Министерство образования и науки Российской Федерации

УДК 577.2:616-006

ГРНТИ 34.15.51, 76.03.31, 76.29.49, 76.35.33

Инв. №

УТВЕРЖДЕНО:

Исполнитель:

Учреждение Российской академии медицинских

наук Научно-исследовательский институт

онкологии Сибирского отделения РАМН

От имени Руководителя организации

/Чойнзонов Е.Л./

М.П.

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ

ОТЧЕТ о выполнении 4 этапа Государственного контракта № П320 от 07 мая 2010 г. и Дополнению от 17 марта 2011 г. № 1 Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт онкологии Сибирского отделения РАМН Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.

Проект: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований Руководитель проекта:

/Кондакова Ирина Викторовна (подпись) Томск 2011 г

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

по Государственному контракту П320 от 07 мая 2010 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт онкологии Сибирского отделения РАМН Руководитель темы:

доктор медицинских наук, Кондакова И. В.

профессор подпись, дата Исполнители темы:

кандидат медицинских Клишо. В.

наук, без ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Спирина. В.

наук, без ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Савенкова. В.

ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Шашова. В.

наук, без ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Комарова. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Асадчикова. Н.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Хворилова К. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Иванова. В.

ученого звания подпись, дата Отчет 65 с., 1 ч., 20 рис., 1 табл., 51 источн., 0 прил.

Биология злокачественных новообразований, метастазирование, раковый деградом, протеасомы, химотрипсинподобная активность протеасом, субъединицы протеасом В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 4 этапу Государственного контракта № П320 "Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований" (шифр "НК-541П") от 07 мая 2010 по направлению "Общая биология и генетика" в рамках мероприятия 1.2.1 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.", мероприятия 1.2 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы.

Цель работы - Изучение активности протеасом и их субъединичного состава в злокачественных опухолях различных локализаций во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами заболевания.

Методы, использованные при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту: 1. Определение тотальной активности и активности пулов протеасом 20S и 26S) в тканях плоскоклеточных карцином, рака эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря флуориметрическим методом. Разделение пулов протеасом методом высаливания. 2. Определение субъединичного состава протеасом в опухолевых и соответствующих нормальных тканей, полученных от больных опухолями головы и шеи, раком эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря методом Вестерн-блоттинг с применением коммерческих антител к различным субъединицам протеасом. 3. Статистическая обработка полученных результатов. Сопоставление показателей активности протеасом и их субъединичного состава с клинико-морфологическими параметрами заболевания, такими как размер опухоли, стадия метастазирования, степень дифференцировки. 4. Подготовка отчета реализации проекта третьего этапа работы.

Инструментарий, использованный при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту:

1. Оборудование для Вестерн-блоттинга (ячейка для электрофореза MINI PROTEAN 3 с модулем для блоттинга (Bio-Rad, США).

2. Лабораторная центрифуга с охлаждением для микропробирок «Эппендорф 5415R»

3. Персональный компьютер 4. Флуориметр ФФМ- 5. Весы электронные настольные «Shimadzu A*120»

6. Диспергатор «IKA ultra turrax».

7. Спектрофотометр «СФ-56, ломо-спектр»

8. Низкотемпературная морозильная камера «Sanyo»

9. pH-метр «Hanna Intrument - pHer+»

10. Термостат ТС 1/80 СПУ Результаты, полученные при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту. Впервые наряду с активностью протеасом была дана характеристика субъединичного состава протеасом в опухолевых образцах и неизмененных тканях. Была выявлена тканеспецифичность активности и субъединичного состава протеасом. Показатели опухолевых тканей были сопоставлены с нормальными тканями, что дало инфрмацию о специфике протеасом при опухолевой трансформации. Результаты сопоставления показателей опухолевых тканей с со стадией онкологического процесса и степенью дифференцировки позволяют судить о связи опухолевого роста и метастазирования с изучаемыми показателями представленными в различных злокачественных новообразованиях, что позволяетт выяснить вклад протеасом в патогенез злокачественных опухолей.

Результаты исследования могут быть основой для поиска специфических мишеней при таргетной терапии опухолей и для разработки новых маркеров метастазирования Нет

СОДЕРЖАНИЕ

1. Аналитический отчет о проведении экспериментальных исследований 1.2. Результаты экспериментальных исследований. Систематизация 1.2.2. Субъединичный состав протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при опухолях различной локализаций и сопоставление его с активностью 1.2.2.1. Субъединичный состав протеасом в ткани плоскоклеточных 1.2.2.2. Субъединичный состав протеасом в ткани рака эндометрия 1.2.2.3. Субъединичный состав протеасом в ткани рака молочной железы 1.2.2.4 Субъединичный состав протеасом в ткани рака почки 1.2.2.4. Субъединичный состав протеасом в ткани рака мочевого пузыря 1.2.3. Связь субъединичного состава протеасом с клиникоморфологическими параметрами при опухолях различной локализаций 1.2.3.1. Связь субъединичного состава протеасом с клиникоморфологическими параметрами при плоскоклеточных карциномах головы и 1.2.3.2. Связь субъединичного состава протеасом с клиникоморфологическими параметрами при раке эндометрия 1.2.3.3. Связь субъединичного состава протеасом с клиникоморфологическими параметрами заболевания при раке почки и мочевого 1.3. Оценка полноты решения задач и достижения поставленных целей 1.4. Оценка эффективности полученных результатов в сравнении 1.5. Разработка рекомендаций по возможности использования результатов 1.6 Разработка рекомендаций по использованию результатов НИР при Экспертные заключения о возможности открытой публикации результатов Проведение 4 этапа исследований по проблеме: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований

ВВЕДЕНИЕ

Наиболее частой причиной смертности среди больных раком различных локализаций является метастазирование, в частности, по данным международного агенства по борьбы с раком, в 90% случаев именно метастазы приводят к смертельному исходу. Из всего множества процессов, вовлеченных в кацерогенез, метастазирование клинически изучено и разработаны способы его регистрации, но этот же процесс наименее исследованы на молекулярном уровне. В целом, идентифицированы основные этапы мультистадийного процесса метастазирования: инвазивный рост – способность опухолевых клеток расти в негомологичной ткани, диссеминация опухолевых клеток через лимфатическую или кровеносную систему, колонизация отдаленных органов и, завершением является рост метастазов, приводящий к фатальному исходу.

Критическим событием в этом спектре является изменение в адгезивных и миграционных свойствах опухолевых клеток и опухолевого микроокружения. В настоящее время известно множество факторов, которые регулируют малигнизацию и распространение опухолевых клеток. Этапы метастазирования опухолевых клеток включают эпителиальномезенхимальную транзицию – переход от неподвижного эпителиального фенотипа к подвижному мезенхимальному, модификацию микроокружения, разрушение экстраклеточного матрикса и базальной мембраны.

Однако именно взаимодействие опухолевых клеток с мироокружением, инвазия в окружающие нормальные ткани и метастазирование в значительной мере обеспечиваются широким спектром протеаз, вызывающих деградацию внеклеточного матрикса. В целом комплекс протеаз, вовлеченный в развитие злокачественных новообразований, получил название «раковый деградом».

Настоящая работа посвящена изучению роли внутриклеточных протеолитических комплексов - протеасом в злокачественных опухолях различных локализаций. Протеасомы включают каталитическое ядро с коэффициентом седиментации 20S, к которому присоединена одна или две регуляторные частицы. Если одной из этих частиц является РА700 (19S регуляторная частица), то образуется 26S протеасома, осуществляющая, главным образом, АТФ- и убиквитин-зависимый протеолиз большинства клеточных белков. Если же в роли регуляторной частицы выступают РА или РА200, то такая ассоциация представляет собой 20S протеасому, которая деградирует малые, аномальные и коротко живущие белки. Протеасомы представлены конститутивными и иммунными формами, образующимися при сочетании конститутивных (1234567, Rpt6) или иммунных протеолитических субъединиц (LMP 2, LMP7 и др.). 20S протеасома прокариот и эукариот состоит из 28 субъединиц. У прокариот протеасома содержит 14 копий идентичных -субъединиц и 14 копий идентичных субъединиц. Протеасома эукариот содержит по 2 копии 7 разных субъединиц и по 2 копии 7 разных -субъединиц. Внешние кольца содержат только -субъединицы, а внутренние два кольца – только -субъединицы.

Пространственная структура всех протеасомных субъединиц одинакова, что следует из высокой гомологии аминокислотной последовательности - и субъединиц. Конститутивные протеасомы, состоящие из конститутивных субъединиц, участвуют в регуляции клеточных процессов. Иммунные 26S протеасомы необходимы для развития иммунного ответа и формирования комплексов гистосовместимости I класса [Ротанова Т.В. и др., 2008; Sharova N. et al, 2008]. Субъединицы LMP2 и MECL1 встраиваются во вновь образующиеся протеасомы совместно, но независимо от LMP7. Включение субъединицы LMP7, хотя и облегчается наличием LMP2 и MECL1, но может осуществляться и без них. Замена конститутивных субъединиц протеасом на иммунные сопровождается формированием модифицированных форм протеасом и приводит к изменению ферментативной активности [Almond J.B., Cohen G.M., 2002].

Протеасому относят к классу N-концевых нуклеофильных гидролаз. Nконцевой треонин -субъединиц важен для катализа, и его замена на серин приводит к снижению эффективности гидролиза. У прокариот все 14 субъединиц идентичны и, следовательно, протеасома содержит протеазных центров. У эукариот три из семи -субъединиц имеют треонинпротеазные каталитические центры разной субстратной специфичности, то есть каждая протеасома имеет 6 протеазных центров. Известно, что субъединица 1 обладает каспазоподобной активностью (гидролизует пептидную связь после отрицательно заряженных а.о.), субъединица 2 – трипсиноподобной активностью, то есть гидролизует пептидную связь преимущественно после положительно заряженных а.о., тогда как 5 – химотрипсиноподобной активностью, то есть гидролизует пептидную связь после объемных гидрофобных а.о. Все протеиназные центры обращены во внутреннюю протеолитическую полость, образованную -субъединицами, доступ субстрата к ним возможен через пору, сформированную субъединицами [Almond J.B., Cohen G.M., 2002].

Протеасомы ответственны за избирательную деградацию белков в клетке и, таким образом, играют ключевую роль в таких клеточных процессах, как регуляция апоптоза, пролиферации и клеточного цикла, противоопухолевой иммунной системы, неоангиогенеза, прогрессии и метастазирования опухоли. Протеасомы могут быть вовлечены в регуляцию инвазии и метастазирования злокачественных опухолей путем регуляции содержания и активности различных регуляторных белков [Girnita L., Kim W.Y.,]. Процессы прогрессирования и метастазирования злокачественных новообразований связаны с активностью рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), разрушение которого регулируется внутриклеточной убиквитин-протеасомной протеолитической системой. Кроме того, протеасомы могут непосредственно регулировать процессы клеточной локомоции, в которых значительная роль принадлежит актинсвязывающим белкам. В настоящее время активно изучается роль убиквитин-зависимого протеолиза в патогенезе злокачественных образований различных локализаций [Li B.,2000, Chen C2006, Voutsadakis I.A.]. Однако активность и субъединичный состав протеасом при метастазировании злокачественных новообразований исследованы недостаточно. Последнее касается, в том онкологической заболеваемости.

К числу социально-значимых онкологических заболеваний относят рак молочной железы, который занимает 1-е место по заболеваемости у женщин и составляет 20% среди женской онкопатологии, рак тела матки, составляющий 7,2%; злокачественные опухоли головы и шеи, которые в общей структуре онкологической заболеваемости занимают шестое ранговое место и составляют в среднем 16-18%; рак мочевого пузыря – 4,5% (8 место);

рак почки – 4,3% (9 место). В последние годы сохраняется тенденция к неуклонному росту заболеваемости по всем вышеперечисленным локализациям.

протеасом в злокачественных новообразованиях во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами злокачественных новообразований и создать новые подходы к прогнозированию течения заболеваний и их лечению. Литературные источники не обладают достаточной информацией о протеасомной системе в различных злокачественных новообразованиях, что делает данную проблему особенно актуальной и значимой для дальнейшего изучения.

Целью исследования четвертого этапа явилось изучение активности протеасом и их субъединичного состава в злокачественных опухолях различных локализаций во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами заболевания.

Задачи исследования:

1. Определить тотальную активность и активность 20S и 26S пулов протеасом и их субъединичный состав в тканях плоскоклеточных карцином головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, почки, мочевого пузыря.

2. Сопоставить значения тотальной активности и активности пулов протеасом (20S и 26S) с субъединичным составом протеасом в опухолевой и неизмененной тканях при плоскоклеточных карциномах головы и шеи, раке эндометрия, раке почки, раке мочевого пузыря.

3. Сопоставить показатели субъединичного состава протеасом с клиникоморфологическими параметрами заболевания, такими как размер опухоли, стадия метастазирования, степень дифференцировки опухоли при опухолях различных локализаций.

Результаты исследования существенно расширят представления о биологической роли протеасом в механизмы опухолевого роста и метастазирования.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ О ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены образцы операционного и биопсийного материала опухолевых и неизмененных тканей больных опухолями головы и шеи, раком эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря, взятых во время операции или эндоскопических процедур. Всего собрано образцов тканей опухолей. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288), получено разрешение этического комитета института.

1.1.1. Материал и объект исследования Материалом для исследования служили послеоперационные образцы опухолевой и визуально неизменной ткани, находящейся на расстоянии не менее 1 см от границы опухолевого очага. Также в исследование были включены образцы биопсийного материала опухолевой и неизмененной ткани. Всего было набрано 37 образцов плоскоклеточных карциномам головы и шеи, 49 образцов рака эндометрия, 58 образцов рака молочной железы, 37 образцов рака почки, 39 образцов рака мочевого пузыря. У всех больных, включенных в исследование, диагноз рака был морфологически верифицирован. Также была проведена морфологическая верификация неизмененной ткани.

После забора образцы изучаемых тканей (опухолевая и неизмененная ткани), взятые из операционного материала, очищали от участков некроза и кровоизлияний, замораживали и хранили при -80 оС.

1.1.2. Методы исследования.

Во всех изучаемых тканях проводилось определение тотальной химотрипсиноподобной активности протеасом и активности 20S и 26S пулов протеасом. На первом этапе для определения тотальной активности протеасом и активности 20S и 26S пулов протеасом из изучаемых тканей получали осветленные гомогенаты. Для этого замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, мМ дитиотреитол, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 минут при 10000g и 4оС.

Фракционирование протеасом. Все процедуры проводили при 4°С. Белки осветленных гомогенатов фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 26S-протеасомами, получали добавлением сульфата аммония до 40% насыщения, фракцию 20S-протеасом – добавлением сульфата аммония до 70% насыщения [Абрамова Е.Б., 2006].

Определение активности протеасом. Химотрипсиноподобную активность тотального пула протеасом, содержащего формы 26S и 20S, определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом [Ben-Shahar S., 1999].

Реакционная смесь для определения активности тотального пула протеасом и пула 26S протеасом содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакционная смесь для определения активности пула 20S протеасом имела такой же состав за исключением MgCl2 и АТФ. Реакцию проводили при 370С в течение 20 мин.

Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «Hitachi-850»

(Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1мг белка.

Содержание белка определяли по методу Лоури [Lowry, O.H. 1951].

полиакриламидном геле. Пробы наносили в буфере, содержащем 0,0625М трис-НСl (pН 6,8), 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий.

Вестерн блоттинг. После электрофореза белков осветленных гомогенатов в 13%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия осуществляли перенос полипептидов на нитроцеллюлезную мембрану Hybond-ECL (Amersham, США). Мембрану инкубировали в течение 2 часов при 20С в буфере TNT, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20. Затем мембрану инкубировали в том же буфере, содержащем 5%-ное обезжиренное молоко и моноклональные антитела к субъединицам 123567 или LMP7 (Santa Cruz, США) или Rpt6 (Biomol International, США) или поликлональные антитела к субъединицам LMP2 и PA протеасом в разведении 1 : 2500 (Santa Cruz, США), отмывали несколько раз буфером TNT и инкубировали в течение 1 часа в буфере TNT с 5%-ным обезжиренным молоком и антителами к IgG мыши или кролика, конъюгированными с пероксидазой, в разведении 1: 10000. После отмывки мембрану подвергали стандартной обработке системой хемилюминесцентной детекции белков (Amersham, США). Плотность полос была определена с помощью стандартной компьютерной программы «Image J». Результаты выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани, где за 100% брали содержание субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

1.1.3. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 8.0. Проверка нормальности распределения исследуемых выборок проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. В таблицах все результаты представлены как m±M, где m-среднее выборочное, M – ошибка среднего. Различия считались