«МЕТОДЫ БИОФОТОНИКИ: ФОТОТЕРАПИЯ Учебное пособие САРАТОВ НОВЫЙ ВЕТЕР 2012 УДК [577.345:615.831](075.8) ББК 28.707.1я73 Г34 Г34 Генина Э.А. Методы биофотоники: Фототерапия. – Саратов: Новый ветер, 2012. – 119 с.: ил. ISBN ...»

Генина Э.А.

МЕТОДЫ БИОФОТОНИКИ:

ФОТОТЕРАПИЯ

Учебное пособие

САРАТОВ

«НОВЫЙ ВЕТЕР»

2012

УДК [577.345:615.831](075.8)

ББК 28.707.1я73

Г34

Г34 Генина Э.А. Методы биофотоники: Фототерапия. – Саратов: Новый ветер,

2012. – 119 с.: ил.

ISBN 978-5-98116-149-0 Настоящее учебное пособие предназначено для расширения и углубления знаний студентов по вопросам действия света на биологические системы; изучения фундаментальных основ фотобиологических процессов и механизма фотодинамических реакций в биологических системах и разработанных на их основе методов фототерапии.

Для студентов, обучающихся по специальностям «Медицинская физика», профилям «Биофизика» и «Медицинская фотоника» направления 011200 «Физика».

Рекомендуют к печати:

Кафедра оптики и биофотоники ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»;

доктор биологических наук, профессор кафедры биофизики ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», научный сотрудник НОЦ фундаментальной медицины и нанотехнологий ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского»

Г.С. Терентюк;

кандидат медицинских наук, доцент кафедры ботаники и экологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

О.В. Ульянова Издание осуществлено при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы»

(государственный контракт № 02.740.11.0879) УДК [577.345:615.831](075.8) ББК 28.707.1я ISBN 978-5-98116-149-0 © Генина Э.А.,

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ФОТОМЕДИЦИНЫ……………………

2. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОЦЕССОВ……………………………………………………………………… 2.1. Понятие фотобиологического процесса…………………………………. 2.2. Внутримолекулярные и межмолекулярные процессы переноса энергии 2.3. Спектр фотобиологического действия……………………………………

3. МЕХАНИЗМ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ РЕАКЦИЙ В

БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ………………………………………………. 3.1. Понятие фотосенсибилизатора…………………………………………… 3.2. Кислороднезависимые фотосенсибилизированные реакции…………... 3.3. Кислородзависимые фотосенсибилизированные реакции……………... 3.4. Синглетный кислород и другие активные формы кислорода…...……… 3.5. Кинетический анализ реакций фотосенсибилизированного окисления.. 3.6. Классификация реакций фотосенсибилизированного окисления……… 4. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КОЖЕ……………………………... 4.1. Эритема……………………………………………………………………... 4.2. Пигментация кожи…………………………………………………………. 4.2.1. Непрямая пигментация (загар)……………………………………….. 4.2.2. Прямая (немедленная) пигментация…………………………………. 4.3. Синтез витамина D3………………………………………………………... 4.4. Фотоканцерогенез………………………………………………………….. 4.5. Фотоаллергия и фотоиммуносупрессия………………………………….. 5. МЕТОДЫ ФОТОТЕРАПИИ………………………………………………………. 5.1. Псораленовая фотохимиотерапия (ПУФА-терапия)…………………….. 5.2. Фототерапия желтухи новорожденных…………………………………... 5.3. Низкоинтенсивная лазерная терапия……………………………………... 5.3.1. Особенности взаимодействия лазерного излучения с биотканями... 5.3.2. Возможные механизмы биологического действия низкоинтенсивных лазеров………………………………….………………………….. 5.4. Другие методы фототерапии……………………………………………… 6. ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ…………………………………………… 6.1. Основы фотодинамической терапии……………………………………... 6.2. Фотосенсибилизаторы……………………………………………………... 6.2.1. Свойства фотосенсибилизаторов…………………………………… 6.2.2. Внутриклеточная локализация фотосенсибилизаторов…………… 6.2.3. Направленная доставка фотосенсибилизаторов…………………… 6.3. Клеточные механизмы фотодинамической терапии…………………….. 6.3.1. Фотодинамическое воздействие на клеточные структуры……….. 6.3.2. Реакции клеток на внешние воздействия……………………………. 6.3.3. Смерть клеток при фотодинамическом воздействии……………... 7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………….. 8. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………...

1. ВВЕДЕНИЕ. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ

ФОТОМЕДИЦИНЫ

Традиционно считается, что фотомедицина начала развиваться только в последнее десятилетие 20 века. Между тем, это не так. Просто бурный всплеск в других медицинских областях в начале 20 века отвлек внимание ученых от фотомедицины. А ведь еще издревле, как простые люди, так и великие доктора, — Гиппократ (Hippocrates), Авиценна (Avicenna), Гален (Galenus) — прекрасно знали о целебных свойствах солнечного цвета. Знали и противопоказания: “на слишком высоком солнце нельзя долго находиться”.

Фототерапия зародилась примерно 4 тыс. лет назад в Египте и Индии. В те времена, как и сейчас, люди страдали от витилиго – кожного заболевания, при котором на некоторых участках кожи деградируют и исчезают меланоциты. Древние врачи для лечения витилиго начали использовать экстракты, получаемые при кипячении семян растений семейства Зонтичные (Ammi majus) или Бобовые (Psoralea corylifolia). Экстракты либо наносили на поверхность кожи, либо принимали внутрь, после чего больные подвергались действию яркого в этих странах солнечного света. Лечение приводило к постепенному восстановлению пигментации. Без света экстракты не действовали.

Дозировки света и содержавшегося в экстрактах фотосенсибилизатора в то время не могли контролироваться: при заниженных дозах фотосенсибилизатора и освещения снижался терапевтический эффект, а при их передозировке возникали ожоги. Так или иначе, уже древние египтяне и индусы практически применяли фотохимиотерапию.

В дальнейшем резкий всплеск интереса к фотомедицине произошел в конце 19-го века и связан в числе прочих со значительными техническими достижениями того времени. Образуется раздел медицины, названный гелиотерапией (в буквальном переводе — лечение солнечным светом). В это время выявлено огромное значение солнечного света при лечении цинги, различных заболеваний суставов, многих кожных болезней. Проводились также работы по изучению влияния света на ускорение заживления ран (сейчас такое влияние полностью научно доказано и ниже мы поговорим более детально о механизме ранозаживления под воздействием света).

Большой вклад в развитие фотомедицины внес известный датский врач Нильс Рюберг Финсен (Niels Ryberg Finsen), который экспериментально доказал применение красной части спектра (“красного солнца”) для лечения оспы. Расширив границы своих исследований, Р. Финсен начал экспериментировать с источниками искусственного света, в особенности с дуговыми угольными лампами. Он хотел выяснить, окажутся ли они эффективными для лечения обыкновенной волчанки – почти не поддающейся терапии кожной болезни, вызываемой микобактерией туберкулеза и часто настолько обезображивающей внешность своих жертв, что они становились изгоями общества. Р. Финсен подвергал пациентов двухчасовому ежедневному воздействию ультрафиолетовых лучей от дуговой угольной лампы постоянного тока силой 25 А. Через много месяцев пораженные участки кожи стали уменьшаться и появились явные признаки выздоровления больных. В 1896 г. в Копенгагене был основан Финсеновский институт светолечения, директором которого стал Р. Финсен. В институте были разработаны способы лечения с помощью финсеновских дуговых ванн, а также терапевтические методы, позволившие увеличить лечебную дозу ультрафиолетового излучения при минимальном повреждении тканей. В последующие пять лет 800 больных волчанкой прошли курс лечения в Финсеновском институте; 50% полностью выздоровели, у 45% отмечалось значительное улучшение. За эти работы Р.

Финсен был удостоен в 1903 году Нобелевской премии по физиологии и медицине «в знак признания его заслуг в деле лечения болезней – особенно волчанки – с помощью концентрированного светового излучения, что открыло перед медицинской наукой новые широкие горизонты».

Примерно в тоже время американские ученые Е. Кнотт (E. Knott) и В.

Хэнкок (V. Hancock) использовали бактерицидное свойство УФ-излучения для лечения больных сепсисом 1.

Открытие фотодинамического эффекта связано с именем Оскара Рааба (Oscar Raab) – студента профессора Херманна фон Таппайнера (Hermann von Tappeiner) в Мюнхенском Фармакологическом институте. О. Рааб начал активные исследования во время зимнего семестра 1887-1888 гг. В своей диссертации он писал: «В это время года яркость солнечного света постоянно менялась, и именно этот факт привел меня к тем результатам, которые мне удалось получить». Суть открытия О. Рааба состояла в том, что когда интенсивность света в поле микроскопа была достаточно большой, окрашенные акридином или другими флуоресцирующими красителями, как например, хинин, метил фосфин и эозин, клетки Paramecia (инфузории туфельки) прекращали движение и погибали, причем спектр действия этого эффекта соответствовал спектру поглощения красителей. Явление было описано в статьях О. Рааба и Х. Таппайнера в 1900 г. Х. Таппайнер назвал это явление «фотодинамическим действием».

Вслед за этим было показано, что для наблюдения фотодинамического лизиса эритроцитов и повреждения клеток инфузорий необходим кислород.

Параллельные исследования растворов биологически важных соединений привели к заключению, что освещение в присутствии красителей приводит к окислению этих субстратов кислородом. Это позволило У. Штраубу (W. Straub) в 1904 г. предположить, что в основе фотоокисления органических соединений и фотоповреждения клеток лежит один и тот же процесс – фотосенсибилизированное окисление кислородом. С этого времени термин «фотодинамическое действие» стали применять для обозначения фотосенсиЭтот метод, названный первоначально по имени его создателей (метод Кнотта-Хэнхука) впоследствии стал более широко известен под названием метод УФ-облучения крови с последующей реинфузией.

билизированных реакций окисления органических соединений в биологических системах и в растворах. Иными словами, фотодинамическими стали называть такие реакции окисления субстратов кислородом, которые не идут в темноте, но осуществляются при добавлении красителя и его освещении.

Красители, фотосенсибилизирующие такие реакции или фотобиологические эффекты, стали называть фотодинамическими красителями. При этом краситель не расходуется, его роль состоит в том, что он делает реакцию окисления чувствительной к свету.

В естественных условиях фотодинамическое действие является причиной многообразных биологических эффектов. Известны фотодинамические болезни человека и животных, как например, вызванные солнцем поражения кожи домашних животных, связанные с потреблением в пищу зверобоя (Hipericum). Это заболевание, названное гиперицизмом, возникает благодаря накоплению в крови пигмента зверобоя – гиперицина. Аналогичное заболевание (фагопиризм) возникает при избыточном потреблении гречихи (Fagopirum), благодаря накоплению фагопирина – пигмента, близкого по химической структуре к гиперицину. Генетические нарушения могут вызвать фотодинамические поражения, вызванные порфирией – избыточным содержанием порфиринов. Известны фотодинамические повреждения кожи, вызванные косметическими средствами, лекарствами, моющими средствами и многими другими факторами. Фотосенсибилизирующее действие смога и органических загрязнений воздуха и воды является одним из факторов, усиливающих их вредное биологическое действие.

Фотодинамическое действие может быть причиной биологических и терапевтических эффектов, вызванных красным и инфракрасным лазерным излучением, причем некоторые из этих эффектов, возможно, обусловлены прямым поглощением лазерного излучения кислородом.

Применение фотодинамического эффекта в онкологии берет свое начало в 1924 г. с работы А. Поликард (A. Policard), в которой было показано, что при облучении ультрафиолетом некоторые злокачественные опухоли человека флуоресцируют в оранжево-красной области спектра. Данное явление объясняли наличием в опухолях эндогенных порфиринов. Позднее это было подтверждено на экспериментальных опухолях, которые начинают флуоресцировать в красной области спектра, если животным предварительно ввести гематопорфирин.

Фотодинамическое уничтожение раковых опухолей и лечение заболеваний, вызванных патологической микрофлорой, являются в настоящее время интенсивно развивающимися направлениями фотомедицины.

Широкое распространение и важное прикладное значение фотодинамического действия делают это явление одним из главных фотобиологических явлений в природе, а изучение его механизмов – одной из фундаментальных фотобиологических проблем.

Фотодинамическая терапия, при которой используются активируемые светом лекарства для избирательного уничтожения раковых клеток, впервые была применена в 1903 г., когда для лечения рака кожи прибегли к эозину и свету. Однако хорошо аргументированные данные о «фотонекрозе» опухолей были получены только в 1942 г. Животным с опухолью вводили гематопорфирин, одновременно облучая их кварцевой лампой. Наряду с известными в тот период симптомами, такими как световая эритема и отек, у экспериментальных животных развивались некроз и отторжение опухолевых тканей.

После этого началось интенсивное исследование и расширение представлений о первом поколении фотосенсибилизаторов, представленном производными гематопорфирина, благодаря чему появились новые возможности лечения, а также сведения о механизмах действия. На данном этапе была продемонстрирована способность малигнизированных тканей поглощать гематопорфирин и его цинкопорфириновые комплексы, и высказано предположение о возможности проведения фототерапии рака с использованием порфиринов.

Современная эпоха применения ФДТ в онкологии началась с публикаций Р. Липсон (R. Lipson) в 60-х годах XX столетия, в которых было показано, что после внутривенной инъекции смеси производных гематопорфирина (HpD) злокачественные опухоли визуализируются за счет характерного флуоресцентного излучения избирательно накопленных порфиринов. В г. было проведено флуоресцентное детектирование и первое фотодинамическое лечение пациентки с раком молочной железы. В 1976 г. HpD был впервые успешно применен в США для лечения рака мочевого пузыря. В 1978 г.

Т. Дж. Догерти и др. (T.J. Dougherty). при лечении методом ФДТ 113 кожных и подкожных злокачественных опухолей описали развитие частичного или полного некроза в 111 наблюдениях. И если для проведения ФДТ в данной работе был использован ламповый источник света с системой фильтров, то уже в 1980 г. впервые было применено воздействие лазерным излучением длиной волны 630 нм. С начала 80-х гг. ФДТ стали применять в лечении эндобронхиального рака, опухолей головы и шеи, пищевода и др.

Современные технические возможности позволили светотерапии, а затем и лазеротерапии сделать значительный шаг вперед. В настоящее время фотомедицина включает не только фототерапию, но и фотохирургию и фотодиагностику. Лазеры и светосинтезирующие аппараты заняли прочное место и в эстетической медицине. Специальные исследования позволили определить дозы воздействия света на организм человека, стимулирующие способность организма к регенерации и самовосстановлению.

Фототерапия 2 (другими словами светолечение или светотерапия) - это вид лечения, состоящий в том, что пациент подвергается воздействию солнечного света, или света с определенными длинами волн от искусственных источников, таких, как лазеры, светоизлучающие диоды, флуоресцентные Термином «фототерапия» в настоящее время обозначают также один из методов арттерапии. Под ним понимают набор психотехник, связанных с лечебно-коррекционным применением фотографии, её использования для решения психологических проблем, а также развития и гармонизации личности.

лампы, дихроичные лампы, или же очень яркого света, имеющего полный спектр дневного света, в течение определённого, предписанного врачом, времени, а иногда также и в строго определённое время суток. Современная фототерапия берет начало в 1923 г., когда для лечения псориаза стали применять ртутно-кварцевые лампы.

Определенная степень желтушности достаточно часто встречается у новорожденных и наблюдается почти у 50 % младенцев между 2-м и 4-м днями жизни. До рождения билирубин связывается и экскретируется преимущественно плацентой, однако после рождения эту функцию выполняет печень новорожденного. Транзиторная гипербилирубинемия является результатом недостаточной активности связывающего фермента печени – глюкуронилтрансферазы. Фототерапия на длине волны ~450 нм – весьма эффективное средство профилактики гипербилирубинемии, способствующее образованию так называемого фотобилирубина, который нетоксичен.

Для ускорения заживления ран, улучшения микроциркуляции крови применяется лазерная терапия, заключающаяся в облучении ран и крови больного красным светом низкоинтенсивных лазеров.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является результатом комбинированного действия трех компонентов – фотосенсибилизатора, света и кислорода. ФДТ представляет собой двухступенчатый процесс: фотосенсибилизирующий препарат применяется местно или системно, после чего производится облучение светом соответствующей длины волны. При фотодинамической терапии наиболее часто используются порфирины в сочетании с красным светом (600 - 700 нм), а также сенсибилизаторы - фталоцианины, хлорины, пурпурины, порфины, различные красители, обладающие фотодинамическими свойствами, сочетания красителей и наночастиц и другие.

Противоопухолевые эффекты данного вида лечения обусловлены комбинацией прямого фотоповреждения клеток, разрушения сосудистой сети опухоли и активации иммунного ответа. Антибактериальное применение ФДТ основано на фотосенсибилизированном повреждении стенки бактериальной клетки с последующей ее гибелью. Таким образом, В основе ФДТ лежит фототоксическое действие света.

Фототоксические эффекты возникают под действием оптического излучения, поглощенного эндогенным хромофором или экзогенным фотосенсибилизатором. Они наблюдаются у всех испытуемых и характеризуются наличием пороговой дозы; эффекты усиливаются с увеличением дозы или концентрации вещества. К фототоксическим соединениям относятся псоралены, порфирины, тетрациклины, фенотиазины, сульфаниламиды, хлорпромазин и др. Клинически фототоксические эффекты проявляются в форме эритемы, эдемы, пигментации и т.д. Многие виды фототерапии основаны именно на фототоксическом действии света.

От фототоксических эффектов следует отличать фотоаллергические эффекты, которые также возникают после поглощения света химическим соединением в коже, но для их возникновения необходима первичная иммунологическая сенсибилизация.

Фотоаллергию от фототоксичности отличают по двум критериям:

1) фотоаллергия перед проявлением эффекта требует нескольких сенсибилизирующих воздействий, тогда как для индукции фототоксического эффекта достаточно одного облучения;

2) только у малой доли испытуемых проявляется чувствительность к данному фотоаллергену, тогда как фототоксический эффект наблюдается у всех экспонировавшихся. Важно отметить, что некоторые вещества обеспечивают фототоксический эффект лишь в высоких дозах, в то время как фотоаллергию вызывают после нескольких малых доз.

Целями учебного пособия являются: расширение и углубление знаний студентов по вопросам действия света на биологические системы; изучение фундаментальных основ фотобиологических процессов и механизма фотодинамических реакций в биологических системах и разработанных на их основе методов фототерапии; знакомство с последними достижениями в области создания фотосенсибилизаторов.

2. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

2.1. Понятие фотобиологического процесса К фотобиологическим относятся процессы, начинающиеся с поглощения кванта света биологически важной молекулой и заканчивающиеся какойлибо физиологической реакцией (позитивной или негативной) на уровне организма.

К фотобиологическим процессам относятся фотосинтез, зрение, загар и эритема кожи, фотопериодизм и многие другие.

Огромное число фотобиологических реакций подразделяют на два типа:

функционально-физиологические реакции и деструктивно-модифицирующие (схема 2.1). Если с помощью света запускаются реакции, в которых образуются продукты, необходимые для выполнения естественных функций клеток или организмов, то они относятся к функционально-физиологическим фотобиологическим реакциям. Если же под действием света происходит повреждение биологических молекул, что приводит к химическим реакциям, не свойственным организму в норме, то такие реакции относятся к деструктивно-модифицирующим.

Схема 2.1. Фотобиологические реакции Каждый тип реакций подразделяется на три класса. Характеристики разных классов фотобиологических реакций приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1. Основные характеристики фотобиологических реакций Образуются фотопродукты, запускающие специализированные усилиЗрение, фототаксис, 2 Информационные тельные механизмы, в результате чего 4 Летальные приводит к гибели организма. Харак- бактерицидный эфтерно для вирусов, микроорганизмов, фекты 5 Мутационные ДНК, т.е. возникновение мутации. Орэффект Условно всякий фотобиологический процесс можно разделить на несколько стадий:

1) поглощение кванта света молекулой;

2) внутримолекулярные процессы обмена энергией (фотофизические 3) межмолекулярные процессы переноса энергии возбужденного состояния;

4) первичный фотохимический акт, сопровождающийся образованием короткоживущих, нестабильных фотопродуктов;

5) темновые реакции, заканчивающиеся образованием стабильных продуктов;

6) биохимические реакции с участием фотопродуктов;

7) общефизиологический ответ на действие света.

Следовательно, фотобиологическая реакция имеет в начале чисто физический, а в конце – чисто биологический характер.

Первые три стадии фотобиологического процесса одинаковы для фотобиологии и люминесценции, поэтому законы фотобиологии имеют аналогии с законами люминесценции.

При поглощении фотона электрон переходит с заполненного уровня (S0) на один из незаполненных уровней, и молекула оказывается в синглетном (S1, S2) электронно-возбужденном состоянии (рис. 2.1). На рисунке прямые стрелки между уровнями, направленные вверх соответствуют поглощательным переходам.

Рис. 2.1. Схема Яблонского энергетических уровней молекул с сопряженными связями: S0 – основное (невозбужденное состояние); S1, S2 и T1, T2 – возбужденные соответственно синглетные и триплетные состояния; около каждого уровня показано направление спина возбужденного электрона по отношению к спину оставшегося электрона; жирные горизонтальные линии – электронные уровни энергии, тонкие (0, 1, 2 … или 0’, 1’, 2’ …) - колебательные уровни;

прямые стрелки – поглощательные и излучательные переходы, волнистые – безизлучательные переходы; ВК – внутренняя конверсия (переходы электрона без обращения спина); ИК – интеркомбинационная конверсия (переходы электрона с обращением спина) (Артюхов В.Г., 2009).

Поглощение энергии фотона биомолекулой осуществляется с помощью хромофорной группы при выполнении ряда условий:

1) энергетическое – длина поглощаемого излучения соответствует разности энергий между основным и возбужденным состояниями (Е2 – Е1 = hc/, где Е1 – энергия основного состояния молекулы; Е2 – энергия возбужденного ее состояния; h – постоянная Планка, равная 6.6256 · 10-27 эрг/с; с – скорость распространения света в вакууме; – длина волны света);

2) содержание в падающем пучке света таких фотонов, которые имели бы возможность взаимодействовать с осциллятором или ротатором молекулы (ротатор – компонент молекулы, связанный с вращением, а осциллятор – связанный с колебанием групп молекулы). Наиболее важным типом взаимодействия является взаимодействие электрического поля световых колебаний Е и дипольного момента молекулы.

Чтобы осциллятор (хромофорная группа: >C=CC=O, >C=S, -OH, -SO3H, -NH2, -COOH, -NH) поглощал энергию, электрическое поле падающего света должно иметь составляющую, параллельную его дипольному моменту. Аналогичное условие ротатора состоит в том, чтобы падающий свет имел составляющую, перпендикулярную оси вращения молекулы;

3) необходимость учета правил отбора – вероятность поглощения кванта света зависит от разрешенности перехода. Наиболее вероятны (интенсивны) только те переходы, которые происходят между состояниями одинаковой мультиплетности, т.е. синглет-синглетные или триплеттриплетные.

Энергия возбуждения, приобретенная молекулой при поглощении кванта света, реализуется различными путями. На рис. 2.1 схематически изображены все возможные процессы фотофизической дезактивации электронновозбужденной молекулы. Прямые стрелки между уровнями, направленные вниз – излучательные переходы, волнистые - безызлучательные.

Время жизни молекул в состоянии S1 составляет 10-8 – 10-9 с. За время порядка 10-11 – 10-12 с возбужденная молекула безизлучательным путем отдает избыток электронной и колебательной энергии окружающей среде. Этот процесс называется внутренней конверсией (ВК). В результате ВК все молекулы вещества независимо от того, в какое электронно-колебательное состояние они были переведены поглощенным фотоном, переходят на низший колебательный подуровень первого синглетного возбужденного состояния (S1). От этого состояния берут начало все последующие фотофизические процессы, в конечном итоге приводящие к дезактивации возбужденной молекулы.

С определенной вероятностью могут реализоваться следующие пути превращения энергии возбужденного состояния S1:

1) в тепло (тепловая диссипация вследствие безизлучательного перехода 2) испускание кванта флуоресценции: S1 S0 + hvфл;

3) фотохимическая реакция: S1 фотопродукт;

4) передача (миграция) энергии возбуждения другой молекуле;

5) переход молекулы в триплетное электронно-возбужденное состояние Т1 с обращением спина электрона: S1 Т1. Переход из триплетного состояния в основное запрещен, т.к. спины электронов одинаковы (параллельны). Поэтому в состоянии Т1 молекула находится значительно дольше (10-4 – 10 с), чем в состоянии S1.

Известны несколько путей дезактивации триплетного возбужденного состояния молекулы:

1) безизлучательный переход в основное синглетное состояние с обращением спина электрона: Т1 S0;

2) испускание кванта фосфоресценции в соответствии с переходом Т 3) фотохимическая реакция с образованием соответствующего фотопродукта;

4) передача энергии возбуждения другой молекуле.

2.2. Внутримолекулярные и межмолекулярные процессы переноса энергии Все многообразие фотобиологических реакций электронновозбужденных молекул сводится к фотоизомеризации или переносу электрона между возбужденной молекулой и субстратом.

Фотоизомеризация – это изменение пространственной структуры молекул, осуществляющееся в электронно-возбужденном состоянии, в которое переходит молекула после поглощения кванта света. Известно, что у органических молекул, находящихся в основном состоянии, невозможно вращение их частей вокруг двойных связей. Такие молекулы имеют плоскую цис- или транс-конфигурацию (рис. 2.2, а). Это связано с особенностями перекрывания -орбиталей при образовании второй связи 3 (рис. 2.2, б).

Для того, чтобы повернуть две части молекулы вокруг двойной связи, нужно уменьшить области перекрывания -орбиталей, для этого нужно затратить значительную энергию (кривая S0 на рис. 2.2, в). Такой процесс самопроизвольно произойти не может. Наименьшую энергию молекула имеет при перекрывании -орбиталей, поэтому -орбитали называют связывающими. При поглощении фотона и переходе в возбужденное состояние молекула сразу после перехода сохраняет плоскую конфигурацию основного состояния. Но возбужденные *-орбитали (S1 и Т1 состояния на рис. 2.2, в) являются разрыхляющими: наименьшую энергию имеет конфигурация, в которой связь разрывается и две части молекулы поворачиваются вокруг -связи на При возникновении между атомами углерода второй двойной связи происходит перекрывание орбиталей еще двух электронов (р-орбиталей) соседних углеродных атомов. Их электронные облака имеют в сечении вид восьмерки, ось которой перпендикулярна направлению -связи. Боковое перекрывание этих орбиталей в двух областях приводит к образованию молекулярной -орбитали, соответственно электроны, формирующие орбиталь, называют -электронами. Плотность образовавшегося облака -электронов сосредоточена по обеим сторонам от линии -связи. Такие -электроны делокализованы по всей цепочке и могут свободно по ней перемещаться подобно электронам проводимости в металле, но не могут ее покинуть.

Образование молекулярной -орбитали в молекуле бодной орбитали (S1 или Т бутадиена (б). Изменение энергии при переходе мона рис. 2.2). В результате лекулы в возбужденное состояние (в) (Ремизов А.Н.

и др., 2003).

вступает в реакции фотоокисления.

Перенос энергии электронного возбуждения между двумя молекулами можно представить в следующем виде:

В результате переноса энергии возбужденная молекула донора энергии D* переходит в основное (невозбужденное) состояние D, а молекула акцептора энергии переходит из невозбужденного состояния А в возбужденное А*.

Донором и акцептором энергии не обязательно являются молекулы разных веществ, ими могут быть также и разные молекулы одного и того же вещества:

Перенос энергии между одинаковыми молекулами (который может быть многократным) называют миграцией энергии. Один из возможных способов переноса энергии между молекулами донора и акцептора заключается в том, что молекула D* излучает квант флуоресценции, а молекула А его поглощает.

Такой перенос называют излучательным. При достаточно малых расстояниях между молекулами донора и акцептора перенос становится безизлучательным.

Безизлучательный перенос энергии может происходить в момент тесного контакта молекул при их кинетических соударениях. Но даже при отсутствии контакта перенос энергии, тем не менее, идет достаточно эффективно.

Для осуществления переноса энергии необходимо выполнение условия резонанса: разность энергий основного и возбужденного электронных уровней обеих молекул должна быть одинаковой и условия индукции – взаимодействие между молекулами должно быть достаточно сильным. Кроме того донор и акцептор должны быть удачно ориентированы друг относительно друга. Если дипольные моменты излучения донора и поглощения акцептора перпендикулярны друг другу, то перенос энергии осуществляться не будет.

Если направление моментов совпадает с направлением радиус-вектора, соединяющего D* и А, то вероятность переноса максимальна.

Надмолекулярные соединения, которые образуются при переносе электрона от молекулы, служащей донором электронов (D) к молекуле – акцептору (А) электронов, называют комплексами с переносом заряда (КПЗ). Эти две молекулы удерживаются вместе за счет электростатического притяжения и более слабых взаимодействий, таких как ван-дер-ваальсовые силы 4, водородные связи 5 и т.д. Как правило, перенос заряда в невозбужденном состоянии комплекса незначителен. Однако при поглощении фотонов таким донорноакцепторным комплексом происходит электронный переход из S0 состояния донора в S1 состояние акцептора (рис. 2.3), что соответствует частичному или полному переносу электрона от D к А:

Ван-дер-ваальсовы силы — силы межмолекулярного взаимодействия с энергией 0.8 — 8.16 кДж/моль. К ван-дер-ваальсовым силам относятся взаимодействия между диполями (постоянными и индуцированными). Название связано с тем фактом, что эти силы являются причиной поправки на внутреннее давление в уравнении состояния реального газа Ван-дер-Ваальса. Эти взаимодействия в основном определяют силы, ответственные за формирование пространственной структуры биологических макромолекул.

Водородная связь — форма ассоциации между электроотрицательным атомом и атомом водорода H, связанным ковалентно с другим электроотрицательным атомом. Водородные связи могут быть межмолекулярными или внутримолекулярными. Часто водородную связь рассматривают как электростатическое взаимодействие, усиленное небольшим размером водорода, которое разрешает близость взаимодействующих диполей. Особенностями водородной связи, по которым её выделяют в отдельный вид, является её не очень высокая прочность, распространенность и важность, особенно в органических соединениях.

Электронному переходу с переносом заряда принадлежит новая широкая и бесструктурная полоса поглощения, отсутствующая у отдельных компонентов. Образовавшийся при возбуждении комплекс растрачивает свою энергию в нескольких процессах. Возможны: обратный излучательный переход с переносом заряда из S1 акцептора в S0 донора (флуоресценция КПЗ), внутренняя конверсия в КПЗ, а также фотохимическое необратимое изменение молекул, входивших в КПЗ (см. рис. 2.3).

Если триплетный уровень донора имеет меньшую энергию, чем возбужденный синглетный уровень акцептора, то может произойти интеркомбинационная конверсия (ИК на рис. 2.3) с последующим излучением фосфоресценции донора. Электронный переход с переносом заряда заканчивается окислением органических молекул. Предполагается, что фотохимические реакции некоторых фотосенсибилизаторов протекают с участием КПЗ.

Донорно-акцепторные комплексы с переносом заряда между возбужденной и невозбужденной молекулами акт – это процесс, в который вступает молекула из нижнего синглетного S1 или триплетного Т1 возбужденных состояний. В ходе этой стадии образуется первичный фотопродукт, непосредственно участвующий в дальнейших химических Рис. 2.3. Схема электронных переходов с переносом заряда (Владимиров Ю.А., По- или физико-химических превращениях.

тапенко А.Я., 2006).

электронно-возбужденных состояниях и свободные радикалы) крайне неустойчивы и быстро переходят либо в исходные вещества, либо в более устойчивые фотопродукты (новые молекулы).

В результате темновой стадии после спонтанных химических превращений первичного фотопродукта образуется стабильный продукт. Стабильное соединение отличается устойчивостью в течение достаточно длительных промежутков времени.

Последующие превращения включают в себя цепь биохимических реакций или перестроек клеточных структур (чаще всего мембран).

Результат биохимических или структурных изменений проявляется на уровне организма: происходит синтез богатых энергией веществ, движение биообъекта, модификация генотипа и т.п.

2.3. Спектр фотобиологического действия Солнце – главный источник излучения для нашей планеты, благодаря которому протекают фотобиологические реакции. Солнечный спектр распределен в диапазоне длин волн от нескольких долей нм (гамма-излучение) до метровых радиоволн. Наибольшую интенсивность непрерывный спектр Солнца имеет в области длин волн 430–500 нм (рис. 2.4). В видимой и инфракрасной областях спектр электромагнитного излучения Солнца близок к спектру излучения абсолютно черного тела с температурой около 6000 К.

Около 9% энергии в солнечном спектре приходится на ультрафиолетовое (УФ) излучение с длинами волн от 100 до 400 нм. Остальная энергия разделена приблизительно поровну между видимой (400–750 нм) и инфракрасной Рис. 2.4. Спектр солнечного излучения и спектры поглощения кислорода и озона:

1 – излучение Солнца у поверхности Радиоизлучение на метровых волнах Земли; 2 – кислород; 3 – озон (Потапенко Биологически важным участком солнечного спектра является относительно небольшой диапазон от 200 до 1000 нм. УФ излучение с длинами волн менее 200 нм используется редко. Оно поглощается кислородом воздуха, поэтому его действие можно изучать только в специальных условиях, например, в вакууме, из-за этого УФ с < 200 нм называют вакуумным.

Коротковолновая граница солнечного спектра у поверхности Земли на уровне моря (на экваторе в безоблачный полдень) определяется длиной волны около 285 нм (рис. 2.4).

Особенно важная роль в фильтрации солнечного излучения принадлежит слою атмосферного озона, расположенному на высоте примерно 20 км от поверхности Земли и определяющему коротковолновую границу спектра. В северных и южных широтах коротковолновая граница сдвинута в область больших длин волн, т.к. угол падения солнечных лучей на поверхность Земли там больше, чем на экваторе, и свету приходится проходить больший путь в атмосфере.

Особенностью биологического действия УФ и видимого излучения является ярко выраженная зависимость биологического эффекта от длины волны излучения. Бактерицидные эффекты вызываются волнами в диапазоне 200 – 315 нм, покраснение (эритема) кожи наиболее эффективно вызывается излучением с длиной волн 280 – 315 нм, зрительный эффект – 400 – 750 нм (видимый диапазон), лечение желтухи новорожденных – фиолетовым светом (около 400 нм). При фотосинтезе растения и фотосинтезирующие бактерии используют весь диапазон солнечного УФ излучения, достигающего поверхности Земли, видимого света, и даже ближнего инфракрасного (ИК) излучения (иногда до 1000 нм).

Разные фотобиологические процессы начинаются с поглощения квантов света разными молекулами, в свою очередь положение полосы поглощения молекулы зависит от ее химической структуры. Меняя длину волны, можно избирательно инициировать те или иные фотобиологические процессы 6.

Поглощение монохроматического света веществом описывается законом Бугера-Ламберта-Бера где I и I0 – интенсивности ослабленного образцом и падающего на образец монохроматического света; l – толщина образца (см); n и с – концентрация вещества в образце, выражаемая соответственно в числе молекул на 1 см (1/см3) или в молях на литр (моль/л); коэффициенты s (cм2) и [л/(моль · см)] характеризуют способность молекул исследуемого вещества поглощать свет данной длины волны и называют поперечным сечением поглощения и молярным коэффициентом поглощения соответственно. Часто способность образцов поглощать свет количественно оценивают величиной оптической плотности OD = cl = lg(I0/I). Зависимость s, или OD от длины волны называют спектром поглощения.

Спектр поглощения ДНК представляет собой широкую неструктурированную полосу и находится в области 200 – 315 нм с максимумом около нм. Спектры поглощения других биологически важных молекул (белков, коферментов, пигментов и т.д.) также представляют собой широкие полосы, но по положению отличаются от спектров ДНК. Способность поглощать свет и положение полосы поглощения определяются, прежде всего, тем, как связаИзбирательность действия отличает биологические эффекты света от эффектов ионизирующего излучения. Поглощение квантов рентгеновского или -излучения осуществляется не молекулами, а атомами и не зависит от того, в состав каких молекул эти атомы входят. Поэтому поглощение ионизирующего излучения происходит в основном теми элементами, которых в организме больше. Так как наш организм на 80% состоит из воды, то радиохимические процессы приводят преимущественно к появлению радикалов воды, которые в дальнейшем повреждают белки, нуклеиновые кислоты, липиды и др.

Рис. 2.5. Химическая структура молекул и спектры связи (двойные связи разих поглощения. N – число сопряженных двойных делены двумя или более связей в молекуле (Потапенко А.Я., 1996).

имеют максимум поглощения короче 200 нм. При окислении липидов двойные связи сдвигаются и становятся сопряженными. При сопряжении двух связей (диеновые конъюгаты) возникает максимум поглощения около 233 нм, при образовании триеновых конъюгатов появляется максимум около 270-280 нм (соответственно 2 и 3).

Белок ретиналь, содержит шесть сопряженных связей и имеет максимум поглощения около 360 нм (4). У каротиноидов еще более длинная система сопряженных связей и еще более длинноволновое поглощение (5). Таким образом, достаточно посмотреть на структурную форму молекулы, чтобы определить, способна ли она поглощать свет, и даже примерно предсказать положение полосы поглощения.

Когда говорится об избирательном действии света, то подразумевается, что фотобиологический эффект вызывается светом только определенного диапазона длин волн. Причем на краях этого диапазона эффективность действия света снижается, а если выйти за пределы «эффективного» диапазона, то данное явление, например, эритему вызвать не удается, сколь долго бы не облучался исследуемый объект, в данном случае кожа.

Для оценки биологической эффективности действия света нужны количественные характеристики. К ним относятся квантовый выход фотохимической реакции и спектр действия.

Как уже обсуждалось выше, молекула, поглотившая квант света и перешедшая в результате в электронно-возбужденное состояние, растрачивает энергию возбуждения на тепловые колебания, высвечивание квантов люминесценции, перенос энергии на другие молекулы, химические реакции и др.

Каждый из указанных процессов осуществляется с определенной вероятностью, эту вероятность называют квантовым выходом данного процесса. Соответственно квантовый выход фотохимической реакции Ф равняется отношению Ф = (число поврежденных молекул) / (число поглощенных квантов).

Вероятность осуществления каждого процесса растраты энергии возбуждения для молекул с сопряженными связями не зависит от энергии поглощенного кванта или, другими словами, от длины волны возбуждающего света. По закону Бугера-Ламберта-Бера молекулы представляют собой мишени с некоторым эффективным сечением s, при попадании в которое происходит поглощение кванта света. В фотохимии ввели понятие поперечного сечения фотохимической реакции = sФ (см2). Видно, что меньше s по абсолютному значению, так как Ф меньше единицы, но форма кривых зависимостей величин s и от длины волны света одинакова.

Важной характеристикой воздействия света на биологические объекты является спектр фотобиологического действия – зависимость биологического эффекта от длины волны действующего света.

Одна из задач при изучении фотобиологических процессов – определение вещества, которое поглощает действующее излучение и, тем самым, участвует в первых стадиях процесса. Для этого изучают спектр фотохимического действия и сравнивают его со спектрами поглощения предполагаемых участников реакции.

Рассмотрим этот подход на примере фотохимической инактивации ферментов при УФ облучении. Особенность этой реакции состоит в том, что она протекает по одноударному механизму: под действием поглощенного кванта молекула либо совсем не изменяется, либо полностью инактивируется, вероятность инактивации есть квантовый выход инактивации.

Рассмотрим кинетику этого процесса. Пусть в кювете толщиной l находится разбавленный раствор фермента в концентрации n молекул в 1 см (см-3); s (см2) – поперечное сечение поглощающего фермента; I0 и I (см-2с-1) – величины, пропорциональные интенсивности падающего и прошедшего через раствор света и выраженные числом квантов на 1 см2 в секунду. Каждую секунду раствор будет поглощать (I0 – I) квантов, при этом в растворе площадью 1 см2 ежесекундно инактивируется число молекул, равное где Ф – квантовый выход фотохимической реакции. Величины I0, I, s и l связаны между собой в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера (см. 2.4):

Из уравнений (2.5) и (2.6) находим В разбавленных растворах, где snl < 0.1, выражение в скобках в правой части уравнения (2.7) приблизительно равно snl. Тогда для кюветы с раствором толщиной l = 1 см можно написать, что Интегрирование выражения (2.8) дает где Dоб = I0t – доза облучения; = sФ – поперечное сечение инактивации фермента, имеет размерность площади.

Для определения строят график зависимости ln(n0/nt) = f(Dоб) (рис. 2.6).

Рис. 2.6. Определение поперечного сечения инактивации фермента (Ремизов А.Н. и др., 2003).

Величина определяет наклон прямой. Поскольку при n0/nt = e, ln(n0/nt) = 1, величину можно найти непосредственно из дозовой кривой инактивации где D37% - доза облучения, при которой остались неразрушенными 37% молекул.

В случае сложной оптически плотной смеси веществ, в которой оптическая плотность образца OD не изменяется в ходе облучения, уравнение (2.5) усложняется и принимает вид где ODA – оптическая плотность вещества, участвующего в фотохимической реакции, Т – коэффициент пропускания смеси. Подставим в уравнение (2.11) sAnAl/ln10 вместо ODА, разделим переменные и проинтегрируем, получаем где К – константа, учитывающая экранировку фотолизируемого вещества.

При нужной длине волны следует измерить оптическую плотность OD, рассчитать коэффициент экранировки К и затем найти из уравнения (2.12).

В фотохимии спектром действия называют зависимость от длины волны действующего света (рис. 2.7).

Как и квантовый выход люминесценции, квантовый выход фотохимических реакций органических молекул в растворах индивидуального вещества по форме соответствует спектру его поглощения s(), т.к. различаются только постоянным множителем Ф. Измерив по дозовым кривым спектр действия, можно процессе вещества, не проводя никаких спектрофотометрических измерений (рис. 2.7).

Рис. 2.7. Спектр действия фотоинактивации () (1) и применена к исследованию бактерицидного дейпоглощения s() (2) трипсиствия света. Сходство процессов при фотолизе на (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 2006).

Фотолиз – химическая модификация вещества под действием света.

молекул в растворе и при фотоинактивации бактерий в суспензии заключается в следующем. Под действием поглощенного кванта молекула либо совсем не изменится, либо превратится в фотопродукт, т.е. возможны только два исхода, причем вероятность фотолиза определяется квантовым выходом Ф.

Предположим, что при поглощении кванта излучения бактерией она так же останется либо живой, либо погибнет (случай, когда бактерия подвергается мутации в данном приближении не рассматривается). Концентрацию жизнеспособных бактерий можно определить подобно концентрации неразрушенных молекул в растворе. Вероятность гибели бактерии при поглощении кванта определяется квантовым выходом бактерицидного эффекта и (так же как при фотолизе молекул) не зависит от длины волны действующего света. Поэтому если в формулы (2.10 - 2.12) вместо концентрации молекул подставить концентрацию бактерий, то можно найти для бактерицидного эффекта и построить спектр действия. Так, например, было установлено, что кривая гибели бактерий под действием УФ-излучения (спектр фотобиологического действия) подобна спектру поглощения нуклеиновых кислот, представляющему широкую неструктурированную полосу в диапазоне длин волн 200 – 315 нм с максимумом при 260 нм. Это дало основание сделать вывод, что гибель бактерий обусловлена повреждением именно нуклеиновых кислот. На этом основано использование в медицине для обеззараживания помещений ртутных бактерицидных ламп, излучающих монохроматический свет с длиной волны 254 нм, что соответствует максимуму спектра действия бактерицидного эффекта.

В случае сложных фотобиологических процессов, когда конечному эффекту предшествуют частично обратимые фотохимические процессы и темновые стадии, уравнение (2.12) может не соблюдаться, и определить для построения спектра действия становится затруднительно.

Подобным процессом является возникновение эритемы кожи. Эритема заключается в расширении кровеносных сосудов кожи, что видно по ее покраснению. Зависимость степени покраснения от дозы характеризуется наличием пороговой дозы (минимальной эритемной дозы, МЭД), вызывающей едва различимое глазом покраснение. Подпороговые дозы эритему не вызывают совсем. При увеличении дозы облучения степень покраснения растет пропорционально логарифму дозы. Здесь отсутствуют количественные показатели, подобные числу разрушенных молекул или погибших клеток, которые можно было бы использовать для расчета.

Выход из положения был найден при введении следующего предположения. Если облучать кожу разными длинами волн и при этом подбирать каждый раз дозу так, чтобы возникающий эффект (степень покраснения) был одинаков, то можно полагать, что одинаковая степень покраснения (стандартный эффект) является результатом одинаковых фотохимических повреждений. В качестве стандартного эффекта обычно выбирают минимальное покраснение, вызываемое МЭД. Величина МЭД является функцией длины волны действующего света. По аналогии с (2.10) было предложено определять величину эритемной эффективности как 1/МЭД. Предполагается, что 1/МЭД пропорциональна, подобно 1/ Д37% из выражения (2.10).

На рис. 2.8 по оси ординат отложена именно такая величина – 1/МЭД.

Выяснилось, что динамика развития, длительность существования и степень покраснения кожи сильно зависят от длины волны действующего света. На этом основании в медицине весь диапазон УФ-излучения принято подразделять на три области: УФА (320-400 нм), УФВ (280-320 нм) и УФС ( < нм). УФА-излучение наименее эффективно. УФВ-излучение способно вызывать наиболее интенсивную и длительную эритему, переходящую при дозах более 10 МЭД в эдему (ожог кожи). УФС-излучение может вызвать только реакция кожи является следствием суммирования двух или трех фотохимических процессов, каждый из которых по-разному зависит от длины волны действующего света. Величину, подобную МЭД, используют и при построении спектров действия загара человека, Рис. 2.8. Спектр действия УФПо сравнению с относительно простой эритемы кожи человека (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., ситуацией, изложенной выше, изучение спектров действия в сложных биологических системах может представлять определенные трудности за счет эффектов экранировки. Суть экранирующего эффекта состоит в том, что часть падающего на объект света поглощается в верхних слоях этого объекта и в его глубине интенсивность действующего света оказывается ниже по сравнению с интенсивностью падающего света, измеряемой экспериментатором. Примером могут служить фотобиологические процессы, протекающие в коже человека и животных. До хромофоров в клетках доходит свет, ослабленный поверхностными слоями кожи (например, роговым слоем), т.е. имеет место оптическое экранирование, которое будет искажать истинный спектр действия эритемы при его регистрации (см. рис. 2.8).

В случае сложных фотобиологических процессов можно для регистрации спектров действия использовать величину биологической эффективности света (БЭС), обратную дозе облучения, вызывающей стандартный биологический эффект Изучение спектров действия показало, что УФВ-излучение наиболее эффективно вызывает не только эритему, но также пигментацию и рак кожи, кроме того, оно подавляет Т-клеточное звено иммунитета и вызывает многие другие эффекты у человека и животных.

3. МЕХАНИЗМ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ

РЕАКЦИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

3.1. Понятие фотосенсибилизатора Биологические объекты обладают чувствительностью к свету за счет наличия эндогенных хромофоров. Фотобиологические процессы, такие как фотомутагенез, фотоканцерогенез, эритема, индуцируются, если под действием света соответствующих длин волн возбуждаются молекулы зрительных пигментов, белков, нуклеиновых кислот или других хромофоров, в норме содержащихся в объекте. В некоторых случаях наблюдается резкое повышение светочувствительности биологических систем. Чаще всего это происходит при попадании в объект экзогенных хромофоров, например каких-либо красителей, поглощающих УФ, видимый или ближний ИК свет. Фоточувствительность может возрастать и при некоторых заболеваниях. Например, в тканях человека при нарушениях эритропоэза 8 или при отравлениях свинцом резко повышается содержание протопорфиринов, и фотохимические реакции с их участием начинают играть более заметную роль по сравнению с нормой.

В фотобиологии соединения, повышающие чувствительность биообъектов к свету, называют фотосенсибилизаторами (ФС). Механизмы фотохимических реакций с участием ФС крайне многообразны, так же как и механизмы действия эндогенных хромофоров.

В общем случае, роль ФС может играть сам субстрат окисления. Примерами таких эффектов может служить фотоповреждение белков и аминокислот под действием ультрафиолетового излучения и самосенсибилизированное окисление кислородом порфиринов. ФС может служить также молекулярный кислород, который, поглощая свет, образует реакционноспособное синглетное состояние.

В итоге процессы фотоокисления органических субстратов кислородом соответствуют схеме 3.1, где показано, что такие реакции могут осуществляться за счет фотовозбуждения красителя (что является наиболее распространенным механизмом и собственно фотодинамическим действием), субстрата или кислорода.

Эритропоэз (erythropoiesis, erythrogenesis) - процесс образования эритроцитов, который обычно протекает в кроветворной ткани костного мозга.

Схема 3.1. Фотодинамическое действие: определение сущности эффекта Фотосенсибилизированные процессы можно разделить на два класса:

нуждающиеся в присутствии кислорода и не нуждающиеся в нем.

3.2. Кислороднезависимые фотосенсибилизированные реакции Примером кислороднезависимых фотосенсибилизированных реакций является фотоприсоединение псораленов (фурокумаринов) к пиримидиновым основаниям ДНК, обнаруженное Л. Мюсайо (L. Musajo), Дж. Родигьеро (G. Rodighiero) и Ф. Далл’Акуа (F. Dall'Acqua) (1965). Эти реакции играют ключевую роль в некоторых процессах, фотосенсибилизированных псораленами. Установлено, что они ответственны за летальное и мутагенное действие УФ-облучения на микроорганизмы, а также лежат в основе его терапевтического воздействия при фотохимиотерапии псориаза и других заболеваний кожи (ПУФА-терапия).

Рассмотрим сначала реакции псораленов с тимином в растворе. Псоралены имеют широкую полосу поглощения с максимумом при ~ 300 нм, простирающуюся до 400 нм. Под действием УФА-излучения (320-400 нм), не поглощаемого тимином, псорален (I) возбуждается и вступает в реакцию присоединения, образуя с тимином (II) несколько циклобутановых аддуктов – III, IV, V, VI (рис. 3.1).

Рассмотрим фотоприсоединение псораленов к тимину, входящему в состав двуспиральной ДНК. В этом случае фотохимической реакции всегда предшествует темновая стадия связывания псораленов с ДНК. Плоские молекулы псораленов встраиваются в двойную спираль между двумя парами комплементарных оснований. Если рядом с псораленом оказался тимин, то реакционноспособные участки молекулы псоралена располагаются близко к реакционноспособной связи тимина. Поглотив фотон, молекула псоралена не должна уже в процессе диффузии «искать» тимин. Таким путем в водных растворах ДНК образуются все четыре типа аддуктов псорален-тимин. Спектральные свойства соединений III, IV отличаются от свойств соединений V, VI: III и IV имеют максимумы поглощения при ~330 нм, тогда как V и VI вообще не поглощают в УФА-области спектра. Поэтому их дальнейшая фотохимическая судьба различна. Соединения III или IV способны, поглотив УФА-фотон, вступить в реакцию фотоприсоединения еще с одним тимином Аддукт – продукт присоединения молекул друг к другу, при котором не происходит какого-либо отщепления фрагментов.

из другой нити ДНК, если такой тимин имеется рядом. Таким образом, после последовательного поглощения двух квантов света молекула псоралена может ковалентно связать между собой две нити ДНК.

Рис. 3.1. Схема взаимодействия псоралена и тимина под действием УФА-излучения: римскими цифрами обозначены молекулы псоралена (I), тимина (II), циклобутановых аддуктов (III, IV, V, VI); арабскими цифрами обозначены номера атомов углерода. У молекул псоралена и тимина реакционноспособные двойные связи обозначены утолщенными линиями (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 2006).

Ф. Далл’Акуа предложена следующая схема реакций фотоприсоединения (схема 3.2):

Схема 3.2. Реакции фотоприсоединения псоралена к ДНК (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 2006) Фотопродукты взаимодействия псоралена и тимина, содержащие одну молекулу тимина, называются моноаддуктами, а содержащие две молекулы тимина – диаддуктами (сшивками в ДНК). Диаддукты являются основной причиной возникновения обнаруженного ранее летального действия на микроорганизмы УФ-облучения в присутствии псоралена, тогда как моноаддукты в большей степени ответственны за мутагенный эффект облучения. Репарация ДНК в случае моноаддуктов протекает легче, чем в случае сшивки.

Однако, если доза ПУФА-воздействия велика или репарирующие системы клетки неполноценны, то клетки гибнут в результате возникновения даже Рис. 3.2. Схема фотореакции хлорпромазина (Владимиров Ю.А., на. Хлорпромазин используют для лечения психических заболеваний. Побочным эффектом терапии оказалось повышение чувствительности кожи пациентов к свету. Максимум спектра поглощения хлорпромазина в водных растворах расположен при 305 нм, хвост поглощения простирается в УФА-область спектра. Электронно-возбужденный хлорпромазин характеризуется высоким выходом триплетных состояний. Первичные фотопродукты в реакциях хлорпромазина – нейтральные свободные радикалы (рис. 3.2, а) или катионрадикалы и сольватированный электрон (рис. 3.2, б):

Эти нестабильные реакционноспособные фотопродукты могут реагировать с биомолекулами. Хлорпромазин с высокой эффективностью фотоприсоединяется к белкам через стадию образования нейтральных радикалов. Эта реакция лежит в основе фотоинактивации бактериофагов; меньшая роль в этом процессе принадлежит реакциям фотоприсоединения хлорпромазина к ДНК и РНК. Напротив, фотомутагенные эффекты хлорпромазина основаны главным образом на его реакциях с ДНК. УФА-облучение хлорпромазина, образовавшего комплексы с ДНК, способствует фотогенерации сольватированных электронов, а последние вызывают разрыв нитей ДНК.

Кислороднезависимых фотосенсибилизированных реакций известно сравнительно мало, хотя они участвуют в важных процессах. Основная часть фотосенсибилизированных процессов нуждается в присутствие кислорода.

3.3. Кислородзависимые фотосенсибилизированные реакции Как правило, в кислородзависимых фотосенсибилизированных реакциях участвуют триплетные возбужденные состояния ФС. В таких реакциях может происходить перенос электрона между органическим соединением и ФС, находящимся в триплетном состоянии. При этом в зависимости от пары сенсибилизатор – субстрат, происходит либо восстановление, либо окисление сенсибилизатора.

Фотовосстановление сенсибилизатора более вероятно, если субстрат является хорошим донором электронов. Схематично первичные события при этом выглядят следующим образом:

S AH S A H

где S, 1S* и 3S* - сенсибилизатор в основном, синглетном и триплетном возбужденных состояниях соответственно; АН – окисляемая молекула; S и A - радикалы сенсибилизатора и субстрата.

В отсутствие кислорода образующиеся радикалы рекомбинируют с генерацией исходных соединений, так что химические изменения в системе минимальны.

В присутствии кислорода свободные радикалы исчезают в одной из реакций:

или Образовавшийся диоксид-радикал может вступать в дальнейшие (в том числе цепные) темновые реакции, приводящие к дополнительному повреждению субстрата:

Дисмутация супероксид-радикалов приводит к формированию перекиси водорода:

из которой в дальнейшем могут образовываться гидроксильные радикалы и другие активные формы кислорода, также участвующие в повреждении биологических субстратов.

Реакции, в которых первичным является процесс окисления возбужденных молекул ФС акцептором электрона, например хиноном (Q), протекают по схеме:

Как можно видеть, на первом этапе происходит перенос электрона, а затем и протона от ФС к хинону. Эта реакция становится необратимой в присутствии второго субстрата окисления (АН), например ненасыщенных липидов и т.д.

Кислород резко усиливает деструктивные эффекты за счет последующих реакций:

Образовавшиеся радикалы могут включаться в разнообразные окислительные процессы. Таким образом, роль кислорода заключается в том, что он связывается с радикалами, первично образующимися в фотохимической реакции, делая ее необратимой. При этом образуются более стабильные продукты фотоокисления.

3.4. Синглетный кислород и другие активные формы кислорода Продукция активных форм кислорода (АФК) является неотъемлемым условием функционирования живых клеток в организмах человека и животных. Выявлен широкий спектр биологического действия АФК: их участие в деструкции молекул, клеток, тканей и органов; поражении организма, вызванном ишемией и реперфузией; канцерогенезе; старении; реализации функций фагоцитов и лимфоцитов; регуляции тонуса сосудов; клеточной пролиферации; воспалительных процессах и др.

Молекулярный кислород О2 в основном состоянии обозначается ( 3 g ).

Причина, по которой молекулярный кислород (диоксиген) обладает высокой реакционной способностью вообще и в реакциях с радикалами в особенности, заключена в необычной структуре его молекулярных орбиталей.

Еще в 1840-х годах М. Фарадей (M. Faraday) обнаружил, что кислород притягивается к магниту. Почти через 100 лет в 1925 г. Р.C. Малликен (R.S.

Mulliken) объяснил магнитные свойства молекулярного кислорода на основе только что разработанных квантово-механических представлений. Его анализ показал, что кислород имеет два неспаренных электрона в нижнем электронном энергетическом состоянии, находящихся на разных молекулярных орбиталях.

Таким образом, основное состояние кислорода - бирадикальное, оно имеет два неспаренных электрона и является парамагнитным триплетным состоянием. Присутствие неспаренных валентных электронов в стабильной молекуле встречается в природе очень редко и определяет высокую реакционную способность молекулярного кислорода.

В живых организмах в процессе эволюции выработались специализированные ферментативные системы восстановления молекулярного кислорода посредством переноса на него одного, двух или четырех электронов. Все ферменты, восстанавливающие молекулярный кислород, представляют собой металлопротеины с активным центром, включающим один или несколько атомов (ионов) металла переменной валентности (Fe, Cu, Zn, Mo, Mn, Co). К ним относятся дыхательные белки (железосодержащие гемоглобин и миоглобин), оксидазы и оксигеназы 10. Активный центр этих ферментов с входящими в него ионами служит донором электронов для кислорода.

При последовательном присоединении электронов к молекулярному кислороду образуются супероксидный анион-радикал ( О ), пероксид водорода (Н2О2) и гидроксильный радикал (•ОН). Изменение спинового состояния электронов в молекуле кислорода может происходить и без присоединения электронов, например, при поглощении кванта света. При этом образуется синглетный кислород 1О2, также обладающий свойствами окислителя (схема 3.3).

Схема 3.3. Образование активных форм кислорода (Артюхов В.Г., 2009).

Основными источниками генерации супероксидного анион-радикала О являются ферментативные системы: NADPH-оксидаза, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза, микросомальные монооксигеназы. Он образуется также как промежуточный продукт окисления тиолов, флавинов, Оксидаза, оксигеназа – любые ферменты (или энзимы), являющиеся катализаторами в реакциях окисления-восстановления.

хинонов, катехоламинов, птеринов, в метаболизме ксенобиотиков 11. Образование О в результате активации NADPH-оксидазы фагоцитов играет важную роль в реализации их микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия. Генерация О и других АФК ксантиноксидазой необходима для метаболизма железа, регуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации и др.

Время жизни супероксидного анион-радикала в биологических субстратах составляет ~10-6 с, радиус действия – 0.3 мкм. Так как О имеет заряд, он плохо мигрирует через мембраны. О относительно слабый окислитель и во многих биосистемах выступает в роли донора электронов, восстанавливая ряд соединений.

Предполагают, что О либо взаимодействует с ДНК непосредственно, либо приводит к образованию вторичных радикалов, воздействующих на ее макромолекулу. Супероксидный анион-радикал может разрушать мембрану эритроцитов, ингибировать Са2+-АТФ-азу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, индуцировать пероксидное окисление липидов через образование •RO2, НО и др. В белках супероксидный анион-радикал участвует в окислении некоторых аминокислотных остатков. Уровень О2 в клетке регулирует высокоспецифичный фермент супероксиддисмутаза (СОД), катализируя реакцию дисмутации:

Пероксид водорода Н2О2 является наиболее стабильным из интермедиатов восстановления кислорода. Его можно получить прямым двухэлектронным восстановлением О2 (с участием ксантиноксидазы или флавиновых оксидаз) или косвенным путем – одноэлектронным восстановлением кислорода с последующей дисмутацией О (3.1) с участием или без участия СОД.

Н2О2 относят к окислителям средней силы; в отсутствие некоторых ферментов и ионов металлов переменой валентности он относительно стабилен, способен мигрировать в клетки и ткани. Токсичность Н2О2 проявляется в том, что он вызывает окисление тиолов и метионильных остатков белков, индуцирует пероксидное окисление липидов, в присутствии фермента участвует в образовании высокореакционноспособных гипогалоидов (HOCl, HOBr, HOI), является источником возникновения чрезвычайно активного окислителя – гидроксильного радикала в реакции Фентона (H. Fenton):

Ксенобиотики (от греч. ) — условная категория для обозначения чужеродных для живых организмов химических веществ, естественно не входящих в биотический круговорот (пестициды, некоторые моющие средства, радионуклиды, синтетические красители, полиароматические углеводороды и др.). Попадая в окружающую природную среду, они могут вызвать повышение частоты аллергических реакций, гибель организмов, изменить наследственные признаки, снизить иммунитет, нарушить обмен веществ, нарушить ход процессов в естественных экосистемах вплоть до уровня биосферы в целом.

Клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию Н2О2 благодаря наличию глутатионпероксидазы 12 и каталазы 13, первая из которых эффективно работает при малых концентрациях Н2О2, вторая – при высоких.

В настоящее время О и Н2О2 уже не рассматриваются как агенты, вызывающие принципиальные морфологические и функциональные сдвиги в клетках, в связи с их низким окислительным потенциалом и наличием в биосистемах ферментов, участвующих в их дезактивации. По-видимому, токсичность супероксидного радикала и пероксида водорода усиливается в условиях интенсивного образования свободных радикалов и «истощения» ферментативных антиоксидантных систем клетки.

Гидроксильный радикал •ОН является наиболее реакционноспособным из АФК: чрезвычайно реактивен в процессах акцептирования, донирования и переноса электронов, может разрывать любую –С-Н- или –С-С-связь. Скорость его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин, равных скорости диффузии и обусловливает очень малые значения времени его жизни в биологических субстратах (~10-9 с), при этом радиус миграции составляет менее 10 нм, что сравнимо с размером органических молекул. Образование •ОН отмечено в реакциях окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габер-Вейса (F. Haber - J. Weiss) (3.3), при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и коферментом Q, при воздействии на биосистемы ионизирующей радиации.

Основным источником гидроксильного радикала служит реакция Фентона (3.2) с участием металлов переменной валентности, главным образом с Fe2+.

Для •ОН характерны три основных типа реакций: отрыв атома водорода от органической молекулы, присоединение к молекуле по двойной связи и перенос электрона. К первому типу реакций относится взаимодействие с фосфатидилхолином биомембран 14, которое является основной реакцией при инициировании пероксидного окисления липидов, а также с сахарами, входящими в состав нуклеиновых кислот. Образующиеся продукты обладают Глутатионпероксидазы - семейство ферментов, защищающих организм от окислительного повреждения, катализируя восстановление перекисей липидов в соответствующие спирты и восстановление пероксида водорода до воды.

Каталаза (от греч. Katalуo - разрушаю) - фермент из группы гидропероксидаз, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой из двух молекул пероксида водорода образуются вода и кислород.

Фосфатидилхолины группа фосфолипидов, содержащих холин, одни из самых распространенных молекул клеточных мембран.

мутагенными свойствами. Примером второго типа реакций служит взаимодействие с пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями 15, приводящее к накоплению вторичных радикалов, повреждающих компоненты нуклеотидов и вызывающих разрывы цепей нуклеиновых кислот.

Таким образом, •ОН обладает сильным цитотоксическим, канцерогенным и мутагенным действием на биосистемы.

Синглетный кислород 1О2 отличается от других АФК тем, что для его получения требуется лишь поглощение энергии без химической модификации кислородных молекул. Открытие абсорбционных полос, обусловленных заселением синглетных уровней молекулярного кислорода, связано с классическими работами В.Х. Волластона (W.H. Wollaston) (1801) и Й. Фраунгофера (J. Fraunhofer) (1814), обнаруживших серию темных полос (фраунгоферовых линий) в спектре излучения Солнца. Г.Р. Кирхгоф (G.R. Kirchhoff) (1858) установил, что фраунгоферовы линии – следствие поглощения солнечного света газами атмосферы, причем полоса при 760 нм принадлежит атмосферному кислороду. В 1928 г. Р. Малликен пришел к заключению, что полоса при 760 нм возникает при электронном переходе с основного триплетного уровня кислорода, обозначаемого как 3, на возбужденный синглетный уровень 1. В 1933 г. была обнаружена еще одна полоса поглощения кислоg рода, на этот раз в инфракрасной области спектра (при 1270 нм), обусловленная переходом из состояния молекулы кислорода 3 в состояние 1 g.

Помимо указанных триплет-синглетных электронных переходов, в молекуле кислорода наблюдается триплет-триплетный переход 3 3 u, коg торый соответствует поглощению при длинах волн короче 200 нм.

В 1947 г. Дж. Каплан (J. Kaplan) зарегистрировал свечение при электрическом разряде в содержащем кислород газообразном азоте на длине волны 762 нм. Впоследствии эта полоса (а также полоса 1270 нм) была зарегистрирована в спектрах послесвечения атмосферы – слабой люминесценции, возникающей на высотах от 60 до 250 км над поверхностью Земли. Излучение при 1270 и 762 нм обусловлено дезактивацией соответственно 1 g и 1 g синглетных состояний молекулярного кислорода:

Люминесценция при 1270 нм является единственным прямым методом («золотым стандартом») определения синглетного кислорода в растворах.

Кислород может участвовать в фотосенсибилизированных реакциях другим способом – за счет тушения им триплетных возбужденных состояний К пуриновым основаниям относятся аденин, гуанин, к пиримидиновым - урацил, цитозин, тимин, входящие в состав нуклеиновых кислот.

сенсибилизатора и образования электронно-возбужденного (синглетного) молекулярного кислорода, который вступает затем в дальнейшие химические реакции с субстратами окисления. Эти процессы можно представить в форме химических уравнений:

S h 3S* (образование триплетого состояния сенсибилизатора) S 3 O2 1S 1O2 (образование синглетного кислорода) (3.4) Важная роль возбужденного кислорода в фотосенсибилизированных реакциях была продемонстрирована еще в 1931 г. доцентом Гейдельбергского университета Г. Каутским (H. Kautsky). В опытах Г. Каутского изучалась реакция фотохимического превращения предварительно обесцвеченного красителя (лейкоформы) малахитового зеленого в окрашенную (ярко-зеленую) форму под действием света, поглощаемого другим красителем - трипафлавином. Идея этого эксперимента заключалась в том, что оба красителя были адсорбированы на разных гранулах силикагеля и непосредственно друг с другом не контактировали. В отсутствие кислорода в смеси гранул никакого образования малахитового зеленого не наблюдалось, тогда как в присутствии кислорода воздуха шло образование малахитового зеленого из лейкоформы.

Г. Каутский очень точно объяснил полученные результаты тем, что происходит перенос энергии с оптически возбужденного трипафлавина на молекулярный кислород, а образовавшийся возбужденный кислород окисляет лейкоформу малахитового зеленого.

Гранулы силикагеля, пропитанные красителем, используются для получения синглетного кислорода и в наши дни. В настоящее время доказана широкая распространенность фотосенсибилизированных реакций с участием О2. Синглетный кислород в растворах генерируется многими красителями, например, метиленовым синим, эозином, бенгальским розовым, протопорфирином, антраценом и др.

О2 (радиус действия ~0.3 мкм) легко окисляет ненасыщенные соединения, образуя гидропероксиды, диоксетаны, эндопероксиды и др. В белках и пептидах основными мишенями служат шесть аминокислотных остатков:

триптофан, гистидин, метионин, тирозин, цистеин, фенилаланин. Биологические последствия окисления синглетным кислородом многообразны: повреждение структуры биомембран, приводящее, в частности, к гемолизу эритроцитов; инактивация ферментов; индукция эритемы и эдемы кожи и др.

К АФК относятся также NO-радикал, пероксинитрит ONOO-, гипогалоиды. В роли эндогенных свободных радикалов, образующихся в реакциях клеточного метаболизма, могут выступать не только выше названные производные молекулярного кислорода, но и некоторые радикальные продукты их взаимодействия с клеточными компонентами: пероксидные радикалы •RO2, алкоксильные радикалы •RO.

NO-радикал (NO•) вырабатывается ферментативно NO-синтазой фагоцитов и гладкомышечных клеток сосудов и выполняет роль расслабляющего фактора для стенок сосудов. NO• обладает высокой скоростью проникновения через клеточную мембрану и длительным временем жизни (несколько секунд). В клетке NO• взаимодействует с низкомолекулярными тиолами, образуя моно- и динитрозильные комплексы, токсичные для клетки. Например, мононитрозоглутатион может вызвать программируемую гибель клетки – апоптоз.

Пероксинитрит ONOOН вызывает вазоконстрикцию (сужение сосудов), агрегацию тромбоцитов, адгезию гранулоцитов клетками эндотелия, их миграцию в очаг повреждения. Действие высокотоксичного пероксинитрита направлено против экзогенных микроорганизмов и эндотелиальных клеток сосудов, в результате чего повышается их проницаемость.

Таким образом, высокореакционноспособные молекулы АФК являются важными факторами микробицидного, цитотоксического и мутагенного действия фагоцитов. Модификация азотистых оснований ДНК может приводить к образованию аутоантител к трансформированной ДНК и индукции аутоиммунных процессов. Модификация белков в условиях повышенного синтеза АФК также вызывает появление у них антигенных свойств. Пероксидное окисление липидов (ПОЛ) приводит к синтезу хемоаттрактантов, усиливающих миграцию фагоцитов в очаг воспаления. Так происходит запуск замкнутого круга реакций (схема 3.4):

Схема 3.4. Цикл реакций, возникающих в присутствии активных форм кислорода (Артюхов В.Г., 2009).

Постоянное образование АФК (называемых еще прооксидантами) в живых организмах находится в равновесии с их дезактивацией антиоксидантами, что лежит в основе внутриклеточного механизма регуляции метаболических процессов – редокс-регуляции. Сдвиг баланса антиоксидантов и прооксидантов в тканях в сторону прооксидантов называют окислительным (или осидативным) стрессом. Следствием окислительного стресса является окислительное повреждение тканей, приводящее к возникновению патологических состояний.

3.5. Кинетический анализ реакций фотосенсибилизированного Если имеется вероятность участия синглетного кислорода в фотосенсибилизированной реакции, то значения констант скоростей отдельных стадий этих реакций уточняются путем анализа кинетики процесса. Последовательность реакций можно представить в следующем виде:

где ИК – интеркомбинационная конверсия.

Синглетный кислород может взаимодействовать с субстратом [В] химически, окисляя его (реакция 3), или физически (реакция 4), а также 1О2 может спонтанно дезактивироваться (реакция 5). В стационарном режиме облучения концентрация 1О2 будет постоянна, т.е. скорость изменения концентрации 1О2 равна нулю:

где Ф - квантовый выход генерации 1О2; (I0 - I) – интенсивность поглощенного света (скорость поглощения на единицу длины); k3, k4 и k5 – константы скоростей химического и физического тушения 1О2 субстратом, а также спонтанной дезактивации 1О2. Квантовый выход Ф окисления субстрата с учетом уравнения (3.5) равен Из (3.6) видно, что Ф зависит от концентрации субстрата и что эта зависимость нелинейная.

Преобразуем уравнение (3.6), введя две новые величины:

- доля химических реакций во всех актах тушения 1О2 субстратом, т.е. доля всего синглетного кислорода, фотогенерированного в системе, истраченная на химическое окисление при [В], когда скоростью реакции 5 – дезактивации 1О2 растворителем – можно пренебречь. Квантовый выход фотоокисления при бесконечно высокой концентрации субстрата Ф, равный можно назвать предельным квантовым выходом данной фотосенсибилизированной реакции.

Параметр численно равен концентрации субстрата, при которой скорость спонтанной дезактивации 1О2 растворителем (реакция 5) и скорость тушения 1О2 субстратом (реакции 3 и 4) равны. В итоге получаем:

По величине отсечки на оси абсцисс (рис. 3.3) находят величину. По отсечке на оси ординат определяют Ф. Величина, обратная, является мерой эффективности взаимодействия 1О2 с субстратом в данном растворителе:

Рис. 3.3. Зависимость квантового выхода фотолиза (Ф) от концентрации диоксифенилаланина (ДОФА), фотосенсибилизи- могут быть измерены на основании рованного 8-метоксипсораленом (8-МОП) регистрации люминесценции синги метиленовым синим (МС), представлетного кислорода.

ленная в обратных координатах (ВладиЗная экспериментально найденмиров Ю.А., Потапенко А.Я., 2006).

уравнению (3.7) величину, которая, как и, характеризует субстрат окисления. Но если 1/ характеризует эффективность субстрата как тушителя синглетного кислорода, то показывает, насколько эффективно это взаимодействие с 1О2 сопровождается химическим разрушением субстрата.

3.6. Классификация реакций фотосенсибилизированного окисления К.C. Фут (C.S. Foote) предложил все фотосенсибилизированные окислительные реакции разделять на два типа (схема 3.5).

К типу I относятся реакции, в которых ФС в триплетном возбужденном состоянии (3S*) первоначально взаимодействует непосредственно с субстратом, а не с молекулярным кислородом.

В реакциях типа II ФС в триплетном возбужденном состоянии на первичных стадиях взаимодействует с молекулярным кислородом.

Схема 3.5. Типы фотосенсибилизированных окислительных реакций (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 2006).

К первому типу относятся описанные разделе 3.3 кислородзависимые реакции фотосенсибилизированного 8-МОП окисления антиоксиданта токоферола (АОН):

S AOH S AO H

В реакциях типа II чаще всего происходит перенос энергии с ФС в триплетном состоянии на молекулярный кислород:

во взаимодействии с субстратом участвует возбужденный синглетный кислород, окисляя последний:

Значительно реже может происходить отрыв электрона от возбужденного ФС с образованием супероксид-аниона:

В последующих реакциях окисления субстрата участвуют уже супероксид-анион и образующиеся из него другие АФК.

Соотношение между процессами типа I и типа II в реакциях фотосенсибилизированного окисления в большой степени зависит от условий эксперимента. Например, гематопорфирин в водных растворах или в мицеллах сенсибилизирует фотоокисление триптофана путем прямой реакции (без 1О2) в том случае, если концентрация триптофана высока, тогда как при низкой концентрации реакция идет с участием 1О2. Связывание сенсибилизаторов с биологическим субстратом обычно способствует протеканию реакций с прямым участием триплетных возбужденных состояний сенсибилизатора. Например, метиленовый синий, связавшийся с эпидермисом кожи, перестает генерировать синглетный кислород. Генерация 1О2 гематопорфирином при связывании с эпидермисом ослабляется более чем в два раза по сравнению с водным мицеллярным раствором и почти в 10 раз – по сравнению с раствором в этаноле. Одновременно возрастает удельный вклад в процесс фотосенсибилизированного окисления свободнорадикальных реакций (тип I).

4. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КОЖЕ

К фотобиологическим процессам, происходящим в коже с участием эндогенных хромофоров, относятся эритема и эдема кожи, пигментация, синтез витамина D, индукция рака кожи (фотоканцерогенез), фотоаллергия и фотоиммуносупрессия и др.

Эритема – это стойкое покраснение кожи, возникающее вследствие расширения кровеносных сосудов кожи – гиперемии. Спектры действия эритемы, индуцируемой ультрафиолетом, изучают и измеряют, начиная с 20-х гг. ХХ в. Однако интерпретация этих спектров представляет достаточную сложность. Получение спектров действия эритемы рассмотрено в разделе 2.3.

В настоящее время стало ясно, что не существует одного «стандартного»

спектра действия эритемы – он может быть суммой двух или трех компонентов. Кроме того, форма спектра действия будет зависеть от времени, прошедшего между облучением и регистрацией покраснения кожи.

Эритему принято разделять на три типа: УФА, УФВ и УФС в зависимости от диапазона УФ излучения, порождающего эритему. Типы эритемы различаются по механизму возникновения и развития. Вероятно, что акцепторами квантов в этих трех случаях являются разные хромофоры, находящиеся к тому же в коже на разной глубине. Однако до сих пор нет сколько-нибудь ясных указаний на природу этих хромофоров.

Существует предположение, что первичными акцепторами действующих квантов являются белки, имеющие максимум поглощения при 280 - нм. Однако в стандартном спектре действия около 280 нм находится не максимум, а провал (рис. 1.9). Возможно, что этот провал возникает из-за экранирующего эффекта белков рогового слоя эпидермиса.

Возможно, что максимум при 292 - 294 нм в спектре действия обусловлен присутствием антиоксиданта -токоферола, имеющего максимум в спектре поглощения при 292 нм. После фотохимических реакций в коже развиваются темновые биохимические реакции, в первую очередь процесс пероксидного окисления ненасыщенных липидов, являющийся начальным звеном эритемной реакции кожи. Антиоксидант ингибирует не фотохимическую стадию эритемы, а темновые биохимические реакции которые и приводят к расширению сосудов дермы – вазодилатации. Для возникновения УФВэритемы необходимо фотохимически разрушить антиоксиданты в коже.

Несомненно, что ответ кожи на УФ-облучение не ограничен только фотохимическими превращениями определенных молекул, а включает в себя также активацию клеток и выброс интермедиатов в систему микроциркуляции.

Известно, что в коже в результате ряда ферментативных реакций из полиненасыщенных жирных кислот образуются простагландины. Механизм возникновения вазодилатации может быть связан с сосудорасширяющим действием простагландинов, количество которых возрастает в эпидермисе после УФВ-облучения.

Следовательно, в первые часы важнейшую роль играют процессы пероксидации липидов, а затем продукты окисления липидов активизируют синтез простагландинов.

Важно отметить, что темновые стадии УФС- и УФА-эритемы иного характера, чем УФВ-эритемы. Так, оксиданты не снимают действия УФСизлучения, а УФА-эритема не подавляется антипростагландиновыми агентами.

Для УФВ- и УФС-эритемы характерно явление фотореактивации. Установлено, что если после УФВ или УФС-облучения кожу осветить видимым светом, то эритемный эффект уменьшается. Явление фотореактивации хорошо изучено на микроорганизмах. Оно заключается в активации видимым светом фермента, восстанавливающего поврежденную ультрафиолетом структуру ДНК в участках возникновения тиминовых димеров. В последние годы такой фермент обнаружен в клетках кожи человека. Однако роль УФповреждения ДНК в индукции эритемы остается неясной.

4.2. Пигментация кожи Пигментация кожи – фотобиологический процесс, приводящий к образованию пигмента меланина, защищающего кожу от фотоповреждения.

Известны три механизма его защитного действия. Во-первых, пигмент поглощает фотоны и как экран ослабляет интенсивность действующего излучения. Во-вторых, меланин является перехватчиком свободных радикалов, образующихся при облучении кожи. Наконец, в-третьих, меланин связывает ионы двухвалентного железа, которые катализируют процесс пероксидного окисления липидов. Тем самым меланин ингибирует цепные реакции пероксидного окисления липидов и другие свободнорадикальные реакции.

Различают два вида процессов пигментации. Один из них – непрямая пигментация, начинающаяся вслед за эритемой через 2-3 сут. после облучения. Другой вид – прямая пигментация – возникает непосредственно сразу под лучами.

4.2.1. Непрямая пигментация (загар) Непрямую пигментацию называют также замедленной, т.к. она начинается через 2-3 сут. после облучения, на 13-21-й день достигает максимума и затем угасает за несколько месяцев. Первичные стадии возникновения загара до сих пор не ясны. Ультрафиолет каким-то образом запускает сложную цепь темновых реакций биосинтеза меланина. Непрямая пигментация активируется излучением с < 320 нм. Спектр действия загара близок к спектру действия эритемы. Под действием УФВ-излучения в коже в ходе темновых биохимических реакций активируется фермент тирозиназа, участвующий в превращении тирозина в меланин (рис. 4.1).

Рис. 4.1. Фотопревращение тирозина в меланин (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., Две первые стадии образования меланина проходят с участием ферментов. Последующие реакции легко осуществляются спонтанно с участием супероксид-аниона и других свободных радикалов.

Оказалось, что большие дозы коротковолнового УФС-излучения ( нм) блокируют пигментообразование под действием естественного солнечного света. Эффект блокирования загара сохраняется 1-1.5 месяца и связан, вероятно, с повреждением аппарата меланогенеза.

Синтез меланина осуществляется в специальных органеллах меланоцитов – меланосомах. Под действием УФ-излучения возникает следующая цепь событий (см. рис. 4.2):

1) активизируется пролиферация меланоцитов;

2) меланоциты гипертрофируются и выпускают разветвленные цитоплазматические выросты – псевдоподии;

Меланоциты – клетки базального слоя, содержащие меланосомы – гранулы с меланином. Эти клетки содержат также фермент тирозиназу, участвующий в превращении тирозина в меланин.

3) увеличивается число меланосом;

4) растет скорость образования меланина в меланосомах;

5) усиливается перенос меланосом в кератиноциты, что совпадает с увеличением скорости деления и смены кератиноцитов;

6) возрастает размер меланосом (особенно выраженный у представителей кавказской и монголоидной рас);

7) в эпидермисе повреждаются ингибирующие тирозиназу сульфгидрильные соединения, за счет чего возрастает активность этого фермента.

Рис. 4.2. Пигментация кожи под действием ультрафиолета (по www.riken.go.jp).

4.2.2. Прямая (немедленная) пигментация Прямая пигментация – возникает непосредственно сразу под лучами, за 1-2 ч. достигает максимума и уменьшается через 3-24 ч. после облучения.

Прямая пигментация никогда не приводит к сильному потемнению кожи.

Спектр ее действия представляет собой широкую неструктурированную полосу в области 300 - 700 нм с максимумом около 400 - 480 нм.

Механизм прямой пигментации включает в себя прямое фотохимическое окисление восстановленного предшественника меланина в меланин.

Этот процесс осуществляется в меланоцитах через образование семихинонов.

Как показало электронно-микроскопическое исследование, в некоторой степени потемнение кожи в ходе прямой пигментации происходит за счет активного передвижения меланосом в псевдоподии меланоцитов. Новые меланосомы при этом не образуются.

Хотя прямая пигментация и не бывает очень интенсивной, но благодаря ней частичная защита от УФ излучения осуществляется уже непосредственно во время воздействия луча света.

4.3. Синтез витамина D Витамин D на самом деле гормон, а не витамин. Обеспечение организма животных и человека витамином D происходит двумя путями: за счёт эндогенного образования в коже под воздействием УФ-лучей и за счёт усвоения экзогенного витамина D в кишечнике из пищи.

Активность препаратов витамина D выражается в международных единицах (ME): 1 ME содержит 0.000025 мг (0.025 мкг) химически чистого витамина D. 1 мкг = 40 МЕ.

Витамины группы D образуются под действием ультрафиолета в тканях животных и растений из стеринов. К витаминам группы D относятся:

витамин D2 – эргокальциферол, выделен из дрожжей, его провитамином является эргостерин;

витамин D3 – холекальциферол, выделен из тканей животных, его провитамин - 7-дегидрохолестерин (7-ДГХ);

витамин D4 - 22,23-дигидро-эргокальциферол;

витамин D5 - 24-этилхолекальциферол (ситокальциферол), выделен из витамин D6 - 22-дигидроэтилкальциферол (стигма-кальциферол).

Сегодня витамином D называют два витамина - D2 и D3 - эргокальциферол и холекальциферол - это кристаллы без цвета и запаха, устойчивые в воздействию высоких температур. Эти витамины являются жирорастворимыми, т.е. растворяются в жирах и органических соединениях и нерастворимы в воде. D3 - единственная форма витамина D в коже.

Эндогенное образование витамина D3 это достаточно сложный процесс, состоящий из нескольких стадий (схема 4.1):

биосинтез холестерина;

превращение холестерина в провитамин D3: 7-ДГХ;

образование превитамина D3 в ходе неферментативной, зависимой от УФ-света фотохимической реакции;

термическая трансформация превитамина D3 в витамин D3.

Затем эндогенный витамин D3 (и его метаболиты) из кожи и (или) поступивший с пищей витамин D3 с помощью D-связывающего белка, выполняющего транспортную функцию, поступает на последующие этапы в печень, почки, где происходит синтез гормона кальцитриола. Кальцитриол выполняет целый ряд функций, основные из которых связаны с усвоением кальция, с формированием и регуляцией минерализации костной ткани.

При достаточной и регулярной инсоляции потребность человека в витамине D полностью обеспечивается фотохимическим синтезом в коже. Вот почему витамин D3 называют «солнечным витамином». Именно фотохимические стадии во многих аспектах являются определяющими и лимитирующими в деятельности D-гормональной системы. Пищевой источник витамина D выполняет лишь компенсирующую роль в случаях дефицита эндогенного витамина.

Схема 4.1. Реакции синтеза витамина D3 в коже Активность фотохимических стадий синтеза витамина D3 находится в прямой зависимости от интенсивности, а также спектрального состава УФоблучения и в обратной - от степени пигментации (загара) кожи. Наличие пигмента при сформированном загаре существенно увеличивает время достижения максимума накопления превитамина D3 в коже, вместо 15 мин - часа Летний загар и зимняя депигментация людей в северных широтах позволяют регулировать интенсивность образования витамина D3 в коже. На синтез витамина D3 в коже влияет также высота местности над уровнем моря, ее географическое положение, время дня и площадь воздействия света. Когда все тело подвергается воздействию солнечных лучей в дозе, вызывающей легкую эритему, содержание витамина D, в крови увеличивается так же, как после приема внутрь 10000 ME витамина D3.

Одна из версий развития цивилизации (с юга на север, от чёрного цвета кожи к белому) говорит, что естественный отбор по цвету кожи способствовал образованию белой расы. На севере селекция шла в направлении белого цвета кожи в связи с необходимостью компенсации недостатка солнечного излучения и дефицита витамина, что могло быть причиной рахита и других заболеваний. А в южных широтах тёмный цвет кожи был необходим для защиты от избытка УФ-лучей.

Фотохимический процесс синтеза витамина D3 происходит только под воздействием на кожу световой и тепловой энергии с определёнными характеристиками. Реакции данного процесса являются неферментативными, т.е.

абсолютно не зависят от присутствия и активности ферментов. Исходным субстратом реакции синтеза витамина D3 является провитамин D3. Более 80% продукции витамина D3 в коже происходит в эпидермисе, а остальное количество в дерме. Снижение синтеза витамина D3 в коже с возрастом, вероятно, является результатом локального дефицита субстрата. Концентрация 7-ДГХ в эпидермисе в возрастном интервале от 20 до 80 лет снижается приблизительно на 50%, что отрицательно сказывается на балансе кальция и других функциональных свойствах D-гормональной системы.

Процесс синтеза витамина D3 в коже принято делить на две стадии (рис 4.3):

1. Образование превитамина D3 из провитамина D3.

2. Образование витамина D3 из превитамина D3.

Первая стадия этого процесса 9,10-секостерола, витамина D3. При температуре тела полное превращение превитамина D3 в витамин D3 происходит примерРис. 4.3. Фотобиогенез и метабоно за 3 дня. Резкие изменения температуры лический путь образования витаповерхности кожи не влияют на скорость мина D.

этого превращения, так как оно происходит в активно растущих слоях эпидермиса, где температура относительно постоянна; изменения температуры внутренних структур организма также слабо влияют на эту реакцию. Превитамин D3 является достаточно неустойчивым соединением, из которого под воздействием различных факторов могут образоваться различные соединения (схема 4.1):

Витамин D3 - в процессе термической изомеризации при температуре > 37°С (без участия дальнейшего облучения);