Министерство образования и науки Российской Федерации

УДК 577.2:616-006

ГРНТИ 34.15.51, 76.03.31, 76.29.49, 76.35.33

Инв. №

УТВЕРЖДЕНО:

Исполнитель:

Федеральное государственное бюджетное

учреждение "Научно-исследовательский

институт онкологии" Сибирского отделения

Российской академии медицинских наук

От имени Руководителя организации

/_ Чойнзонов Е.Л /

М.П.

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ

ОТЧЕТ о выполнении 5 этапа Государственного контракта № П320 от 07 мая 2010 г. и Дополнению от 17 марта 2011 г. № 1, Дополнению от 23 марта 2012 г. № 2 Исполнитель: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научноисследовательский институт онкологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.

Проект: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований Руководитель проекта:

/Кондакова Ирина Викторовна (подпись) Томск 2012 г.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

по Государственному контракту П320 от 07 мая 2010 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Руководитель темы:

доктор медицинских наук, Кондакова И. В.

профессор подпись, дата Исполнители темы:

доктор медицинских наук, Клишо Е. В.

без ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Спирина Л. В.

наук, без ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Шашова Е. Е.

наук, без ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Савенкова О. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Комарова Т. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Иванова Э. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Коваль В. Д.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Колегова Е. С.

Отчет 67 с., 1 ч., 13 рис., 4 табл., 40 источн., 0 прил.

Биология злокачественных новообразований, метастазирование, раковый деградом, протеасомы, химотрипсинподобная активность протеасом, субъединицы протеасом, рецепторы эстрогенов и прогестерона В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 5 этапу Государственного контракта № П320 "Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований" (шифр "НК-541П") от 07 мая 2010 по направлению "Общая биология и генетика" в рамках мероприятия 1.2.1 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.", мероприятия 1.2 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы.

Цель работы - Изучение роли протеасомной системы в регуляции уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в тканях рака молочной железы.

Методы, использованные при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту: Иммуногистохимический метод определения уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в тканях рака молочной железы. Флуориметрическое определение активности протеасом и определение субъединичного состава протеасом методом Вестерн-блоттинг в тканях рака молочной железы. Сопроставление уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в тканях рака молочной железы с субъединичным составом и активностью протеасом. Подготовка результатов исследований для публикации в зарубежных журналах или в рекомендованных президиумом ВАК ведущих рецензируемых научных журналах со ссылкой на проведение НИР в рамках реализации ФЦП. Подготовка отчета реализации проекта пятого этапа работы.

Инструментарий, использованный при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту:

1. Оборудование для Вестерн-блоттинга (ячейка для электрофореза MINI PROTEAN 3 с модулем для блоттинга (Bio-Rad, США).

2. Лабораторная центрифуга с охлаждением для микропробирок «Эппендорф 5415R»

3. Персональный компьютер 4. Флуориметр ФФМ- 5. Весы электронные настольные «Shimadzu A*120»

6. Диспергатор «IKA ultra turrax».

7. Спектрофотометр «СФ-56, ломо-спектр»

8. Низкотемпературная морозильная камера «Sanyo»

9. pH-метр «Hanna Intrument - pHer+»

10. Аквадистиллятор Электрический ДЭ-4-2МН 11. Микроволновая печь LG MS-1904H 12. Микроскоп световой Carl Zeiss «axiostar plus»

Результаты, полученные при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту. Изучена роль протеасомной системы в регуляции уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в тканях рака молочной железы. При высокой протеасомной активности происходит разрушение рецепторов эстрогенов, что может обуславливать их низкую или отрицательную экспрессию в опухолевых клетках. Результаты исследования создают предпосылки для разработки новых подходов к терапии рака молочной железы.

Нет.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Аналитический отчет о проведении экспериментальных исследований 2. Результаты экспериментальных исследований. Систематизация 2.2. Содержание рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухолях молочной 2.3. Тотальная активность протеасом и активность 26S и 20S пулов протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при раке молочной железы 2.4. Cубъединичный состав протеасом в ткани рака молочной железы 2.5. Связь тотальной активности и субъединичного состава протеасом с 2.6. Взаимосвязь тотальной активности протеасом, активности 26S и 20S пулов протеасом и субъединичного состава протеасом с уровнем рецепторов эстрогенов и прогестерона в ткани рака молочной железы 2.7. Оценка полноты решения задач и достижения поставленных целей 2.8. Сопоставление и обобщение результатов анализа научноинформационных источников и экспериментальных исследований 2.9. Оценка эффективности полученных результатов в сравнении с 2.10. Разработка рекомендаций по возможности использования результатов 2.11. Разработка рекомендаций по использованию результатов НИР при 3. Публикации результатов НИР. Экспертные заключения о возможности открытой публикации результатов НИР. Копии статей. Проведение 5 этапа исследований по проблеме: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований.

ВВЕДЕНИЕ

Выявление молекулярных механизмов развития злокачественных опухолей остается одной из самых актуальных проблем биологии и закономерности изменения клеточных процессов на молекулярном уровне при развитии опухолей, но и применить полученные знания для диагностики и лечения онкологических заболеваний. В этой связи наиболее перспективно исследование полифункциональных ферментативных систем, к числу которых относятся протеасомы – мультисубъединичные белковые структуры, обладающие несколькими протеолитическими активностями.

Протеасомы являются главным компонентом внутриклеточного ракового деградома и регулируют многочисленные клеточные процессы путем устранения белков и/или образования пептидов, в этих процессах участвующих [Edwards D., 2009]. Они представлены двумя пулами: 26S и 20S протеасомами [Ротанова Т.В. и др. 2008, Piccinini M., 2005]. Деградация в белков в протеасоме наблюдается при прикреплении к ним цепочки убиквитина и последующим гидроксилированием остатков пролина и аспаргина.

По набору протеолитических субъединиц протеасомы человека можно разделить на две группы – конститутивные и иммунные протеасомы.

Протеолитические субъединицы X, Y, Z конститутивных протеасом замещаются на субъединицы LMP7, LMP2 и LMP10, соответственно, при сборке иммунных протеасом [Ротанова Т.В. и др., 2008; Sharova N. et al, 2008]. Субъединицы LMP2 и LMP10, как правило, встраиваются парой, а субъединица LMP7 может включаться в протеасомы либо совместно с этими двумя субъединицами, либо независимо от них, формируя таким образом множественные формы иммунных протеасом [Mani A. et al, 2005, Busse A., 2007]. Субъединицы X и LMP7 проявляют химотрипсинподобную (ХТП) активность, субъединицы Y и LMP2 – каспазаподобную активность, и субъединицы Z и LMP10 – трипсинподобную активность. При этом трипсинподобной активностями по сравнению с конститутивными формами [Almond J.B., Cohen G.M., 2002]. Изменения субъединичного состава множественных форм протеасом отражаются в конечном итоге на активностях общего пула протеасом. Поэтому изменение активностей пула протеасом в разные периоды развития опухоли может быть уникальной характеристикой различных стадий заболевания.

Протеасомы ответственны за избирательную деградацию белков в клетке и, таким образом, играют ключевую роль в таких клеточных процессах, как регуляция апоптоза, пролиферации и клеточного цикла, противоопухолевой иммунной системы, неоангиогенеза, прогрессии и метастазирования опухоли. Протеасомы могут быть вовлечены в регуляцию инвазии и метастазирования злокачественных опухолей путем регуляции содержания и активности различных регуляторных белков [Girnita L. et al, 2003].

К числу молекул, на которые протеасомы оказывают регуляторное влияние, относятся рецепторы стероидных половых гормонов, которые играют важную роль в патогенезе горомонозависимых опухолей. Одним из наиболее распространенных гормонозависимых злокачественных новообразований является рак молочной железы (РМЖ). Отмечается неуклонный рост численности больных, увеличение смертности и возникновение рака этой локализации в более раннем возрасте по сравнению с прошлыми десятилетиями [Чиссов 2012].

Особенности клинического течения РМЖ во многом определяются воздействием эстрогенов на ткани-мишени [Salah J. 2012], что проявляется в активации пролиферации [Hо H., Heo J.S., 2006], ингибировании процесса (трансформирующий фактор роста, эпидермальный фактор роста) [Mueck A.O 2010]. Вышеперечисленные эффекты эстрогенов реализуются через взаимодействие с рецепторами эстрогенов, вследствие чего запускаются пролиферативные сигнальные каскады, которые повышают митотическую активность тканей-мишеней и ингибируют апоптоз, а также увеличивает вероятность повреждения генома за счет дополнительных факторов [Kiess, W., et al., 1997; Li, J. J. et al., 1990; Zhao Z., et al., 2006]. Показано, что повышение пролиферативной активности клеток рака молочной железы эстрогенами осуществляется за счет активации протоонкогена с-myc и увеличения экспрессии белка, способствующего прохождению клеткой митотического цикла – циклина-Д [Копнин, Б.П., 2000; Carroll J.S., 2002]. В процессе пролиферации, которая опосредована действием эстрогеновых рецепторов, увеличивается количество мутаций и ограничивается время, необходимое для репарации повреждений. Эффективность терапии РМЖ зависит от наличия рецепторов эстрогенов, которые экспрессируются примерно в 70% всех случаев рака молочной железы, и являются главной мишенью гормональной терапии.

Основным путем регуляции уровня рецепторов эстрогенов является убиквитин-протеасомный путь, который контролирует стабильность молекулы рецептора. Данные по изучению активности протеасом при раке молочной железы не многочисленны. В исследованиях Li C., Kiran M.

показано, что активность протеасом была достоверно выше в опухолях по сравнению с неизмененными тканями, взятыми от тех же больных РМЖ [Li C., Kiran M., 2005]. Также ряд исследований посвящен ингибированию протеасомной системы, однако механизм различного ответа нормальных и раковых клеток на ингибирование протеасом до конца не ясен. Доказано, что раковые клетки более чувствительны к ингибиторам протеасом и, таким образом, эти ингибиторы могут быть эффективны в лечении определенных опухолей [Adams J. 2002, Voortman J. 2007, Brooks AD, 2010]. В 2003 году ингибитор протеасом бортезомиб стал первым одобренным к использованию распространенного РМЖ [Yang C.H., Gonzales-Angulo A.M., 2006].

При ингибировании химотрипсиноподобной активности протеасом в культуре клеток РМЖ наблюдалось увеличение уровня рецепторов эстрогенов [Nawaz Z. еt al., 1999]. Однако есть и противоположные данные, указывающие на то, что ингибирование активности протеасом было связано с внутриклеточной релокализацией рецепторов эстрогенов из ядра в цитоплазму, их убиквитинированием, деградацией и снижением функциональной активности, что в итоге приводило к апоптозу опухолевых клеток [Marx C., Yau Ch, 2007]. Показано, что протеасомы могут регулировать содержание рецепторов эстрогенов не только за счет их деградации, но и влияя на процесс транскрипции, активность РНКполимеразы и синтез м-РНК [Powers G.L., et al., 2010]. Следует отметить, что все эти исследования проводились на культурах клеток. Несмотря на то, что на клеточных культурах можно изучать механизмы опухолевой прогрессии, огромный интерес представляют данные, полученные в результате изучения первичных опухолей человека, так как они могут определить тактику поиска маркеров и их использование для мониторинга и оценки эффективности лечения. Следует отметить, что на клиническом материале работы по изучению протеасомной регуляции экспрессии рецепторов эстрогенов отсутствуют. Есть единичные сведения о том, что снижение протеасомной деградации рецепторов эстрогенов вследствие генетических нарушений приводит к увеличению риска возникновения РМЖ в его наиболее злокачественной форме с развитием метастазов [Harrell J.C. et al. 2007].

Таким образом, комплексное изучение активности и субъединичного состава протеасом при раке молочной железы во взаимосвязи с уровнем рецепторов эстрогенов и прогестерона создает предпосылки для создания новых подходов к прогнозированию исхода заболевания и его лечению.

Литературные источники не обладают достаточной информацией о роли протеасомной системы в регуляции количества и функции рецепторов половых стероидов, что делает данную проблему особенно актуальной и значимой для дальнейшего изучения.

протеасомной системы в регуляции уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в тканях рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Определить экспрессию рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухолевой ткани рака молочной железы.

2. Определить тотальную активность, активность 20S, 26S пулов протеасом и их субъединичный состав в ткани рака молочной железы.

3. Сопоставить показатели активности и субъединичного состава протеасом в тканях РМЖ с клинико-морфологическими параметрами заболевания, такими как размер опухоли и стадия метастазирования.

4. Проанализировать зависимость между общей активностью протеасом, активностью их пулов, субъединичным составом протеасом и экспрессией рецепторов эстрогенов и прогестерона при раке молочной железы.

Выполнение вышеуказанных задач имеет большое значение не только для расширения представлений о биологической роли протеасом в механизмах регуляции уровня рецепторов стероидных гормонов и в процессах опухолевого роста, но также полученные результаты могут лечь в основу формирования новых подходов для терапии РМЖ.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ О ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

операционного материала опухолевых и неизмененных тканей больных опухолями молочной железы, взятые во время операции. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288), получено разрешение этического комитета института.

1.1.1. Материал и объект исследования Объектом исследования на 5 этапе работы явились 70 больных раком молочной железы T1-4N0-3M0, находящихся на лечении в отделении общей онкологии ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

включающее в себя: клинический осмотр, маммографию, УЗИ молочных свертывающей системы, общий анализ мочи, рентгеновское исследование легких, ЭКГ.

Материалом для исследования служили послеоперационные образцы морфологически верифицированной опухолевой и неизменной ткани, находящейся на расстоянии не менее 1 см от границы опухолевого очага.

Всего было набрано 70 образцов тканей рака молочной железы. Забор тканей проводился в течение первого часа после выполнения радикальной мастэктомии или органосохраняющих операций.

Для морфологического и иммуногистохимического исследования взятые образцы помещались в 10% pH-нейтральный формалин. Общая продолжительность фиксации была не более 18-24 часов. Материал проводился по стандартной методике и заливался в парафин. С парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4-5 мкм. Для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей гематоксилина и эозина, исследование проводилось с помощью светового микроскопа фирмы «Carl Zeiss» «Axiostar plus».

«Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2003).

Определялась принадлежность опухоли к гистологическому типу. Степень злокачественности оценивали при инвазивном протоковом раке по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson (1957) в модификации C.W. Elston (1991). При этом учитывали количество полиморфизм.

Для оценки состояния протеасомной системы образцы изучаемых тканей (опухолевая и неизмененная ткани) очищали от участков некроза и кровоизлияний, замораживали и хранили при -80 оС.

1.1.2. Методы исследования.

Изучение экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках иммуногистохимическим способом с использованием стрептавидинбиотинового метода. Исследование выполнялось по следующей схеме. Срезы депарафинировали в 3 порциях спирта (96°), затем промывали 5 мин в дистиллированной воде, помещали стекла со срезами в пластиковый держатель и погружали в 0,01М цитратный буфер рН=6,0, после чего осуществляли демаскировку антигенов в микроволновой печи. Демаскировку проводили в два этапа: первые 7 мин при мощности Р=60, затем 1 мин остывания при открытой дверце, далее 7 мин при мощности Р=40 (выходная мощность микроволновой печи 700 Вт). После демаскировки оставляли емкость со стеклами остывать при комнатной температуре на 20 мин и промывали в двух порциях фосфатного буфера по 5 мин, наносили блокирующий реагент (Peroxidase Blocking Reagent, фирма «Dako») на мин., после промывали в дистиллированной воде 5 мин., затем в фосфатном буфере – 5 мин. Далее наносили первые антитела и инкубировали срезы при температуре 25С 60 мин. После инкубации срезы промывали в фосфатном буфере и наносили биотинилированые антитела на 10 мин., затем промывали в фосфатном буфере и наносили на срезы стрептавидин-биотиновый комплекс на 10 мин. После тщательной отмывки трис-буфером срезы обрабатывали хромогенным субстратом (3,3-диаминобензидин в буферном растворе). С диаминобензидином инкубировали 10 мин. Использовали систему визуализации фирмы «Dako» LSAB2 System – HRP. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

При исследовании применяли антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные). Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой контрольных реакций на серийных срезах.

Экспрессию рецепторов к половым гормонам оценивали по 3-х балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Для оценки выраженности экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону определяли процент клеток, имеющих рецепторы, и «показатель экспрессии» (ПЭ). Последний представляет собой сумму произведений степени экспрессии, умноженную на процент соответствующих клеток, и подсчитывается по следующей формуле: ПЭ = 3 A + 2 B + 1 C, где А – процент интенсивно окрашенных ядер; В – процент умеренно окрашенных ядер; С – процент слабо позитивных ядер. Шкала варьирует от 0 до 300 баллов (Петров С.В., 2000). Клетки, в ядрах которых обнаруживается экспрессия к рецепторам эстрогенов при ПЭ выше 20 считаются положительными к рецепторам эстрогенов (ЕР+) (Рис.1). При ПЭ менее 20 опухоль считается ЕР(-).

Рис. 1. Выраженная Экспрессия рецепторов к эстрогену клеток РМЖ 3+.Увеличение 400.

В отношении рецепторов прогестерона при ПЭ менее 5 опухоль считается отрицательной по рецепторам прогестерона (ПР(-), при ПЭ более – положительной (ПР(+)) (Рис. 2).

Рис. 2. Выраженная экспрессия рецепторов к прогестерону клеток РМЖ 3+.Увеличение 400.

Рис. 3. Отсутствие экспрессии ЕР и ПР в ткани молочной железы.

Увеличение 400.

На рис. 3. показано отсутствие экспрессии ЕР и ПР в ткани молочной железы.

определения тотальной химотрипсиноподобной активности протеасом, активности 26S, 20S пулов протеасом, а также проводилась оценка субъединичного состава. На первом этапе для определения тотальной активности протеасом и активности 20S и 26S пулов протеасом из изучаемых тканей получали осветленные гомогенаты. Для этого замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали и ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ центрифугировали 60 минут при 10000g и 4оС.

Фракционирование протеасом. Все процедуры проводили при 4°С. Белки осветленных гомогенатов фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 26S-протеасомами, получали добавлением добавлением сульфата аммония до 70% насыщения [Абрамова Е.Б., 2006].

Определение активности протеасом. Химотрипсиноподобную активность тотального пула протеасом, содержащего формы 26S и 20S, определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом [Ben-Shahar S., 1999].

Реакционная смесь для определения активности тотального пула протеасом и пула 26S протеасом содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакционная смесь для определения активности пула 20S протеасом имела такой же состав за исключением MgCl2 и АТФ. Реакцию проводили при 370С в течение 20 мин.

Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «ФФМ-1»

(Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1мг белка.

Содержание белка определяли по методу Лоури [Lowry, O.H. 1951].

полиакриламидном геле. Пробы наносили в буфере, содержащем 0,0625М трис-НСl (pН 6,8), 2% додецил сульфат соды, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий.

Вестерн блоттинг. После электрофореза осуществляли перенос полипептидов на PVDF-мембрану (Immobylon, Millipore, США).

Иммунодетекцию проводили согласно протоколу для «SNAP i.d.» (Millipore, США) с антителами к субъединицам протеасом 123567 (MCP231), LMP7 (56-T), LMP2 (H-200), PA28 (L-19) (Santa-Cruze, США), а также антитело к субъединице Rpt6 Anti-Subunit Rpt6 (S8), моноклональное (clone p45-110) фирма Biomol int. Затем мембрану подвергали обработке системой хемилюминесцентной детекции ECL (GE Healthcare, Великобритания).

Плотность полос оценивали с помощью компьютерной программы «ImageJ».

Стандартизация проводилась относительно содержания белка. Результаты выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

1.1.3. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 8.0. Проверка нормальности распределения исследуемых выборок проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для использованием непараметрического критерия Спирмена. Также был проведен дисперсионный анализ с использованием непараметрического критерия Краскол-Уоллиса (F). В таблицах все результаты представлены как m±M, где m-среднее выборочное, M – ошибка среднего. Различия считались