинская Академия 12-15 – 12-30 "Концентрационная зависимость эффекта формы для полимерных кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 12-30 – 12-45 "Молекулярные свойства полилизинов дендритной архитектуры" кафедра физики полимеров физического ф-та СПбГУ 12-45 –12-55 "Изучение радиационных повреждений ДНК спектральными кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 12-55–13-05 "Взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины (II) различной структуры и состава" Богданов Алексей Александрович кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 13-05–13-15 "Конформационные изменения молекулы ДНК в растворе, вызванные присутствием поликатионов и многозарядных ионов" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 13-15– 13-35 "Наноструктуры на основе ДНК" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 13-35–13-55 "Интеркаляция как способ связывания биологически активных кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 13-55–14-10 Закрытие конференции 14-10 –14-50 Обед С 15-00 посещение могилы Э.В. Фрисман 1. Антипина А. Ю., Юрченко А. А.

';

"Моделирование взаимодействия двух полимерных цепей" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 2. Антюхова М. А., Юрченко А. А.

"Исследование поведения полиэлектролита вблизи заряженной поверхности" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 3. Бакулев В. М., Морозова Е.В., Turel I., Касьяненко Н. А.

"Исследование спектрально-люминесцентных свойств соединения рутения с антибиотиком офлоксацином и процессов их связывания с ДНК" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, University of Ljubljana, Faculty of Chemistry and Chemical Technology 4. Белашева И. Б., Морошкина Е. Б., Криворотов Д. В.

"Взаимодействие производных имидазоизохинолина с молекулой ДНК" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА РФ 5. Белых Р.А., Касьяненко Н. А.

"Взаимодействие молекулы ДНК с ионами алюминия в растворе" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 6. Борисова И. В., Богданов А.А.

"Исследование структурных особенностей взаимодействия цисдихлордиамминоплатины(II) с молекулой ДНК" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 7. Галюк Е. Н., Ландо Д.Ю., Фридман А. С.

"Кинетика изменения стабильности ДНК при связывании соединений платины" Институт биоорганической химии НАН Беларуси 8. Демидов В.Н., Божкова Е. А., Зырянова И.М., Касьяненко Н.А.

"Структура, электронное строение и взаимодействие с ДНК трис-хелатного комплекса Fe(II) с 1,10-фенантролином D,L-[Fe(phen)3]SO4" Санкт-Петербургский технологический институт, кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 9. Ефимова С.С., Остроумова О.С., Щагина Л.В.

"Активность сирингомициновых каналов в присутствии органических анионов и дипольных модификаторов в мембраноомывающих растворах" Институт Цитологии РАН 10. Затрудина Р.Ш., Конькова Е. П.

"Уширение и сдвиг длинноволновой полосы поглощения аминокислот в полярном растворителе" Волгоградский государственный университет 11. Коженков П.В., Шишилов О.Н., Рамазанов Р.Р., Ефименко И.А., Касьяненко Н.А.

"Изучение взаимодействия комплекса K2[PdHGluCl2] с молекулой ДНК in vitro" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, Институт общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН 12. Космотынская Ю.В., Иманбаев Р.Т., Богданов А.А., Касьяненко Н.А.

"Анализ совместного действия радиации и противоопухолевых препаратов платины на структуру и свойства молекулы ДНК в растворе" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, Санкт-Петербургский Государственный Горный Университет 13. Куранова М. Л., Спивак И.М., Сурма С.В., Щеголев Б.Ф.

"Влияние экранирования магнитного поля Земли на фибробласты человека" Институт Цитологии РАН, Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН 14. Леонтьева Т. В., Морошкина Е. Б., Криворотов Д. В.

"Взаимодействие молекулы ДНК с производными коралина и папаверина" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА РФ 15. Лысякова Л. А., Назарова О. В., Панарин Е. Ф., Касьяненко Н. А.

"Создание генных векторов с включением цисплатина на основе комплексов ДНК с синтетическими поликатионами" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, Институт высокомолекулярных соединений РАН 16. Макароничева А. В., Добрун Л.А., Михайлова М.Е., Лезов А.В.

"Молекулярные свойства полиэтиленгликоля модифицированного пространственнозатрудненными фенолами в растворах" кафедра физики полимеров физического ф-та СПбГУ 17. Марченков В.В., Марченко Н.Ю., Марченкова С.Ю., Котова Н.В., Семисотнов Г.В.

"Взаимодействие шаперона GroEL с субстратными белками: роль лигандов и внешних условий" Институт белка РАН 18. Назарычев В. М., В.И. Пахомов "Моделирование нанодиода и нанорезистора" Севастопольский Национальный технический университет 19. Осинникова Д. Н., Морошкина Е.Б., Кузнецов В.А.

"Исследование взаимодействия молекулы ДНК с производными бензоимидафталозина спектральными и гидродинамическими методами" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА РФ 20. Пучкова А. О., Соколов П. А., Касьяненко Н. А.

"Металлизация ДНК серебром" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 21. Р.Р. Рамазанов, Б.Ф. Щеголев, Н.А. Касьяненко "Неэмпирическое исследование свойств электронного и пространственного строения урациловых производных комплексов платины методами квантовой химии" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, ФГУ "Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова" 22. Семисотнов Г.В., Марченков В.В., Марченко Н.Ю., Рябова Н.А., Котова Н.В.

"Самоорганизация молекулярного шаперона GroEL/GroES in vitro" Институт белка РАН 23. Силантьева И. А., Воронцов-Вельяминов П.Н.

"Решеточная модель полимерной звезды и её исследование методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга-Ландау" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 24. Старкова Т.Ю., Чихиржина Е.В., Поляничко А.М.

"Два механизма взаимодействия белка HMGB1 с ДНК" Институт Цитологии РАН, кафедра молекулярной биофизики физического ф-та 25. Сулацкая А. И.

"Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл" Институт Цитологии РАН 26. Тарасенко О.А., Иващенко Т.Э., Насыхова Ю.А., Коротеев А.Л., Баранов В.С.

"Особенности пренатальной диагностики Синдрома Шерешевского-Тернера с помощью метода количественной флуоресцентной ПЦР" НИИ Акушерства и Гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН 28. Титов А.В., Варшавский М.С., Лопатько К.Г., Касьяненко Н.А.

"Изучение взаимодействия наночастиц серебра с молекулой ДНК в водно-солевом растворе" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины 29. Титов Е.В., Santer S., Лысякова Л.А., Zakrevskyy Y., Lomadze N., Зырянова И.М., Касьяненко Н.А.

"Изучение взаимодействия ДНК со светочувствительным сурфактантом" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, University of Potsdam, Institute of Physics and Astronomy 30. Ушков П. А., Богданов А. А.

"Определение взаимодействия ДНК с ионами меди (II) в присутствии ЭДТА" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ 31. Феофилова М.С., Огарков М.А., Чихиржина Е.В., Поляничко А.М.

"Исследование кинетики взаимодействия цисплатина с ДНК и белком HMGB1" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ, Институт Цитологии 32. Фонин А.В., Степаненко Ольга В., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К.

"Перспективы создания чувствительного элемента флуоресцентного биосенсора на глюкозу" Институт Цитологии РАН 33. Шабанова Т. С., Богданов А.А.

"Исследование взаимодействия ДНК с соединением палладия (II)" кафедра молекулярной биофизики физического ф-та СПбГУ

ВЛИЯНИЕ ГИДРОФОБНОСТИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН НА

СПОСОБНОСТЬ АПОМИОГЛОБИНА ОБРАЗОВЫВАТЬ

АМИЛОИДНЫЕ СТРУКТУРЫ

Катина Н.С., Балобанов В.А., Кашпаров И.А., Ильина Н.Б., Васильев В.Д., Богданов А.А.1, Тимченко А.А., Бычкова В.Е.

Институт белка Российской академии наук, Пущино, Московская обл., С.Петербургский государственный университет, Физический факультет, кафедра Молекулярной биофизики, С.Петербург, Петродворец Возникновение ряда генетических заболеваний связано с появлением амилоидных образований типа сенильных бляшек и фибриллярных агрегатов в различных органах и тканях. Поэтому изучение механизма образования амилоидов представляется важным как для молекулярной биологии и молекулярной биофизики, так и для медицины. В данной работе изучена способность мутантных форм модельного белка апомиоглобина образовывать амилоидные структуры после инкубация растворов белков при разрешенной для клетки температуре в течение 24 часов. Для тестирования образования амилоидных структур были использованы методы флуоресценции, кругового дихроизма в дальней УФ области и инфракрасной спектроскопии, электронной и атомно-силовой микроскопии, и малоуглового рентгеновского рассеяния. Исследование процесса амилоидообразования было проведено при разрешенной для клетки температуре 40оС, рН 5.5, т.е. в условиях, близких физиологическим. При этом структура нативного белка сохраняется в пределах ее изменений на базовых линиях зависимостей нативного состояния белка от рН и температуры. Наблюдается существенное различие в образовании амилоидов мутантными белками в зависимости от положения аминокислотной замены в первичной последовательности. Однако обнаружено, что гидрофобность замен в выбранном положении полипептидной цепи белка мало влияет на способность белка образовывать амилоиды. Замена заряженной аминокислоты на ароматическую резко повышает способность белка к агрегации. Прослеживается зависимость между изменением стабильности нативной формы белка вследствие замены одного аминокислотного остатка и способностью белка образовывать амилоидные структуры.

Работа поддержана Программами «Молекулярная и клеточная биология»

Президиума РАН и «Ведущие научные школы» (НШ-2791.2008.4), грантами РФФИ (09Фундаментальные науки – медицине», Федерального агентства по науке и инновациям (ФАНИ 02.740.11.0295) и Медицинского института Ховарда Хьюза (HHMI 55005607) Финкельштейна А.В.

БЛИЖНИЙ ОРИЕНТАЦИОННЫЙ ПОРЯДОК И ГИДРОФОБНЫЕ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В РАСТВОРАХ БИОПОЛИМЕРОВ

Дадиванян А.К. *, Пашинина Ю.М. *, Ноа О.В. **, *Московский государственный областной университет, [email protected] **Московский государственный университет, Химический факультет.

Гидрофобные взаимодействия играют большую роль в биологических системах – они стабилизируют структуру биополимеров, благодаря им происходит агрегация белков и возникает надмолекулярная структура липидов.

В случае гидрофобных взаимодействий парциальные энтропия и энтальпия смешения отрицательны, что не объясняется существующими статистическими теориями растворов.

Отрицательную энтропию смешения связывают с существованием кластеров воды, однако такой подход не может описать ряд явлений, в частности, увеличение теплоемкости органических веществ при растворении в воде.

Статистическая теория гидрофобных взаимодействий может быть развита на основе представлений о ближнем ориентационном порядке в растворах.

Мы рассмотрели зависимость энергии взаимодействия молекул воды с молекулами бензола и алифатических углеводородов, которые входят в липиды и боковые группы аминокислотных остатков протеинов и ответственны за гидрофобные взаимодействия, от их взаимной ориентации.

Энергия взаимодействия вычислялась методом атом-атом потенциалов по соотношениям:

Rij расстояние между i атомом молекулы углеводорода и j атомом молекулы воды.

где По значениям энергии межмолекулярного взаимодействия были определены вероятности различных ориентационных состояний и найдена корреляционная ориентационная функция S. Было установлено, что значения S отличны от нуля как при температурах ниже критических температур компонентов раствора, так и выше, в то время как при температурах выше критической температуры индивидуальной жидкости ориентационный порядок отсутствует.

Таким образом, полученные данные показывают, что парциальная энтропия смешения может быть отрицательной, что соответствует экспериментальным данным.

В предположении, что молекулы воды, находящиеся в первом монослое вокруг молекул углеводородов, ориентированы относительно них, можно считать, что вращательные степени свободы молекул воды заменяются колебательными, что приводит к увеличению теплоемкости каждой молекулы на 3K/2. При этом теплоемкость каждой молекулы растворенного углеводорода увеличивается на 3KN/2, где N – число молекул воды в монослое. Последний результат находится в соответствии с экспериментальными данными, которые до сих пор не были подтверждены теоретически.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, гранты №№ 10-07-00385-а, 10-03-90028-Bel_a и Министерства образования и науки Российской Федерации, государственный контракт № 02.740.11.5218.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА В ВИРУСОЛОГИИ

Иванов* Ю.В., Тимковский* А.Л., Феофанов** С.А.

*) Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН 188300, Ленинградская обл., г. Гатчина, Орлова Роща, e-mail: [email protected] **) Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущинский Научный центр РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, e-mail:

Обзорный доклад посвящен основным примерам применения молекулярной биофизики для решения задач как теоретической вирусологии, так и практической медицины. Это актуально в связи с тем, что вирусы выходят на одно из первых мест по опасности для человека и человечества в целом, в особенности в связи с участившимся появлением новых штаммов и типов вирусов. В настоящее время разработка вакцин, противовирусных химиопрепаратов и средств профилактики вирусных заболеваний и эпидемий невозможна без изучения статической и динамической структуры биомакромолекул и межмолекулярных взаимодействий с их участием. Здесь полностью применим весь набор и традиционных, и новых экспериментальных методов молекулярной биофизики. Оптимальная стратегия борьбы с вирусными инфекциями заключается в комбинации трех направлений, каждое из которых решает свой круг задач.

Эти направления можно систематизировать в соответствии с тем, на каких стадиях индивидуального развития вируса и/или эпидемической ситуации наиболее рационально их использование. Тогда первым по применению будет направление, основанное на заблаговременном предупреждении (профилактике, задержке) вспышки вирусного заболевания, особенно при недостаточно полной информации о типе или штамме вируса.

Это направление заключается в неспецифической профилактике вирусных заболеваний индукторами интерферона (ИФН), среди которых приоритет принадлежит полимерным, в особенности полинуклеотидным, индукторам ИФН. Здесь необходима оптимизация структуры индукторов и их взаимодействия с клеточными рецепторами. Задержка развития вирусной инфекции позволяет выиграть время для точной идентификации вируса и подготовки вакцины для осуществления второго направления – выработки у значительных групп людей специфического иммунитета к данной инфекции. Здесь также важны вопросы молекулярного распознавания и межполимерных взаимодействий. И, наконец, для лечения заболевших людей необходимо третье направление – разработка активных химиотерапевтических средств, позволяющих достаточно быстро подавить размножение вируса в организме. Здесь лекарства представлены в основном псевдосубстратами для вирусных ферментов, однако важны и другие примеры с использованием полимер-полимерного и полимер-лигандного распознавания. Таким образом, для разработки вакцин, противовирусных химиопрепаратов и средств профилактики вирусных заболеваний и эпидемий полностью применим весь набор и традиционных, и новых экспериментальных методов молекулярной биофизики:

оптические методы (спектроскопия поглощения, кругового дихроизма, комбинационного рассеяния, светорассеяние, флуоресцентные методы), АСМ, а также рентгеноструктурный анализ, спектроскопия ЯМР выделенных в чистом виде специфических молекулярных комплексов и компьютерное моделирование. Приведены примеры исследования межмолекулярных взаимодействий и их оптимизации во всех перечисленных направлениях.

[1] Тимковский А.Л. Индукторы интерферона. Рига: Зинатне, 1981, 52–65. [2] Тимковский А.Л. Вестник СПбГУ, сер. 4, 2007, вып. 1, 21-32. [3] Богданов А.А., Иванов Ю.В., Касьяненко Н.А., Потехин С.А., Суржик М.А., Тимковский А.Л., Феофанов С.А., Хусаинова Р.С., Яковлев. К.И. Биофизика. 2008. Т. 53, № 5. С. 740-743.

САМООРГАНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО ШАПЕРОНА

Семисотнов Г.В., Рябова Н.А., Марченков В.В., Котова Н.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Московская область, г.

Пущино, Ул. Институтская 4, e-mail: [email protected] Белки теплового шока клеток Escherichia coli GroEL (Hsp 60) и GroES (Hsp 10) являются представителями семейства молекулярных шаперонов, принимающих участие в правильном сворачивании и олигомеризации различных белков как in vivo так и in vitro.

Вместе с тем, многие шапероны сами по себе являются сложными олигомерными образованиями. В частности, GroEL и GroES состоят из 14 и 7 идентичных субъединиц соответственно, объединенных в специфические кольцевые структуры. Таким образом, ответ на вопрос каким образом самоорганизуются молекулярные шапероны, в частности, GroEL и GroES представляет особый интерес. В настоящей работе исследованы равновесные и кинетические процессы денатурации и ренатурации GroEL и GroES, а также влияние на эти процессы белковых лигандов и внешних условий (ионной силы и концентрации глицерина). Показана достоверность того, что самоорганизация GroES in vitro происходит спонтанно и не требует никаких дополнительных факторов. В противоположность этому, самоорганизация GroEL на стадии олигомеризации является лиганд-зависимой, а ее эффективность зависит от природы лигандов (АДФ или АТФ или GroES) и ионной силы раствора (наиболее эффективен сульфат аммония). На стадии формирования свернутой мономерной формы GroEL (т.е. сворачивания субъединиц) лиганды и ионная сила раствора не являются необходимыми. Кроме того, показана определяющая роль ко-шаперона GroES в самоорганизации шаперона GroEL при его малых (менее 0.2 мг/мл) концентрациях. При более высоких концентрациях GroEL влияние GroES менее выражено. На основании полученных результатов предложена модель самоорганизации in vitro молекулярного шаперона GroEL/ES от клубка до олигомера.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-00768-а), Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология») и Федерального агентства по науке и инновациям (№ 02.740.11.0295).

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИЙ

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ И СОПОЛИМЕРНЫХ ЗВЕЗД

Санкт-Петербургский государственный университет, Институт высокомолекулярных соединений РАН В последнее десятилетие сильно разветвленные полимерные системы привлекают к себе особое внимание в связи с возможностью их использования для направленного транспорта биологических и лекарственных молекул в клетке. Это инициирует дополнительный интерес к изучению свойств сильно разветвленных систем, к которым относятся микрогели, мицеллярные структуры и звездообразные полимеры, дендримеры и др.

Целью данной работы является теоретическое исследование полиэлектролитных и амфифильных сополимерных звезд. Для исследования структуры звезд использован численный метод Схойтенса-Флира для решения уравнений самосогласованного поля (метод SF - SCF).

Показано, что аналитическая теория хорошо согласуется с результатами численного моделирования при описании внутренней части полизлектролитных звезд. Описание распределения звеньев полимера на периферии звезды выходит за рамки существующих аналитических приближений, и соответсвующие результаты численного моделирования представляют особенный интерес. Проведен анализ конформаций звезд в зависимости от заряженности звеньев и концентрации соли в растворителе (воде).

Амфифильные полиэлектролитные звезды являются примером так называемых “умных полимеров”, поскольку они могут образовывать специфические молекулярные структуры в воде, которые изменяются при изменении внешних условий (ионной силы, pH). В данной работе исследованы звезды, у которых все лучи являются сополимерами одинакового состава: внутренний блок состоит из нейтральных гидрофобных звеньев, а внешний – из полиэлектролитных. В таких звездах гидрофобные блоки формируют плотное ядро, а гидрофильные – внешнюю рыхлую корону. Существенным фактором, влияющим на изменение конформации звезды в зависимости от внешних условий, является взаимодействие между ядром и короной. Гидрофобное ядро может сворачиваться и разворачиваться не только в результате изменения гидрофобных взаимодействий при изменении качества растворителя, но и под действием растягивающей силы со стороны короны, которая, в свою очередь, определяется преимущественно ионной силой растворителя. В работе методом самосогласованного поля исследовано изменение конформации сополимерной звезды в зависимости от ее структуры (количество лучей и их состав) и от внешних параметров (сродство растворителя, ионная сила). Показано, что при изменении параметров может происходить фазовый переход гидрофобного ядра из глобулярного в растянутое состояние. При этом наблюдается микрофазное разделение в ядре.

ПРЕНАТАЛЬНЫЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ

В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

Кащеева Т.К.1, Кречмар М.В.1, Николаева Ю.А.1, Вохмянина Н.В.2, Кузнецова Т.В.1, Романенко О.П.2, Баранов В.С. НИИАГ им. Д.О.Отта СЗО РАМН1, СПбГДЦ(МГ)2, [email protected] Главной задачей пренатальной диагностики является своевременное выявление врожденной и наследственной патологии с целью получения максимально точного прогноза для жизни и здоровья плода. Известно, что врожденная патология плода нередко возникает у женщин, не относящихся к группе высокого риска, в том числе и в молодых семьях, с неотягощенным акушерско-гинекологическим или генетическим анамнезом. Ведущую роль в отборе женщин групп высокого риска по врожденной и наследственной, прежде всего, хромосомной, патологии плода играют программы ультразвукового и биохимического скринингов. Беременные с высоким риском рождения ребенка с синдромом Дауна (СД) после консультации генетика направляются на инвазивную пренатальную диагностику с целью кариотипирования плода. Определение нормативных значений содержания сывороточных маркеров матери на разных сроках беременности для жительниц Петербурга и оценка значимости тех или иных факторов, влияющих на их уровень, в норме и при патологии плода были проведены в лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им.Д.О. Отта. Массовые исследования содержания альфа-фетопротеина (АФП) и хорионического гонадотропина (ХГ) в 15-18 недель беременности осуществляются в Санкт-Петербурге с 1997 года. На основе параметров полученных распределений уровня маркеров при нормальной беременности и при СД у плода разработаны автоматизированные программы расчета индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна с учетом возраста и анамнеза матери. За 2008- гг. во 2-м триместре уровень АФП и ХГЧ был исследован у 86572 женщин, что составило 82,5% от всех беременных города. Чувствительность скрининга составила 73% (высокий риск наблюдался в 45 из 62 случаев СД у плода) при 6,7% ложноположительных результатов, при этом выявлялся один случай СД у плода на инвазивных пренатальных диагностики. С 2003 года в НИИАГ им.Д.О. Отта осуществляется исследование уровня плазменного ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А) и свободной бета-субъединицы ХГ (своб. в-ХГ) в 9-13 недель беременности. Показано, что эффективность выявления СД с помощью комбинированного ультразвукового и биохимического скрининга (БС) в 9-13 недель существенно выше, чем БС в 15-18 недель. В 2008-2009 гг. в 9-13 недель беременности обследовано 12807 женщин, с учетом третьего маркера для расчета комбинированного риска - толщины воротникового пространства (ТВП) по данным УЗИ ложноположительные результаты составили 6,4%. Чувствительность составила 94% ( из 35 случаев) и был выявлен один случай СД у плода на 14 инвазивных пренатальных диагностик.

Однако переход на массовое обследование беременных в ранние сроки наталкивается на серьезные организационные трудности. Создание «клиник одного дня», оборудованных ультразвуковой аппаратурой экспертного класса и биохимическими анализаторами последнего поколения (определение содержания маркеров за 20 мин.), обеспечит своевременное выявление беременных высокого риска и возможность проведения инвазивной пренатальной диагностики еще в 1-м триместре беременности.

Для обеспечения координации действий все центры биохимического скрининга и аппараты экспертного УЗИ должны быть связаны с помощью Интернета в единую сеть городского пренатального скрининга.

КОМПЕНСАЦИЯ СТАБИЛИЗИРУЮЩИХ И

ДЕСТАБИЛИЗИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА ДНК, ВЫЗВАННЫХ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ ПЛАТИНЫ И ИХ

АНАЛОГАМИ

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Противоопухолевые соединения платины и их неактивные аналоги вызывают очень сильные нарушения двойной спирали ДНК. Эти нарушения (химические модификации) приводят к снижению температуры плавления (термической стабильности) в случае коротких олигонуклеотидных дуплексов, если модификации не приводят к межцепочечному сшиванию нитей (6-11оС, при относительной концентрации на нуклеотид rb=0.033; 8.4оС, rb=0.025). Если такое сшивание происходит (цисплатин, трансплатин), то температура плавления повышается. Однако мы показали, что структурные нарушения в области сшивки снижают термостабильность дуплекса длиной 15-20 пар оснований примерно на 10оС (rb=0.025-0.033 на нуклеотид).

Дестабилизация, наблюдаемая для олигонуклеотидных дуплексов, находится в противоречии с данными для длинных ДНК. При физиологической ионной силе цисплатин снижает температуру плавления на 4-5оС (rb=0.05 на нуклеотид), а трансплатин и Pt[(dien)Cl]Cl немного повышают. Можно было бы предположить, что происходит частичная (цисплатин) или полная (трансплатин и Pt[(dien)Cl]Cl) компенсация дестабилизации, вызванной структурными нарушениями. Компенсация может быть вызвана 1) стабилизацией, обусловленной снижением линейной плотности отрицательного заряда двойной спирали (более сильной для длинных ДНК);

2) межцепочечными сшивками, образованными цисплатином и трансплатином.

Мы провели теоретическое и экспериментальное исследование этих предположений.

Известно, что повышение концентрации ионов Na+ или снижение плотности отрицательного заряда в ДНК облегчает ее депротонирование в щелочной среде. В результате в щелочной среде положительные ионы не повышают, а снижают стабильность ДНК. Действительно, наши эксперименты показали, что в щелочной среде дестабилизирующее влияние цисплатина увеличивается с 4-5 до 11-14оС при rb=0.05, а в случае трансплатина и Pt[(dien)Cl]Cl небольшая стабилизация (~1oC) сменяется гораздо более сильной дестабилизацией (3-8оС). Таким образом, соединения платины существенно снижают плотность заряда ДНК.

Стабилизирующее влияние межцепочечных сшивок на температуру плавления длинных ДНК определялось путем математического моделирования. При этом локальная дестабилизация в точках сшивания оценивалась из калориметрических измерений, проведенных для сшитых дуплексов. Оказалось, что свободная энергия перехода спираль-клубок уменьшается на ~5-7 ккал на моль модификаций из-за структурных искажений в точках сшивания, что сильно снижает термическую стабильность.

Проведенные нами расчеты показали, что само сшивание увеличивает термостабильность примерно на такую же величину, что и вызванные ими структурные нарушения. В результате межцепочечные сшивки термической стабильности не изменяют.

Таким образом, слабое изменение термостабильности длинных ДНК соединениями платины является отражением почти полной компенсацией сильных стабилизирующих и дестабилизирующих эффектов.

PHOTOMECHANICAL CONTROL OVER POLYMERS: FROM

TOPOGRAPHY CHANGE OF THE THIN FILMS TO DNA

COMPACTION

University of Potsdam, Germany, [email protected] Photosensitive compounds have been attracting a lot of interest in the last decades.[1-2] Their unique responses to external illumination are a crucial factor towards many interesting applications such as constructing smart thin polymer films, that can reversible change their topography and surface energy on a nanometer scale. Moreover, complexes of photosensitive molecules with biological objects, for instance DNA macromolecule, might introduce a new way of controlling functional properties by light.

Here we discuss two projects in which photosensitive azo containing surfactants play a major role. First, we report on photosensitive polymer brushes and their application in nanomanipulation of the absorbed objects. Main effort is made on characterization and understanding of reversible manipulation of the polymer brush topography induced by irradiation with UV intensity nano-pattern.[3-8] In the second part of talk, we discuss how with the help of the same photosensitive cationic surfactant one can control DNA compaction / decompaction process by light.[9] 1. Seki, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2007, 80, 2084.

2. Natansohn, A.; Rochon, P. Chem. Rev. 2002, 102, 4139.

Schuh, C.; Santer, S.; Prucker, O.; Rьhe, J. Advanced Materials, 2009, 21, 4706.

Santer, S.; Kopyshev, A.; Donges, J.; Ruhe, J.; Jiang, X.; Zhao, B.; Muller, M. Langmuir, 2007, 23, 279.

Santer, S.; Kopyshev, A.; Donges, J.; Yang, H.-K.; Ruhe, J Advanced Materials, 2006, 18, Santer, S.; Kopyshev, A.; Yang, H.-K.; Ruhe, J. Macromolecules, 2006, 39, 3056.

Santer, S.; Kopyshev, A.; Donges, J.;Yang, H.-K.; Ruhe, J. Langmuir, 2006, 22, 4660.

Prokhorova, S.; Kopyshev, A.; Ramakrishnan, A.; Ruhe, J. Polymer brushes, edited by Advincula, R.C, Brittain, W.J., Ruhe, J., Caster, K., WILEY-VCH, 2004.

9. Zakrevskyy, Y.; Kopyshev, A.; Lomadze, N.; Morozova, E.; Lysyakova, L.; Kasyanenko, N.; Santer, S. “DNA compaction by azobenzene containing surfactant” submitted to J Phys.

НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА HMGB КАК

МОДУЛЯТОРЫ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА.

Санкт-Петербургский государственный университет, Физический E-mail: [email protected] Белки семейства HMGB1/2 являются одними из наиболее многочисленных негистоновых белков хроматина. По существующим на сегодняшний день представлениям белки HMGB семейства взаимодействуют преимущественно с участками ДНК, не входящими в состав нуклеосом, в том числе с линкерными участками ДНК.

Однако не секрет, что в силу своей доступности, открытые участки ДНК являются мишенями и для множества других белков. Наиболее распространенным среди них является гистон H1, связывающийся с линкерными участками ДНК на входе/выходе из нуклеосомной частицы. Содержание гистона H1 в хроматине в несколько раз превышает количество белка HMGB1, а потому встаёт вопрос об их взаимном влиянии на связывание с ДНК. Вполне естественно ожидать, что одновременное присутствие этих двух белков изменит ход комплексообразования.

Одной из важных особенностей взаимодействия HMGB1 и H1 с ДНК является изгиб молекулы ДНК в месте связывания белков в сторону большой бороздки. Само связывание белков при этом происходит по разным бороздкам двойной спирали: HMGB взаимодействует по малой, тогда как гистон Н1 – по большой. Опираясь на данные многочисленных исследований взаимодействия белков H1 и HMGB1 с ДНК, наряду с гипотезами о конкурентной природе их связывания, появились гипотезы и о совместном действии обоих белков на ДНК. Не так давно было высказано предположение о возможности одновременного совместного формирования единого комплекса с ДНК. В частности, было показано, что существенную роль при образовании тройного комплекса играют белок-белковые взаимодействия между молекулами Н1 и HMGB1.

Нами было продемонстрировано, что взаимодействие белков HMGB1 и Н1 с ДНК может быть разделено на несколько этапов, в зависимости от соотношения белок/ДНК в пробе. Было также установлено, что при достижении некоторого порогового соотношения белок/ДНК в пробе связывание обоих белков с ДНК носит ярко выраженный кооперативный характер. Было показано, что активность взаимодействия HMGB1 с ДНК, в особенности на кооперативной стадии, модулируется заряженным Сконцевым доменом белка. На основании различных экспериментов была получена оценка для размера участка связывания белка HMGB1 на ДНК, который по данным разных авторов составил 12-15 п.о. в расчёте на каждый HMGB-домен белка, участвующий в связывании.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 09-08-01119, 10-04и Правительства Санкт-Петербурга. Часть работ проводилась в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009- годы.

РОЛЬ ЛИНКЕРНЫХ ГИСТОНОВ СЕМЕЙСТВА Н1 В СТРУКТУРНОЙ

ОРГАНИЗАЦИИ СУПЕРКОМПАКТНОГО ХРОМАТИНА

Е. Чихиржина1, Т. Старкова1,2, А. Поляничко1,2, Е. Костылева1, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Санкт-Петербургского государственного университета За компактизацию ДНК, а следовательно и за поддержание высших уровней структурной организации хроматина отвечает гистон Н1, связанный с линкерным участком. Удобной моделью для изучения компактизации ДНК являются клетки спермиев, поскольку ДНК в ядре этих клеток упакована очень плотно. По всей видимости, степень упаковки ДНК зависит от белкового окружения. В процессе сперматогенеза клетки претерпевают различные физические и биохимические изменения.

Наиболее интересной является замена гистона Н1 на спермий-специфические варианты (например, в хроматине морских беспозвоночных), так как в этом случае полностью сохраняется нуклеосомная организация хроматина. Такие белки отличаются от соматического более длинной полипептидной цепью и повышенным содержанием аргинина, который прочно связывается с ДНК за счет возникновения водородных связей.

Вероятно, именно эти особенности полипептидной цепи сперминных гистонов лежат в основе структурной организации хроматина спермиев. В работе методами кругового дихроизма и спектрофотометрического плавления исследована структура комплексов ДНК со спермий-специфическими гистонами семейства Н1, полученными из хроматина спермиев морской звезды, морского ежа и двустворчатого моллюска и тимуса теленка,.

Гистоны, выделенные из спермиев морского ежа и морской звезды характеризуются наличием дополнительных –спиральных участков в С-концевом домене и с ДНК связываются кооперативно. Гистон Н1 спермиев моллюска, обладая наибольшей способностью образовывать левоспиральные структуры и наименьшей - -спиральные участки, при взаимодействии с ДНК формирует комплексы, не образующие высокоупорядоченные специфические структуры. Возможно, для появления последних существенным является взаимодействие гидрофобных кластеров на поверхности спиральных участков, способствующих регулярной ассоциации комплексов. В гистонах Н1 хроматина спермиев иглокожих таких структур больше, чем в других гистонах, и это может объяснить более выраженную способность их комплексов с ДНК формировать компактные структуры. Спектрофотометрическое плавление свободной ДНК и ДНК в составе комплекса позволило оценить способность белков стабилизировать структуру ДНК и рассчитать изменение энтальпии ДНК при связывании с гистонами семейства Н1.

Дифференциальные кривые плавления имеют два температурных перехода, соответствующие плавлению свободной ДНК и ДНК, связанной с белками. Было показано, что наиболее основной, а следовательно, и более заряженный гистон Н спермиев моллюска стабилизирует ДНК в большей степени, а ДНК связанная с наименее заряженным соматическим гистоном плавится при более низкой температуре.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№№ 10-04-00092, 09-08Комитета по науке и высшей школе Администрации г. Санкт-Петербурга.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ШУНГИТОВОГО УГЛЕРОДА С

БЕЛКАМИ И МЕМБРАНАМИ КЛЕТОК КРОВИ

Рожков С.П., Горюнов А.С., Борисова А.Г., Суханова Г.А., Учреждение Российской академии наук Институт биологии Карельского Учреждение Российской академии наук Институт геологии Карельского Впервые получены устойчивые водные дисперсии шунгитового углерода, физикохимические и структурные свойства которых сравнимы со свойствами дисперсии фуллеренов С60 и наноалмаза. Это проявляется также в подобии их биологических эффектов в модельных системах, в качестве которых использовались растворы гемоглобина и сывороточного альбумина, а также суспензии цельных эритроцитов и мембран теней эритроцитов. Для оценки эффектов и механизмов влияния наночастиц на модельные системы применялись методы ЭПР спиновых меток и зондов, дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, динамического светорассеяния, электронной микроскопии, гель-хроматографии.

Исследован механизм устойчивости дисперсий шунгитового углерода к процессам агрегации. Взаимодействие шунгитового углерода с водой и макромолекулами определяется свойствами и осуществляется посредством поверхностных непланарных графеновых структур, которые имеют значительный для такого взаимодействия дипольный момент. Это обусловливает существенную гидрофильность поверхности наночастиц.

На модельных клеточных системах эритроцитов обнаружены эффекты, универсальные для всех наночастиц углерода:

- усиление взаимодействия белков актин-спектринового комплекса и стабилизации их по отношению к действию температуры;

- снижении устойчивости эритроцитов к гемолизу и склонность к агрегации;

- каталитическое влияние наночастиц углерода на свободнорадикальные реакции, запускаемые двухвалентным железом, как в дисперсиях наночастиц углерода, так и в клеточных суспензиях.

Обнаружено, что наночастицы способны образовывать устойчивые динамические комплексы с белками, в результате чего формируется белковая корона и создается локальное увеличение концентрации белка в окружении наночастиц, причем в первом адсорбционном слое наблюдается изменение конформации белков в сторону более развернутого состояния. При этом могут инициироваться процессы белок-белкового взаимодействия, имеющие физиологическое значение.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ

РАЗНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ НА РЕГУЛЯЦИЮ УРОВНЯ КАЛЬЦИЯ

В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ

Белостоцкая Г.Б.1,3, Елдашев И.С.1, Сурма С.В.2, Щеголев Б.Ф.2, Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 2Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, 3Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова, [email protected] На культивируемых скелетных мышечных клетках (сателлитная культура) новорожденной крысы было показано, что слабое (60-200 мкТл) постоянное магнитное поле (ПМП) ускоряет пролиферацию и дифференцировку миобластов и вызывает образование гипертрофированных миотрубок с большим числом ядер на сутки раньше, чем в контроле. В противоположность этому экранирование геомагнитного поля (ГМП, 48-50 мкТл), снижающее магнитное воздействие до 0,3 мкТл, вызывает подавление всех стадий развития мышечных клеток в культуре. Также было установлено, что ПМП, превышающее геомагнитный фон всего в 3-4 раза, индуцирует в сформированных миотрубках достоверное 3-3,5-кратное увеличение концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i). Эксперименты в бескальциевой среде (ЭГТА, 1 мМ) и с блокаторами дигидропиридиновых (ДГПР, нифедипин, 20-50 мкМ) и рианодиновых (РиР, дантролен, 30-90 мкМ) рецепторов позволили установить, что нарастание [Ca2+]i под воздействием ПМП происходит не за счет входа Ca2+ извне через L-каналы (ДГПР), а благодаря высвобождению Ca2+ из саркоплазматического ретикулума (СР) через РиР. Влияние МП на работу рецепторов наружной мембраны и СР оценивали по амплитуде и скорости Са2+ ответов на действие ацетилхолина (АцХ), KCl и активатора РиР - 4-хлор-м-крезола (4ХмК). При кратковременном воздействии усиленного МП (200-400 мкТл) активность АцХ-рецепторов (АцХР) и РиР снижается, а при длительном – восстанавливается (Рис.).

Скорость нарастания [Ca2+]i в ответ на подачу KCl, напротив, со временем снижается, что может свидетельствовать о нарушении взаимодействия между ДГПР и РиР.

Продолжительное экранирование ГМП ускоряет нарастание [Ca2+]i, вызванное активацией АцХР и РиР. Эти эффекты могут быть обусловлены концентрацией Ca2+ в СР.

Поскольку ПМП индуцирует нарастание [Ca2+]i, опустошая при этом цистерны СР, то при дополнительном открытии РиР с помощью 4-ХмК наблюдается снижение скорости высвобождения Ca2+, а при активации РиР (4-ХмК, 0,5 мМ) в ослабленном ГМП происходит более стремительный выход Ca2+ из наполненного СР.

Скорость нарастания [Ca2+]i, нМ/с

СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ОЧИСТКИ ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК

КОРНЕЙ КУКУРУЗЫ

Санкт-Петербургский университет, биолого-почвенный факультет, e-mail:

Клетки всех живых организмов отделены от внешней среды цитоплазматической мембраной (плазмалеммой), в которой локализованы транспортные механизмы, ответственные за поступление минеральных веществ и воды. Для анализа работы этих механизмов необходимо получать препараты плазмалеммы в «чистом» виде. Получение мембранной фракции, обогащенной фрагментами плазмалеммы, осуществляется с помощью дифференциального центрифугирования и разных способов очистки. При очистке в градиенте плотности сахарозы образуются везикулы плазмалеммы, обладающие разной ориентацией, которую невозможно строго контролировать в ходе получения. В конце прошлого века фракцию мембран, обогащенную фрагментами плазмалеммы, стали получать с помощью очистки в двухфазной полимерной системе.

Этот метод дает возможность получать фракцию плазмалеммы с преимущественно нормальной ориентацией везикул. Однако детального сопоставления двух методов очистки плазмалеммы не проводилось.

Задачей данного исследования являлось оценить влияние способа очистки везикул плазмалеммы на их замкнутость, транспортную и гидролитическую активность H+АТФазы – одного из ключевых транспортных ферментов плазмалеммы.

Объектом исследования служили везикулы плазмалеммы из клеток корней 4-дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L.) гибрида F1 Нарт 150.

Очистку везикул плазмалеммы проводили с помощью ступенчатого градиента плотности сахарозы (1.13/1.17) или двухфазной системе (декстран/ПЭГ). Загрузку везикул ионами калия осуществляли с помощью осмотического шока. Пассивный транспорт ионов и генерацию мембранного потенциала у везикул оценивали спектрофлуориметрически с помощью потенциал-чувствительного зонда diS-C3-(5) (возб.-570 и фл.-668 нм).

Ориентацию везикул определяли по АТФ-гидролитической функции Н+-АТФазы с использованием каналогенного препарата аламетицина и детергента brij-58.

В опытах с зондом установлено, что везикулы плазмалеммы, очищенные как с помощью двухфазной системой, так и в градиенте плотности сахарозы были замкнуты и обладали слабой пассивной проницаемостью для ионов K+ и Na+. Пассивный транспорт ионов в данных условиях не зависел от ориентации мембран везикул. Предобработка аламетицином и brij-58 везикул существенно не изменяла пассивную проницаемость для ионов K+ и Na+. Везикулы не реагировали на повышение концентрации аламетицина и brij-58, соответственно, но давали ответ на введение в систему другого реагента.

Отмечено некоторое влияние brij-58 на зонд.

Гидролиз АТФ Н+-АТФазой в присутствии каналогенного препарата аламетицина и детергента brij-58 усиливался, что было связано с доступностью АТФ-гидролизующих центров фермента, расположенных на внутренней поверхности мембраны везикул для АТФ. brij-58 вызывал также некоторое усиление неспецифической гидролазной активности. При очистке в двухфазной системе наблюдалось увеличение везикул, имеющих нормальную ориентацию. Этот метод также значительно сокращал время подготовки препаратов мембран.

Работа поддержана грантами РФФИ № 05-04-49619 и 08-04-00566.

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ ЗЕЛЕНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО

БЕЛКА, SFGFP, ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГУАНИДИНТИОЦИАНАТА

Степаненко Олеся В., Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Институт цитологии РАН, [email protected] Флуоресцентные белки (FPs) и их улучшенные мутантные формы с чрезвычайно разнообразными спектральными свойствами нашли широкое применение в клеточной биологии в качестве биологических маркеров. Уникальной особенностью всех FPs является их способность формировать хромофор из собственных аминокислот в положении 65-67 без участия каких-либо кофакторов или ферментов. Жесткая структура -бочонка, окружающего хромофор, выполняет многочисленные функции.

Формирование нативной пространственной структуры вокруг хромофор-образующих аминокислот обеспечивает правильную ориентацию остатков, катализирующих и направляющих синтез хромофора. Огромное разнообразие спектральных свойств FPs определяется не только химическим различием структур хромофора, но и его взаимодействием с аминокислотами микроокружения. Структура -бочонка защищает хромофор от воздействия среды и ограничивает подвижность хромофора, предотвращая его безызлучательную дезактивацию. Изучение процессов фолдинга и структурной динамики FPs представляет большой интерес.

Следует заметить, что исследование сворачивания–разворачивания большинства FPs осложняются необратимостью процессов денатурации из-за агрегации белка. Белок sfGFP (super folder GFP) не агрегирует при денатурации и способен к рефолдингу.

Изучение процессов разворачивания–сворачивания sfGFP под действием химического денатуранта было выполнено с использованием ряда физико-химических методов:

абсорбционной спектроскопии, собственной флуоресценции и флуоресценции зеленого хромофора, кругового дихроизма в ближней УФ-области и видимой области спектра и гель-хроматографии. В качестве денатурирующего агента был выбран гуанидинтиоцианат (GTC) вместо широко используемого гуанидингидрохлорида (GdnHCl). Было показано, что квазиравновесие устанавливается при инкубации белка в растворах GTC в течение 24 часов, в растворах GdnHCl для этого требуется несколько дней. Разрушение нативной структуры белка происходит в области концентраций GTC от 0.5 до 2.5 М и сопровождается синхронным изменением всех регистрируемых характеристик sfGFP. В области небольших концентраций GTC (менее 0.1–0.2 М) мы наблюдали несколько эффектов. Существенное уменьшение интенсивности флуоресценции хромофора и триптофанового остатка sfGFP при переводе в раствор с небольшой концентрацией GTC не сопровождалось заметным изменением пространственной структуры белка, о чем свидетельствует измерение параметра А (I320/I365) и анизотропии флуоресценции. Согласно данным гельфильтрации, в этой подобласти концентраций GTC происходит незначительное увеличение гидродинамических размеров sfGFP. Также заметно изменяется полоса поглощения sfGFP в видимой области спектра: существенно падает интенсивность поглощения анионной формы хромофора, и одновременно возрастает интенсивность поглощения нейтральной формы хромофора.

Эти данные свидетельствуют о сдвиге равновесия между молекулами белка, содержащими хромофор в нейтральной и анионной формах. Мы полагаем, что данные изменения могут быть вызваны локальными изменениями структуры sfGFP.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (контракты 02.740.11.5141 и P1198) и гранта президента РФ (MKD-ГАЛАКТОЗА/D-ГЛЮКОЗА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК – КАК

ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМОЙ

БИОСЕНСОРНОЙ СИСТЕМЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА С

ГЛЮКОЗОЙ

Степаненко Ольга В., Степаненко Олеся В., Фонин А.В., Верхуша В.В., Институт цитологии РАН, [email protected] Конструирование биосенсорных систем для непрерывного определения уровня глюкозы в крови людей имеет высокое значение для пациентов, больных диабетом.

Перспективным белком на роль чувствительного элемента такой биосенсорной системы является D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из E.coli, поскольку при его взаимодействии с D-глюкозой наблюдаются значительные перестройки третичной структуры белка. Константа диссоциации комплекса GGBP с сахаром очень низка (1мкМ). Поскольку концентрация сахара в крови здоровых людей составляет 3-8мМ, GGBP дикого типа не может использоваться для определения концентрации глюкозы в крови человека. Для этих целей необходимо создавать мутантные формы GGBP с повышенной константой диссоциации комплекса белок – глюкоза. Свойства GGBP дикого типа позволяют использовать его в биосенсорной системе на глюкозу в сочетании с трансдермальными методами экстракции сахара из крови или межклеточных и иных жидкостей, сопряженными с существенным разбавлением глюкозы. Необходимое качество биосенсора непрерывного действия заключается в устойчивости его чувствительного элемента к различным воздействиям. При исследовании стабильности GGBP к действию гуанидингидрохлорида (GdnHCl) было выявлено существенное влияние вязкости на процессы взаимодействия белка с глюкозой. Разворачивание GGBP под действием GdnHCl в присутствии глюкозы обратимо. Равновесные зависимости разворачивания – сворачивания комплекса GGBP с глюкозой (GGBP/Glc) были зарегистрированы только после инкубации GGBP/Glc в присутствии GdnHCl в течение дней. Низкая скорость достижения равновесия между нативным комплексом GGBP/Glc и белком в развернутом состоянии связана с тем, что присутствие в растворе GdnHCl приводит к увеличению его вязкости. Подобный эффект не наблюдался при тепловой денатурации GGBP/Glc. Таким образом, лимитирующей стадией процесса разворачивания-сворачивания комплекса GGBP/Glc является разрушение/возникновение конфигурационного соответствия между белком в нативном состоянии и молекулой глюкозы. Скорость этих процессов изменяется с увеличением/уменьшением концентрации денатуранта. Эксперименты по изучению взаимодействия GGBP c глюкозой подтвердили эти предположения. Отщепление иона кальция – второго лиганда GGBP – незначительно влияет на стабильность комплекса GGBP/Glc, однако существенно дестабилизирует GGBP в отсутствие глюкозы. Разворачивание комплекса GGBP-Ca/Glc также обратимо. Эксперименты по тепловой денатурации GGBP позволили показать, что необратимость разворачивания GGBP в присутствии и отсутствие лигандов вызвана агрегацией молекул белка при его инкубации в развернутом состоянии при высокой температуре. Степень агрегации молекул белка зависит от концентрации белка, температуры и длительности инкубации. Полученные данные необходимо учитывать при конструировании биосенсорной системы на глюкозу с GGBP в качестве чувствительного элемента.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (02.740.11.5141 и 16.512.11.2114), гранта президента РФ (MK-1181.2010.4).

ВЛИЯНИЕ ВОДЫ НА ПРОЯВЛЕНИЕ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МОЛЕКУЛЕ NADH

Волгоградский государственный университет, [email protected] Роль воды в клетках определяется ее химическими и структурными свойствами.

Эти свойства связаны с малыми размерами молекул, их полярностью и способностью соединяться друг с другом водородными связями. Из-за симметричного распределения зарядов молекула воды действует как диполь. Дипольный момент обусловливает способность воды активно вступать во взаимодействие с различными веществами. Таким образом, при исследовании органических молекул, участвующих в биопроцессах, одним из основных является вопрос о факторах, определяющих вид электронных спектров поглощения в таком полярном растворителе как вода.

Для расчета спектроскопических характеристик сольватированного кофермента восстановленного никотинамидаданиндинуклеотида были использованы полуэмпирические [1] версии метода самосогласованного поля (Хартри-Фока) в приближении частичного пренебрежения дифференциальным перекрыванием.

Предварительно проводилась оптимизация геометрии модельной химической системы, т.е. минимизация ее энергии за счет изменения пространственного расположения атомов друг относительно друга, что позволило найти ближайший локальный минимум на поверхности потенциальной энергии системы.

Неэмпирический (ab initio) метод был использован для расчета линий поглощения электронного спектра изолированной молекулы NADH и тестирования по этим данным результатов полуэмпирического расчета энергии первого синглетного перехода. После того, как было установлено их приемлемое согласие, полуэмпирический метод применялся для расчета энергий переходов молекулы из основного в первое возбужденное электронное состояние в водном растворе с различной концентрацией. Для этого моделировались непрерывные с постоянной плотностью макроскопические условия. Изменения в геометрии сольватированных молекул отражали различия между изолированными и находящимися в растворе оптимизированными структурами. Для учета электронной корреляции был использован метод конфигурационного взаимодействия.

Выделение в структуре крупной молекулярной системы минимальных структурных единиц, сохраняющих в известной степени свойства исходной системы, является общепринятым приемом [2, 3]. В данном подходе макросистема представляется в виде совокупности локальных фрагментов, для каждого из которых решение электронной задачи может быть получено стандартными методами. Поведение концентрационной зависимости энергии перехода единой системы локальных фрагментов молекулы NADH, аденина и никотинамида, из основного в первое возбужденное электронное состояние объяснено в рамках внутримолекулярного взаимодействия исследуемого кофермента по типу переноса энергии электронного возбуждения.

1. Л.А. Грибов, В.И. Баранов, Б.К. Новосадов, Методы расчёта электронноколебательных спектров многоатомных молекул, Наука, Москва (1984), 325 с.

2. А.В. Немухин, И.М. Колесников, В.А. Винокуров, Строение комплекса алюмофенилсилоксана и его фрагментов по данным полуэмпирических и неэмпирических расчетов, Журнал структурной химии (1995), 36, № 3, С. 410417.

3. Х.Ш. Абдулов, Расчет интенсивностей полос ИК-спектров ориентированных полимеров, Журнал прикладной спектроскопии (2004), 71, № 4, С. 451455.

ТВЕРДОТЕЛЬНАЯ 2Н ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ ДЕТЕКТИРУЕТ

СВЕТОИНДУЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ И

ДИНАМИКЕ РЕТИНАЛЯ В ПРОЦЕССЕ АКТИВАЦИИ РОДОПСИНА

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия, кафедра медицинской физики, [email protected], Университет Аризоны, химический факультет, [email protected] ЯМР спектроскопия на дейтерии с использованием селективного дейтерирования является важным инструментом для исследования локальной структуры и динамики биомолекул, в частности мембран и мембранных белков. В данной работе показано как твердотельная 2Н ЯМР спектроскопия позволяет получать информацию связанную с механизмом активации рецепторов, сопряженных с G белком. Было проведено селективное дейтерирование метильных групп ретиналя (атомы углерода С18, С19, С20) и исследованы 2Н ЯМР спектры и релаксация в темновом состоянии родопсина, а также метародопсине I и метародопсине II. Измерения проводили при температурах ниже температуры фазового перехода липидов из жидко-кристаллического состояния в гель, при которых вращательная диффузия молекул родопсина заморожена, позволяя выявить внутреннюю динамику лиганда ретиналя.

Анализ угловых зависимостей формы линий 2Н ЯМР селективно дейтерированных метильных групп для родопсина в ориентированных мембранах позволил определить равновесные конформации лиганда в связывающем кармане родопсина. Времена зеемановской и квадрупольного порядка релаксации (T1Z и T1Q) для метильных групп были интерпретированы в терминах случайных скачков вокруг оси вращения третьего порядка или анизотропной вращательной диффузии. Температурные зависимости T1Z и T1Q позволили рассчитать энергии активации (Ea) или потенциальные барьеры, а также предэкспоненциальные множители для вращательной диффузии метильных групп.

Сравнительно низкие энергии активации для метильных групп С19 и С20 в темновом состоянии и при переходе в предактивное состояние мета I и активное мета II свидетельствуют об отсутствии стерических столкновений данных групп с боковыми цепями аминокислот в связывающем кармане. Напротив высокая энергия активации группы С18 указывает на то, что подвижность этой метильной группы ограничена за счет взаимодействия с Glu122 на третьей спирали и атомом водорода Н8 ретиналя. Результаты ЯМР релаксации предполагают, что -ионное кольцо остается в гидрофобном кармане при активации родопсина. Времена зеемановской релаксации позволяют определить динамические параметры, но не выявляют анизотропию вращательной подвижности метильных групп, в то же время одновременная подгонка температурных зависимостей T1Z и T1Q указывает, что вращение метильных групп вокруг оси симметрии происходит значительно быстрее, чем переориентация оси. Таким образом взятые вместе данные T1Z и T1Q предоставляют новый способ исследования молекулярного движения и взаимодействий в мембранных белках.

На основе полученных 2Н ЯМР данных по структуре и динамике ретиналя предложен механизм активации родопсина, в котором энергия поглощенного фотона используется для преодоления потенциальных барьеров при изменении конформации протеина.

Выявлена роль метильных групп в процессе активации белка. Показано, что изменения в структуре и динамике ретиналя инициируют флуктуации трансмембранных спиралей 5 и 6 в мета I – мета II динамическом равновесии родопсина.

КОНЦЕНТРАЦИОННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ЭФФЕКТА ФОРМЫ ДЛЯ

ПОЛИМЕРНЫХ РАСТВОРОВ

Физический факультет Санкт-Петербургского государственного 198504, Санкт-Петербург, Петродворец, Ульяновская ул., Одним из чувствительных методов исследования структуры макромолекул является динамическое двойное лучепреломление в потоке полимерных растворов (ДЛП) [1]. Для определения анизотропии сегмента полимера обычно используется оптический коэффициент сдвига [n]/[], т.е. отношение величин динамооптической постоянной и характеристической вязкости. Если показатели преломления полимера и растворителя совпадают, это отношение пропорционально величине анизотропии сегмента полимерной молекулы. Однако, в случаях, когда показатели преломления полимера и растворителя не совпадают, интерпретация экспериментальных данных осложняется так называемым эффектом формы [1]. В общем случае наблюдается концентрационная зависимость величины [n]/[], и эта зависимость определяется дополнительными вкладами эффектов макроформы и микроформы. Что касается эффекта макроформы, то он определяется дополнительной положительной величиной поляризуемости макромолекулы вследствие различия в значениях среднего показателя преломления набухшего молекулярного клубка и окружающей среды. При концентрациях, когда клубки заполняют весь объем и раствор предполагается однородным, эффект формы клубка должен полностью исчезать, чего не наблюдается на практике. Считается [1, 2], что это может быть связано с неравномерным распределением массы внутри клубка, которое предлагалось учитывать эмпирическим путем.

В данной работе в предположении линейного изменения плотности клубка по объему и, используя формулы Максвелла для поляризуемости эллипсоида, показывается, что анизотропия формы должна вести себя как убывающая функция порядка ~1/C. На примере ряда литературных данных, полученных для растворов гибкоцепных полимеров, показывается, что данный вид зависимости хорошо описывает наблюдаемые концентрационные эффекты формы.

1. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С.Я. Структура макромолекул в растворах. М.:

Наука, 1964.

2. E.V. Frisman and V.N. Tsvetkov, J.Polymer Science, 30 (1958), pp. 297-314.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИЛИЗИНОВ ДЕНДРИТНОЙ

АРХИТЕКТУРЫ

1Евлампиева Н.П., 2Добродумов А. В., 2Окатова О.В., 3Cottet H.

1Научно-исследовательский институт физики Санкт-Петербургского государственного 2Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия 3 Max Mousseron Institute of Biomolecules, Montpellier University, Montpellier, France Дендримерная или дендримероподобная архитектура полимерных молекул имеет целый ряд преимуществ в сравнении с полимерами традиционной линейной структуры, поскольку позволяет в значительно бульшей степени контролировать топологию, объем, форму, гидродинамические размеры и поверхностные свойства макромолекул. В последние годы число полимеров, молекулы которых обладают дендритной архитектурой, постоянно росло как за счет синтеза дендримеров новой химической структуры, так и за счет создания дендритных аналогов известных полимеров цепного строения. Актуальность подобных преобразований во многом связана с запросами современных нано- и биотехнологий, требующих полного контроля молекулярных свойств на уровне отдельных молекул. Сама стратегия синтеза позволяет задавать необходимую топологию и получать дедритные макромолекулы необходимой массы и формы, что практически невозможно контролировать для статистически свернутых цепей линейной архитектуры. Отмеченные тенденции проявились и в области синтеза биомолекул, в частности, в модификации синтетических полиаминокислот и

NH NH NH

O HO HO HO

HN CH C CH N C CH N C CH NC

NH 2 C C N C CH N C CH N C C OH

O HO HO HO

рис.) является наличие неточечного центра ветвления, поэтому авторы методики синтеза классифицировали их как дендриграфы поли-L-лизина [1]. Образцы четырех последовательных генераций ДПЛ были исследованы в водных буферных системах и апротонном растворителе — диметилформамиде, методами вискозиметрии, поступательной изотермической диффузии, Тейлоровской дисперсии и 1H ЯМР. Были получены скейлинговые соотношения для характеристической вязкости, коэффициентов поступательной диффузии и гидродинамических размеров молекул в разных растворителях. Проведено сопоставление гидродинамических свойств дендримеров и дендриграфов сходной химической структуры и показано, что они существенно отличаются.

[1] H. Cottet et al. // Biomacromolecules. 2007. V.8. P. 3235-3243.

ИЗУЧЕНИЕ РАДИАЦИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

СПЕКТРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ

Санкт-Петербургский государственный университет, Физический факультет, кафедра Молекулярной биофизики; [email protected] Известно, что под действием ионизирующей радиации в молекуле ДНК происходит разрушение, модификация и отщепление азотистых оснований (а.о.), а также локальное разрушение водородных связей (частичная денатурация) как в местах образования указанных повреждений, так и на других участках макромолекулы [1]. Эти факторы оказывают противоположное влияние на спектр поглощения облученной ДНК (частичная денатурация вызывает гиперхромный эффект, а разрушение а.о. приводит к уменьшению поглощения), и в то же время одинаковое влияние на спектр КД ДНК – снижение интенсивности [2].

В работе были проведены исследования спектральных параметров молекулы ДНК, гамма-облучённой дозами D=0–1000 Гр, в растворах ионной силы µ=0.003 М, 0.005 М, 0.15 М, 1 М 3 М NaCl, 3 М MgCl2, а также в растворе, содержащем 0.003 М NaCl и 0. М MgCl2 (т.е. с суммарной µ=0.005 М). Ранее было показано, что при D30 Гр и µ0.15 М NaCl наблюдается значительное снижение удельного объема ДНК в растворе [3], однако, это не сопровождается заметными изменениями в спектрах поглощения и КД ДНК.

Большие дозы облучения (D>30 Гр) вызывают изменение формы спектров поглощения ДНК: снижение интенсивности в максимуме (=260 нм), увеличение интенсивности в минимуме (=230 нм), небольшой сдвиг спектра в длинноволновую область, а также незначительное увеличение поглощения растворов вне полосы поглощения ДНК (=300 нм) с ростом дозы облучения. С увеличением концентрации электролита в облучаемом растворе указанные изменения становятся менее заметны. Чтобы разделить вклад в спектры поглощения облучённой ДНК разрушения а.о. и нарушений вторичной структуры, был проведён гидролиз облучённых растворов ДНК, как описано в [4].

Интенсивность поглощения гидролизованных растворов на всех длинах волн монотонно снижается с ростом дозы облучения. По-видимому, так как после гидролиза вторичная структура ДНК оказывается полностью разрушенной, интенсивность поглощения гидролизованной ДНК определяется только количеством хромофоров – а.о., и в спектрах поглощения наблюдается индуцированное радиацией снижение количества а.о. Далее, пренебрегая вкладом в поглощение гидролизованной ДНК модифицированных а.о.

(учесть который не представлялось возможным), мы определили концентрацию хромофоров в облучённых растворах по методу Спирина [4]. Обнаружено, что количество разрушенных а.о. и нарушения вторичной структуры снижаются с ростом ионной силы облучаемого раствора.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 09-08-01119-а).

1. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения), Москва, Физматлит, 2004.

2. Ramm E. I., Vorob'ev V. I., Birshtein T. M., Bolotina I. A., Volkenshtein M. V. Eur. J.

Biochem. 1972, 25, 245-253.

3. Frisman E. V., Zarubina 0. P. Biophys. Chem., 1993, 46, 37–46.

4. Спирин А.С. Биохимия, 1958, 23(5), 656–662.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК С КООРДИНАЦИОННЫМИ

СОЕДИНЕНИЯМИ ПЛАТИНЫ (II) РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ И

СОСТАВА

Богданов А.А., 1Юнг Т.А., 2Серебрянская Т.В., 3Яковлев К.И., Санкт-Петербургский государственный университет, физический факультет, кафедра молекулярной биофизики, 2НИИ физико-химических проблем Белорусского государственного университета, 3СанктПетербургская химико-фармацевтическая академия, [email protected] Механизм действия многих лекарственных препаратов обусловлен их взаимодействием с молекулой ДНК в клетке. К таким препаратам относятся и некоторые координационные соединения платины, применяемые в медицине. Поиск новых противоопухолевых агентов среди координационных соединений платины и платиновых металлов является одной из приоритетных задач. Для изучения свойств новых препаратов данного класса и их взаимодействия с молекулой ДНК удобно использовать модельные системы, представляющие собой водно-солевые растворы. На основании конформационных изменений макромолекулы при ее взаимодействии с новыми соединениями, а также сравнивая эти данные с полученными ранее для известных противоопухолевых препаратов, можно делать выводы о характере связывания новых соединений и, предположительно, об их потенциальной противоопухолевой (цитостатической) активности.

В работе изучены структурные изменения молекулы ДНК в комплексе с обладающим высокой противоопухолевой активностью соединением цисдихлордиамминплатина (II) (цис-ДДП) и его неактивным транс-аналогом. Показано, что образование бидентатной связи цис-ДДП с ДНК провоцирует появление изгибов двойной спирали. Связывание ДНК с транс-ДДП может сопровождаться появлением сшивок между отдаленными участками цепи. Исследовано взаимодействие ДНК с соединением цис-[Pt(ФАТ)2Cl2]·H2O (ФАТ – 5-амино-1-фенилтетразол). Показано, что соединение цисPt(1-ФАТ)2Cl2]·Н2О взаимодействует с молекулой ДНК в растворе с образованием координационной связи, по позиции N7 гуанина. Образовавшийся комплекс является бидентатным. Взаимодействие цис-[Pt(1-ФАТ)2Cl2]·Н2О с ДНК вызывает изменение конформационных параметров макромолекулы схожие с теми, что происходят при взаимодействии с ДНК препарата цисДДП в аналогичных условиях эксперимента.

Исследовано взаимодействие ДНК с соединением цисдикарбоксипиразиндиамминплатина(II). Показано, что данное соединение взаимодействует с макромолекулой в условиях отсутствия ионов хлора в растворе, препятствующих, по-видимому, прохождению реакции акватации. Данное соединение образует координационную связь по позиции N7 гуанина и связывается, с большой степенью вероятности, монодентатно. В работе проведено сравнение данных о взаимодействии с молекулой ДНК как новых, так и ранее исследованных координационных соединений платины.

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ ДНК В

РАСТВОРЕ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПРИСУТСТВИЕМ

ПОЛИКАТИОНОВ И МНОГОЗАРЯДНЫХ ИОНОВ

Физический факультет Санкт-Петербургского государственного В водном растворе отрицательно заряженная высокомолекулярная ДНК принимает конформацию сильно набухшего статистического клубка, размер которого зависит от присутствия катионов. Процесс конденсации ДНК in vitro (образование однородных компактных упорядоченных наноструктур под действием полиэтиленгликоля, многозарядных ионов, поликатионов и др.) является предметом исследования на протяжении многих лет, так как он в какой-то мере моделирует процесс упаковки ДНК в хроматине и головках бактериофагов. В последнее время интерес к изучению конденсации ДНК возрос из-за появления новых задач (создание эффективных генных векторов на основе интерполиэлектролитных комплексов, создание наноструктур различной конфигурации и др,).

В работе проведено сравнение конформационных изменений молекулы ДНК в растворе, вызванных ее взаимодействием с поликатионами различной длины и трехвалентными ионами металлов. Методами кругового дихроизма, ультрафиолетовой спектрофотометрии, динамического светорассеяния, вискозиметрии, динамического двулучепреломления и атомно-силовой микроскопии изучены изменения вторичной и третичной структуры ДНК в растворах большой (1М NaCl) и малой (5 мМ NaCl) ионной силы при ее взаимодействии с поликатионами. Проведен сравнительный анализ влияния длины цепочки полилизина в диапазоне от 2 до 327 звеньев, локализации заряда (на примере трехвалентных ионов металлов, спермидина и трилизина) на конформацию ДНК. Показано, что наблюдается существенное различие структурных изменений ДНК, предшествующих конденсации, вызванной поликатионами и малыми конденсирующими агентами. Построены фазовые диаграммы для систем ДНК-поликатион в растворе 0. М NaCl. Определяющим фактором для реализации конденсации ДНК, индуцированной полилизином со степенью полимеризации n>17, является зарядовое соотношение (или отношение концентраций отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК и положительно заряженных атомов азота полилизина N/P). Для разбавленных растворов ДНК с олигопептидами (n=3 и n=5), а также в присутствии спермина и спермидина в условиях малой ионной силы конденсация макромолекулы начинается при определенных концентрациях мономерных звеньев конденсирующих агентов независимо от С(ДНК).

При n=2 конденсации ДНК в растворе не наблюдается. В растворах ДНК большой ионной силы (1 М NaCl) олигопептиды и полиамины не оказывают влияния на размер макромолекулы в условиях эксперимента, а полилизин вызывает падение вязкости при больших N/P >1.5. Оценка размеров наночастиц, формируемых при конденсации ДНК, проведенная с помощью метода динамического светорассеяния, свидетельствует об образовании компактных дискретных частиц диаметром порядка 200 нм. Изображения ДНК, полученные с помощью атомного силового микроскопа (NanoScope 4a,Veeco), демонстрируют формирование дискретных сферических и тороидальных частиц размером того же порядка.

ИНТЕРКАЛЯЦИЯ КАК СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С МОЛЕКУЛОЙ ДНК

Санкт-Петербургский Государственный Университет, [email protected] Взаимодействие низкомолекулярных соединений с ДНК уже более 40 лет находится в поле зрения исследователей, поскольку такие соединения, как правило, обладают мутагенной, а также противоопухолевой активностью и могут рассматриваться в качестве потенциальных предшественников новых лекарственных препаратов. Одним из способов связывания этих соединений с ДНК является интеркаляция. Концепция интеркаляции была предложена Лерманом в середине 60-ых годов прошлого века для описания обратимого, нековалентного связывания с двуспиральной ДНК соединений с плоским гетероциклическим протяженным хромофором. Сущностью интеркаляции является встраивание такого хромофора между соседними парами оснований ДНК, увеличивающее расстояние между ними с 3,4А до 6,8А.

С этого времени взаимодействие лигандов с ДНК исследуется различными физическими и биохимическими методами с целью определения химико-физической основы корреляции между структурой соединения и его биологической активностью, а также влияния модификации структуры соединений на физические, химические и биологические свойства их комплексов с ДНК.

В лаборатории молекулярной биофизики физического факультета СПбГУ исследования взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК проводятся с года. На основе использования спектрофотометрии, вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления была разработана методика, позволяющая определять способ связывания лиганда с ДНК. С помощью этой методики были исследованы соединения акридинового, феназинового, фенотиазинового, ксантонового рядов, многочисленные производные актиноцина – аналоги противоопухолевого антибиотика актиномицина D и другие. Настоящая работа является обзором результатов, полученных в лаборатории и позволяющих сделать определенные выводы как об изменении макромолекулярных параметров ДНК при связывании, так и о влиянии структурных особенностей соединений на их способность интеркалировать в двойную спираль ДНК. В частности было установлено, что для интеркаляции хромофора важно ионное состояние лиганда, а также оптимальное расположение катионоидного центра относительно хромофора.

Заместители, способные специфическим образом взаимодействовать с ДНК в составе молекулы лиганда, могут препятствовать интеркаляции хромофора в двойную спираль.

Наличие громоздких заместителей, асимметрично расположенных на хромофоре, приводит к «частичной» интеркаляции, сопровождающейся изломом (кинком) двойной спирали ДНК. Было также показано, что интеркаляционное связывание лиганда с молекулой ДНК различным образом влияет на термодинамическую жесткость макромолекулы.

Полученные в лаборатории результаты не только позволили установить интеркаляционное связывание с ДНК таких известных антибиотиков как дауномицин, актиномицин и блеомицин, но и выработать определенные рекомендации для химиковсинтетиков для проведения направленного синтеза новых биологически активных соединений.

МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ДВУХ ПОЛИМЕРНЫХ ЦЕПЕЙ

Санкт-Петербургского государственного университета Экспериментальным исследованиям взаимодействия полимеров с различными веществами посвящено множество работ, сделанных на кафедре молекулярной биофизики СПбГУ. Целью данной работы было изучение комплекса полимерных цепей при различных типах связывания.

Исследовалось взаимодействие двух полимерных цепочек, состоящих из узловмономеров, соединённых бестелесными сегментами единичной длины. Система находилась в кубической ячейке с длиной ребра, равной удвоенной длине полимера, с периодическими граничными условиями. Рассматривались континуальная и дискретная (на простой кубической решётке) модели.

Для континуальной модели взаимодействие мономеров описывалось потенциалом Леннарда-Джонса U (r ) = 4 ij ((d / r ) 6 (d / r )12 ) (для ij < 0 ) и U (r ) = 4ij (d / r )12 (для ij > 0 ), где r — расстояние между центрами мономеров, d — диаметр мономеров, ij — константа взаимодействия мономеров i-й и j-й цепи. Для решёточной модели каждому положению несоседних по цепи мономеров на единичном расстоянии (контакту) сопоставлялась энергия ij. Для обеих моделей константы взаимодействия 11 = 22, 12 = 1. Параметры 11 и 22 варьировались от 0,2 до 5 и брались как положительными, так и отрицательными.

Были реализованы программы для расчёта термодинамических зависимостей системы. Расчёты проводились методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга — Ландау. Рассчитаны зависимости удельной теплоёмкости, среднеквадратичных радиусов инерции полимеров и среднего расстояния между центрами масс цепочек от температуры.

Во всех случаях, в том числе и при отталкивании мономеров одной цепи друг от друга ( 11, 22 > 0 ), при понижении температуры наблюдается компактизация системы.

При отталкивании и при слабом притяжении ( 11, 22 12 ) мономеров одной цепи друг к другу образуется глобула из переплетённых полимерных цепей. А при сильном притяжении ( 11, 22 12 ) полимеры компактизуются отдельно друг от друга, слипаясь своими поверхностями.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТА

С ПЛОСКОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ МЕТОДОМ МОНТЕ-КАРЛО

Санкт-Петербургского государственного университета На кафедре молекулярной биофизики физического факультета СПбГУ проводятся эксперименты по высаживанию ДНК из водно-солевого раствора на кремниевую подложку с дальнейшей её металлизацией. Мы решили смоделировать этот процесс.

Интерес представлял тот факт, что отрицательно заряженная ДНК высаживается на отрицательно заряженную подложку.

Исследовалось взаимодействие одиночного полииона с бесконечной заряженной однородной «стенкой», занимающей полупространство с бесконечной плоской гранью, в присутствии противоионов. Рассматривались континуальная и дискретная (на простой кубической решётке) модели.

Изучался случай, когда полиион и «стенка» имеют одноимённые заряды. Заряд каждого мономера считался равным 1. Заряд «стенки» был равномерно распределён по её поверхности с плотностью, варьировавшейся от 0,003 до 0,03. Также в системе присутствовали противоионы, заряды которых принимались равным +1, +2, +3, +4 (в разных экспериментах). Их число подбиралось таким, чтобы соблюдалась электронейтральность. Между элементами системы вводилось кулоновское взаимодействие. В направлении перпендикулярном «стенке» система ограничивалась на расстоянии равном длине полииона, а вдоль «стенки» введены периодические граничные условия.

Были реализованы программы для расчёта термодинамических зависимостей системы. Расчёты проводились методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга — Ландау. Рассчитаны температурные зависимости удельной теплоёмкости, среднеквадратичных радиуса инерции и расстояния между концами полииона, среднего расстояния центра масс полииона от «стенки» и средней z-координаты ионов.

Эффект высаживания полииона на одноимённо заряженную подложку был обнаружен. При понижении температуры наблюдается приближение (высаживание) полииона к поверхности «стенки». Эффект усиливается при увеличении заряда ионов.

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНО-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ

СВОЙСТВ СОЕДИНЕНИЯ РУТЕНИЯ C АНТИБИОТИКОМ

ОФЛОКСАЦИНОМ И ПРОЦЕССОВ ИХ СВЯЗЫВАНИЯ С ДНК

Бакулев В. М., 1Морозова Е.В., 2Turel I., 1Касьяненко Н. А.

Санкт-Петербургский государственный университет, Физический факультет, кафедра Молекулярной биофизики University of Ljubljana, Faculty of Chemistry and Chemical Technology Рутениевые комплексы, как и противоопухолевые препараты платины, связываются с ДНК in vivo, нарушая ее структуру и функции, что приводит к гибели раковой клетки.

В данной работе исследовано взаимодействие молекулы ДНК с новым органометаллическим рутениевым комплексом, содержащим офлоксацин и природное соединение пара-цимол (4-изопропилтолуол), связанных между собой координационной связью с атомом рутения (Рис.1, соединение С1).

Для определения взаимного влияния компонентов на спектральные свойства соединения С1 были изучены спектры поглощения, возбуждения и испускания люминесценции как самого С1, так и его составляющих (офлоксацина и пара-цимолдихлоррутената). Влияние парацимолдихлоррутената слабо проявляется в поглощении и практически незаметно в флуоресценции С1. Спектральные свойства соединения С1 в основном определяются офлоксацином. Концентрационные зависимости интенсивности флуоресценции С1 и офлоксацина выявляют присутствие люминесцирующих димеров при концентрациях выше 10-5 М/Л. Определены их спектры поглощения и флуоресценции. Изучено влияние ДНК на спектры поглощения, возбуждения и испускания флуоресценции офлоксацина и его металлокомплекса с Ru при различных концентрациях в 0.005 М водном растворе NACl. По измерению кривых связывания этих соединений с ДНК получены значения числа сайтов и констант связывания. На основании полученных экспериментальных данных сделаны предположения о моделях взаимодействия ДНК с офлоксацином и синтезированным органометаллическим рутениевым комплексом.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ИМИДАЗОИЗОХИНОЛИНА С

МОЛЕКУЛОЙ ДНК

Белашева И. Б., 1Морошкина Е. Б., 2Криворотов Д. В.

Санкт-Петербургский Государственный Университет, 2НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА РФ, [email protected] В данной работе исследовалось взаимодействие 4 производных имидазоизохинолина с молекулой ДНК. Эти соединения можно отнести к классу синтетических алкалоидов. Все исследованные соединения обладают одинаковым хромофором и различаются только природой заместителя.

Исследование взаимодействия производных имидазоизохинолина с молекулой ДНК проводилось с помощью методов спектрофотометрии, кругового дихроизма и вискозиметрии.

В ходе спектрополяриметрического титрования при больших концентрациях ДНК наблюдалось появление в видимой области индуцированного сигнала кругового дихроизма отрицательного знака низкой интенсивности и изменение спектров кругового дихроизма в полосе, сопряженной с полосой поглощения ДНК. Это свидетельствует о связывании данных соединений с ДНК.

Изменения в электронных спектрах поглощения этих соединений в присутствии ДНК в ходе спектрофотометрического титрования также свидетельствуют об их взаимодействии с молекулой ДНК. С увеличением концентрации ДНК наблюдается гипохромный эффект и батохромный сдвиг максимума длинноволновой полосы спектра поглощения. Наличие двух изобестических точек свидетельствует о двух типах связывания этих соединений с ДНК. По результатам спектрофотометрического титрования были определены термодинамические параметры связывания исследованных соединений с молекулой ДНК (количество мест связывания и константы связывания).

Для первичного связывания этих соединений получены константы, рассчитанные для модели с исключенными местами связывания [1].

Для определения способа связывания исследуемых соединений с ДНК было проведено вискозиметрическое титрование растворов ДНК растворами исследованных соединений.

Увеличение приведенной вязкости ДНК при увеличении концентрации лиганда в растворе позволяет сделать предположение об интеркаляционном связывании исследованных соединений с ДНК.

1. Mc Ghee J.D., von Hippel P.H.J. Mol. Biol., v.86, p.469, 1974.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК С ИОНАМИ

АЛЮМИНИЯ В РАСТВОРЕ

Санкт-Петербургский государственный университет, Физический факультет, кафедра Молекулярной биофизики Интерес к исследованию влияния алюминия на биологические макромолекулы обусловлен появившимися недавно данными о том, что при определенных условиях этот металл может провоцировать развитие таких заболеваний, как болезни Альцгеймера, Паркинсона и энцефалопатия. Было обнаружено, что заболевания сопровождаются локализацией алюминия в хроматине пораженных клеток.

Существуют данные, что это является причиной их генетической нестабильности. В связи с этим возникла необходимость рассмотрения возможного взаимодействия ионов алюминия с молекулой ДНК. В настоящее время влияние ионов металлов на конформацию молекулы ДНК в растворе изучено достаточно хорошо. Известно, что ионы щелочных и щелочноземельных металлов связываются с фосфатными группами, а переходных – еще и с азотистыми основаниями ДНК. Состояние иона алюминия в водном растворе меняется в результате взаимодействия с молекулами растворителя. Соответственно, во взаимодействие с ДНК может вступать одна из возможных форм ионов алюминия – Al3+ Al(OH)2+, Al(OH)2+.

В работе методами назкоградиентной вискозиметрии, УФ-спектрофотометрии, кругового дихроизма (использовали автодихрограф Mark IV, Jobin Ivon), атомной силовой микроскопии (NanoScope IVa, Veeco) проводили изучение взаимодействия с молекулой ДНК ионов алюминия в растворах 0,005 М и 1 NaCl. Использовали соль АlCl3 (для анализа, Merck), высокомолекулярную ДНК тимуса теленка (Sigma), М = 11 ·106 Да. В работе изучено кислотно-основное равновесие в водных растворах алюминия и в растворах, содержащих AlCl3, NaCl и ДНК. Исследование конформационных изменений ДНК проводили в области концентраций алюминия, диапазон значений рН которых не обеспечивает протонирования молекулы ДНК.

Состояние макромолекулы во всем диапазоне используемых концентраций соответствует непротонированной двуспиральной В-форме.

Показано, что в растворах малой ионной силы ионы алюминия взаимодействуют с молекулой ДНК, вызывая уменьшение объема молекулярного клубка. При этом наблюдается изменение спектра кругового дихроизма ДНК, что может свидетельствовать о влиянии связывания на вторичную структуру макромолекулы. В растворах большой ионной силы (1 М NaCl) объем молекулы ДНК практически не меняется при увеличении концентрации AlCl3 в растворе. Таким образом, можно заключить, что взаимодействие происходит с помощью электростатических сил. Так как трехвалентные ионы Fe3+ и La3+ вызывают уменьшение объема молекулярного клубка не только и при малых, но и при больших концентрациях поддерживающего электролита (это объясняется структурированием макромолекулы за счет образования внутримолекулярных сшивок), остается предположить, что связывание ионов алюминия с молекулой ДНК осуществляется по-другому. Это в какой-то мере подтверждается результатами, полученными методом атомной силовой микроскопии.

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИС-ДИХЛОРДИАММИНОПЛАТИНЫ(II) С

МОЛЕКУЛОЙ ДНК

Санкт-Петербургский государственный университет, физический факультет, кафедра молекулярной биофизики, Цис-дихлордиамминоплатина(II) (цис-ДДП), используется в медицине в качестве противоопухолевого препарата с 70-х годов прошлого века. Механизм действия препарата обусловлен взаимодействием с молекулой ДНК в клетке, при котором нарушаются процессы трансляции, транскрипции и репликации. Цис-ДДП способна образовывать с ДНК два типа бидентатных сшивок - однонитевые и двунитевые сшивки, причем присутствует избирательность к гуанину. Считается, что первые тип играет главную роль в противоопухолевой активности препарата, хотя логичнее было бы предположить, что за это ответственны именно межнитевые сшивки.

Целью работы было изучение структурных особенностей взаимодействия цисдихлордиамминоплатины(II) с молекулой ДНК в растворе, включая особенности влияния именно межнитевых сшивок на свойства макромолекулы. Было показано, что цис-ДДП провоцирует образование изгибов на цепи ДНК при образовании комплексов.

Проведенные эксперименты по нетемпературной денатурации ДНК в различных условиях свидетельствуют в пользу того, что цис-ДДП частично препятствует денатурации. Данный факт может быть обусловлен только влиянием межнитевых сшивок за счет препятствия расхождению двойной спирали ДНК в процессе денатурации, поскольку известно, что однонитевые сшивки вызывают некоторую дестабилизацию вторичной структуры макромолекулы.

КИНЕТИКА ИЗМЕНЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ДНК ПРИ

СВЯЗЫВАНИИ СОЕДИНЕНИЙ ПЛАТИНЫ