МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра микробиологии, эпизоотологии и вирусологии

Государственное управление ветеринарии

Краснодарского края

Государственное учреждение Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория»

А.А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ, Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ, Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ. Е.А. ГОРПИНЧЕНКО, А.В. СКОРИКОВ

ДИАГНОСТИКА ИЕРСИНИОЗОВ

ЖИВОТНЫХ

Учебное пособие г. Краснодар,

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Государственное управление ветеринарии Краснодарского края Государственное учреждение Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория»

А. А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ, Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ, Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ, Е.А. ГОРПИНЧЕНКО, А.В. СКОРИКОВ

ДИАГНОСТИКА ИЕРСИНИОЗОВ

ЖИВОТНЫХ

Учебное пособие Для студентов высших учебных заведений факультета ветеринарной медицины по направлению подготовки «Ветеринария»

КРАСНОДАР, УДК 619:616.98-07:579.842.23(075) ББК 48. Д Авторы: А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, Л.В. Шевченко, Г.А. Джаилиди, Д.Ю. Зеркалев, Е.А. Горпинченко, А.В. Скориков Учебное пособие «Диагностика иерсиниозов животных».

Краснодар: КубГАУ, 2013. 27 с.

В учебном пособии изложены основные свойства возбудителей иерсиниозов животных; описаны бактериоскопические, бактериологические, биохимические, биологические и серологические методы диагностики и дифференциальной диагностики заболевания.

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

Лысенко А.А. – доктор ветеринарных наук, профессор, декан факультета ветеринарной медицины КубГАУ.

Куриннов В.В. – доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Рекомендовано методической комиссией факультета ветеринарной медицины КубГАУ протокол №3 от 19 ноября года.

© Кубанский государственный аграрный университет 350044, Краснодар, ул. Калинина, Диагностика иерсиниозов животных Цель занятия: изучить правила отбора патологического материала и отправки в ветеринарную лабораторию, основные свойства возбудителей иерсиниозов животных, методы лабораторной диагностики.

Диагностика иерсиниоза и псевдотуберкулеза животных проводится комплексно, учитывают эпизоотологические данные, клинические признаки, патологоанатомические изменения и лабораторные исследования.

Род Yersinia согласно «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology» (1994) объединяет 11 видов: Y. pestis; Y. pseudotuberculosis; Y.

enterocolitica; Y. kristensenii; Y. intermedia; Y. frederiksenii; Y.

aldovae; Y. rohdei; Y. mollaretii; Y. bercovieri; Y. ruckeri. Из них зоопатогенными видами являются: Y.pestis — возбудитель чумы, острого инфекционного заболевания животных и человека, относящегося к группе особо опасных инфекций; Y. pseudotuberculosis — возбудитель псевдотуберкулеза животных; Y. enterocolitica — возбудитель иерсиниоза животных и человека; Y. ruckeri— возбудитель «красного рта» радужной форели и других видов рыб, остановимся на диагностике иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Иерсиниоз - инфекционная болезнь многих видов животных и человека, характеризующаяся у молодняка животных гастроэнтероколитами с развитием диареи (фекалии нередко с примесью крови), которая может перемежаться с запорами. Реже могут наблюдаться артриты, конъюнктивиты, дерматиты и бронхопневмония. У коров могут наблюдаться маститы, эндометриты, рождение нежизнеспособного приплода, энтериты. У кроликов болезнь протекает в виде эпизоотии с высокой летальностью. При этом у больных животных отмечают анорексию, прогрессирующее истощение, субфебрильную температуру и последующий смертельный исход. Широко распространено длительное бактерионосительство. У человека кроме диареи возможно развитие псевдоаппендицита, мезентериалыюго лимфаденита, артритов, менингита, гепатита, поражения сетчатки, сепсиса, сопровождающегося высоким уровнем смертности.

Возбудителем болезни является Y.enterocolitica. Эти бактерии выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков, насекомых. Они обнаружены в воде, почве, сточных водах, пищевых продуктах, включая овощи и фрукты.

Широкой распространенности иерсиний способствуют их психрофильные свойства (способность размножаться и накапливаться в различных питательных субстратах при 4° С).

Псевдотуберкулез — инфекционная болезнь многих видов животных и человека, характеризующаяся преимущественно латентным течением, мезентериальным лимфаденитом, длительным расстройством деятельности желудочно-кишечного тракта. Возможно развитие тяжелой септицемии. У лошадей может наблюдаться пневмония и сильное обезвоживание на фоне диареи. У крупного рогатого скота наблюдают пневмонию, аборты и маститы. Аборты и маститы при псевдотуберкулезе могут быть у овец и коз. У кроликов болезнь возможна в острой, подострой и хронической формах.

У птиц отмечают острую форму заболевания с развитием поносов, одышки, истощением, взъерошенностью шерсти, потемнением кожных покровов. У собак и кошек псевдотуберкулез чаще всего начинается остро без заметного продромального периода. Появляются лихорадка, угнетение, анорексия, диарея, рвота, боль в мышцах при пальпации. В ряде случаев отмечают кашель, а также признаки поражения печени (желтушное окрашивание склер, темный цвет мочи). Нередко клинические признаки кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза оказываются весьма сходными.

У людей различают кишечную, скарлатиноподобную, артритную формы течения псевдотуберкулеза. Нередко болезнь протекает с поражением печени и напоминает болезнь Боткина. Возможно развитие септической формы, особенно у детей, пожилых и ослабленных лиц.

Возбудителем болезни является Y. pseudotuberculosis, выделяемая от млекопитающих, птиц, пресмыкающихся, земноводных, членистоногих и рыб.

Принципиальные схемы лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сходны и потому ниже излагаются совместно.

Лабораторная диагностика иерсиниозов основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

Бактериологическое исследование Для исследования направляют свежие трупы мелких животных и птиц целиком, трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, отрезки тонкого и толстого отделов кишечника, перевязанные с двух сторон, мезентериальные и подчелюстные лимфоузлы, корень языка, миндалины.

С целью прижизненной диагностики используют фекалии. При наличии в фекалиях примеси крови, слизи, гноя, пленок для исследования отбирают именно такие пробы. Наибольшие шансы на выделение возбудителя имеются, если материал отбирают в период острого течения болезни при повышенной температуре тела.

Микроскопическое исследование исходного материала. Из поступившего материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Иерсиний являются грамотрицательными прямыми палочками с закругленными концами, иногда имеют вид коккобактерий. Диаметр клеток 0,5-0,8 мкм, длина от 0,8-1,2 до 2,0мкм.

Выделение и идентификация культур иерсиний Культивирование. Возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза являются факультативными анаэробами, обладающими и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Хемоорганотрофы. Оптимальная температура культивирования 22-28° С, но размножаться они способны при температурах от 2 до 40° С.

Диапазон рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН 7,4-7,6.

Иерсиний хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах Мак-Конки, Эндо, Серова, СБТС. Среда Плоскирева и висмутсульфит агар обладают выраженным ингибирующим действием на иерсиний обоих видов. Оба возбудителя способны расти на голодных средах (голодно-кислый агар, фосфатно-буферный раствор и др.).

Высеву исследуемого материала на питательные среды обычно предшествует его обогащение, позволяющее повысить эффективность выделения культур иерсиний.

Общепризнанным методом обогащения материала при исследованиях на иерсиниозы является метод холодового обогащения, основанный на способности иерсиний размножаться в питательных субстратах при низких плюсовых температурах. Большинство других микроорганизмов, включая и энтеробактерии иных родов, такой способностью не обладает. Способность Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis расти на голодных средах и использование в силу этого фосфатно-буферного раствора в качестве среды обогащения, придают методу дополнительную эффективность.

Исследуемый материал массой не менее 20 г растирают в ступках. Измельченные пробы вносят в пробирки со стерильной средой обогащения (фосфатно-буферный раствор) в соотношении 1:5. Пробирки помещают в холодильник при температуре 4° С. Начиная со вторых-третьих суток хранения из пробирок начинают делать ежедневно (до получения положительных результатов, но не более суток хранения) высевы на среду Эндо или среду с индикатором бромтимоловым синим (СБТС), являющуюся дифференциальнодиагностической для выделения возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Существенным недостатком классического метода холодового обогащения является его длительность (до 15 суток), из-за чего бактериологические исследования в ряде случаев затягиваются до суток. Устранить этот недостаток позволяют рекомендуемые для выделения и идентификации чистой культуры Y. enterocolitica экспресс-методы, предусматривающие использование «холодового удара», «теплового удара» и «щелочной обработки».

При применении метода «холодового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в холодильную камеру при температуре минус 18° С на 18 часов. Затем материал оттаивают и делают из него высевы на среды Эндо или СБТС.

При использовании метода «теплового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в термостат при 42° С на 18 часов. После этого производят посевы на среды Эндо или СБТС.

Для метода «щелочной обработки» предварительно готовят 40%-ный раствор едкого кали на стерильной дистиллированной воде и хранят его в холодильнике. Перед проведением исследований из 40%-ного раствора готовят 0,5%-ный раствор едкого кали на стерильном 0,5%-ном растворе натрия хлорида. Для этого в стерильных условиях смешивают 7,9 мл 0,5%-ного раствора натрия хлорида с 0,1 мл 40%-ного раствора едкого кали.

Приготовленный таким образом раствор щелочи разливают по 0,2 мл в лунки полистироловой пластины и вносят в них 0,2 мл исследуемого материала в среде обогащения. Смесь тщательно перемешивают. Выдерживают в течение 3-5 мин и делают высевы в бульон Хоттингера. Посевы инкубируют при 37° С в течение суток и делают из них высевы в чашки со средами Эндо или СБТС.

Помимо фосфатно-буферного раствора в качестве сред обогащения могут быть использованы буферно-казеиново-дрожжевая среда, 1%-ная забуферная пептонная вода, 1%-ная пептонная вода с добавлением К2НРО4.

Исследуемый материал с жидких сред обогащения высевают на среду Эндо или СБТС петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. Посевы инкубируют при 22-25° С в течение 18-24 час (на СБТС — в течение 48 час). По истечении этого срока посевы просматривают и характерные для иерсиний колонии пересевают на слабощелочной МПА или агар Хоттингера. Посевы инкубируют при 22-25° С в течение суток. Из типичных изолированных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Из тех же колоний делают высевы на питательный бульон для определения оксидазной активности. Посевы инкубируют при 22-25° С в течение суток. В бульонные культуры добавляют 0,2 мл оснафтола и 0,3 мл диметилпарафенилендиамина, содержимое пробирок перемешивают. При наличии оксидазы в течение 30 сек происходит окрашивание бульона в фиолетовый цвет. Дальнейшему изучению подлежат только грамотрицательные, не образующие оксидазу культуры (сем.

Enterobacteriaceae). Такие культуры высевают на среду Клиглера и среду с мочевиной по Кристенсену. Для дальнейшего изучения отбирают культуры, не образующие сероводород (оранжево-красный цвет среды Клиглера не изменяется в черный после 24 час инкубирования посевов), обладающие уреазной активностью (красно-малиновое окрашивание среды Кристенсена в течение 1-4 суток инкубирования посевов).

Характер роста иерсиний на питательных средах. На плотных питательных средах при 4-28° С оба возбудителя в аэробных условиях образуют колонии S-формы. На агаре Хоттингера и МПА через 18-24 часа образуются круглые с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии с голубоватым оттенком, мягкой консистенцией и диаметром 0,5-1,0 мм. На агаре Эндо колонии круглые, выпуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные со слегка розоватым оттенком, диаметром от 0,1 до 1,0 мм.

На СБТС агаре через 48 часов на сине-голубом фоне среды образуются голубые колонии с фестончатым краем, выпуклым центром и суховатой матовой поверхностью, диаметром 1,5-2,0 мм.

При взятии петлей они сдвигаются по поверхности агара. Иногда (особенно у возбудителя псевдотуберкулеза) виден светло-голубой ободок по краю колонии. Колонии других энтеробактерий, не разлагающих мочевину (эшерихии, сальмонеллы и др.), изменяют окраску среды, приобретая желтый цвет и характерную морфологию (сочные, выпуклые). В жидких средах (МПБ, бульон Хоттингера) образуют равномерное помутнение.

При температурах культивирования свыше 28° С микроорганизмы обоих видов диссоциируют в R-форму. При этом на плотных питательных средах, наряду с описанными выше колониями Sформы, появляются колонии с выраженным полиморфизмом по размеру, форме, цвету (особенно при температуре 37° С и выше).

Чаще всего R-формы колоний имеют бугристую поверхность, неправильную форму, неровные изрезанные края, коричневожелтоватый цвет. Нередко они имеют суховатую консистенцию. В жидких средах R-формы образуют помутнение и хлопьевидный осадок либо осадок и рыхлую поверхностную пленку с прозрачной надосадочной жидкостью.

Морфология иерсиний в культуре. В мазках из культур возбудители обоих видов представляют собой грамотрицательные овоидные палочки или коккобактерии размером 0,5- 0,8x1,0-3,0 мкм.

Спор и капсул не образуют. Y. enterocolitica чаще располагается в мазках поодиночно, но может образовывать и цепочки различной длинны. Y. pseudotuberculosis цепочки образует чаще, а также может окрашиваться биполярно.

Иерсиний обоих видов подвижны при температуре ниже 30° С (подвижность выражена максимально при 20-22° С) за счет перитрихиально расположенных жгутиков и неподвижны при 37° С. У Y. enterocolitica подвижность обычно выражена в большей степени, чем у Y. pseudotuberculosis.

Идентификация иерсиний по ферментативным признакам.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для иерсиний культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами относят к роду Yersinia на основании изучения их ферментативных свойств. К иерсиниям относят штаммы микроорганизмов, не обладающие оксидазной активностью, не образующие сероводород, уреазопозитивные, дающие положительную реакцию с метиловым-красным, отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра (при 37° С), не растущие на среде Симмонса, не образующие лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, подвижные при 4-28° С и неподвижные при 37-42° С, не ферментирующие лактозу и ферментирующие с образованием кислоты маниит, L-арабинозу. Ни Y.

pseudotuberculosis, ни Y. enterocolitica не растут в присутствии KCN.

При дифференциации Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis следует иметь в виду, что Y. pseudotuberculosis не ферментирует лактозу, сахарозу, раффинозу, целлобиозу, дульцит, инозит, сорбит, инулин и D-арабинозу, но ферментируют с образованием кислоты глюкозу, галактозу, L-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маинит и салицин; редуцируют нитраты, метиловый синий; вступают в реакцию с метиловым красным; образуют каталазу; обладают уреазной активностью; не образуют ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауера при температурах 25 и 37° С.

Y. enterocolitica не ферментируют лактозу (есть лактозоположительные варианты, часто среди сероваров 05 и 07, 8), рамнозу, раффинозу; не обладают фенилаланиндезаминазой, лизиндекарбоксилазой и аргининдегидролазой. Реакция Фогес-Проскауэра положительная при температуре 25° С и отрицательная при 37° С.

Другие 8 видов рода Yersinia, а именно: Y. aldovae, Y.

kristensenii, Y. frederiksenii, Y. rohdei, Y. mollaretii, Y. bercovieri, Y.

intermedia, Yruckeri могут находиться в испражнениях людей, животных и в смывах с предметов окружающей среды. Они так же, как Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis хорошо растут на питательных средах для выделения иерсиний. Тесты, позволяющие дифференцировать Y. pseudotuberculosis, 5 биоваров Y. enterocolitica от других часто встречающихся видов иерсиний, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные биохимические свойства Y.pseudotuberculosis и Y.enterocoutica, отличающие их от других видов рода Yersinia

I II III IV V

Проскауер 25° С Симмонса 25° «d» — признак варьирует у различных штаммов.

Возбудитель псевдотуберкулеза по ряду свойств сходен с возбудителем чумы (Y. pestis) и в ряде случаев, главным образом при исследовании материала от грызунов (особенно в природных очагах чумы), когда посевы из органов производят непосредственно на плотные питательные среды, может возникнуть необходимость дифференциации этих возбудителей. Основные отличительные признаки Y. pseudotuberculosis и Y. pestis представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Свойства и дифференциация Y.pestis и Y.pseudotuberculosis Патогенность для кроликов - Наиболее ценными для дифференциации этих возбудителей являются тесты, характеризующие их отношение к мочевине, подвижность, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы. Кроме того, следует учитывать неприхотливость к питательным средам Y.pseudotuberculosis и отсутствие полиморфизма у колоний Y.pestis, который обычно растет на специальных средах, и при 28° С на вторые сутки образует колонии только R-формы. При подозрении на выделение Y.pestis дальнейшую идентификацию проводят в специализированных учреждениях.

Культуры, отнесенные к видам Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis, подвергают серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле. Завершающим этапом является определение патогенных свойств выделенных штаммов иерсиний.

Серологическая индикация и идентификация иерсиний.

Y.enterocolitica имеют соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены. У вирулентных штаммов обнаруживаются V- и W-антигены, расположенные в наружной мембране клетки. У отдельных штаммов имеется антиген К1, связанный с фимбриями и разрушающийся только автоклавированием при 120° С в течение час.

О-антигены возбудителя кишечного иерсиниоза являются полисахаридами, устойчивыми к нагреванию и действию этанола. Согласно классификации Winbland—Wauters по О-антигену различают более 60 сероваров Y.enterocolitica, которые обозначают арабскими цифрами 1,2 и т.д. Часть сероваров имеет разделение на субсеровары, обозначаемые буквами a, b и т.д. Также буквами обозначают и жгутиковый термолабильный антиген, разрушающийся при кипячении.

Наиболее распространенными среди животных и людей являются серовары: 0l,2a,3; 02a, 2b,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30;

06,31; 07,8; 08; 09; 010; 013,7; 014; 015; 018; 019, 8; 020; 021 и 022.

Y.enterocolitica серовара О3 распространены на всех континентах. Частота их обнаружения на территории России составляет от 15 до 60% и более. Далее следуют серовары 04,32 и 05,27 (10-50%), 07,8 (5-10%) и 09 (1-30%). Другие из названных сероваров встречаются значительно реже. Часть культур типировать не удается.

Y.pseudotuberculosis имеют жгутиковый антиген (Н), 2 соматических (О) антигена S и R, антигены вирулентности — V и W, расположенные в наружной мембране и выраженные при температуре культивирования иерсиний 37° С. Н-антиген образуется при температуре 18-20° С, термолабилен и не имеет диагностического значения. R-антиген является общим для всех псевдотуберкулезных бактерий, а также и для Y.pestis. Обнаружена общность этого антигена с сальмонеллами групп В и D. По S-антигену различают 8 сероваров Y.pseudotuberculosis, обозначаемых римскими цифрами (I-VIII).

Большая часть штаммов, выделенных на территории России, как и в других странах, от животных, человека, из объектов внешней среды, относится к серовару I (60-90%). На втором месте по частоте обнаружения находится серовар III (10-30%). Серовары II, IV, V обнаруживают в 2-8% случаев. О циркуляции в нашей стране Y.pseudotuberculosis сероваров VI, VII и VIII сведений нет.

Антигенные связи Y.pseudotuberculosis и большинства сероваров Y. enterocolitica слабые и выявляются лишь иммуннодиффузионными методами. Более значительные антигенные взаимодействия, проявляющиеся в традиционной РА, имеют место у возбудителя псевдотуберкулеза серовара I с культурами Y.enterocolitica сероваров 08; 018 и 021.

Оба возбудителя имеют общий антиген с энтеробактериями других видов, за счет чего могут быть получены положительные реакции с сыворотками к некоторым представителям этого семейства. У Y.pseudotuberculosis установлены антигенные связи с сальмонеллами шигеллами и эшерихиями, у Y.enterocolitica — с сальмонеллами, протеями, серрациями, гафниями, клебсиеллами. Особо следует отметить наличие антигенного родства у серовара 09 с представителями рода Brucella.

В связи с этим в благополучных по бруцеллезу хозяйствах нередко выявляются неспецифические реакции с бруцеллезным диагностикумом, обусловленные инфицированием крупного рогатого скота Y.enterocolitica. Возбудитель кишечного иерсиниоза имеет антигенное родство с холерным вибрионом и возбудителем туляремии. С Y.pestis близкие антигенные связи и постоянные перекрестные положительные результаты реакций имеет возбудитель псевдотуберкулеза. Y.enterocolitica не имеет антигенных связей с Y.pestis.

Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к видам Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками к наиболее распространенным сероварам иерсиний. Наборы, выпускаемые для этих целей (Санкт-Петербургский институт им. Пастера), включают сыворотку, поливалентную к I-V сероварам, и сыворотки, моновалентные к I и III сероварам Y.pseudotuberculosis, а также сыворотки к сероварам: 03; 04,32; 04,33; 05,27; 05; 06,30; 07,8; 08; 09 и 013, Y.enterocolitica.

Реакция агглютинации ставится по общепринятой методике. С этой целью из флакона пастеровской пипеткой набирают сыворотку, не захватывая при этом осадка со дна флакона. Каплю сыворотки наносят на предметное стекло и тщательно растирают в ней петлю 20-24-часовой агаровой культуры испытуемого штамма. После получения гомогенной суспензии стекло покачивают осторожными круговыми движениями. Положительная реакция (агглютинация) наступает сразу или не позднее 2-3 мин в виде склеивания бактериальной массы с образованием плотных, с трудом разбивающихся зернышек. Жидкость при этом полностью или частично просветляется.

При отрицательной реакции смесь сыворотки и бактериальной массы остается в виде равномерной гомогенной взвеси.

В последние годы разработан и успешно апробирован ряд методов диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, направленных на обнаружение возбудителей или их антигенов в патологическом материале от павших животных, а также в копрофильтратах и моче больных животных с подозрением на псевдотуберкулез и иерсиниоз.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В последнее десятилетие установлена прямая зависимость между степенью выраженности вирулентных свойств Y.pseudotuberculosis и концентрацией антигенов вирулентности в наружней мембране. Показано, что для реализации адгезии возбудителя к эпителию слизистой оболочки кишечника с последующей инвазией и размножением в эпителии и макрофагах необходима экспрессия белков наружной мембраны (БНМ) — антигенов вирулентности. Данное обстоятельство делает перспективным использование БНМ с диагностическими целями.

В настоящее время разработано и апробировано 3 варианта тестсистем для ИФА, направленного на обнаружение БНМ иерсиний:

ИФА-ЛПС — псевдотуберкулезная система с широким спектром применения как для диагностики псевдотуберкулеза, так и для решения эпидемиологических вопросов. Чувствительность метода —105 микробных клеток в 1 см3 пробы, что соответствует мкг/мл липополисахарида возбудителя. Эффективность метода 70,2-81,1%;

ИФА-БНМ-1 — тест-система для ранней диагностики псевдотуберкулеза. Обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять возбудителя в органах и тканях животных, копрофильтратах и моче. Она наиболее эффективна при исследовании материала в начальный период болезни, когда антигены обнаруживают в 69-84% проб копрофиль-тратов и в 21-38% проб мочи. Чувствительность метода 10s-5х105 микробных клеток в 1 см3;

ИФА-БНМ-П — тест-система для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в материалах от больных (копрофильтраты, моча), павших и вынужденно убитых животных.

Для определения видовой принадлежности выявленных иерсиний (антигенов возбудителя) пробы, давшие положительную реакцию в тест-системе ИФА-БНМ-П, проверяют в тест-системе ИФАЛПС для выявления возбудителя (антигенов) псевдотуберкулеза.

Чувствительность метода — 105 микробных клеток в 1 см3, эффективность — до 83,6% положительных проб при исследовании копрофильтратов в первые 5 дней болезни. На пике инфекционного процесса данным методом выявляют до 70% инфицированных животных.

Для исследования материала в тест-системе ИФА-БНМ-П копрофильтраты, выпот брюшной полости вносят в фосфатнобуферную или буферно-казеиново-дрожжевую среду в количестве 1 г на 5 см3 среды для подращивания при температуре 3-7° С.

Внутренние органы и ткани растирают с этими средами в ступке (соотношение 1:5). Образцы исследуют в первые сутки получения проб и затем на 3-5-е сутки от начала подращивания. Мочу исследуют в нативном виде.

Результаты учитывают визуально или спектрофотометрически.

В первом случае реакцию оценивают в крестах по интенсивности появляющегося коричневого окрашивания в лунках. Положительной считают реакцию с пробой, которая дала реакцию не менее чем на ++, и по интенсивности окраски существенно отличается от проб отрицательного контроля (К-, оцененные как «-» или «+»).

Положительные результаты должны быть и в пробе с положительным контролем (К +).

При спектрофотометрическом учете результатов содержимое лунок с отрицательным контрольным образцом (К-) используют в качестве нулевого контроля. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 450 нм и считают результат положительным, если коэффициент поглощения светового потока исследуемого образца достигает величины не менее 0,05.

Наборы компонентов для постановки всех трех вариантов ИФА разработаны Санкт-Петербургским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Каждый из компонентов рассчитан на проведение 192 анализов, включая контроли.

Реакция коагглютинации (РКА). Для постановки РКА пробы мочи и копрофильтратов (с подращиванием и без него) прогревают в водяной бане в течение 30-40 мин, центрифугируют, фильтруют и исследуют надосадочную жидкость. Сыворотку крови исследуют в нативном состоянии.

На предметное стекло, разделенное на необходимое число секторов, наносят капли исследуемого материала. В каждую из капель исследуемого образца добавляют по 1 капле коагглютинирующих диагностикумов различных видов и сероваров иерсиний, в последнюю каплю вносят взвесь несенсибилизированных стафилококков (отрицательный контроль). В качестве положительного контроля на отдельном предметном стекле смешивают по 1 капле каждого использованного диагностикума с 1 каплей липополисахарида соответствующих бактерий в концентрации 10-20 мкг/см3. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская слияния проб, расположенных рядом. Результат реакции учитывают через 5минут экспозиции стекол во влажной камере по образованию хлопьев агглютината стафилококков и просветлению жидкости.

РКА наиболее эффективна в начальный период острого заболевания (1-5-й дни), при других формах — в сроки максимальной выраженности клинических признаков. По данным различных авторов чувствительность данного метода исследований составляет 105-108 микробных клеток/см3. Эффективность при кишечном иерсиниозе —до 85%, при псевдотуберкулезе — до 60-70% в первые дней от начала болезни. В отличие от РА при постановке РКА не наблюдается перекрестных реакций с другими представителями энтеробактерий, бруцеллами. Использование РКА сокращает сроки исследования на иерсиниоз с 14-17 до 3-4 суток в сравнении с традиционным бактериологическим исследованием.

Реакция латекс-агглютинации (РИА). РИА используют для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в копрофильтратах и в смывах с объектов внешней среды. В отличие от РКА, в качестве носителей иммуноглобулинов используют частицы латекса, которые не обладают антигенностью, а потому предпочтительнее стафилококка. Латексный псевдотуберкулезный диагностикум выпускается Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сывороток. Сконструированы латексные диагностикумы и для индикации Y.enterocolitica сероваров 03; 05, 30; 07,8.

Чувствительность метода — 106 микробных клеток в 1 см3 исследуемой пробы. Диагноз на псевдотуберкулез данным методом может быть подтвержден у 73% больных животных.

Большинство штаммов Y.enterocolitica, выделяемых на территории Российской Федерации от животных, человека и из объектов внешней среды, относятся к сероварам 03; 09; 05, 27; 08; 06, 30. В Европе преобладают бактерии сероваров 03 и 09, в США — 08, на Дальнем Востоке — 06.

В многочисленных работах, посвященных изучению иерсиниозов у животных, сообщается, что практически на всех территориях от свиней изолируют Y.enterocolitica сероваров 03; 04,32; 05;

05,27; 06,30; 07; 08; 09; 011;012;017 и 019,а иерсиний, выделенные от крупного рогатого скота, относятся к сероварам 03; 04; 05,27;

07,8; 012; 013 и 018.

Определение патогенности Y.pseudotuberculosis являются патогенными микроорганизмами. У них, в отличие от Y.enterocolitica, отсутствует зависимость вирулентности от наличия плазмиды, контролирующей синтез V- и W-антигенов и кальцийзависимость роста, поскольку бесплазмидные варианты сохраняют инвазивные и цитотоксические свойства. Это указывает на определяющую роль хромосомного контроля основных патогенных свойств Y.pseudotuberculosis. Поэтому выделение чистой культуры, отнесение ее к виду Y.pseudotuberculosis и определенному его серовару являются достаточными основаниями для постановки диагноза на псевдотуберкулез. Однако и в этом случае иногда прибегают к постановке биопробы. С этой целью ставят кератоконъюнктивальную пробу (тест Шереня) на морских свинках. При этом в один из конъюнктивальных мешков животного инокулируют каплю суспензии испытуемого штамма концентрацией 1010 микробных тел. При положительном результате в течение 48-72 час развивается гиперемия конъюнктивы, отек век и сужение глазной щели, наблюдают серозно-гнойное истечение.

Возможно использование для постановки биопробы и белых мышей, которых заражают орально, внутривенно или внутрибрюшинно. В зависимости от метода инокуляции псевдотуберкулезного возбудителя, животные погибают на 3-9-е сутки. На вскрытии обнаруживают увеличение печени и селезенки, которые имеют многочисленные некротические очажки, напоминающие туберкулезные бугорки, но в отличие от них, не подвергающиеся обызвествлению. Аналогичные абсцессы или узелки обнаруживают и в легких.

К безусловно патогенным Y.enterocolitica относятся бактерии сероваров 03; 04, 32; 05; 05, 27; 06, 30; 07,8; 08; 09 биоваров II и IV, реже I и III. Наряду с ними выделяется и значительная часть апатогенных иерсиний. При этом принадлежность того или иного штамма к определенному серологическому и биологическому варианту далеко не всегда подтверждает либо опровергает его этиологическую значимость. Имеется достаточно сообщений о выделении патогенных штаммов иерсиний серобиоваров, ранее считавшихся непатогенными, и наоборот. Из-за столь неоднозначной роли различных серобиоваров Y.enterocolitica в патологии животных для правильного решения вопроса о патогенности того или иного штамма, а следовательно, и для правильной постановки диагноза необходимы дополнительные исследования его факторов вирулентности.

Для большинства патогенных штаммов Y. enterocolitica характерны выраженные адгезивные свойства, обусловливающие колонизацию возбудителя на энтероцитах, а также энтеротоксигенность.

Продуцируемый возбудителем в больших количествах термостабильный энтеротоксин весьма сходен с таковым энтеротоксигенных неинвазивных эшерихий.

Механизм действия термостабильного энтеротоксина Y.enterocolitica связан с активацией аденилатциклазы в эпителиальных клетках кишечника, что ведет к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и нарушению водноэлектролитного баланса и энтеросорбции. В реализации действия энтеротоксина принимают участие и простоглаидины. Наблюдаемая при этом колонизация энтероцитов при минимальной инвазии или ее отсутствии подтверждает важную роль энтеротоксина в патогенезе кишечного иерсиниоза. Энтеротоксигенные Y.enterocolitica вызывают у животных и человека диареи различной интенсивности.

Штаммы Y.enterocolitica, обладающие инвазивностью, способностью размножаться в органах и тканях организма хозяина, вызывают генерализованную инфекцию. Корреляции между эптеротоксигенностью и инвазивностью у данного возбудителя не установлено.

В отличие от Y.enterocolitica, у Y.pseudotuberculosis установлены максимальная инвазивность, цитотоксичиость и способность к генерализации инфекции. Действие энтеротоксина Y.pseudotuberculosis на слизистую оболочку кишечника выражено значительно меньше, чем у Y. enterocolitica.

К настоящему времени установлено, что к возбудителю кишечного иерсиниоза чувствительны некоторые лабораторные животные: гибель морских свинок наблюдается при внутрибрюшном их заражении патогенными иерсиниями в дозе 3х109 микробных клеток в течение 24-48 часов. К подкожному введению возбудителя животные оказались устойчивы; у морских свинок конъюнктивит, а в ряде случаев абортивный кератит при введении патогенных иерсиний серовара 09 в конъюнктивальную полость. При этом штаммы серовара 03 патологической реакции не вызвали.

Лучшими способами заражения являются внутрибрюшное и подкожное введение бактерий. При этих способах аппликации иерсиний в разных опытах и для различных сероваров (03; 08; 09;

06,30) ЛД50 возбудителя составляли от 1,5х107 до 2,5х108 микробных клеток.

При пероральном заражении мышей инфекционный процесс удавалось воспроизвести только при искусственном подавлении иммунитета (бестимусные животные, обработка иммунодепрессантами) либо на мышах-гнотобиотах.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что патогенность Y.enterocolitica для лабораторных животных изучена еще недостаточно. Дополнительную сложность в изучении данного вопроса вызывает циркуляция в природе патогенных иерсиний с различной степенью вирулентности для животных, включая и лабораторных.

Вследствие этого нередко при заражении патогенными иерсиниями лабораторных животных их гибели не наблюдается, поэтому биопроба для проверки патогенности Y. enterocolitica не рекомендуется.

Выше упоминалось о том, что патогенность у Y.enterocolitica детерминируется плазмидой и сопровождается наличием у таких штаммов ряда культуральных особенностей, которые предложено использовать в качестве маркеров вирулентности.

Определение способности к аутоагглютинации. Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жидкой питательной среде и заключается в спонтанном склеивании клеток иерсиний. Для проверки данной способности в две пробирки со средой Кларка засевают чистую культуру испытуемого штамма Y.enterocolitica, полученную на МПА. Посевной материал вносят в количестве 106-108 микробных клеток в объеме 1 см3. Одну из пробирок инкубируют при температуре 37° С, вторую — при 25° С в течение 24-48 часов.

Патогенные иерсинии при температуре культивирования 37° С образуют обильный хлопьевидный осадок, а при 25° С — равномерное помутнение, при этом возможен небольшой, компактный осадок.

Непатогенные бактерии в обеих пробирках дают рост в виде равномерного помутнения при отсутствии хлопьев.

При длительном лабораторном хранении штаммов с частыми пересевами и культивированием при 37° С часть изначально патогенных клеток, составляющих популяцию изучаемого штамма, может утрачивать плазмиду, отвечающую за вирулентность. При наличии в популяции 30-70% таких бесплазмидных клеток результаты теста становятся нечеткими. В таких случаях его повторяют после предварительного клонирования с целью выделения плазмидосодержащих клонов. Данную операцию можно осуществить при определении кальцийзависимости роста изучаемого штамма, что также относится к одному из маркеров вирулентности у данного вида бактерий.

Определение кальцийзависимости роста. Данный тест основан на том, что у патогенных иерсинии при культивировании их на кальцийдефицитной агаровой среде при температуре 37° С проявляется ограничение роста. Это выражается образованием колоний значительно меньшего диаметра, чем при культивировании на обычных питательных средах или при дефиците ионов Са ++, но при температуре 25° С.

Для определения кальцийзависимости готовят специальную кальцийдефицитную среду на основе коммерческого агара АГВ. На поверхность этой среды в двух чашках Петри засевают культуру испытуемого штамма, выращенную в среде Кларка при 25° С. Посев ведут с тем расчетом, чтобы получить рост изолированных колоний (от 100 до 500 клеток на стандартную чашку Петри). Одну чашку инкубируют при 37° С, вторую — при 25° С в течение 48 часов, после чего учитывают результаты теста.

Патогенные иерсинии при 37° С вырастают в виде колоний значительно меньшего диаметра, чем на чашке, инкубировавшейся при 25° С. Иногда рост может отсутствовать вовсе. Дополнительное инкубирование такой чашки при 25° С в течение 24-48 часов ведет к образованию колоний обычного размера.

Непатогенные иерсинии при обеих температурах образуют колонии обычной величины (через 24 часа диаметром 1,0-1,5 мм, через 48 часов — до 1,5-2,0 мм).

При наличии в популяции патогенных иерсинии клеток, утративших плазмиду, детерминирующую факторы патогенности, рост при 37° С отмечают в виде различного соотношения крупных и мелких колоний.

Определение температурозависимой морфологии колоний.

Морфологию колоний иерсинии изучают после их 24-48-часового инкубирования при 25° С и 37° С на агаре АГВ в чашках Петри.

Учет результатов осуществляют невооруженным глазом или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют окуляр-микрометром.

При 37° С патогенные иерсинии образуют малопрозрачные, желтоватого цвета, зернистые, выпуклые колонии, диаметр которых, как правило, не превышает 1,0 мм.

При 25° С колонии патогенных штаммов сходны по морфологии и размерам с колониями, образуемыми непатогенными иерсиниями при обеих температурах инкубирования. Они более прозрачны, голубоватого цвета, плоские, маслянистой консистенции, имеют диаметр в 1,5- 3 раза больший, чем у патогенных иерсинии, вырастающих при 37° С.

Определение пиразинамидазной активности. Тест основан на способности непатогенных Y.enterocolitica продуцировать пиразинамидазу и отсутствии такой способности у патогенных штаммов.

Для выполнения теста готовят специальную плотную питательную среду с пиразинкарбоксиамидом. В пробирку со скошенной питательной средой высевают культуру испытуемого штамма и инкубируют посевы в течение 48 часов при 25-30° С. По окончании инкубирования на поверхность среды с выросшими колониями наносят 1%-ный водный свежеприготовленный раствор железистого сульфата аммония. Учет результатов теста проводят через 15 минут.

Колонии непатогенных иерсинии, продуцирующих пиразинамидазу, приобретают розовую окраску, патогенных — не изменяют своего цвета.

Серологическая идентификация вирулентных иерсинии в реакции агглютинации на стекле (РА-СВИ). Вирулентные иерсинии выявляют с помощью диагностической сыворотки к вирулентным иерсиниям (СВИ) в РА на стекле.

Комплект для РА с сывороткой диагностической к вирулентным иерсиниям (СВИ) содержит СВИ с рабочим разведением 1: и 10 %-ную нормальную кроличью сыворотку («К-» для контроля специфичности).

Для постановки реакции на обезжиренное предметное стекло наносят 1 каплю СВИ и 1 каплю «К-». В обе капли добавляют по одной петле культуры испытуемого штамма, выращенной на МПА при 25-37° С, и растирают биомассу до образования гомогенной суспензии. Затем стекло осторожно покачивают, наблюдая за результатом реакции.

Положительная РА вирулентных иерсиний с СВИ характеризуется появлением крошек агглютината в течение 3 минут. Агглютинат лучше заметен на темном фоне при косом освещении. В суспензии с нормальной сывороткой («К-») агглютинат образовываться не должен.

При отрицательной реакции в обеих каплях сохраняется равномерная, гомогенная суспензия бактерий.

Серологическая диагностика псевдотуберкулеза и кишечного Реакция агглютинации. Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены, представляющие собой суспензию инактивированных формалином культур эталонных штаммов Y.enterocolitica сероваров 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 07,8;

09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III концентрацией 10 млрд.

микробных клеток в 1 см3. Перед постановкой реакции, которую осуществляют методом равных объемов, антигены разводят до рабочей концентрации 1 млрд/см3 (1:10).

При кишечном иерсиниозе характер гуморального иммунного ответа в значительной степени зависит от тяжести и клинического проявления болезни. Высокие титры антител обнаруживаются при тяжелом поражении суставов и септической форме инфекции. При легком течении, особенно при гастроэнтероколитах, антитела выявляют в более низких титрах, однако и в этом случае их уровень часто достигает диагностических величин. Выше упоминалось о наличии у иерсиний общих внутриродовых антигенов и антигенов, обуславливающих перекрестные реакции с рядом энтеробак-терий других родов, бруцеллами. Однако на пике инфекционного процесса уровень видосеровароспецифических антител, как правило, значительно превышает уровень гетерологичных антител. Этим обусловлен минимальный диагностический титр в РА, равный 1:160Лучше использовать метод парных сывороток крови, при котором достоверным считается 2-4-кратное и более нарастание титров антител. Антитела к Y.enterocolitica начинают выявляться со 2-й недели болезни.

К антигенам антитела в крови появляются уже к концу первой недели болезни, а существенное увеличение титров (1:200 и более) отмечают к началу 3-й недели. Этими сроками определяется необходимость использования, как и при кишечном иерсиниозе, метода парных сывороток при постановке РА. Через 2 месяца наблюдается снижение концентрации антител, и к 6 месяцам их титры обычно не превышают значений 1:50-1:100.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). В последнее время для серодиагностики иерсиниозов все шире применяется РНГА, как тест более чувствительный в сравнении с РА. С этой целью разработаны моновалентные антигенные эритроцитарные диагностикумы к Y.enterocolitica сероваров 03; 05; 07,8; 06,30; 09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III, двухвалентный диагностикум к сероварам 03 и 09, а также поливалентный диагностикум дополнительно содержащий псевдотуберкулезный антиген.

РНГА применяют со 2-3-й недели болезни, используя метод парных сывороток. Диагностический титр — разведение сыворотки 1:100 и более.

РНГА с использованием антительных эритроцитарных диагностикумов используется для обнаружения иерсиниозных антигенов в патологическом материале и в объектах внешней среды. Исследуемый материал при этом перед исследованием подращивают 3-5 суток, инактивируют при 56° С и берут для исследования надосадочную жидкость.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для дифференциации специфического иммунного ответа, возникающего в острый период иерсиниоза и псевдотуберкулеза, от неспецифических антител используют иммуноферментное определение количественного содержания IgM и IgG.

В острый период данных заболеваний в сыворотке крови преобладают IgM, которые замещаются IgG к концу первого месяца от начала инфекционного процесса. Поэтому обнаружение специфических IgM при однократном исследовании проб крови может с большой долей вероятности подтвердить клинический диагноз.

Используется твердофазный ИФА в пластинах и ДОТ-ИФА.

В первом случае реакцию учитывают визуально по изменению окраски содержимого лунки планшета либо спектрофотометрически по оптической плотности продукта реакции, которая у положительных образцов должна превышать в 2-3 раза таковую в контрольных пробах.

ДОТ-ИФА проводят на нитроцеллюлозных мембранах. Данный вариант анализа не уступает по чувствительности твердофазному, но проще его в техническом исполнении. При этом используются микроколичества антигена, а результаты оцениваются визуально. Положительным результатом считается появление коричневых точек па фильтрах с исследуемыми образцами при отсутствии окрашивания в контроле.

Чувствительность ИФА превышает чувствительность РА и РНГА в 10 раз. Антитела при псевдотуберкулезе выявляются начиная с 3-й недели болезни. Диагностический титр 1:256 и более.

Наибольшие трудности представляет дифференциация иерсиниоза, обусловленного сероваром 09, от бруцеллеза. Это связано с выраженным антигенным родством их возбудителей. В таких случаях, помимо постановки серологических реакций Райта, Хеддельсона, Роз-Бенгал на бруцеллез, перспективно применение метода дифференциации иерсиниоза и бруцеллеза по классам иммуноглобулинов (М и G) в ИФА. При этом в качестве специфического антигена используют убитую ацетоном культуру Br.abortus. Стандартный антиген представляет собой взвесь убитых ацетоном бруцелл концентрацией 10 млрд./мл. Перед постановкой реакции антиген разводят 1:10 (рабочая концентрация 1 млрд./мл) 0,9%-ным раствором натрия хлорида.

Методика приготовления компонентов реакции, техника постановки и учета ИФА изложены в инструкции по применению пероксидазных конъюгатов к иммуноглобулинам М и G, выпускаемым ТОО «Полигност» (Санкт-Петербург).

Контрольные вопросы. 1. Правила взятия, оформления и отправки в лабораторию патматериала для исследования? 2. Как ставят диагноз на иерсиниозы? 3. Дифференциальная диагностика иерсиниозов. 4. Методы лабораторной диагностики иерсиниозов. 5. На чем основана лабораторная диагностика на иерсиниозы?

Список использованной литературы 1. Антонов Б.И, Борисова В.В, Волкова П.М. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник. - М.: Агропромиздат, 1986.

2. Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Власов Н.А. и др. Особо опасные болезни животных. Покров.: ВНИИВВиМ, 1998.

3. Ветеринарная микробиология иммунология: Учебник /Под ред.

проф. Н. А. Радчука. - М. Агропромиздат 1991.

4. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М. Агропромиздат 1989.

5. Колычев Н. И. Ветеринарная микробиология и иммунология.

Омск 1996г.

6. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.

Костенко Т.С., Родионова В.Б, Скородумов Д.И. М.: Колос, 2001.

7. Сидоров М.А, Скородумов Д.И, Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. – М.: Колос, 1995.

8. Скородумов Д.И, В.В. Субботин, Сидоров М.А, Костенко Т.С.

Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. – М.: ИзографЪ, 2005.

9. Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н.

Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. – Краснодар. - 2009, 575 с.

10. Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Литвинова А.Р., Брилев Р.О., Злищева М.А. Совершенствование специфической профилактики крупного рогатого скота//Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: Ветеринарные науки, 2009. – № (ч.1). - С. 127-129.

Авторы: А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, Л.В. Шевченко, Г.А. Джаилиди, Зеркалев Д.Ю., Е.А. Горпинченко, А.В. Скориков Учебное пособие «Диагностика иерсиниозов животных».

© Кубанский государственный аграрный университет 350044, Краснодар, ул. Калинина,