«КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЕ Монография Под редакцией академика АМТН, д.м.н., профессора А.Н. Лищука Тула – 2011 УДК 611-013.11; 616-003.9 Иванов Д.В., Хадарцев А.А. Клеточные технологии в ...»

Иванов Д.В., Хадарцев А.А.

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В

ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЕ

Монография

Под редакцией

академика АМТН, д.м.н., профессора

А.Н. Лищука

Тула – 2011

УДК 611-013.11; 616-003.9

Иванов Д.В., Хадарцев А.А. Клеточные технологии в восстановительной медицине: Монография / Под ред. А.Н. Лищука.– Тула: Тульский полиграфист, 2011.– 180 с.

В монографии даны основные сведения о современном взгляде на клеточные технологии с позиций восстановительной медицины. Изложены основные понятия применяемые в клеточной биологии. Осуществлён экскурс в историю развития клеточных технологий, который позволяет понять роль советских и российских учёных в данном разделе науки. Описаны разработки авторов по получению и использованию эндометриальных стволовых клеток в восстановительной медицине. Представлен опыт по применению клеточных технологий в лечении поражений сердечно-сосудистой системы, заболеваний печени, метаболических нарушениях и использовании клеточных технологий у спортсменов. Рассмотрены основные законодательные моменты существующие не только в РФ, но и в мире, оказывающие влияние на развитие клеточных технологий.

Издание рассчитано как на специалистов широкого профиля (биологов, клиницистов), так и на не подготовленного читателя.

Рецензенты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Г. Зилов Член-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор Н.А. Фудин ISBN 978-5-88422-434- © Иванов Д.В., Хадарцев А.А., © Тульский полиграфист, 2  

ПРЕДИСЛОВИЕ

Стволовые клетки (СК) от взрослого организма клинически используются в лечении гематологических заболеваний, таких как лейкемия, более 40 лет. Эти клетки получают из костного мозга пациента. В последние годы их стали получать из крови пуповинного канатика, жировой ткани и менструальной крови.

СК обладают отличительными от других клеток свойствами, а именно: они недифференцированные, незрелые, способны к пролиферации, самообновлению, превращению в дифференцированные клетки и регенерирующие ткани и, особенно важно, что при делении они всегда дают себеподобную клетку. Имеются два основных вида клеток: эмбриональные и неэмбриональные, к которым относятся, например фетальные клетки. Эмбриональные СК (ЭСК) являются плюрипотентными, потому что они могут дифференцироваться во все типы клеток. В отличие от них неэмбриональные СК являются мультипотентными, так как их потенциал дифференцироваться в различные типы клеток ограничен. Также различие между ними – в превалировании и большем потенциале к спонтанной дифференцировке у эмбриональных, чем у неэмбриональных клеток.

В последние десятилетие активно разрабатывается возможность применения в клинической медицине клеточных технологий. На которые возлагаются большие оптимистические надежды в лечении заболеваний считавшихся ранее не излечимыми.

Взлёт научного интереса к данной теме стал возможен после получения эмбриональных СК в 1998 году (Thomson J.A. et al., 1998).

В настоящее время уже получено более 225 линий эмбриональных клеток. В научных исследованиях активно разрабатываются все типы и виды клеток (Трактуев Д.О. и соавт., 2006; Иванов Д.В. и соавт., 2006; Репин В.С. и соавт., 2007; Потапов И.В., Кириллов И.А., 2007; Сухих Г.Т. и соавт., 2007; Бокерия Л.А. и соавт., 2009; Хадарцев А.А. и соавт., 2009; Иванов Д.В., 2009;

Сабурина И.Н. и соавт., 2009; Мороз В.В. и соавт., 2009). ЭСК получаются из внутренней клеточной массы бластоцисты, которая формируется через 7 дней после оплодотворения (фертилизации) яйцеклетки. Неэмбриональные СК получают из органов и тканей   после развития трёх зародышевых листков (экто-, мезо-, эндодермы). Основное отличие заключается в том, что неэмбриональные СК коммитированны только на одну линию дифференцировки (Tuch B.E., 2006).

На лабораторных животных исследованы эффекты после применения клеток в коррекции повреждений внутренних органов таких как печень (Киясов А.П. и соавт., 2006; Ярыгин К.Н., 2008;

Долгих М.С., 2008; Asahina K. et al., 2006; Lorenzini S., Andreone P., 2007; Ogawa S., Miyagawa S., 2009; Zhou P. et al., 2009; Kung J.W.

et al., 2010), поджелудочная железа (Bouwens L., Rooman I., 2005;

Roche E. et al., 2006; Zhao Y. et al., 2006; Noguchi H., 2007; Levicar N.

et al., 2007; Lee D.D. et al., 2008; Vija L. et al., 2009; Guo T., Hebrok M., 2009; Song W.J. et al., 2009), сердце (Кругляков П.В. и соавт., 2006;

Станков Д.С. и соавт., 2010; Parmacek M.S., 2006; Jujo K. et al., 2008; Reinecke H. et al., 2008; Kim H. et al., 2009; Joggerst S.J., Hatzopoulos A.K., 2009; Tang X.L. et al., 2010; Wojakowski W. et al., 2009), сосуды (Потапов И.В., Кириллов И.А., 2007; Eichmann A.

et al., 2005; Bailey A.S. et al., 2006; Nakano M. et al., 2007; Yoder M.C.

et al., 2007; Otsu K. et al., 2009), а также поражение спинного (Сухих Г.Т. и соавт., 2007; Козлова Е.Н., 2008; Pfeifer K. et al, 2004; Lim P.A., Tow A.M., 2007; Lee K.H. et al., 2007; Cao Q. et al., 2010) и головного мозга (Соколова И.В. и соавт., 2006; Цыб А.Ф. и соавт., 2006; Horita Y. et al., 2006; Taupin P., 2006; Shindo T. et al., 2006; Sykov E., Jendelov P., 2007; Srivastava A.S. et al., 2008; Obermair F.J. et al., 2008; Walker P.A. et al., 2009; Srivastava M.V., 2009; Xiong Y. et al., 2010).

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

строения живого организма, или за изучение его физиологических отправлений, Впервые в отечественной науке использовал термин «стволовая клетка» профессор кафедры гистологии и эмбриологии Императорской Военно-медицинской академии А.А. Максимов.

В 1909 году он сформулировал данное определение в статье, опубликованной на немецком языке «Лимфоцит как общая стволовая клетка разнообразных элементов крови в эмбриональном развитии и постфетальной жизни млекопитающих».

Несомненной заслугой А.А. Максимова является то, что он выдвинул положение о СК во взрослом организме, в частности, о стволовой клетке крови.

Необходимо сказать ещё об одном нашем учёном с мировым именем, внёсшим неоценимый вклад в развитие клеточных технологий. Александр Яковлевич Фриденштейн – уникальный учёный и исследователь – в различных областях биологии и медицины. Анализируя работы А.А Максимова в статьях, докладах и лекциях, сопоставляя их с результатами, полученными на моделях селезёночных и агаровых колоний, Александр Яковлевич сформировал у своих современников интерес к кругу этих работ и проблем, поднятых в них, а понятие «СК» широко вошло в научную терминологию. Именно проблемам СК кроветворной ткани были посвящены многие годы в творческой жизни Александра Яковлевича. Полученные данные о пролиферативных и дифференцировочных потенциях впервые выявленной категории стромальных клеток-предшественников позволили сформулировать понятие о стволовых стромальных клетках кроветворной и лимфоидной тканей (Фриденштейн А.Я., Куралесова А.И., 1971; Friedenstein A.J., 1980).

В 1667 году J.-B. Denis во Франции сообщает о первой попытке переливания крови от овцы человеку. Фактически была выполнена трансплантация ксеногенных клеток. Это одно из первых, зафиксированных по дате событий. На самом деле попытки использования клеток крови были известны намного раньше. Ещё в 12 веке монахи с целью омоложения вводили себе кровь молодых послушников, получая при этом «омолаживающий эффект».

В 1884 году Вильяме подкожно имплантировал больному сахарным диабетом фрагменты ткани поджелудочной железы овцы.

1889 год – Чарльз Эдуард Броун-Секар (1817–1894) предположил, что «слабость пожилых мужчин обусловлена снижением функции яичек». Он активно развивал свою идею и в возрасте 72 лет как истинный исследователь сделал себе подкожную инъекцию экстракта из тестикул собаки и морской свинки, после чего на заседании Французского научного общества сообщил о значительном улучшении физического самочувствия.

В 1890 году Томсон в Нью-Йоркском университете провёл эксперименты по пересадке клеток головного мозга от кошки собаке.

В 1906 году была выполнена первая успешная пересадка роговицы.

В 1907 – первое успешное переливание АВО-совместимой крови.

В 1922 году в США надпочечники плода были пересажены двум пациентам с болезнью Аддисона, после чего наблюдали длительный терапевтический эффект. Надо отметить, что это были пересадки фетальной абортной ткани.

Во Франции в 20-х годах прошлого века врач С. А. Воронов использовал в этих целях экстракты яичек шимпанзе. Существует версия, что именно С.А. Воронов послужил прототипом профессора Преображенского в известном романе М.А. Булгакова «Собачье сердце». Ещё одной интересной деталью в «Собачьем сердце» являются операции по омоложению. Анализ научнопопулярной и общественно-политической литературы 1920-х годов показал, что операции по омоложению – это не фантастика, а одна из самых ярких примет того времени (Мягков Б., 1957). Михаил Афанасьевич Булгаков был по образованию врач, причем с очень обширной клинической практикой. В его отчетах за период работы земским врачом отмечено, что за год он принимал 14000 пациентов. Он очень тщательно изучал материалы, касающиеся проведения «операций по омоложению». За хирургическими уточнениями писатель обращался к своему киевскому другу и врачу Н.Л. Гладыревскому, который работал в Москве в клинике профессора А.В. Мартынова, ещё в 1924 году в своей больнице осуществившего несколько опытов по омоложению.

В 1928 году в Италии была произведена первая безуспешная пересадка поджелудочной железы пациенту с инсулинозависимым сахарным диабетом. Начавшаяся в середине XX века эра успешной пересадки органов надолго приостановила фундаментальные и прикладные разработки с трансплантацией соматических клеток.

В 1931 году П. Ниханс в Швейцарии спас от смерти пациентку, которая после ошибочного удаления околощитовидной железы находилась в коматозном состоянии. Он получил патент на заморозку функционально полноценных клеток животных. В дальнейшем терапия с помощью замороженных клеток животных получила его имя. Интересно, что в данный промежуток времени П. Ниханс разрабатывал метод получения растворимого кофе из замороженного сырья для компании «Nestle».

Приказ Министра Здравоохранения СССР Смирнова С.А.

«О широком внедрении в клиническую практику методов академика Филатова, разработанного в 1932 году» датируется февраля 1951 года. Известен этот приказ тем, что является одним из первых и единственным приказом, в котором было чётко прописан алгоритм получения фетальных тканей и их применения в клинике.

В 1951 году – первая демонстрация выживаемости летально облучённых животных после трансплантации костного мозга, которую выполнила группа учёных под руководством Lorenz (Cell Therapy-Technologies,Markets and Companies. «JainPharmaBiotech», 2005).

В середине 50-х годов E. Thomas сделал пересадку костного мозга после радиационного лечения острой лейкемии. Донором костного мозга выступила сестра-близнец. В это же время разрабатывается метод криопресервации костного мозга человека.

1958 год – G. Mathe произвёл трансплантацию костного мозга облучённым физикам-ядерщикам. Она потерпела фиаско из-за отсутствия иммуносупрессии, а совместимость определялась только по группам крови.

В 1961 году выполнена первая пересадка фетальных гематогенных предшественников двум пациентам с апластической анемией.

В 60–70-х годах разработаны методы криопресервации спермы и опубликованы первые положительные результаты искусственного осеменения (Edwards R.G., Brody S.A., 1995).

C 1966 – волна операций по пересадке поджелудочной железы, предпочтение отдавалась фетальной поджелудочной железе из-за большого количества эндокринной ткани. В это же время начинаются попытки трансплантации изолированной эндокринной ткани, как более эффективной технологии лечения больных диабетом (Шумаков В.И. и соавт., 1995).

В 1965–1970 гг. сразу в нескольких лабораториях научились выделять островки Лангерганса грызунов.

В 1968 году группой профессора E.D. Thomas выполнена первая успешная трансплантация HLA-совместимого костного мозга больному лейкемией (Buckner C.D. et al., 1970).

В 1972 году W.F. Ballinger и P.E. Lacy экспериментально обосновали эффективность трансплантации островковых клеток поджелудочной железы для лечения сахарного диабета (Cell Therapy-Technologies, Markets and Companies. «JainPharmaBiotech», 2005).

В последующие 10 лет в США, СССР, Канаде и Европе стали чаще появляться сообщения об успешной пересадке островковых клеток пациентам, приводящей к временной, а иногда и к устойчивой ремиссии (Шумаков В.И. и соавт., 1995).

В 1975 году была осуществлена первая успешная пересадка стволовых гемопоэтических клеток фетальной печени при наследственном ADA-дефиците – отсутствии фермента аденозиндезаминазы в клетках иммунной системы (Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998).

В 1981 году M.J. Evans и M.H. Kaufman выделили эмбриональные СК из бластоцисты мыши. G.R. Martin вводит понятие «эмбриональная СК». Дальше в многочисленных работах демонстрируются плюрипотентные возможности дифференцировки обнаруженных клеток и возможности их применения для клеточной трансплантологии (Evans M.J., Kaufman M.H., 1981).

В 1985 году шведские неврологи опубликовали первые положительные результаты лечения болезни Паркинсона пересадкой хромаффинной ткани фетальных надпочечников в стриатум (Backlund E.O. et al., 1985). Оказалось, что донорские ДОФАпродуцирующие клетки способны контролировать гиперкинез и другую симптоматику заболевания у пациентов, не реагирующих на лекарственную терапию. С тех пор клеточные пересадки шаг за шагом развиваются в медицине многих стран мира, когда прекращаются стандартные медицинские услуги по страховке.

Пересадки гематогенных и мезенхимальных СК стали регулярной медицинской услугой в гематологии, онкологии, в случае некоторых иммунодефицитов (Репин B.C. и соавт., 2007).

В 1986 году проходит первое клиническое испытание трансплантации островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом (Cell Therapy-Technologies, Markets and Companies. «JainPharmaBiotech», 2005). В последствии руководитель группы Paul Lacy становиться основателем Общества Клеточной Трансплантации (Cell Transplant Society).

В 1988 году во Франции проведена первая успешная трансплантация клеток пуповинной крови 5-летнему мальчику, страдающему от анемии Фанкони (Gluckman E. et al., 1989).

В 1989 году J. Touraine совместно с коллегами осуществили внутриматочную трансплантацию СК фетальной печени в развивающейся зародыш человека, имплантированный в матку. В результате предотвратили развитие семейной талассемии у детей.

В 1991 году опубликованы данные о лечении 28 пациентов с наследственными дефектами метаболизма (болезнь Гоше, Фабри, Нимана-Пика, болезни «накопления» и др.) путем трансплантации фетальных донорских клеток печени в зародыш in utero (Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998).

В 1992 году – первые трансплантации гепатоцитов больным с печеночной недостаточностью (Mito M. et al., 1992).

В 1996 году – первая клеточная генотерапия в клинике – трансплантация аутологичных гепатоцитов, трансфецированных геном рецептора липопротеидов низкой плотности детям с семейной гиперхолестеринемей (Raper S.E. et al., 1996). В этом же году начинаются клинические испытания по лечению рассеянного склероза аутологичными гемопоэтическими клетками (Fassas A. et al., 1997).

В 1998 году J.A. Thomson et al. описали алгоритм выделения эмбриональных СК из бластоцисты человека (Thomson J.A.

et al., 1998). В этом же году осуществлена первая в мире трансплантация клеток аутологичной пуповинной крови из частного банка (Ferreira E. et al., 1999).

В 2001 году впервые опубликованы данные по введению клеток в сердце человека для лечения сердечной недостаточности после инфаркта миокарда (Menasche P. et al., 2001).

В 2001 году Джорж Буш накладывает запрет на исследование в области эмбриональных СК в США по политическим и религиозным соображениям.

В 2002 году опубликованы результаты лечения детей с нарушенным остеогенезом с помощью аллогенных мезенхимальных (стромальных) клеток костного мозга (Horwitz E.M. et al., 2002).

В России в 2000–2004 годах бурный расцвет применения различных видов клеток в клинической практике. Появляется большое количество публикаций в прессе противоречивого характера о результатах применения клеток.

В 2004 году корейский учёный W.S. Hwang (2004) получил линию аутологичных эмбриональных СК человека с помощью переноса ядра соматической клетки.

31 декабря 2004 года Приказ Минздравсоцразвития от декабря 2004 г. № 346 «Об организации выдачи разрешений на применение медицинских технологий». Данный приказ сделал практически невозможным получение лицензии на применение клеточных технологий в клинике.

В 2005 году – создание индивидуальных линий эмбриональных СК методом переноса ядра соматической клетки пациента (Hwang W.S., Poh S.I. et al., 2005).

В 2005 году в России начинаются массовые проверки всех медицинских учреждений, в которых выполнялись клеточные трансплантации. Возбуждаются уголовные дела, накладываются административные взыскания за нарушения в работе медицинских учреждений с использованием клеточных технологий.

В 2008 году A.J. French et al. впервые воспроизвели начальные этапы клонирования человека с использованием метода SCNT (перенос ядра соматической клетки).

В марте 2009 года президент США Барак Обама объявил об отмене запрета на финансирование из федерального бюджета исследований эмбриональных СК.

В апреле 2009 года в России сформирована рабочая группа по доработке проекта и концепции технического задания проекта Федерального закона «О применении биомедицинских технологий в медицинской практике»», согласно Приказу №80, подписанному Министром здравоохранения и социального развития РФ Голиковой Т.А.

В 2010 году появляются несколько законопроектов о регламенте применения клеточных технологий в РФ (Иванов Д.В. и соавт., 2010).

Кратко описанные в хронологическом порядке события так или иначе повлияли на развитие клеточных технологий в мире и в России. Сейчас можно говорить о новом витке развития событий с позитивной тенденцией.

КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

Клеточная терапия только сейчас начинается выделяться в самостоятельную науку, которую пока ещё не преподают в медицинских образовательных учреждениях России. Как наука, клеточная терапия замыкает на себе сразу несколько больших разделов медицины: гистологию, физиологию, иммунологию, хирургию, терапию, эндокринологию и, естественно, биологию развития. Большое количество новых терминов и понятий, возникающих с развитием клеточных технологий, начинает вводить в затруднение даже врачей, которые общаются с биологами, работающими с культурами клеток. Чётко прописанные понятия и определения дают возможность легко и быстро разобраться в данной ситуации и играют важную в роль в понимании происходящих процессов. Можно привести несколько достаточно устоявшихся основных терминов клеточной терапии.

В настоящей монографии, если по контексту не требуется иного значения, приведённые ниже термины имеют значение, указанное напротив каждого из них:

Клетка (англ. – cell) – основная структурно-функциональная единица всех живых организмов, окружённая мембраной. Клетка является элементарной (простейшей) живой системой, которая (в отличие от вирусов) способна самостоятельно воспроизводиться.

Стволовые клетки, СК (англ. – stem cells) – группа клетокпредшественников, обладающих способностью к самообновлению и дифференцировке в специализированные ткани.

Эмбриональные СК, ЭСК (англ. – embryonic stem sells) – а) плюрипотентные – клетки эмбрионов и внезародышевых оболочек до имплантации (с 11 дня после оплодотворения); б) клетки эмбриона с постимплантационного периода до 9 недели, способные дифференцироваться в целостный орган или тканевую структуру.

Эмбриогенез (англ. – embryogenesis) – 1) в эмбриологии – развитие организма от оплодотворения до рождения; 2) в акушерстве – период внутриутробного развития (первые 8 недель), в течение которого преобладают процессы формирования основ организации и закладки органов.

Постнатальные СК (англ. – postnatal stem cells) – обозначаются клетки, находящиеся в организме после родов. Они локализуются в костном мозге, пуповинной крови, а также в других органах и тканях, способные трансформироваться в разные типы клеток (мультипотентные клетки).

Гемопоэтические СК (англ. – hemopoietic stem cells) – находящиеся в кроветворных органах и крови, способные давать начало различным росткам кроветворения.

Мезенхимальные (стромальные) СК, МСК (англ. – stromal stem cells) – СК, находящиеся в костном мозге, жировой ткани, обладающие способностью к дифференцировке в остеобласты, хондроциты, теноциты, адипоциты, миобласты, фибробласты.

Репродуктивное клонирование (англ. – reproductive cloning) – клонирование с целью создания нового организма, генетически идентичного исходному.

Клонирование (англ. – cloning) – искусственное создание копий, генетически идентичных исходным: ДНК, клеток, тканей, организмов.

Клон (англ. – clon) – линия клеток, генетически идентичных клетке, от которой они происходят.

Аллогенные клетки (англ. – allogenic cells) – клетки, относящиеся к другой особи того же биологического вида. Например: клетки от человека к человеку.

Аутологичные клетки (англ. – autologus cells) – собственные клетки пациента.

Ксеногенные клетки (англ. – xenogenic cells) – гетерологичные клетки, полученные от представителя иного, чем реципиент вида; (прим.авторов к примеру, для человека это клетки свиньи).

Индуцированные плюрипотентные СК (на английской аббревиатуре «iPS») репрограммированные с помощью четырёх транскрипционных факторов дифференцированные клетки.

Зигота (англ. – zygote) – диплоидная клетка, образующаяся при слиянии мужской и женской гамет.

Бластоциста (англ. – blastocyst) – ранняя стадия развития зародыша, предшествующая гаструле, имеет форму пузырька.

Внутренняя клеточная масса (англ. – inner cell mass, ICM) – скопление истинно СК в бластоцисте, ранней стадии развития эмбриона.

Фетус (англ. – fetus) – плод, нерожденный организм. У человека, называется с 9 недели после зачатия и до момента рождения.

Фетальные СК (англ. – fetal stem cells) – клетки полученные из фетуса.

Ткани (англ. – tissue) – совокупность гистологических элементов (клеток и элементов межклеточного вещества).

Орган (англ. – organ) – любая часть тела выполняющая специфическую функцию.

Клеточные технологии (англ. – cell technology) – биомедицинские технологии с использованием клеток и клеточноинженерных конструкций.

Клеточная терапия (англ. – cell therapy) – применение различных видов клеток в лечении заболеваний человека.

Соматические клетки (англ. – somatic cells) – все клетки организма, формирующие тело и не являющиеся половыми клетками.

Формирование пространственной организации эмбриона в основном изучалось на шпорцевой лягушке Xenopus laevis, зародыши которой являются удобными объектами для экспериментов. Процесс эмбриогенеза позвоночных разделяют на три периода:

1. Дробление оплодотворённого яйца на множество мелких клеток, которые формируют слой наподобие эпителия.

2. Гаструляция и нейруляция, последовательные взаимосвязанные процессы в результате которых происходит образование полости первичной кишки и нервной трубки. В результате гаструляции полая сферическая бластула превращается в трёхслойную структуру: внутренний слой, т.е. стенку первичной кишки, называют энтодермой, наружный слой, который так и остался снаружи – эктодермой, а между ними промежуточный рыхлый слой ткани, состоящей из первичной и вторичной мезенхимы – мезодермой. Эти три первичных зародышевых листка, характерные для всех высших животных. Организация трёхслойного эмбриона в общих чертах соответствует организации взрослого животного с пищеварительной трубкой внутри, эпидермисом снаружи и органами соединительнотканного происхождения между ними (Fink R.D., McClay D.R., 1985). Процесс образования нервной системы из эктодермы называется нейруляцией.

Трубка, образовавшаяся из эктодермы, называется нервной трубкой, из которой в процессе дальнейшего развития возникает спинной и головной мозг.

3. Органогенез, в результате которого возникают различные органы и части тела. В процессе пространственной организации зародыша, клетки перемещаются, принимают определённые позиционные значения, определяемые адгезионными свойствами их поверхности, а также их внутренним химизмом. Клетки одного типа стремятся взаимодействовать между собой и отделяются от иных, отличающихся от них клеток. Таким образом происходит стабилизация пространственной организации и обеспечивается способность клеток к спонтанной сортировке при их искусственном смешивании. Изменение характера адгезионных свойств лежит в основе морфогенетических процессов.

Поскольку характер позиционных значений данного класса клеток проявляется через изменение свойств клеточной поверхности, он может управлять миграцией других популяций эмбриональных клеток в процессе сборки сложных тканей или органов.

Эти периоды не имеют чётких границ и могут в значительной степени перекрываться (Browder L.W., 1986).

В связи с увеличивающимся интересом к клиническому применению СК, практикующим врачам необходимо знать, при каких заболеваниях эти клетки могут быть использованы, поэтому  нами была разработана собственная классификация различных видов клеток, ориентированная на практическое применение в клинической практике.

1. По срокам развития:

a. Эмбриональные c. Постнатальные ii. Клетки взрослого организма 2. По отношению к реципиенту a. Собственные (аутологичные) i. Аллогенные (фетальные, пуповинной крови и др.) 3. По фенотипу a. Гемопоэтические b. Мезенхимальные (стромальные) c. Нейрональные При написании работы мы опирались на данную классификацию.

Эмбриональные клетки – клетки, получаемые из эмбриона.

У человека эмбриональный период длится до конца 8-ой недели внутриутробного развития. С 9-ой недели, когда уже все главные органы и структуры сформированы, начинается фетальный период, т.е. эмбрион считается фетусом. Наибольшим вниманием у исследователей пользуются эмбриональные СК (ЭСК), которые получают из внутренней клеточной массы бластоцисты.

Именно на ЭСК возлагается мечта человечества о неисчерпаемом источнике жизни. Человеческие ЭСК были выделены в 1998 году (Thomson J.A. et al., 1998; Reubinoff B.E. et al., 2000), что окончательно сделало регенеративную медицину и конструирование тканей реальной возможностью для лечения заболеваний человека в будущем. ЭСК обладают тотипотентностью – способностью дифференцироваться в любые клетки организма. Самое понятие СК подразумевают такой вид клеток, при делении которых возникает точно такая же СК и вторая клетка, способная к дифференцировке в специализированную клетку.

Фетальные клетки – клетки, получаемые на определённом этапе развития организма, в частности у человека в период с 9ой до рождения. Фетальные клетки на этапах развития проходят от плюрипотентных способных давать множество разных типов дифференцированных клеток в определённом типе ткани до унипотентных клеток, т.е. способных давать строго определённые типы конечных дифференцированных клеток.

Постнатальные клетки – клетки, получаемые после рождения организма. Сюда относятся клетки пуповинной крови, которые получают из пуповинного канатика, соединяющего мать с ребёнком. Также к постнатальным клеткам относятся все клетки взрослого организма, которых в настоящее время насчитывается более 225 видов. Для примера, специализированные клетки кожи – фибробласты, клетки печени – гепатоциты, клетки сердца – кардиомиоциты и т.д.

По отношению к реципиенту клетки разделяются на аутологичные, т.е. собственные клетки, и донорские. Аутологичные клетки получаются из собственных тканей реципиента, например крови, жира, кожи и обладают антигенами соответствующими антигенам реципиента, что позволяет им преодолевать процесс отторжения.

Донорские клетки подразделяются на аллогенные и ксеногенные. Аллогенные – клетки относящиеся к другой особи того же биологического вида. Т.е. в отношении человека это клетки от другого человеческого органа или ткани. К данному типу клеток относятся фетальные клетки, клетки пуповинной крови, донорская кровь. Ксеногенные клетки – клетки, получают от представителя иного, чем реципиент, вида. Для человека ксеногенные клетки – это клетки от свиньи, кроликов, овцы и т.п.

Они несут на себе большое количество чужеродных белков, что приводит к выраженным иммунологическим реакциям, в частности отторжения.

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) дают начало гранулоцитарным, моноцитарным, эритроидным, мегакариоцитарным и лимфоидным колониям. Однако наибольший интерес представляют ГСК, которые развиваются следующим образом.

У эмбриона гемопоэз начинается в желточном мешке, но по мере развития эта функция переходит к печени плода и, наконец (после 20-ой недели внутриутробного развития у человека), к костному мозгу, где и продолжается в течение всей жизни. ГСК, дающая начало всем элементам крови, плюрипотентна и заселяет другие гемо- и лимфопоэтические органы и самовоспроизводится, превращаясь в новые СК. ГСК характеризуются экспрессией CD34 и Thy1(CD90) и отсутствием CD38, CD33, и HLADR (Baum C.M. et al., 1982; Craig W. et al., 1993; Sutherland H.J. et al., 1989). ГСК также не имеют экспрессии большого количества маркеров характерных для зрелых клеток крови и это важный фактор, благодаря которому идентифицируют и изолируют клетки. CD34 – это трансмембранный гликопротеин, экспрессируемый не только юными гемопоэтическими клетками, но и фибробластами и сосудистым эндотелием. У человека CD34 является маркером стволовых и прогениторных клеток. Необходимо отметить, что ГСК экспрессируют адгезионные молекулы такие как L-селектин (Sackstein R., 1997) и интегрин (Coulombel L.

et al., 1997), а также хоумингассоциированную молекулу клеточной адгезии (Н-САМ) (Deguchi T. et al., 1999). В последнее время ГСК изолируют с помощью эндоглина (CD150).

Мезенхимальные СК (МСК) – это прогениторные клетки, способные дифференцироваться в мезодермальные ткани, включая остеобласты, хондроциты, адипоциты. В большинстве случаев их получают из костного мозга, а также из большого разнообразия взрослых и фетальных тканей.

Фенотипически МСК экспрессируют маркеры, некоторые из которых, к сожалению, не являются специфическими маркерами. Общепринято, что взрослые человеческие МСК не экспрессируют маркеры гемопоэтических клеток, такие как CD45, CD34, CD14, или CD11. Они также не экспрессируют костимулирующие молекулы, такие как CD80, CD86, или CD40 или молекулы адгезии CD31 (тромбоцит/эндотелиальной клетки молекула адгезии [PECAM]-1), CD18 (лейкоцит функциональноассоциированный антиген-1 [LFA-1]), или CD56 (молекула адгезии нейрональной клетки-1), но они могут экспрессировать CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71, и Stro- а также хорошо известные адгезионные молекулы CD106 (молекула адгезии сосудистой клетки [VCAM]-1), CD166 (молекула адгезии активированного лейкоцита [ALCAM]), межклеточные адгезионные молекулы (ICAM)-1, и CD29 (Haynesworth S.E. et al., 1992; Galmiche M.C. et al., 1993; Pittenger M.F. et al., 1999; Conget P.A., Minguell J.J., 1999; Sordi V. et al., 2005; Le Blanc K. et al., 2003). Существуют работы, которые описывают изоляцию МСК, как человеческих, так и от грызунов (крысы, мыши) используя отбор антител основанный на фенотипе МСК.

Некоторые исследователи используют метод негативной селекции для обогащения фракции МСК, когда удаляются гемопоэтические клетки (Baddoo M. et al., 2003); другая часть исследователей наоборот используют антитела для позитивного выделения МСК (Jones E.A. et al., 2002; Gindraux F. et al., 2007).

МСК из разных источников не экспрессируют одинаковых молекул, как на человеческих клетках, т.е., несмотря на то, что человеческие и крысиные МСК экспрессируют CD34-, имеются работы, в которых доказана вариабельность экспрессии CD34 на мышиных МСК (Peister A. et al., 2004). В основном считается, что все МСК лишены маркера ГСК CD45 и маркера эндотелиальных клеток CD31. Однако, важно отметить, что различия в экспрессии большинства поверхностных маркеров может изменяться из-за секреции дополнительных факторов дополнительными клетками при начальных пассажах и в результате экспрессия in vitro некоторых маркеров МСК может не всегда коррелировать с их экспрессией in vivo (Gronthos S. et al., 2001). Открытие МСК прославило нашего учёного А.Я. Фриденштейна (Friedenstein A.J. et al., 1970). Через некоторое время Pittenger совместно с коллегами описал возможность дифференцировки в трёх направлениях мезенхимальных клеток (Pittenger M.F. et al., 1999).

Прошло 40 лет, и в настоящее время накоплен значительный опыт в исследовании уникальных свойств МСК. Их научились извлекать из множества тканей, обнаружили мультипотентные свойства и способность создавать ткани, т.е. способность к тканевой инженерии, что делает МСК чрезвычайно перспективными для клинического применения. Поэтому клиницистам важно знать основные характеристики и свойства этой популяции клеток.

Маркеры МСК. У МСК есть отличительные особенности, в частности, они хорошо прикрепляются к пластику, способны дифференцироваться в костную, хрящевую и жировую ткани и могут быть выделены из большинства взрослых типов тканей пациента. Однако, даже если их выделять при градиенте плотности, они все равно остаются гетерогенной культурой клеток с разнообразным пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Для применения клеточных технологий в клинике необходима чёткая характеристика маркеров клеток и поэтому делались и продолжают выполняться исследования для идентификации МСК и, соответственно, лучшего выделения их, что особенно важно при выделении клеток из различных тканей.

Большинство работ выполнены на МСК полученных из человеческого и мышиного костного мозга, но постепенно увеличивается число работ по исследованию мезенхимальных клеток из других органов и тканей. Отмечено, что имеется небольшое количество вариаций между популяциями клеток, полученных из разных источников.

При определении характеристик клеток есть понятие негативных и позитивных маркеров. Если белковая молекула не определяется на поверхности клетки, то данный маркер считается негативным для клетки и, если происходит экспрессия маркера, то он считается позитивным или положительным.

Негативные маркеры. Принято, что МСК не экспрессируют CD11b (маркер иммунных клеток), гликофорин-А (маркер эритроидной линии клеток) и CD45 (основной маркер гемопоэтических клеток). CD34 (примитивный маркер ГСК) практически не экспрессируется на человеческих МСК, зато на мышиных – всегда. CD31 (маркер эндотелиальных и гемопоэтических клеток) и CD117 (маркер гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток) почти всегда отсутствуют и на человеческих и на мышиных клетках. У биологов, изучающих свойства МСК, нет категоричного позитивного маркера. Обилие сообщений от научных групп об идентификации и характеристиках клеток основывается на использовании различных субпопуляций маркеров. В клинике без чёткой характеристики клеток интерпретация результатов крайне трудна.

Позитивные маркеры. Stro-1 – хорошо и давно известный маркер МСК. Клеточная популяция негативная по маркеру Stro- не способна к формированию колоний (Simmons P.J., TorokStorb B., 1991). Негативная селекция против гликофорина-А совместно с селекцией Stro-1+ (позитивных) клеток резко увеличивает получение клеток из костного мозга – в 10 раз (Gronthos S.

et al., 2003). Клетки Stro-1+ могут стать фибробластами, поддерживающими ГСК, гладкомышечными клетками, адипоцитами, хондроцитами и остеобластами (Dennis J.E. et al., 2002).

Кроме того, экспрессия Stro-1 различается между двумя популяциями культивированных МСК, которые имели различное происхождение и способность поддерживать ГСК (Bensidhoum M.

et al., 2004). Однако указанные выше свойства не делают маркер Stro-1 основным маркером МСК. В частности, он экспрессируется не только МСК, неизвестен также аналог у лабораторных животных (мышей) и, наконец, его экспрессия уменьшается во время культуральных работ, а также использование Stro-1 ограничено в маркировании для изоляции МСК, или идентификации во время ранних пассажей (Gronthos S. et al., 2003). До конца функции антигена Stro-1 ещё не изучены, но использование его с другими МСК-маркерами является тем не менее лучшим вариантом для идентификации.

Другие маркеры МСК – CD106 или VCAM-1 (сосудистая молекула клеточной адгезии) экспрессируются клетками эндотелия сосудов и прилежащими плотными периваскулярными клетками. Считается, что CD106 (VCAM-1) совместно с Stro- представляют собой отличные маркеры человеческих МСК.

CD73 является 5/-нуклеозидазой и стимулируют адгезию лимфоцитов к эндотелию. Способность данной молекулы долго экспрессироваться в культуре относит его к маркеру МСК (Haynesworth S.E. et al., 1992). Имеется много других маркеров, которые экспрессируются МСК, однако они не выносятся на первое место из-за недостаточного постоянства экспрессии. К ним относят CD105, CD90(Thy-1), CD44, CD29, CD13, FlkCD309), Sca-1, and CD10.

Таким образом, можно сказать, что МСК типично негативны, т.е. не экспрессируют CD34, CD45, CD14, CD11b, CD19, CD79a, and HLA-DR и, наоборот, позитивны, т.е. экспрессируют Stro-1, CD29, CD73, CD90, CD105, CD166, и CD44 (Abdallah B.M.

et al., 2005; Foster L.J. et al., 2005; Dominici M. et al., 2006;

Keating A., 2006).

При анализе дифференцировки СК очень важную роль играет их тканевое происхождение. В настоящее время уже стала рутинной методика получения МСК из костного мозга, а также из тканей мезодермального происхождения, т.е. жира, мышц, костей и сухожилий. Недавно мультипотентные клетки изолировали и из других тканей не мезодермального происхождения.

В частности, проведены работы по получению пластикадгерентных МСК-подобных колоний клеток из головного мозга, селезёнки, печени, почек, лёгких, тимуса и поджелудочной железы у мышей с похожими морфологическими свойствами и иммунофенотипом после нескольких пассажей (Silva Meirelles L., 2006). А в другом исследовании мышиные МСК были получены из свежеизолированных клеток сердца, печени, почек, яичников, кожи на основании CD45–/CD31–/Sca-1+/Thy-1+ фенотипа (Blashki D. et al., 2006). Естественно возник вопрос – во всех тканях существуют специфические ниши для МСК, или они существуют автономно и не зависят от микроокружения. Ответ на данный вопрос появился достаточно быстро. С момента как Schofield в 1978 выдвинул концепцию «ниш» для СК, идея была широко поддержана и получила окончательное подтверждение в последние годы. Ниша представляет собой место или комплекс специфических условий обитания, в котором есть все необходимые элементы окружающие СК, когда они находятся в неактивном состоянии. К этим элементам относятся неСК, которые находятся с СК в контакте, благодаря экстрацеллюлярному матриксу и растворимым в нем молекулам. Из-за такого микроокружения СК находятся в неактивном состоянии, т.е. не дифференцируются. Считается, что определённые сигналы должны дойти до ниш СК и сообщить о необходимости дифференцировки СК для регенерации или репопуляции повреждённой ткани.

Где же располагаются ниши? Одним из мест их расположения является периваскулярное пространство, что было определено благодаря экспрессии у МСК, полученных из периваскулярного пространства, гладкомышечного актина (SMA) и установлении их фенотипа как CD45–/CD31–/Sca-1+/Thy-1+ клетки (Blashki D. et al., 2006). В пользу существования данной ниши, благодаря маркерам Stro-1 и CD146, МСК были обнаружены в выстилке кровеносных сосудов костного мозга и дентальной пульпы (Shi S., Gronthos S., 2003). Эти клетки также экспрессировали SMA, а некоторые – даже 3G5 маркер, который ассоциирован с клеточной поверхностью перицитов, т.е. экспрессируется перицитами. Некоторые учёные сразу же предположили, что перициты в действительности являются МСК, потому они легко могут дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, адипоциты (Doherty M.J. et al., 1999). Расположение МСК в периваскулярных нишах по всему телу даёт им возможность лёгкого доступа ко всем тканям и уверенность в том, что МСК интегрированы в процессы восстановления большинства различных тканей. Белки трансмембранной клеточной адгезии, кадхерины, функция межклеточной адгезии, миграция, дифференцировка – являются очень важными в биологии МСК. Все это тесно связано с биологией ниш других СК (Grayson W.L. et al., 2006). Продолжает оставаться в зоне научного интереса исследование молекулярных основ взаимодействия между МСК и их «соседями». Важно отметить, что никаких специфических компонентов экстрацеллюлярного матрикса, позволяющего поддерживать МСК в неактивном состоянии, в нишах не выявлено. Однако имеются чёткие доказательства того, что сам по себе экстрацеллюлярный матрикс может регулировать дифференцировку МСК, что имеет потенциал для применения в тканевой инженерии. Например, если удалить все клетки из экстрацеллюлярного матрикса, который образовался на титановой подложке после культивирования остеобластов, то при размещении в нем МСК, увеличивается количество остеогенных маркеров, таких как щелочная фосфатаза и отложения кальция (Datta N. et al., 2005).

Создание искусственного матрикса, который может мимикрировать микроокружение in vivo и регулировать нужную дифференцировку СК, наверное, самый многообещающий метод для терапевтического применения. Крайне необходима молекулярная информация о взаимодействии матрикса и МСК, наиболее вероятно с использованием интегринов, которая уже применяется в биологии ниш других систем (Campos L.S., 2005).

У всех СК, и, мезенхимальных, в частности, есть особенность или даже явление, которое называется хоуминг. Они приходят в место повреждения и начинают процессы восстановления повреждённых тканей, часть которых имеет способность восстанавливаться некоторое время местными дифференцированными клетками. Как правило, такие клетки находятся в постмитотическом состоянии. Поэтому для прихода стволовых или прогениторных клеток необходимы стимулирующие сигналы. Изучение биологии ниш СК необходимо не только для выявления того, что позволяет долго сохранять СК, но также и причин заставляющих их эмигрировать. Даже у здоровых животных МСК способны к хоумингу не только в костный мозг, но и в лёгкие и мышцы (Francois S. et al., 2006). Способность МСК кажется связанной с возможностью экспрессировать Stro-1, что позволяет позитивным по данному маркеру клеткам мигрировать и приживаться в большинстве изучаемых тканей. Считается также, что зрелые клетки, которые были повреждены в организме, способны секретировать не только сигналы для хоуминга (миграции), но и сигналы дифференцировки. К примеру, МСК из костного мозга мышей начинали миогенную дифференцировку в среде из повреждённой мышечной ткани скелетной мускулатуры и оставались неактивными в среде с неповреждёнными скелетными мышцами (Santa Maria L. et al., 2004). Проведённые работы in vitro подтвердили, что некоторые неповреждённые клетки могут индуцировать дифференцировку МСК, когда с ними осуществляется непосредственный контакт. К примеру, клетки печени способны индуцировать гепатогенез (Lange C. et al., 2005). Важно заметить, что зрелые клетки не всегда индуцируют дифференцировку МСК в своём собственном направлении. Так – непосредственный контакт с хондроцитами индуцирует остеогенез, но не хондрогенез (Gerstenfeld L.C. et al., 2003).

Ясно, что окружение вокруг МСК является крайне важным определяющим фактором их идентичности.

Зная основные направления и суть происходящих изменений, клиницисту становиться более понятен алгоритм применения МСК в лечении различных заболеваний. Сейчас продолжается разработка и поиск основных сигнальных путей и основного регуляторного гена, стимулирующего дифференцировку МСК. Возможность создать биологические стимуляторы для получения желаемой дифференцировочной программы клеток, или возможность блокировать побочные направления дифференцировки, или нежелательные направления – крайне важны в клиническом применении, особенно когда поднимается вопрос о тканевой инженерии или регенерации ткани. Так перестройка рубцово-изменённой ткани миокарда после инфаркта в костном направлении крайне нежелательна, зато необходимо получение кардиомиоцитоподобных клеток для восстановления сократимости повреждённой ткани.

Рассмотрим основные направления и регулирующие факторы хондрогенеза (образования хрящевой ткани». Хондрогенная дифференцировка МСК в лабораторных условиях (при культивировании) воспроизводит механизм образования хряща in vivo.

Маркеры, экспрессируемые при хондрогенезе, позитивно характеризуют хондроциты, полученные из МСК, включая транскрипционные факторы (sox-9, scleraxis) и гены экстрацеллюлярного матрикса – коллаген 2 и 9 типа, аггрекан, декорин и др.

(Baksh D. et al., 2004; Tuan R.S. et al., 2003). Несмотря на полученные данные, специфические сигнальные пути, по которым проходит информация о запуске экспрессии, остаются до сих пор неизвестны. Изучение естественных мутаций в человеческом организме и генетические исследования на молекулярном уровне идентифицировали несколько важных сигнальных молекул, включая трансформирующий фактор роста (TGF-) (Massague J. et al., 2000), костный морфогенетический белок (ВМР), фактор роста и дифференцировки (GDF) (Chen D. et al., 2004). Выполненные работы с использованием рекомбинантных протеинов и аденовирусным инфицированием МСК совместно культивированные с факторами TGF-1, TGF-3, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-12, BMP-13, и GDF-5 достоверно доказали быструю дифференцировку в хондрогенном направлении МСК, полученных из разнообразных источников мезодермального происхождения (Tuan R.S. et al., 2003). Получается, что используя данное свойство МСК, дифференцировку в хондрогенном направлении их можно применять при восстановлении повреждённой структуры хрящей суставных поверхностей. Данное направление клеточных технологий, используемое в ревматологии совместно с противовоспалительной терапией, благоприятно будет воздействовать на клинические результаты лечения больных с артрозами.

При остеогенезе или формировании костной ткани, главенствующую роль играет белок ВМР и, в особенности, ВМР-2 и ВМР-6, которые очень сильно стимулируют МСК в остеогенном направлении (Friedman M.S. et al., 2006). Каскад реакций, происходящих с участием генов Runx2, Smurf1, Smurf2 приводит к формированию костной ткани (Jeon E.J. et al., 2006). Ещё одним из важных цитокинов, играющих важную роль в дифференцировке МСК в остеогенном направлении, играет Wnts. В научных работах было доказано, что высокий уровень эндогенного цитокина Wnts ускоряет остеогенез и наоборот, низкий уровень данного цитокина приводит к ингибированию процесса формирования костной ткани (Gaspar C., Fodde R., 2004). Множественные совместные взаимодействия между ВМР белками, цитокинами (Wnts, TNF-) и генами приводят к стимулированию или угнетению дифференцировки МСК в остеогенном направлении.

Поиск новых механизмов и транскрипционных факторов, приводящих к формированию костной ткани из МСК, позволит найти новые программы дифференцировки клеток, что позволит более эффективно использовать их в травматологии.

Адипогенез, или образование жировой ткани. Процесс дифференцировки МСК в адипогенном направлении происходит, когда блокируется остеогенная дифференцировка. Важную роль в данном процессе играет PPAR (Nuttall M.E., Gimble J.M., 2004). При недостаточной стимуляции МСК в остеогенном направлении можно получить адипогенную дифференцировку, что клинически будет выражаться в отсутствии эффекта от проводимой клеточной терапии. С другой стороны при блокировании адипогенной дифференцировки можно получить уже костную ткань.

Миогенез, или образование мышечной ткани, является крайне важным и перспективным направлением в дифференцировке МСК. В настоящее время большинство исследований миогенеза из взрослых СК основываются на получении клеток из скелетной мышечной ткани или сателлитных клеток. Однако уже продемонстрирован эффект стимулирования миогенеза из взрослых МСК после трансфекции активированным Notch (Dezawa M. et al., 2005), правда, не ясен механизм данного эффекта. Существует группа исследователей, которые сфокусированы сугубо на кардиомиогенезе. В своих работах они демонстрируют важность межклеточного взаимодействия при сокультивировании МСК и кардиомиоцитов и стимулировании МСК кардиомиогенеза на моделях инфаркта миокарда в лабораторных условиях (Li H. et al., 2006). Более глубокие исследования по данному направлению свойств дифференцировки МСК проходят в клинике и лабораториях и их актуальность продолжает оставаться на самом высоком уровне, потому что количество пациентов с поражением миокарда увеличивается год от года.

Теногенез или формирование ткани сухожилий и связок из MСК активно изучается, хотя и является менее значимым по сравнению с кардиомиогенезом. В формировании сухожилий in vivo играют важную роль белок GDF, а также некоторые белки семейства TGF- (Wolfman N.M. et al., 1997). Зато при культивировании в лаборатории для получения теноцитов из МСК необходимы не только специфические ростовые факторы, но и дозированная механическая нагрузка, которая играет крайне важную роль в получении направленных нитей сухожилия (Altman G.H. et al., 2002). Пока остаются неидентифицированными специфические маркеры дифференцировки, приводящие к теногенезу из МСК. В настоящее время более менее определена роль белка scleraxis (Brown D. et al., 1999) и R-Smad8 (Hoffmann A.

et al., 2006) в теногенной дифференцировке МСК.

Таким образом, взрослые МСК являются самым перспективным кандидатом из всех клеток для восстановительной медицины. Основное требование – это идентификация МСК in vivo. На моделях с мышами мечение происходит благодаря генетическим маркерам (Tumbar T. et al., 2004). Асимметричное деление показало способность клеток к самообновлению. Это уникальное свойство СК эксплуатируется для идентификации сателлитных мышечных клеток и может быть использовано для идентификации МСК in vivo при изучении их делений. При использовании профиля поверхностных антигенов и генных наборов достаточно один раз чётко выделить и идентифицировать популяцию МСК. Роль каждого компонента системы МСК должна быть чётко проанализирована. Основное направление включает идентификацию сигнальных факторов, которые ускоряют самообновление МСК, а также сигнальные пути, позволяющие запускать линейную дифференцировку. Все последующие исследования будут направлены на изучение систем экспрессии и взаимосвязи между семействами белков, например, TGF- и Wnt. Идентификация специфических рецепторов на клеточной поверхности, которые активируются сигнальными молекулами, например белками семейства TGF- (BMP) и Wnt, во время самообновления и цитодифференцировки крайне важны для понимания и, самое главное, для связывания взаимодействия между сигнальными сетями как внутри, так и снаружи клетки. Понимание данных механизмов позволит стимулировать взрослые МСК для восстановления после повреждения.

Несмотря на наличие доступа к ЭСК, многие лаборатории выбрали изучение взрослых СК не столько по этическим соображениям, сколько из-за практических аспектов и требований повседневного прогресса, необходимого для развития клеточной терапии. Исходя из относительной простоты изоляции, потенциала экспансии, стабильного фенотипа, транспортабельности, предпочтительными для использования в регенеративной медицине оказались МСК. Это ускорило изучение взаимодействия аллогенных МСК с иммунной системой хозяина, а также возможностей использования МСК в клинической практике (Bobis S. et al., 2006).

К значимым ограничениям широкого использования МСК можно отнести необходимость получения для нужд терапии значительного числа клеток, и желательность их получения как можно менее инвазивным способом. Оба препятствия казались практически непреодолимыми до тех пор, пока сразу несколько групп исследователей не обратило внимания на возможность получения СК из менструальной крови.

Открытие было основано на предположении, что СК могут присутствовать в менструальной крови, так как они были ранее обнаружены в эндометрии (Ferenczy A. et al., 1979; Conti C.J. et al., 1984; Spencer J.A. et al., 2005; Chiba T. et al., 2007). Эндометрий матки человека содержит эндометриальный слизистый слой, который относится к высоко регенерирующим тканям, и располагается на плотном миометрии. Эндометриальномиометриальное сочленение достаточно неравномерное и не имеет подслизистого слоя, отделяющего эндометриальную железистую ткань от находящихся ниже гладкомышечных клеток миометрия (Umezawa A., Makino H., 2008). Эндометрий и субэндометриальный миометрий происходят из Мюллеровских желёз во время эмбриогенеза, в то время как слои миометрия происходят во время фетального периода и развиваются из других источников (Okulicz W.C. et al., 1997; Umezawa A., Makino H., 2008). Эндометрий подразделяется структурно и функционально на две главные зоны, где верхняя, или функциональная, содержит железы, распространяющиеся от поверхности эпителия и поддерживающиеся стромой, и нижняя или базальная, состоящая из базального слоя желёз, плотной стромы и лимфоидных агрегатов (Padykula H.A., 1991; Tabibzadeh S., 1991; Patel A.N. et al., 2008; Umezawa A., Makino H., 2008). Обе зоны как функциональная, так и базальная в дальнейшем подразделяются на два морфологически разных слоя (Biervliet et al., 2004; Kim Y.J. et al., 2007; Meng X. et al., 2007; Patel A.N. et al., 2008), хотя другие исследователи считают различие между 4 слоями менее очевидным и предпочитают концепцию поляризации микроокружения (Thomson J.A. et al., 1998; Umezawa A., Makino H., 2008). Клеточный состав эндометрия включает в себя люминальный и железистый эпителий, стромальные фибробласты, эндотелиоциты и лейкоциты. Эндометрий человека проходит более чем циклов регенерации, дифференциации и отторжения за время репродуктивного периода (Kaiserman-Abramof I.R., Padykula H.A., 1998; Meng X. et al., 2007; Han X. et al., 2009). Каждый месяц 4– мм слизистой ткани вырастает в течение 4–10 дней в первой половине пролиферативной стадии менструального цикла (Meng X. et al., 2007). Важно отметить, что концепция регенерации эндометрия подтверждается расположением СК именно в базальном эндометрии, что было установлено много лет назад (Roth E., Taylor H.B., 1966; Padykula H.A. et al., 1989; Patel A.N. et al., 2008).

При изучении пролиферации эндометриальных клеток были обнаружены зональные различия, которые показали постепенное замещение эпителиальных и стромальных клеток – прогениторными СК, располагающимися в базальном эпителии в области эндометриально-миометриального соединения (Padykula H.A. et al., 1984; 1989; Fuchs E., Segre J.A., 2000; Cui C.H. et al., 2007).

Позже был установлен дисбаланс между индексом пролиферации эндометриальных желёз в базальном и функциональном слоях во время пролиферативной и секреторной фаз цикла у макак при использовании фосфорилированного гистона Н3, как пролиферирующего маркера (Cervello I. et al., 2007). Такой уровень тканевого новообразования сопоставим с клеточным возобновлением в высокорегенерирующих тканях, таких как кроветворные ткани костного мозга, эпидермис, эпителий кишечника, где взрослые СК замещают выбывающие клетки для сохранения тканевого гомеостаза (Matthai C. et al., 2006; Gargett C.E.

et al., 2009). Дальнейшие косвенные доказательства существования эндометриальных стволовых/прогениторных клеток представлены в результатах экспериментальных исследований приматов, и в клинических исследований, когда эндометрий полностью восстанавливался и функционировал во время беременности после почти полностью удалённого эндометриального слоя (Yuan H. et al., 1995; Hida N. et al., 2008). В других клинических исследованиях установлено наличие регенерирующих эндометриальных слоёв у женщин после электрохирургической абляции, применявшейся для лечения меноррагии (Uduwela A.S. et al., 2000), и даже возникновение беременности (Abbott J.A., Garry R., 2002). Клинические исследования подтверждают присутствие взрослых СК в эндометрии. Эти утверждения основаны на получении оссификатов после беременности, источником которых являются не фетальные ткани, а хроническое воспаление и травма (Bird and Willis, 1965). Именно воспаление и травма активизируют включение МСК в регенерацию тканей. Кроме того, такие ткани как гладкая мускулатура, кости и хрящи – также обнаруживаются в эндометрии (McLennan C.E., Rydell A.H., 1965; Schwab K.E. et al., 2005; Bobis S. et al., 2006).

Более поздние работы свидетельствуют о возможности изолировать из эндометрия и культивировать 2 типа клеток: эпителиальные прогениторы и МСК (Gargett C.E., 2006). Также сообщается о маркере плюрипотентности Oct-4 (POU5F1), обнаруженном в некоторых клетках стромы человеческого эндометрия (Matthai C. et al., 2006). Поскольку СК были обнаружены в эндометрии, возникло предположение, что они также могут быть обнаружены в отторгаемом вместе с менструальной кровью эндометрии. Но при изучении СК выделенных из менструальной крови (МенСК), оказалось, что они представляют собой неоднородную группу клеток, и некоторые субпопуляции, повидимому, отличающиеся от СК, полученных из интактного эндометрия, а также от МСК. Работы Cui et al. (2007), Meng et al.

(2007), Patel et al. (2008), Р.А. Мусина и соавт. (2008), A. Umezawa, H. Makino (2008), N. Hida et al. (2008) положили начало новому перспективному направлению в получении и использовании МенСК в терапевтических целях.

Ещё 2004 году заявку на выданный в 2006 году патент «СК, полученные из отслоившегося при менструации эндометрия, способ их получения и применение» подала группа российских учёных (Мусина Р.А. и соавт., 2006). Изобретение предусматривает применение отслоившегося при менструации эндометрия для получения СК, т.е. описывает новый источник и способ получения СК из отслоившегося при менструации эндометрия.

Согласно изобретению, СК «полученные из отслоившегося при менструации эндометрия, могут быть использованы в косметологии, например для общего омоложения организма, омоложения кожи, лечения и/или укрепления волос; в стоматологии, например для лечения и/или укрепления дёсен и/или лечения и/или коррекции зубов; в травматологии, например в терапии ожогов, ран, повреждений кожи и/или переломов; и в терапии дегенеративных заболеваний, например невралгии, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, ишемической болезни сердца или конечностей, воспалительных заболеваний и заболеваний кожи, а также для создания банка СК».

Но текст данного документа в широкой печати не публиковался. Первыми представили работу, описывающую выделение клеток эндометрия из менструальной крови, Cui et al. (2007).

Причём в этом исследовании процедура получения МенСК носила сугубо прикладной характер: авторы просто использовали этот метод для получения МСК эндометрия, опираясь на общеизвестный факт, что в менструальной крови содержатся клетки отторгающегося эндометрия. Сама работа посвящалась изучению возможности экспрессии человеческого дистрофина. Они успешно культивировали множество первичных клеток, изолированных из менструальной крови, и обнаружили как минимум 2 морфологически разные группы: маленькие веретенообразные клетки и большие палочкообразные.

Уникальный фенотип МенСК был связан с гистологическими и эмбриологическими отличиями эндометрия (Du H., Taylor H.S., 2007).

Meng et al. (2007) выделяли из менструальной крови мононуклеарные клетки, и изучали субпопуляцию прилипающих клеток. Выделенные клетки оказались способны выдерживать в тканевой культуре более 68 удвоений без нарушений кариотипа.

Индекс пролиферации был значительно выше, чем у контрольной культуры МСК пуповинной крови, удвоение после 20 удвоений наступало каждые 19,4 часа, в сравнении с 1,5–2 сутками у двух контрольных линий пуповинной крови. Была обнаружена способность выделенных СК дифференцироваться в клетки линий всех трёх зародышевых листков: мезодермальные – миоциты, остеоциты, эндотелий, адипоциты, кардиомиоциты; эктодермальные – нейрональные клетки; и эндодермальные – гепатоциты, панкреатические клетки, клетки дыхательного эпителия. Дифференцировка была подтверждена иммуногистохимически: образовавшиеся тканевые клетки экспрессировали соответствующие этим тканям маркеры. Клетки, находившиеся в контрольной среде, без дополнительной стимуляции, не экспрессировали маркеры дифференциации. После 68 удвоений клетки сохраняли способность продуцировать присущий им ряд маркеров. Кроме этого, полученные клетки продуцировали MMP3, MMP10, GM-CSF, angiopoetin-2, и PDGF-BB в 10 раз больше, чем 2 контрольные линии МСК пуповинной крови.

Обнаружены следующие особенности СК, выделенных из менструальной крови:

1) высокий индекс пролиферации в сравнении с контрольными линиями МСК пуповинной крови 2) отсутствие способности экспрессии маркера МСК STRO- 3) способность к экспрессии маркера ЭСК Oct- 4) высокая экспрессия матричных металлопротеаз Выделенные клетки не экспрессируют свойственные эндометриальным СК маркеры CD34 и CD45.

Patel et al. (2008) также обнаружили высокую скорость удвоения МенСК, которая составляла 24–36 часов. Из начальных 50000 клеток за 26 дней было получено 48000000 клеток. Клетки оставались диплоидными, без хромосомных аберраций, как было установлено при определении кариотипа на 12 пассаже. Более того, RT-PCR анализ показал, что МенСК на 12 пассаже экспрессируют мультипотентный маркер Oct-4, но не SOX-2 или Nanog.

Полученные группой Patel данные об экспрессии маркеров принципиально различаются от данных, опубликованными группами Cui и Meng по позитивной реакции на экспрессию плюрипотентного маркера SSEA-4 и c-kit (CD117), которые также были колокализованы на изолированном клоне МенСК. Была обнаружена экспрессия маркеров CD166, CD49f, MHCI, и умеренная экспрессия CXCR4, ответственного за хоуминг СК. Негативная реакция отмечена на маркеры MHC II и LIN.

МенСК, исследованные группой Patel, дифференцировались в клеточные линии: мезодермальные – адипоциты, хондроциты, остеоциты, кардиомиоциты; эктодермальные – олигодендроглия, астроциты.

МенСК сохраняли более чем 50 % теломеразной активности даже на 12 пассаже при сравнении с ЭСК, что намного выше, чем у МСК дериватов костного мозга. Группой Meng теломеразная активность не изучалась.

МенСК, выделенные группой Patel, имели сходные характеристики с СК человеческого эндометрия по ряду показателей:

экспрессии c-kit (CD117) (Conti C.J. et al., 1984), по экспрессии Oct-4 (Matthai C. et al., 2006), по клональному размножению (Gargett C.E., 2007), а также с СК эндометрия мышей по c-kit (CD117) и Oct-4 (Chambers I. et al., 2003). Исходя из этого, авторы придерживаются версии о происхождении МенСК из СК эндометрия. Наличие эмбриональных маркеров SSEA-4 и Oct- объясняет высокую скорости размножения этих клеток.

Р.А. Мусина и соавт. (2008) отнесли выделенные МенСК по экспрессируемым маркерам, потенциалу дифференциации и морфологическим признакам к МСК, отметив при этом в качестве особенных признаков высокую клоногенную активность и низкую способность к дифференцировке в адипоциты.

А. Umezava и Н. Makino (2008) на основании собственных исследований относят менструальную кровь к источникам получения МСК.

Несмотря на относительно недавнюю историю обнаружения МенСК, уже появились попытки изучения их практического использования.

Так, Сui et al. (2007) в той же публикации, которая открыла тему изучения менструальной крови как источника СК, исследовали предполагаемые эндометриальные прогениторы, полученные из образцов эндометриальной ткани, на предмет восполнения мышечной дегенерации у мышей с mdx-моделью миопатии Дюшенна. По замыслу авторов, имплантированные клетки должны были предоставлять человеческий дистрофин в дегенеративные мышцы иммунодефицитных mdx-мышей. Авторы изучили извлечённые из менструальной крови клетки, чтобы установить, могут ли первично культивированные нетрансформированные клетки также восполнить дистрофичные мышцы. In vivo перенос извлечённых из менструальной крови клеток в дистрофичные мышцы иммунодефицитных mdx-мышей восстанавливал экспрессию дистрофина сарколеммой. Имплантируемые клетки были помечены enhanced-green-флуоресцентным белком и раздельное состояние человеческих и мышиных ядер заставляло предположить, что человеческий дистрофин экспрессируется благодаря слиянию миоцитов хозяина и имплантированных клеток. Анализ in vitro показал, что эндометриальные прогениторные клетки и клетки, извлечённые из менструальной крови, могут эффективно трансдифференцировать в миобласты/миоциты, сливаясь с мышиными миобластами C2C12 при совместном культивировании in vitro и начинать экспрессировать дистрофин после слияния. На основании проведённого эксперимента авторы заключают, что эндометриальные прогениторные клетки и дериваты менструальной крови могут переносить дистрофин в дистрофичные миоциты через слияние и транс дифференциацию in vitro и in vivo.

Toyoda et al. (2007) также обратили внимание на миогенный потенциал клеток, извлечённых из менструальной крови, отметив её высокую репликативную активность и способность трансдифференцировать в миоциты с неожиданно высокой частотой. Это свойство МенСК позволяет спасать дистрофичные миоциты у мышей с mdx-моделью миопатии Дюшенна.

Murphy et al. (2008) считают аллогенные МенСК «лекарством с полки» для лечения критической ишемии нижних конечностей, опираясь на следующие свойства этих клеток: 1) высокий уровень продукции ростовых факторов и металлопротеаз 2) способность ингибировать воспалительный ответ и отсутствие иммуногенности 3) способность к размножению в большом количестве без утраты способности к дифференциации и нарушения кариотипа.

Hida et al. (2008) обнаружили, что МенСК после соответствующей индукции начинают спонтанно делиться, демонстрируя кардиомиоцит-специфичное действие. Кардиальные тропонинпозитивные кардиомиоциты образуются in vitro в 27–32 % случаев. МенСК пролиферируют в среднем 28 поколений без влияния на кардиомиогенную трансдифференцировочную способность, и экспрессируют м-РНК из GATA-4 перед кардиомиогенной индукцией. Авторы предполагают, что большая часть кардиомиогенных клеток МенСК происходит из отслоившихся маточных эндометриальных желёз, так как МСК, полученные из моноклональных эндометриальных желёз в 76–97 % случаев трансдифференцируют в кардиальные клетки in vitro. МенСК были позитивны по CD29, CD105 и негативны по CD34, CD45.

Трансплантированные МенСК значительно улучшали нарушенную функцию сердца, уменьшали площадь инфаркта миокарда на модели у бестимусных крыс, ткань из кардиомиоцитов МенСК наблюдалась в зоне инфаркта миокарда in vivo. Авторы делают вывод о МенСК как о новом, мощном и доступном источнике для кардиальной клеточной терапии.

Han et al. (2009) изучали способность неманипулированных МенСК изменять рост глиомы, с использованием агрессивной C6/LacZ7 (C6) модели у СД-крыс. В основе идеи эксперимента были положены результаты предыдущих исследований на животных, которые показали, что избирательный тропизм МСК к глиоме может быть использован в качестве средства селективной доставки цитотоксических средств. Эндометриальные регенеративные клетки являются популяцией клеток мезенхимального типа, которые обладают способностью к плюрипотентной дифференциации и характеризуется уникальными поверхностными маркерами и продукцией факторов роста. Эндометриальные регенеративные клетки вводили внутривенно, или внутрь опухоли.

В результате показано значительное ингибирование глиомы:

уменьшение объёма на 49 % после внутривенного введения (р < 0,05), и около 46 % после введения внутрь опухоли (р < 0,05).

Редукция опухоли была связана с ингибированием ангиогенеза и сокращением числа CD133 позитивных клеток в инкраниальной опухоли. Несмотря на ангиогенный потенциал МенСК в модели ишемии задней конечности, эти данные подтверждают парадоксальную способность МенСК ингибировать опухоли.

Авторы считают необходимым провести дополнительные исследования для определения качественных различий между физиологическим ангиогенезом, который, как представляется, поддерживается МенСК, и ангиогенезом опухоли, который, как оказалось, ингибируется МенСК.

Наконец Zhong et al. (2009) описали 4 случая использования МенСК внутривенно и интратекально у пациентов с рассеянным склерозом. Донорами менструальной крови послужили здоровые, некурящие женщины-добровольцы 18–30 лет. Исследование проводилось в рамках начальной стадии изучения безопасности препарата. Исследование продолжалось более года, за это время не было отмечено иммунологических реакций и побочных эффектов связанных с лечением. Эти предварительные данные говорят о возможности клинического использования МенСК и являются основанием для дальнейшего изучения этого нового типа СК.

При анализе опубликованных материалов нам удалось выделить способы получения эндометриальных клеток. Так, группа австрийских учёных по руководством K.E. Schwab получала клетки эндометрия после гистерэктомии у женщин в возрасте от 31 до 52 лет. Операцию выполняли в пролиферативной фазе эндометрия, 5 мм слой эндометрия впоследствии собирался в среду, содержащую раствор Дульбеко, набор антимикотических антибиотиков, ксеногенную сыворотку. Выделение клеток проходило с использованием коллагеназы, механического расщепления и применением магнитного сортинга.

L. Lynch и его коллеги из Университетского госпиталя в Дублине получали клеточный материал с помощью кюретажа при выскабливании матки и помещением клеточного материала в среду Хенкса с антибиотиками и ксеногенной сывороткой. В лаборатории материал отмывался от резидуальной крови и размещался в раствор с энзимами на 20 минут при температуре 37С. В дальнейшем материал пропускали через марлевый фильтр и повторно отмывали, причём удалось добиться получения 1 млн клеток в мл.

Японские исследователи из Университета Фукуока под руководством K. Kato также получали материал из тканей матки после выполненной гистерэктомии у женщин в возрасте 37– лет. Клеточная суспензия была получена после механической и энзимной обработки тканей. В дальнейшем ею пропускали через марлевый фильтр и культивировали.

В России группа учёных под руководством Р.А. Мусиной из НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, получила эндометриальные клетки инвазивным путём с помощью биопсии тканей матки. В дальнейшем выполнялись работы по культивированию клеток.

По сообщениям R. Dimitrov из института биологии и иммунологии репродукции Болгарской Академии наук совместно с коллегами получены эндометриальные ткани после гистерэктомий у женщин в возрасте 32–52 года, выполненных по поводу аденомиоза матки, во время пролиферативной и секреторной фазы. Образцы помещались в ксеногенную сыворотку с антибиотиками и доставлялись в лабораторию, где эндометрий бережно отделялся от миометрия и разделялся механическим путём на небольшие фрагменты, которые помещались в раствор коллагеназы и выдерживался при 37С в течение 1 часа. В дальнейшем, после фильтрации и центрифугирования, начинали культуральные работы.

C. Matthai et al. получали клеточный материал из тканей матки после гистерэктомий, выполненных у женщин в возрасте 29–51 год, в независимости от дня менструального цикла.

В своих работах S. Kyo и коллеги из Университета в Каназаве (Япония), получали эндометриальные ткани у женщин в возрасте 42–52 лет также после экстирпаций матки по причине миоматозного поражения. Операция выполнялась в поздний период менструального цикла, ткани помещались в среду Дульбеко с коллагеназой и диоксирибонуклеазой.

X. Meng из института биокоммуникационных исследований (Wichita, USA) собирал у здоровых женщин во время менструального цикла эндометриальные клетки, используя урологические колпачки. Содержимое колпачка переливалось в пробирки объемом 5 мл, содержащие антибиотики, раствор фосфатного буфера и ЭДТА. В дальнейшем клетки разделялись с помощью градиента Фиколла, затем культуральные работы выполнялись на чашках Петри, содержащих среду ДМЕМ, антибиотики, ксеногенную сыворотку.

Подобную методику получения эндометриальных клеток описал и Z. Zhong из госпиталя в Changsha (Китай), у молодых здоровых женщин в возрасте 18–30 лет в условиях стационара.

Специально разработанный стерильный колпачок вводился во влагалище и оставался там в течение 30–60 минут. После этого содержимое колпачка переливалось в специальный собирающий контейнер, который перемещался в стерильное помещение, где выполнялись работы по очистке и выделению клеток.

В своих исследованиях авторы отмечали, что существует определённая взаимосвязь между качеством, жизнеспособностью, активностью клеток фазой менструального цикла и возрастом женщины.

Клиницисту приходиться сталкиваться в практике с характеристикой клеток, поэтому целесообразно суммировать маркеры, по которым характеризуются клетки. На поверхности клетки имеются определённые белковые молекулы, которые позволяют оценить принадлежность клетки к тому или иному виду.

CD1a Рецептор антигенов на лимфоцитах, клетках Лангенгарса CD2 Рецептор на Т-клетках, натуральных киллерах, тимофитах CD4 Маркер Т-хелперов CD6 Рецептор для активации Т-клеток CD8 Маркер Т-клеток CD9 Маркер МСК, ассоциированный с ангиогенезом (LiL.) CD10 Маркер предшественников Т- и В-лимфоцитов CD11 Маркер лейкоцитов, принадлежит к молекулам адгезии, представитель семейства интегринов CD14 Маркер моноцитов CD15 Маркер эмбриональных стволовых клеток (SSEA-4) CD17 Маркер нейтрофилов CD18 2-интегринучаствуют в адгезии лейкоцитов к эндотелию или другим клеткам иммунной системы CD21 Рецептор вируса Эпштейн-Барра CD29 1-интегринмолекула адгезии на мезенхимальных и стволовых клетках печени (ChoN.H.) CD31 Является маркером ангиогенеза, экспрессируется на лейкоцитах и эпителиальных клетках CD33 Антиген, свойственный клеткам миелоидного ряда CD34 Маркер гемопоэтических стволовых клеток CD38 Маркер дифференцирующихся гемопоэтических СК CD41a Рецептор для фибриногена обнаруженный на МСК и тромбоцитах CD44 Рецептор гиалуроновой кислот обнаруженный на тканевых CD45 Маркер лейкоцитов CD54 Маркер моноцитов и эндотелия CD56 Маркер нервных клеток, CD57 Маркер натуральных киллеров CD59 Белок ингибирующий комплемент обнаруживается на МСК(Jabbour H.N.)и стволовых гемопоэтических клетках SPпопуляции костного мозга (Prianishnikov V.A.) CD65 Рецептор миелоидных линий клеток CD69 Сигнальная молекула гемопоэтических клеток CD70 Маркер активированных Т- и В-клеток CD71 Маркер активированных лейкоцитов, обнаруживается на большинстве делящихся клеток CD73 Экто-5'-нуклеотидаза, вовлечённая в миграцию МСК CD79 Маркер В-клеток CD81  Маркер мезенхимальных стволовых клеток CD83 Маркер дендритных клеток CD90 Маркер Т-клеток, гемопоэтических и МСК CD93 Маркер эндотелиальных клеток CD106 Рецептор VCAM-1 на МСК и эндотелиоцитах CD111 Маркер нейрональных стволовых клеток и нейроэпителиальных клеток CD112 Молекула адгезии между эпителиальными и эндотелиальными клетками CD117 Маркер гемопоэтических стволовых/прогениторных клеc-KIT) ток CD133 Гемопоэтический/ангиобластный маркер CD139 Маркер кроветворных клеток CD144 Маркер прогениторов эндотелиальных клеток CD145 Маркер эндотелиальных и стромальных клеток CD150 Маркер активированных лимфоцитов CD166 Молекула клеточной адгезии, маркер МСК CD175 Маркер стволовых клеток CD235 Гликофорин А Nectin-1 Маркер НСК (CD111) Nectin-2 Молекула адгезии между эпителиальными и эндотелиальCD112) ными клетками DAF Маркер гемопоэтических клеток (CD55) ICAM Маркер моноцитов и эндотелия (CD54) L-селектин Экспрессируется на лейкоцитах и обеспечивает их адгезию к эндотелию в начальной фазе воспаления, а также участвует в хоуминге лимфоцитов Oct-4 Маркер эмбриональных стволовых клеток STRO-1 Маркер мезенхимальных стволовых клеток Nanog Маркер эмбриональных стволовых клеток Криоконсервация – процесс замораживания и хранения биологических материалов и, в частности, клеток. В настоящее время, собранные и полученные клетки до момента использования в исследовательских целях сохраняются в жидком азоте.

Сохранение при низкой температуре практически полностью блокирует все метаболические процессы в клетках (Makino S. et al., 1991).

Перед криоконсервацией клеток добавляют криоконсерванты для протекции от низких температур. Концентрация и соотношение с клетками криопротектора являются важными факторами, отвечающими за жизнеспособность клеток. Наиболее известный в настоящее время и более всего применимый криопротектор является диметилсульфоксид (ДМСО), который используется с 60-х годов прошлого столетия (Wells J.R. et al., 1979; Sputtek A., Kber C., 1991; Rowley S.D., 1992). Первые сообщения о лабораторных исследованиях ДМСО как криопротектора были выполнены на человеческих эритроцитах и сперматозоидах крупного рогатого скота (Lovelock J.E., Bishop M.W., 1959).

ДМСО относительно свободно проникает внутрь клетки через мембраны и предотвращает формирование кристаллов льда внутри клетки, а также разрывы мембран во время замораживания (Branch D.R., 1994). В доступной литературе описаны различные комбинации использования различных веществ с ДМСО (Donaldson A., 1996; Gorlin J., 1996; Sputtek A., 1997; Halle P., 2001). Введение большого количества ДМСО в организм реципиента совместно с клетками часто приводит к различным токсическим реакциям, таким как тошнота, рвота, гипотензия, транзиторная гипертензия, нарушение ритма и более тяжелые, как анафилаксия и острая почечная недостаточность (Keung Y.K. et al., 1994; Martino M. et al., 1996; Zambelli A. et al., 1998). Негативные эффекты от ДМСО зависят от количества погибших клеток, которые также могут вызывать побочные явления в виде лихорадки или схваткообразных болей в животе (Zambelli A. et al., 1998), поэтому у больных необходимо проводить превентивные мероприятия в виде введения антигистаминных или гормональных препаратов (Hermndez-Navarro F. et al., 1995). У здоровых людей после введения значительного количество ДМСО могут возникать такие симптомы, как головная боль и различного рода реакции желудочного-кишечного тракта, не только от самого ДМСО, но и от его метаболита – диметилсульфида, который является более токсичным соединением и, в отличие от ДМСО, который выводится почками, в течение 2 суток продолжает выделяться через кожу, легкие и почки. Таким образом, попадание значительного количества ДМСО в организм может вызывать проблемы для здоровья в течение нескольких дней.

Замораживание клеток при низких температурах сохраняет их метаболические механизмы, но иногда приводит к повреждению клеточных мембран, потому что быстрое охлаждение в физиологическом растворе приводит к формированию кристаллов льда внутри клеток. Кристаллы льда разрушают мембранные барьеры клетки и клеточных органелл (Mazur P., 1977; Gorlin J., 1996). Поэтому добавление различного рода криопротекторов просто необходимо. Раствор ДМСО – прозрачная, бесцветная жидкость, имеющая сильную связывающую способность для воды (Brayton C.F., 1997), поэтому он очень хорошо растворим в воде и спокойно проходит через клеточные мембраны, что создает прекрасные условия для поддержания постоянного осмотического градиента как внутри, так и снаружи клетки, предохраняя от формирования кристаллов льда. К сожалению, выполняемые действия по криоконсервации для некоторых клеток являются губительными (Rowley S.D., 1992). Техника криконсервации для СК и эритроцитов различна (Mazur P., 1977), чрезвычайно плохо криоконсервируются гранулоциты (Rowley S.D., 1992). В настоящее время поиск новых криопротекторов продолжается в основном в двух основных направлениях: 1) применение низкомолекулярных, хорошо проникающих в клетки соединений (в качестве таких соединений успешно апробированы димексид, диметилацетамид, 1,2-пропандиол и др.); 2) применение высокомолекулярных соединений, обеспечивающих криозащиту без проникновения в клетки.

Преимущества второго направления очевидны, однако существует много нерешенных проблем. В определенной мере обнадеживающие результаты получены при использовании в качестве криопротекторов поливинилпирролидона с молекулярной массой 12000–25000Д, полиэтиленоксида – с молекулярной массой 1500 и 4000Д (Иванов Д.В., 2000) и оксиэтилкрахмала.

Исторически сложилось так, что первое направление значительно опередило в своем развитии второе. Более того, проникновение криопротектора в клетки ранее считали необходимым условием их защиты. Действительно, присутствие криопротекторов внутри клеток снижает интенсивность процессов вымораживания воды из растворов, концентрирования внутриклеточных солей и величину возникающих на мембране градиентов концентраций. Тем не менее, после процедуры криконсервирования внутриклеточный криопротектор может выступать в роли повреждающего фактора, если не приняты необходимые меры по его удалению из клеток до этапа их ресуспендирования в изотонической среде (Шахов В.П. и соавт., 2004).

Процедура удаления криопротектора из клеток (отмывание) требует соблюдения основного условия: осмотическое давление отмывающих растворов должно эффективно предотвращать набухание клеток до критических пределов, при которых возможны нарушения ионного баланса. Несмотря на трудоемкость процедуры отмывания, в настоящее время накоплен достаточно большой опыт длительного хранения замороженных тканей (в том числе – клеток крови) с последующим клиническим применением.

С нашей точки зрения наиболее оптимальной является среда для криоконсервирования, когда используется заменитель эмбриональной телячьей сыворотки и криопротектор – ДМСО в соотношении 9:1. Криопробирки с суспензией клеток в среде для криоконсервирования постепенно охлаждают со скоростью ~10С в минуту до -70оС и через 24 часа переносят на хранение в жидкий азот (- 1960C). В этих условиях клетки могут храниться десятилетиями. В последующие годы они могут быть извлечены из криогенного хранилища, разморожены и использованы.

Этап приготовления клеточного материала для последующих работ после длительного хранения в условиях низких температур – реконсервация – не менее важен, чем процесс криконсервации. При заборе криопробирок из жидкого азота необходимо соблюдать технику безопасности (использовать защитные очки или маску, специальные перчатки и т.п.), так как при нарушении режима размораживания возможен взрыв криопробирок. После извлечения из сосуда Дьюара или криохранилища быстро помещают криопробирку с клетками в водяную баню (37–380С). Оставляют на несколько минут до оттаивания внутреннего содержимого. Проверку полного оттаивания внутреннего содержимого осуществляют плавным переворачиванием криопробирки до появления однородной клеточной массы без крупных конгломератов. Дальнейшие манипуляции проводят в стерильных условиях для снижения риска контаминации клеточного материала. Самый оптимальный вариант – это работа в ламинарных шкафах. После извлечения клеточного материала из криопробирок его откручивают в центрифугах при режимах g = 600–1000см2/с в течении 7–10 минут для удаления супернатанта. Повторяют процедуру отмывания минимум 2 раза. После подготовки клеточного материала проверяют его жизнеспособность. В настоящее время появились автоматические счетчики, которые позволяют давать результаты в виде графиков и картинок, на которых отражаются жизнеспособность клеток, их количество, размеры и многие другие параметры.

Осуществлено изучение свойств и источников для получения фетальных клеток, под которыми понимаются клетки, которые получаются с 9 недели развития человека. В последние лет отмечен очевидный прогресс в описании базисных особенностей ЭСК и разнообразных типов взрослых СК, включая методы репрограммирования, определения сроков жизни СК и концепцию «ниш» нахождения (Klimanskaya I. et al., 2008). На фетальные клетки стали обращать больше внимания, что связано с получением результатов по применению взрослых СК.

Их терапевтический потенциал был всегда высок, торможение развития в данной области связано с морально-этическими вопросами и отношением церкви. Фетальные клетки могут быть получены непосредственно из фетуса или же из поддерживающих структур фетуса (Hemberger M. et al., 2008). К ним относятся амниотическая жидкость, Вартонов студень, амниотическая мембрана, плацента, а также пуповинная кровь. Практически все эти источники после рождения ребенка утилизируются.

Сейчас активно начинает использоваться пуповинная кровь. Все эти ткани содержат огромное количество клеток, причем легко получаемых для исследований особенностей популяций СК и, что самое главное, без каких либо морально-этических проблем по сравнению с ЭСК. Эти относительно новые источники дают также возможность проследить судьбу различных типов фетальных клеток. Особенно это может быть использовано для описания и прослеживания онтогенеза, т.е. развития определенного типа СК. Все выполненные до настоящего времени исследования показывают, что СК, полученные из фетальных источников, имеют схожие свойства с ЭСК по экспрессированию определенных маркеров (Guillot P.V. et al., 2007). Они обладают способностью к самообновлению, в то время как их спектр дифференцировочного потенциала, несмотря на место их локализации – in vivo или in vitro, размещается посередине между плюрипотентными ЭСК и мультипотентными взрослыми СК.

Рассмотрим более подробно каждый из источников.

В рутинной медицинской практике амниотическая жидкость получается с помощью амниоцентеза для диагностических целей, однако совсем недавно появились работы, в которых имеются важные предположения о потенциале СК, полученных из амниотической жидкости и сделан акцент на возможность получения СК из альтернативного источника (Prusa A.R. et al., 2003, 2004; Tsai M.S. et al., 2004, 2006; Zhao P. et al., 2005; Bossolasco P. et al., 2006; De Coppi P. et al., 2007; Roubelakis M.G. et al., 2007; Kim J. et al., 2007; Perin L. et al., 2008; Kolambkar Y.M. et al., 2007; Kunisaki S.M. et al., 2007). Естественно, что популяция клеток в амниотической жидкости гетерогенна, в её состав входят клетки из всех трех зародышевых листков, и она содержит множество частично дифференцированных прогениторных клеток. Большинство из этих клеток имеют эпителиальное происхождение, т.е происходят или из развивающегося фетуса или же из внутренней поверхности амниотической мембраны. Кстати, в отношении клеток, полученных из амниотической оболочки, идут оживленные дискуссии в отношении того, чтобы называть их «стволовыми клетками амниотической оболочки». Клетки амниотической жидкости на ранних этапах гестации экспрессируют большое количество эндодермальных и мезодермальных маркеров, по сравнению с более поздними сроками гестации, в тоже самое время различия по эктодермальным маркерам не отмечено вообще (Perin L. et al., 2008). Введение в практику двухстадийных культуральных протоколов позволило не только изолировать, но и клонально нарастить мультипотентные мезенхимальные СК (ММСК) из амниотической жидкости второго триместра беременности и получить их фенотипические характеристики (Tsai M.S. et al., 2004). Эти ММСК из амниотической жидкости экспрессировали маркеры типичные для мезенхимальных клеток, в частности CD29, CD90, CD166, CD73, CD105, CD49е (Bossolasco P. et al., 2006; De Coppi P. et al., 2007; Roubelakis M.G. et al., 2007; Kolambkar Y.M. et al., 2007). Они были позитивны для интегрина VLA5, эндотелиального маркера CD (НСАМ-1 antigen), CD58 и, самое важное, были негативны на гемопоэтические маркеры CD45, CD34 и CD14 (Tsai M.S. et al., 2006; Roubelakis M.G. et al., 2007), а также негативны для миогенных маркеров (Bossolasco P. et al., 2006). Была также отмечена важная особенность клеток из амниотической жидкости: после клональных методов культивирования они начинали экспрессировать маркеры нейральных клеток (Prusa A.R. et al., 2004;

Tsai M.S. et al., 2006). Проведённые исследования независимыми группами исследователей доказали, что эти клетки могут проявлять характеристики мультипотентных СК благодаря обнаруженным у них маркеров СК таких как Oct-4, Nanog, SSEA-4 (De Coppi P. et al., 2007; Roubelakis M.G. et al., 2007; Kim J. et al., 2007). Устойчивая экспрессия маркера Oct-4 в культуре МСК из амниотической жидкости по данным одних авторов (Roubelakis M.G. et al., 2007) составила 30 пассажей, других исследователей (Kim J. et al., 2007) только до 19 пассажа. И в первом, и во втором случае – это большое количество пассажей для «разгона» культуры. Более того эти клетки после методов клонального культивирования поддерживались в недифференцированном состоянии и сохраняли плюрипотентность, клонногенность и, особенно важно, геномную стабильность. Сохранение геномной стабильности говорит об отсутствии патологически изменённых популяций клеток, или, в клинической практике – отсутствие туморогенной трансформации введённого материала.

Проверка геномной стабильности проводилась с помощью анализа кариотипа, и по данным клеткам одной группой учёных проверялась более чем на 250 популяциях (De Coppi P. et al., 2007;

Perin L. et al., 2008), другой группой учёных (Roubelakis M.G. et al., 2007) проверялись более чем 20 пассажей. Проведён успешный опыт поддержания культуры мезенхимальных клеток из амниотической жидкости в течении 8 месяцев (Kim J. et al., 2007)! При этом сохранялся стабильный кариотип и высокая пролиферативная активность. Пролиферативная активность по одним данным составила 36 часов (De Coppi P. et al., 2007), когда количество клеток увеличивается в 2 раза, по данным других исследователей (Roubelakis M.G. et al., 2007) составила часов. Систематическое изучение популяции мезенхимальных клеток из амниотической жидкости показало, что данные клетки очень быстро пролиферируют. Наблюдалось более чем 9-ти кратное логарифмическое увеличение со средним периодом 32, дня независимо от гестационного срока (Kunisaki S.M. et al., 2007). Этот пример наглядно говорит о том, что для получения 100х106 клеток необходимо всего лишь 5 мл амниотической жидкости (Kunisaki S.M. et al., 2007). Другие работы зафиксировали достоверную корреляцию между получением МСК и плотностью посева при культивировании при низкой плотности ( клеток на см2). В результате увеличение дублирования популяции происходило в 21 раз (Sessarego N. et al., 2008). Количество МСК из амниотической жидкости оценивается от 0,9 до 1,5%, в то время, как приблизительно 2,7х105 МСК из амниотической жидкости может быть получено при начале культивирования из каждого образца. Наконец, клонально увеличенные МСК из амниотической жидкости показывают широкий спектр дифференцировочного потенциала, давая линии таких клеток, как адипоциты, хондроциты, остеоциты, гепатоциты, нейральные клетки и кардиомиоциты (Tsai M.S. et al., 2006; De Coppi P. et al., 2007).

Достоверно доказано присутствие плюрипотентных клеток в амниотической жидкости, благодаря использованию позитивной иммуноселекции с применением поверхностного антигена CD117 (с-kit рецептор) и тирозинкиназного фактора специфичного для СК, которые первично присутствуют на ЭСК и первичных зародышевых клетках (De Coppi P. et al., 2007). Прямое доказательство плюрипотентности этой CD117+ популяции СК было получено впервые с помощью изящного метода, тестирующего клональные линии, и подтверждённого потом с помощью мечения ретровирусами. Установлена способность клеток in vivo дифференцироваться в функциональные клетки всех трёх зародышевых ростков (De Coppi P. et al., 2007). Эти c-kit+ клетки могут представлять те же самые плюрипотентные СК, которые были получены из культуры МСК из одной амниотической клетки и описаны ранее (Tsai M.S. et al., 2006). Важно отметить, что ни одна из описанных выше клеточных линий после результатов тестирования не привела к тератомам, что крайне важно для дальнейшего безопасного использования СК, полученных из амниотической жидости, в клинических целях. Хотя метод оценки туморогенности в данных исследованиях выполнялся при жёстких условиях и адекватном контроле, должно быть отмечено, что отсутствие формирования тератомы просто говорит о низкой скорости роста и незначительной степени спонтанной пролиферативной способности и дифференцировки этих СК.

Главные шаги вперёд для углублённого понимания функциональных клеточных взаимодействий фетальных СК по сравнению с взрослыми СК были сделаны совсем недавно как на транскриптонном (Tsai M.S. et al., 2006), так и на протеомном уровнях (Roubelakis M.G. et al., 2007). Эти работы показали не только наличие в ядре клеток целого ряда белков и генов транскрипции, которые присутствуют в МСК из разнообразных источников, но также и зафиксировали уникальные особенности, опосредованные транскриптами и белками, связанными с пролиферацией и примитивным фенотипированием СК как в амниотической жидкости, так и в амниотической оболочке, пуповинной крови и костном мозге. Остаётся проверить предположение: действительно ли это протеины и какова их значимость в придании индивидуальных особенностей различным типам фетальных клеток.

Применение in vivo МСК из амниотической жидкости сейчас только начинается. Это несмотря на то, что данные клетки проявляют характеристики кардиомиоцитов (Zhao P. et al., 2005).

Использование их на моделях ишемии не привело к дифференцировке в кардиомиоциты, однако резко усилило процессы неоваскуляризации (Sartore S. et al., 2005). Эти данные доказывают, что данные клетки требуют репрограммирования до введения (Chiavegato A. et al., 2007). Похожие предварительные результаты были достигнуты при восстановлении повреждённого седалищного нерва (Pan H.C. et al., 2006), восстановлении частичного или полного циркулярного дефекта трахеи (Kunisaki S.M. et al., 2007), создании клапанов сердца (Schmidt D. et al., 2007), интеграции в повреждённую почку и выживание в ткани почки (Perin L. et al., 2008), или, через паракринный эффект, отображение комбинированного эффекта на посттравматическое ремоделирование и гладкомышечную регенерацию мочевого пузыря (Dе Coppi P. et al., 2007).