ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ» РАМН

На правах рукописи

СЕЛЯСКИН КИРИЛЛ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ АПОПТОЗА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ

НЕКОТОРЫХ АЛИМЕНТАРНЫХ И ТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

03.01.04. – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, Тутельян Виктор Александрович Москва – 2014 Содержание Содержание ………………………………………………………………………… Введение ……………………………………………………………………………. Глава 1. Обзор литературы……………………………………………………….. 1.1. Молекулярные механизмы апоптоза и его биологическая роль в поддержании тканевого гомеостаза ….………………………………... 1.2. Влияние токсических и алиментарных факторов на систему программируемой гибели клетки ……………………………………... 1.3. Современные методические подходы к исследованию активности апоптоза …………………………………..…………………….……….. Глава 2. Материалы и методы исследования………………………………… 2.1. Экспериментальные животные …………………………….………….... 2.2. Схемы экспериментов ………………………………..………………… 2.3. Биохимический метод определения активности каспазы-3………..….. 2.4. Морфометрические исследования ………………………………..…….. 2.5. Гель-электрофореза изолированных клеток «ДНК-комет»………..…... 2.6. Статистическая обработка результатов исследований ……………..…. Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение ……….… 3.1. Сравнительная характеристика методов определения активности апоптоза у крыс на экспериментальных моделях токсического воздействия …………………………………….………………..………. 3.1.1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона………………………………………………….….…. 3.1.2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия CCl4……………………... 3.2. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз CCl4 лабораторным животным….….. 3.3. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз CCl4.. 3.4. Определение активности апоптоза у крыс как биомаркер при оценке влияния алиментарных факторов……………………………………….. 3.4.1. Влияние дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия CCl4 и витаминной недостаточности ………………………... 3.4.2. Влияние фитостероидов на активность апоптоза у крыс………… 3.4.3. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa20 ……..…………………………………………… Глава 4. Заключение ……………………………………………………………… Выводы …………………………………………………………………….……….. Список литературы ………………………………………………………………. В В Е Д Е Н И Е Актуальность темы Прогрессивные исследования механизмов апоптоза создали предпосылки для использования теоретических и практических знаний в экспериментальной и клинической медицине [28, 31, 32, 36, 39, 64, 113]. Показано, что после индукции апоптоза дальнейшая судьба клетки (гибель или выживание) зависит от целого ряда факторов, модулирующих программированную клеточную гибель. К таким факторам можно отнести постоянно существующие в клетке белки, такие как семейство Вс1-2, IAP и каспазы, а также индуцируемые стрессом молекулы – факторы регуляции транскрипции NF-kB и р53, церамид, киназы JNK, р38 и ERK.

Нарушение механизмов регуляции апоптоза, приводящее к его ингибированию или неадекватному активированию, лежит в основе патогенеза онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний [20, 27, 28, 72, 124].

Исследование молекулярных механизмов, отвечающих за контроль процессов апоптоза, позволило выявить ряд диагностически значимых маркеров различных этапов гибели клетки [44, 49, 113]. Вместе с тем, наличие, как минимум, двух механизмов инициации апоптоза и сложной сети его регуляции позволяет говорить о возможной неоднозначности полученных результатов при изучении молекулярных факторов, характерных для определённого этапа апоптоза, а сравнительная оценка чувствительности различных методов значительно затруднена из-за большого разнообразия оцениваемых критериев. В прикладном аспекте одним из перспективных направлений, наряду с исследованием молекулярных маркеров апоптоза, может являться непосредственное определение количественных показателей, характеризующих процессы деструкции цитоскелета и фрагментации ДНК в тканях, позволяющих наиболее достоверно оценить активность апоптоза [67, 101, 154].

Поскольку апоптоз является эволюционно-консервативным системным процессом, обеспечивающим поддержание гомеостаза на протяжении всего периода жизни организма, показатели активности апоптоза можно рассматривать как интегральные биомаркеры, отражающие уровень адаптации организма к окружающей среде и обладающие высокой неспецифической чувствительностью к воздействиям различной природы [51, 61, 134, 138, 152]. Есть все основания полагать, что определение активности апоптоза может быть эффективно использовано в исследованиях, направленных на изучение влияния экзогенных воздействий различной природы, в том числе, низкотоксичных объектов.

Комплексное изучение апоптоза под влиянием разнообразных средовых или онтогенетических факторов широко представлено в научных публикациях [58, 103, 125, 147, 161], однако влияние алиментарных факторов на предрасположенность клетки к апоптозу остается до настоящего времени наименее изученным аспектом проблемы.

Целью настоящей работы является выявление наиболее чувствительных методов определения активности апоптоза и использование этих методов для изучения активности апоптоза при воздействии алиментарных и токсических факторов.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку чувствительности биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на экспериментальной модели индукции апоптоза адренокортикотропным гормоном.

2. Провести сравнительную оценку чувствительности биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на модели токсического действия низких и сверхнизких доз тетрахлорметана.

3. Охарактеризовать влияние модификации пищевого статуса животных, получавших рацион с дефицитом пантотеновой кислоты на изменение активности апоптоза в органах лабораторных животных.

4. Изучить влияние различных доз фитостероидов на активность стресса, вызванного воздействием электрического тока.

5. Изучить активность апоптоза у крыс, получавших генно-инженерномодифицированную (ГМ) кукурузу, содержащую кассету экспрессии Впервые сравнительно охарактеризована чувствительность биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов, позволяющих обнаружить апоптоз на эффекторном этапе (содержание белков Bcl-2, Bax, p53, активность каспазы-3), а также этапе деструкции (фрагментации ДНК) в органах крыс при токсических воздействиях различной интенсивности. Установлено, что метод ДНК-комет является наиболее чувствительным для определения активности апоптоза при воздействии низких и минимально низких доз токсических факторов.

Показано, что дефицит пантотеновой кислоты в рационе крыс снижает активность апоптоза в печени животных, а при сочетанном действии введения CCl и дефицита пантотеновой кислоты имеет место обратный эффект – увеличение активности апоптоза. Введение в рацион крыс фитостероидов в нормальных условиях не влияет на интенсивность процессов апоптоза, тогда как при сочетанном воздействии фитостероидов и моделированного стресса (воздействие электрическим током), было выявлено ингибирующие действие фитостероидов и сохранение активности процессов апоптоза в пределах физиологических значений.

высокочувствительного системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий различных факторов окружающей среды, в частности алиментарных факторов.

Определение активности апоптоза в органах лабораторных животных включено в систему оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения в качестве системного биомаркера.

чувствительного метода определения активности апоптоза при изучении воздействий экзогенной природы.

1. Сравнительная характеристика биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на различных экспериментальных моделях свидетельствует, что метод ДНК-комет является наиболее чувствительным для оценки активности апоптоза.

2. Изучение активности апоптоза может быть использовано в качестве высокочувствительного системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий различных факторов окружающей среды, в частности алиментарных факторов.

Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье»

(Москва, 1-3 декабря 2008 г.), XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов (Москва, 30 ноября – 2 декабря 2009 г.), XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» (Москва, 5 – 7 декабря 2011г.), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.). Апробация работы состоялась 17 декабря 2013 г. на межлабораторной научной конференции ФГБУ «НИИ питания» РАМН.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в научном журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные механизмы апоптоза и его биологическая роль в В самообновляющихся тканях организма человека ежедневно погибают 50миллиардов клеток, освобождая место для новых генераций. Физиологическая гибель клетки – апоптоз – это нормальный процесс поддержания гомеостаза за счет элиминации клеток, исчерпавших свой физиологический ресурс, дальнейшее существование которых представляет по какой-либо причине угрозу для организма.

Апоптоз является физиологически активным способом гибели клеток, контроль над которым осуществляет сложная иерархическая система внеклеточных и внутриклеточных факторов, при этом механизмы индукции и динамика процессов клеточной смерти могут варьировать в зависимости от целого ряда факторов, в том числе – от характера питания индивидуума.

Впервые термин «апоптоз» был предложен в работе J. R. Kerr с соавт. (1972) «Апоптоз как фундаментальный биологический феномен», и исходно обозначал динамику структурных изменений тканей, морфологическую картину гибели клетки.

Так, было показано, что структурные изменения клетки происходят в виде двух дискретных этапов: первый этап сопровождается изменениями структуры цитоскелета, коллапсом клеточных органелл в цитоплазме, конденсацией и сморщиванием гранул, распадом ядра и образованием апоптозных телец; на втором этапе происходит фагоцитоз апоптозных телец макрофагами или окружающими паренхиматозными и стромальными клетками образовавшихся апоптозных телец и их последующее разрушение под действием лизосомальных ферментов [90, 158, 159].

Биохимические и молекулярные механизмы апоптоза были изучены несколько позднее в эксперименте на нематодах (Caenorhabditis elegance) [63, 73, 75, 76, 98, 105, 123] (Lettre Gumienny Metzstein Ellis Reddien Hengartner). На основании полученных данных был сделан вывод, что физиологическая гибель клеток осуществляется по сходной генетической программе у филогенетически различных организмов – нематод, растений, насекомых и позвоночных [66, 89, 98, 129, 107].

детерминированной программой, которую можно условно разделить на три этапа:

инициации (индукции), эффекторный и деструкции.

Инициация апоптоза может быть вызвана различными факторами:

внеклеточными, опосредующими свое действие через рецепторные внутриклеточными, опосредующими свое действие через повреждение ядра и повреждение мембран митохондрий.

Внеклеточные факторы обеспечивают реализацию апоптогенного сигнала через специальные рецепторы смерти (death receptor, DR) расположенные на поверхности клетки и служащие сенсорами внеклеточных сигналов к апоптозу (схема 1). Сигналы подают рецептор-специфические лиганды смерти (death ligand, DL), которые могут быть сцеплены с мембраной или находиться в растворенной форме. Наиболее изученными и имеющими наибольшее биологическое значение являются специфические рецепторы смерти Fas (C95, APO_1/FAS) и TNF-R1 (tumor necrosis factor receptor 1) и соответствующие им лиганды смерти – Fas-лиганд и TNFлиганд. Вместе с тем, в настоящее время обнаружен ряд других рецепторов гибели клеток: DR3 (Death Receptor 3 он же Apo3, WSL-1, TRAMP и LARD), DR4 (Death Receptor 4), DR5 (Death Receptor 5 он же Apo2, TRAIL-R2, TRICK2 и KILLER) и DR6 (Death Receptor ) [19, 33, 52, 81, 108].

При связывании Fas-лиганда и Fas-рецептора происходит тримеризация рецептора и накопление С-концевого внутриклеточного домена смерти (death domen, DD), что приводит к образованию сигнального комплекса, индуцирующего апоптоз (death-inducing signaling complex, DISC), и мобилизации цитоплазменного белка FADD (Fas-associated death domain) (схема 1). В свою очередь FADD вступает во взаимодействие с прокаспазами 8 и 10 – неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз и инициирует апоптоз через активацию каспазы-8 и 10.

При связывании TNF-лиганда с TNF-рецепторами происходит аналогичный процесс, результатом которого является мобилизация белка TRADD (TNF receptorassociated death domain) и его взаимодействие с каспазами 8 и 10. Активация каспазы-8 и 10 является началом эффекторного этапа клеточной гибели, вызванного внеклеточными факторами.

Молекулярные механизмы регуляции апоптоза включают возможность ингибирования процесса на каждом из этапов развития. Так, реализация внеклеточного апоптогенного сигнала может быть остановлена на этапе активации каспазы-8, 10 белком FLIP (FADD-like inhibitory protein). Ингибитор каспаз FLIP избирательно связывается с Fas-/TNF-ассоциированными доменами смерти (FADD/TRADD), блокируя активацию каспазы-8, 10 и передачу проапоптотического сигнала от рецепторов смерти [5]. FLIP существует в двух формах – короткой (FLIPS), содержащей два эффекторных домена смерти, и длинной (FLIPL), в которой, помимо эффекторных, присутствует каспазоподобный домен [5, 22, 107, 108].

механизмов: ядерного, включающегося в результате повреждения ДНК, и митохондриального, включающегося в результате повреждения мембран митохондрий [6, 70, 71, 92, 119, 126] (схема 1). Внутриклеточные инициаторы апоптоза можно условно разделить на физико-химические и биологические (табл. 1).

Ионизирующее излучение (УФ-лучи, Гормоны (глюкокортикоидные, Механическое или термическое Токсины (альфа токсин, токсин В реализации ядерного механизма апоптотического сигнала важная роль принадлежит белку р53, накопление которого является диагностическим критерием повреждения ДНК [36, 47, 84, 93]. Действительно, повреждение ДНК стимулирует накопление белка р53, который активирует систему репарации клетки. Быстрое накопление белка p53 вызывает репрессию ряда генов, регулирующих (пресинтетической фазе).

Активация апоптоза через внешнее (внеклеточное) воздействие Сигнальный комплекс

АПОПТОЗ

Bid, tBid, Bax – основные проапоптотические белки семейства Bcl-2. При накоплении критического * уровня в цитоплазме происходит их транслокация в митохондрии и запускается митохондриальный Схема 1. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза: пути активации.

Таким образом, при определенных условиях, если повреждение ДНК существенно и необратимо (нерепарабельно), данный белок направляет клетку по пути апоптоза. Проапоптотическое действие белка р53 связывают с индукцией проапоптотических белков Fas, DR5, Bax, Noxa, AIP1, PIG3 и PID, а также с ингибированием антиапоптотических белков Bcl-2. Способность индуцировать апоптоз – важная составляющая опухолесупрессорной функции белка p53.

Митохондриальные механизмы апоптоза включаются при различных гипоксических состояниях, оксидативном стрессе, нарушении окислительного фосфорилирования и энергообеспечения клетки в целом [50, 70, 71 83, 126] (схема 1). В клетке резко снижается мембранный потенциал митохондрий, что обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий вследствие образования пор. Диаметр пор составляет ~ 2,9 нм, поэтому вещества с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже легко проходят через мембрану митохондрий.

Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема, среди которых такие апоптогенные факторы как цитохром С, прокаспазы -2, -3, -9, белок AIF (apoptosis inducing factor), SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases) [116, 150, 157].

Образование пор – не единственный механизм выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Образование пор во внешней мембране, не связанное с набуханием матрикса, может быть вызвано белками семейства Bcl- [139] (схема 1). Bcl-2-подобные белки, получившие название от своего первого представителя — Всl-2 протоонкогена, который был открыт на В-клетках лимфомы (В-сеll lymphomas), являются одними из основных регуляторов апоптоза и играют важную роль во внутриклеточной трансдукции и терминации апоптозного сигнала (схема 1, схема 2). На сегодняшний день известно более 25 представителей этого семейства которое включает в себя как проапоптозные (Вах, Bid, Ваk, Воk, Bad, BclxS, Bim, Bik, Blk, Hrk), так и антиапоптозные (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, McU, Bfll) белки [40, 42, 46, 56, 59, 70, 71, 94, 118, 124, 128, 131, 139]. Антиапоптозные белки семейства Вс1-2 локализованы в наружной мембране митохондрий, а также в эндоплазматическом ретикулуме и перинуклеарной мембране [41, 70, 72, 110, 128], проапоптозные белки в основном локализованы в цитозоле клетки [41, 70-72, 110, 121, 128].

Анти- и проапоптозные белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, при этом, решающим моментом в запуске апоптоза является гетеродимеризация этих белков [94, 104].

Поскольку каждый из Bcl-2-подобных белков может одновременно взаимодействовать с другими представителями этого семейства, в клетке возникает большое количество гетеродимерных комбинаций. Следствием гетеродимеризации в большинстве случаев является взаимная нейтрализация про- и антиапоптозных белков, поэтому соотношение между про- и антиапоптозными представителями этого семейства определяет чувствительность клеток к апоптозу [94, 112]. Любое нарушение их равновесия приводит к существенному изменению восприимчивости клетки к индукторам апоптоза [71, 94, 112, 124, 153].

Началом эффекторного этапа апоптоза является активация специальных протеолитических ферментов – каспаз. Каспазы (КФ 3.4.22, классификация MEROPS – клан CD, ID:C14) – это внутриклеточные цистеиновые протеазы, специфически расщепляющие белки после остатков аспарагиновой кислоты (Cysteine ASPartate specific proteASE – CASPASE). К настоящему времени охарактеризовано 18 каспаз [17, 36, 62], нумерация которых соответствует хронологическому порядку с момента открытия первого члена этого семейства – каспазы-1 в 1992 г. [17, 36, 53] (табл. 2).

В соответствии с их биологической функцией, каспазы разделены на два подсемейства: CED-3 – непосредственно участвующие в апоптозе, и ICE – обеспечивающие процессинг провоспалительных цитокинов (табл. 3) [17, 36, 62].

Каспазы подсемейства CED-3 синтезируются в клетке в виде проферментов, состоящих из четырех доменов: NH2-концевого продомена, большой субъединицы (молекулярная масса ~ 20 кДа), малой субъединицы (~ 10 кДа) и линкерного участка, соединяющего большую и малую субъединицы (рис 1).

Каспаза-1 ICE (IL-l -converting enzyme) Длинный, с CARD-участком Каспаза-8 MACH, FLICE, CAP4, Mch5 Длинный, с двумя DED-участками Прокаспазы превращаются в каспазы в результате протеолитического расщепления на субъединицы с последующей ассоциацией большой и малой субъединиц в гетеродимер. Два гетеродимера образуют тетрамер – активный фермент, с двумя каталитическими центрами [55, 120, 141, 142, 162]. Каспазы различаются по длине аминокислотной последовательности NH2-концевого продомена, который бывает коротким (20–30 аминокислотных остатков) или длинным (более 90 аминокислотных остатков). В длинном продомене обнаружено два модульных участка – эффекторный домен смерти (death effector domain, DED) и домен мобилизации каспаз (caspase recruitment domen, CARD), которые обеспечивают образование комплексов прокаспаз со специальными адаптерными белками (FADD, TRADD и др.). Поскольку структурные особенности каспаз подсемейства ICE (за исключением каспазы-1), участвующих в процессинге цитокинов, в настоящее время не изучены, нельзя исключать их возможной роли в апоптотической гибели клеток.

Каспазы, непосредственно участвующие в каскаде апоптотических реакций, принято подразделять на инициаторные и эффекторные. Первые (каспаза-2, -8, -9, активируют вторые (каспаза-3, -6, -7, -14), которые, в свою очередь, гидролизуют внутриклеточные субстраты [17, 36, 137].

Пути активации каспазного каскада апоптоза подразделяют на:

рецепторный, являющийся продолжением реализации апоптогенного сигнала, вызванного внеклеточными факторами;

апоптогенного сигнала, вызванного внутриклеточными факторами.

Рецепторный путь начинается с активации каспазы-8 и -10 (схема 1) и его дальнейшее развитие в зависимости от типа, стадии дифференцировки и функционального состояния клетки, может происходить по двум направлениям:

первое – активация прокаспаз-3, -6, -7; второе – активация белка Bid и запуск митохондриального пути апоптоза. Каспазы-8 и -10, расщепляют цитозольный белок Bid с образованием его активной формы tBid (truncated Bid), который, в свою очередь, меняет конформацию белка Bax, вызывая образование проницаемого для белков канала во внешней мембране митохондрий. Также возможна инициация клеточной гибели при высвобождении лизосомальных протеаз – катепсинов.

Например, каспаза-8 вызывает выход из лизосом катепсинов B, D и L, который затем активирует цепочку сигнальных белков Bid, Bak и Bax, что приводит к повышению проницаемости митохондриальной мембраны и увеличению выхода апоптогенных факторов из митохондрий [149].

Выход из митохондрий апоптогенных факторов вызывает формирование апоптосомного комплекса (апоптосомы), инициирующего активацию каспазы-9. В состав апоптосомы входят цитохром С, прокаспаза-9 и не менее 8 субъединиц Apafмолекулярная масса апоптосомы более 1,3 МДа. Apaf-1 играет роль арматуры на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9 в присутствии цитохрома С и АТФ [48, 163]. Предполагается, что Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром С в результате АТФ-зависимого конформационного изменения Apaf-1, затем Apaf-1 претерпевает дальнейшие конформационные изменения, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена Apaf- для прокаспазы-9, которая также содержит CARD-домен. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из Apaf-1-цитохром-Скомплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9, которая активирует прокаспазы-3, -6, -7 (схема 1) [17, 36, 48, 163].

Активация апоптоза через внешнее (внеклеточное) воздействие Сигнальный комплекс (DISC) Клеточная мембрана Схема 2. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза: основные ингибиторы.

Все известные ингибиторы каспаз можно условно разделить на три группы (табл. 5): I) физиологические ингибиторы, синтезируемые в клетках для предотвращения распада функционально активных молекул, II) пептиды, синтезируемые вирусами, и III) синтетические пептиды, связывающие активные центры каспаз (табл. 4) [17].

ингибиторные XIAP и др.) сигнальных путей путей апоптоза ростовых мессенджеры сигнального пути Специфические генов В регуляции активности каспаз принимают участие ингибиторы белков апоптоза, кодируемые X-xpoмосомой (X-linked inhibitors of apoptosis protein, XIAP), в состав которых входят три N-концевых BIR-домена и С-концевой RING-домен.

Эти белки ингибируют прокаспазы-3, -6, -7, а также каспазу-9, блокируя их активные сайты, однако, в условиях повышенного содержания каспаз-3, -7 эти ферменты могут расщеплять XIAP [127, 145].

образуются соответствующие им эффекторные каспазы-3, -6, -7, что является началом заключительно этапа – этапа деструкции апоптоза. На данном этапе ингибитором процесса может быть оксид азота (NO), который блокирует апоптоз посредством избирательного нитрозилирования эффекторных каспаз [91] (схема 2).

Повышение концентрации каспаз-3, -6, -7 является точкой необратимого развития апоптозного процесса [17, 36]. Действие каспаз-3, -6, -7 идет по трем основным направлениям:

первое – разрушение белков, защищающих клетку от апоптоза, например белка ICAD (Inhibitor of caspase activated deoxyribonuclease), являющегося ингибитором нуклеаз, вызывающих фрагментацию ДНК [156]);

второе – модификация белков путем отщепления их каталитической и/или регуляторной субъединиц, в этом случае мишенями активированных каспаз являются сигнальные протеины (Raf-1, PAK2/hPAK65, РСК5, p21-GAP и др.); инактивация регуляторов транскрипции или ДНК-репликации (репликативный фактор С), а также протеинов, участвующих в ДНКрепарации (поли(АДФ-рибозо)полимераза); деградация структурных белков таких как топоизомераза II и гистон H1, также приводит к фрагментации ДНК [17, 36, 120].

третье – непосредственное разрушение клеточных структур (например, ядерных белков ламинов, формирующих жесткие полимерные белковые структуры, которые находятся под ядерной мембраной и участвуют в опосредованно через разрушение таких белков цитоскелета, как гельзолин, фодрин, FAK (focal adhesion kinase) и РАК2 (p21-activated kinase 2), способствуя образованию апоптотических телец [17, 36, 45, 120];

Активация каспаз-3, -6, -7 вызывает необратимые изменения клеточных структур и дисбаланс метаболических систем, что приводит к гибели клетки.

Таким образом, молекулярно-клеточные механизмы апоптоза очень сложны, и, как показали исследования последних лет, практически не изменились в процессе эволюции, что свидетельствует о фундаментальной биологической роли гибели клеток [124].

1.2. Влияние токсических и алиментарных факторов на систему Современные знания о молекулярных механизмах развития апоптоза не оставляют сомнений, что регуляция апоптоза находится в прямой зависимости от пищевого статуса [99, 151], однако в научной литературе сведения по данному вопросу разрозненны и противоречивы, и для их систематизации необходимо проведение целого ряда дополнительных исследований. Так, очевидно, что обеспеченность организма полноценным белком является необходимым условием для нормального развития процесса апоптоза, поскольку все апоптоз-специфические рецепторы и ферменты представляют собой белковые молекулы, тем не менее, в литературе практически отсутствуют экспериментальные данные о влиянии диет с различным содержанием белка на изменение активности апоптоза [117, 151].

Липиды также принимают активное участие в регуляции программы клеточной смерти: в качестве структурных компонентов липиды определяют функциональное состояние мембран клеток и клеточных органелл, а также функциональное состояние рецепторных систем, реализующих апоптогенный сигнал внеклеточного воздействия. B исследовании [143] показано, что сфинголипиды индуцируют апоптоз, тогда как фосфолипиды и полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) препятствуют реализации программы гибели клетки, выступая в роли факторов роста. Вместе с тем, ПНЖК, как потенциальные субстраты перекисного окисления липидов, в определенных условиях (окислительный стресс) могут оказывать апоптоз-индуцирующее действие.

Некоторые классы липидов оказывают влияние на экспрессию генов апоптоза (АРОE, АРОС3, LPL, PON1 и MTHFR), непосредственно взаимодействуя с факторами транскрипции (NF-B, HNF4, PPAR, и SREBP1) [147, 148], или действуя опосредованно, путем изменения генерации вторичных липидных мессенджеров (церамида, сфингозина и др.).

Углеводы не оказывают прямого действия на изменение активности апоптоза, однако, их избыточное или недостаточное поступление с рационом, как и нарушения углеводного обмена, способствуют развитию патологических состояний, провоцирующих сбой механизмов гибели клеток [109].

большинстве случаев зависит от их антиоксидантных/прооксидантных свойств. Так, токоферол, ретинол и аскорбиновая кислота оказывают антиоксидантное действие за счет способности инактивировать кислородные метаболиты, ограничивая их накопление и повреждающее действие. Следовательно, при дефиците этих витаминов, возрастает вероятность инициации кислород-зависимых типов апоптоза.

Кроме того, по данным [82], аскорбиновая кислота участвует в регуляции синтеза белка p53 и процессах репарации генетического материала клетки.

Одним из механизмов влияния эргокальциферола на апоптоз является активация специфических Bcl-2-подобных белков апоптоза (Bak, Bax и др.), а также непосредственное участие в синтезе необходимых для апоптоза цитокинов.

Пиридоксин, цианокобаламин и фолиевая кислота участвуют в обеспечении защиты митохондриального генома, а также участвуют в нейтрализации клеточного токсического эффекта ряда ксенобиотиков. В исследованиях [95] показана способность цианкобаламина к снижению активности апоптоза, вызванного кортикостероидами, в период эмбрионального развития. Пантотеновая кислота оказывает мембраностабилизирующий эффект, участвует в процессах окисления и ацетилирования липидов и углеводов, в синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников, входит в состав кофермента А. Недостаток пантотеновой кислоты в организме приводит к нарушению обмена веществ, что также может являться одним из факторов запуска апоптоза.

Одной из основных функций микроэлементов в программируемой гибели клетки является их участие в качестве ко-факторов или катализаторов ферментов свободно-радикального окисления. Натрий (Na+) играет весьма важную роль в регуляции водного обмена, его выведение из клеток осуществляется Na+/K+АТФазой, которая является мишенью активных форм кислорода (АФК), поэтому повышение уровня АФК приводит к обратимому ингибированию данного фермента [60]. Кроме того, АФК являются причиной поражения мембран клеток и нарушения их проницаемости, что, в свою очередь, приводит к накоплению кальция (Са2+) и магния (Mg2+) в клетке [68]. Увеличение концентрации Са2+ и Mg2+ в цитоплазме трансглутаминазы, вызывает повышение активности клеточных протеиназ, что также может стать причиной активации апоптоза [18, 60].

Калий (K+) – основной внутриклеточный катион, важнейшая биологическая роль которого заключается в поддержании трансмембранного потенциала.

Нормальный потенциал мембраны или ее гиперполяризация обеспечивают пролиферативную активность клетки, тогда как деполяризация мембраны служит обязательным условием реализации апоптоза. Известно, что церамид (медиатор липидного пути апоптоза) способствует инактивации К+-каналов, накоплению ионов калия в клетке и деполяризации мембраны [96].

Медь (Cu2+), цинк (Zn2+) и марганец (Mn2+), являясь компонентами активного центра медь-цинковой (Cu,Zn)- и марганец (Mn)- зависимой свободнорадикального оксиления и эндонуклеазной активности. Кроме того, Cu,ZnСОД стабилизирует спиральную структуру ДНК, блокирует транскрипционные факторы Fas, с-myc, и стимулирует ген bcl-2, способствуя торможению эндонуклеаз и предупреждению апоптоза [78].

Железо (Fe3+) – важный эссенциальный микроэлемент, катализирующий реакции, в которых генерируются АФК (например, реакция Фентона и реакция Осипова), вызывающие повреждениz хромосом, накопление белка p53, и, как следствие, инициацию апоптоза [69].

Алюминий (Al3+) принимает участие в построении эпителиальной и соединительной тканей, участвует в процессе регенерации костной ткани, влияет на реакционную способность пищеварительных ферментов. Увеличение концентрации ионов Al3+ в клетках служит причиной выраженной интоксикации и нарушения процессов внутриклеточного обмена. Высокая способность к образованию токсичных комплексных соединений обусловливает роль Al3+ в снижении активности внутриклеточных ферментных систем, что приводит к гибели клетки [86].

Большинство из наиболее изученных к настоящему времени токсических факторов оказывает влияние на молекулярные механизмы регуляции апоптоза [113].

Процесс программируемой гибели клетки может быть инициирован в результате прямого или опосредованного повреждающего действия в зависимости от свойств, дозы и времени экспозиции токсического агента [113, 122]. Впервые влияние продемонстрированно на модели гибели тимоцитов и лимфоцитов под действием глюкокортикоидов. Впоследствии было установлено, что 2,3,7,8-тетрахлородибензоп-диоксин также вызывает апоптоз тимоцитов [90, 113, 158, 159].

В последние годы широкое распространение получила гипотеза активации апоптоза в условиях умеренных токсических воздействий, недостаточных для развития некроза. Действительно, на примере действия оксида мышьяка (As2O3) и 2,3-диметокси-1,4-нафтохинона на клетки поджелудочной железы, а также четыреххлористого углерода (ССl4) – на клетки печени, было показало, что низкие дозы этих веществ инициируют апоптоз, тогда как более высокие дозы приводят к некрозу. Аналогичные результаты были получены в исследованиях целого ряда других соединений: микотоксинов (фумонизины, охратоксин А), антибиотиков (циклогексимид, гигромицин и др.), солей тяжелых металлов (хлорид ртути, сульфат кадмия и др.) – изучено действие на клетки печени и почек; некоторых соединений свинца – на нейроны, астроциты и фоторецепторы сетчатки глаза; Т-2 токсина и 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты – на клетки тимуса и селезенки; катехоламинов – на кардиальные и скелетные миоциты [113].

1.3. Современные методические подходы к исследованию Основными критериями, характерными для апоптоза, являются:

функционально – необратимое прекращение жизнедеятельности клетки;

морфологически – потеря микроворсинок и межклеточных контактов, конденсация хроматина, уменьшение объема клетки, ее фрагментация и образование апоптозных телец; биохимически – гидролиз белков цитоплазмы и межнуклеосомный распад ДНК; генетически – структурно-функциональная перестройка генетического аппарата клетки [16, 90].

В настоящее время в научных исследованиях используются следующие основные методы определения активности апоптоза:

1. Биохимические методы определения степени фрагментации ДНК и 2. Микроскопические методы регистрации морфологических изменений Биохимические методы исследования активности апоптоза Метод ДНК-комет («DNA-comet assay»), впервые описанный Ostling и Johansson в 1984 г. [114], является быстрым и весьма чувствительным методом регистрации повреждений ДНК и изучения репарации ДНК на уровне одиночных клеток. Усовершенствования и модификации метода ДНК-комет позволили значительно повысить его чувствительность и расширить сферу применения, однако практически не затронули основные принципы, положенные в его основу [133].

Метод ДНК-комет постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу — оценке влияния пищевого рациона, факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК; по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа;

исследований по экологии. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза [34].

Известно, что в клетках, гибнущих по механизму апоптоза, ДНК, как правило, претерпевает межнуклеосомную деградацию, являющуюся характерным маркером процесса. Апоптотические клетки имеют вид слабо флуоресцирующих «ДНКкомет» с широким диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой».

Использование метода ДНК-комет для регистрации апоптотических клеток в популяциях особенно актуально в случае, когда доступным является только небольшое количество образца. С помощью метода ДНК-комет удается получать информацию не только о содержании ДНК в апоптотических клетках, но и о размерах фрагментов ДНК, вышедших из клетки при действии электрического поля [11].

Возможности метода ДНК-комет, его преимущества и недостатки наиболее наглядно продемонстрированы в работе по исследованию генотоксичности химических соединений, выбранных из различных групп канцерогенных веществ.

Тестирование проводилось на мышах (в 8 органах) и продемонстрировало преимущества этого метода, в первую очередь связанные с возможностью определять повреждения ДНК и активность апоптоза в любом органе, независимо от степени митотической активности в нем. Результаты исследования показали, что метод обладает наибольшей эффективностью при определении фрагментации молекул ДНК как вследствие однонитевых разрывов индуцированных химическими веществами, так и образующихся из щелочелабильных сайтов ДНК, что в свою очередь является характерным признаком необратимой фазы апоптоза [34].

Важным аспектом в исследованиях генотоксичности и канцерогенности химических соединений является их причастность к формированию радикальных форм кислорода и азота, которые могут инициировать канцерогенез благодаря своей способности реагировать с ДНК, вызывая мутации. Так, в ряде экспериментов показано, что оксид азота (NO) и его производные могут содействовать процессу канцерогенеза. Генотоксичность NO определяется как его концентрацией, так и механизмами попадания в организм. NO и его реактивный радикал пероксинитрит (ONOO-) индуцируют однонитевые разрывы ДНК, вызывают как процессы репарации ДНК, так и гибели, путем некроза или апоптоза. Кроме того, ускорение апоптоза в клетках является прямым ответом на проникновение NO. Метод ДНКкомет позволяет определять мутагенное действие экзогенного NO. Количество повреждений ДНК росло пропорционально увеличению концентрации NO, как в нормальных клетках, так и в клетках аденокарценомы легкого. Такие исследования подтверждают, что метод ДНК-комет является надежным методом для оценки генотоксичностии и изменения активности апоптоза при действии различных химиопрепаратов in vitro.

Использование метода ДНК-комет позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. В ряде работ было показано, что использование метода ДНК-комет оказывается полезным для разделения субпопуляций апоптотических клеток и клеток на ранних стадиях некроза. При некрозе нарушение целостности клеточных мембран предшествует деградации ДНК, а при апоптозе деградация ДНК развивается раньше процесса разрушения клеточной мембраны.

Поэтому метод ДНК-комет не менее информативен, чем другие методы, основанные на оценке степени деградации ДНК, такие как проточная цитометрия [34, 133].

Определение активности каспаз биохимическим методом основан на использовании в качестве субстрата каспазы-3 синтетического пептида DEVD (AspGlu-Val-Asp). Для флуориметрического метода используется DEVD-AFC субстрат, для колориметрического метода – DEVD-pNA субстрат. Два метода определения активности каспазы-3 в целом демонстрируют сопоставимые результаты [87, 116].

Так в работе [116] с использованием колориметрического метода, было установлено снижение активности каспазы-3 в гепатоцитах мышей линии 129S6, подвергавшихся длительному воздействию этанола при включении в их рацион сульфата цинка. В другом исследовании [87] определяли активность каспазы- после моделирования артериальной гипертензии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что хроническая перегрузка левого желудочка сердца, вызванная вазоренальной артериальной гипертензией, усиливает апоптотическую гибель клеток миокарда в правом желудочке.

Таким образом, определение активности каспазы-3 позволяет установить сам факт апоптоза и его интенсивность. Помимо применения биохимического исследования, целесообразно использование других методов определения апоптоза, однако преимуществом биохимического метода является возможность определения путей инициации клеточной гибели [116].

Также следует отметить, что биохимический метод определения активности каспазы-3 может быть эффективно использован при исследовании неапоптотических функций данного фермента в организме. Так появляются свидетельства того, что каспаза-3 может выполнять ряд важных функций в организме. В частности, в нейронах каспаза-3 принимает участие в нейропротекции при ишемическом прекондиционировании. Каспаза-3 быстро активируется в ограниченных внутриклеточных компартментах при формировании конусов роста клеток сетчатки и необходима для установления правильных нейрональных связей.

Можно предположить, что каспаза-3 не только необходима для реализации большинства сценариев апоптоза, но и принципиально важна для реализации важнейших неапоптотических процессов. Использование данного метода позволяет продемонстрировать плейотропность каспазы-3 и понять адаптивные преимущества такой плейотропности для клетки и целого организма [23].

Микроскопические методы определения апоптоза Все микроскопические методы морфологической идентификации апоптоза можно подразделить на следующие группы:

1) рутинное свето-микроскопическое исследование;

2) флуоресцентно-микроскопическое исследование;

3) электронно-микроскопическое исследование;

4) выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ;

5) иммуногистохимическое выявление белков апоптоза.

Наиболее доступным и простым методом выявления апоптических клеток и изучения их морфологических особенностей служит световая микроскопия гистологических препаратов. Для этого используют тонкослойные срезы, окрашенные азуром А (для идентификации формы хроматина) или гематоксилином и эозином (для выявления структур цитоплазмы). Результаты микроскопических исследований свидетельствуют о конденсации цитоплазмы и ядерного материала в клетках после индукции апоптоза in vitro. Критериями отличия апоптоза от некроза выступают распад клеток на фрагменты, содержащие гранулярные отмешивания красителя и не имеющие диффузного прокрашивания цитоплазмы. Так, при апоптозе мембранные структуры клеток остаются неповрежденными, что препятствует распространению красителя в цитозоле. Низкая эффективность данного метода связана, с одной стороны, с незначительной длительностью специфичной для апоптоза стадии фрагментации клеток (всего 1—1,5 ч [90]), а с другой стороны, с трудностями изучения в данных условиях морфологии погибающих клеток и апоптотических телец [16].

Метод флуоресцентной микроскопии часто используется для выявления апоптоза. Исследуют как окрашенные клетки во взвеси, так и фиксированные препараты. Окрашивание производится с использованием флюорохромов, специфически связывающихся с ДНК: DAРI, Хехст 33258, акридинового оранжевого и бромистого этидия. Обычно признаком апоптоза при использовании флуоресцентной микроскопии служит выявление ярко светящегося конденсированного хроматина.

Некоторое применение находят также методы, с помощью которых производится оценка состояния цитоплазматической мембраны клетки, а именно — ее проницаемости при окраске аннексином V, специфически связывающегося с остатками фосфатидилсерина мембраны апоптозных клеток с последующей цитофотометрией. Вследствие изменений проницаемости цитоплазматической мембраны апоптические клетки накапливают краситель значительно быстрее, чем интактные. Метод позволяет выявлять ранние изменения проницаемости плазматической мембраны и хроматина, предшествующие межнуклеосомной фрагментации ДНК.

Характерные для апоптических клеток ультраструктурные изменения можно выявить с помощью электронной микроскопии. С помощью метода электронной микроскопии выявляют различия в ультраструктурных изменениях клеток в динамике апоптоза, инициированного действия различных индукторов апоптоза.

Однако, сложность методики изготовления образцов и продолжительность времени, затрачиваемого на проведение анализа, существенно ограничивают возможности использования этого метода визуализации [16].

Выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ с помощью метод считается самым надежным и специфическим способом выявления апоптоза, поскольку направлен на верификацию основного признака — распада ДНК под действием Mg2+/Ca2+-зависимых эндонуклеаз с образованием фрагментов, размеры которых кратны размеру одной нуклеосомы (186 азотистых оснований). Для выявления этого процесса применяют так называемый TUNEL-метод (Terminal deoxynucleotided Transferase — mediated dUTP — biotin Nick — End Labeelirg), или терминальное дезоксиуридиновое мечение концов [16]. Суть метода заключается в специфическом связывании с 3-концом разорванной нити ДНК дУТФ, меченного дезоксинуклеотидтрансферазой. Метод считается особенно ценным в тех случаях, когда нужно выявить апоптоз в тканях, содержащих небольшое число гибнущих клеток. Метод допускает параллельное проведение на одном и том же срезе иммуногистохимических и некоторых гистохимических реакций.

С помощью иммуногистохимических методов исследований определяют наличие протеинов, составляющих каскад биохимических процессов, приводящих к апоптозу. В некоторых случаях к ним относят и ТUNEL-метод, что, по сути, неверно, так как последний не включает использование взаимодействий антиген — антитело. На основании иммуногистохимических данных делают выводы о возможности вступления тех или иных клеточных элементов в апоптоз, но не об уровне этого процесса в популяции клеток. Известно, например, что такой важный фактор апоптоза, как каспаза-3, может быть выявлен в нейтрофилах, у которых экспериментально заблокирована возможность развития апоптотических процессов.

Обычно используют поли- и моноклональные антитела к протеинам р53, Bсl-2, Bax, MPM-2, RB, Fas, циклинам, каспазам и т.д. [97] Проточная цитометрия является современной технологией быстрого измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика проточной цитометрии заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клеточной суспензии в потоке жидкости. причем степень световой дисперсии позволяет получить представление о ее размерах и структуре. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом в результате так называемого гидродинамического фокусирования струи в струе [146].

В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

рассеяние света под малым углом (1–10°) для определения размеров клетки, рассеяние света под углом 10°, что позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеточного содержимого, интенсивность флуоресценции для определения состава клеточной субпопуляции [16].

Среди наиболее часто применяемых флуорохромов находятся следующие:

флуоресцеин изотиоционат (FITC), фикоэритрин (PE, RD1), перидининхлорофилл протеин (Per-CP), алофикоцианин (APC), а также тандемные красители (фикоэритрины Cy5 и Cy7) [77].

Методологические приемы проточной цитометрии высокоинформативны и наиболее полно отражают состояние клетки, что позволяет определить, на какой стадии апоптоза находится клетка. Выявление клеток на ранних стадиях апоптоза осуществляется посредством аннексина V, для более поздних этапов апоптоза характерно наличие в клетке гиподиплоидного набора ДНК, выявляемого с помощью пропидия иодида. ДНК-гистограммы позволяют четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточного цикла. Целый набор различных флуорохромов сделал возможным количественные исследования таких физиологических параметров как концентрация свободных ионов кальция, уровень окислительных процессов, величина митохондриального потенциала, активность различных клеточных ферментов (в том числе каспаз), а также интенсивность экспрессии отдельных генов (bcl-2, p53 и других). Совокупность информации о содержании ДНК, молекулярных маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, полученной методом проточной цитометрии, имеет большое значение для комплексной оценки механизмов регуляции апоптоза [77, 146].

На основании проведенного анализа литературы можно сделать вывод, что молекулярно-клеточные механизмы апоптоза в настоящее время являются предметом всестороннего изучения, что способствует более глубокому и полному пониманию патофизиологии целого ряда болезней. При этом наибольшее внимание уделяется изучению роли апоптоза в патогенезе онкологических, гериатрических, а также аутоиммунных заболеваний.

Обобщенная научная информация по данной проблеме подтверждает правомерность двух гипотез: во-первых, регуляция процессов программируемой гибели клеток находится в прямой зависимости от пищевого статуса, что позволяет рассматривать направленную алиментарную регуляцию в качестве наиболее предпочтительного способа коррекции индуцированного апоптоза; во-вторых, существующие данные однозначно указывают на апоптоз-инициирующее влияние умеренных токсических воздействий, что обеспечивает возможность использования данного показателя в токсикологических исследованиях в качестве интегрального индикатора неблагоприятного действия на организм.

В настоящее наметилась тенденция к использованию количественных методов оценки апоптоза, таких как проточная цитометрия, определение активности каспаз, морфологические методы и др. Учитывая неоднозначность признаков апоптоза, необходимо комплексное использование разных методов для определения и оценки апоптотической гибели.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все модельные эксперименты выполнены на 220 крысах-самцах линии Вистар с массой тела 250-270 г., полученных из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая». Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим +21-23С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. На протяжении всех экспериментов не отмечено гибели крыс контрольной и опытных групп. Состав, пищевая и энергетическая ценность использованных рационов представлены в табл.

Состав полусинтетического казеинового рациона (ПКР) состав солевой смеси ПКР представлен в табл. 6 и 7.

в состав в/р витаминов ПКР входит L-метионин в количестве 500 мг/кг рациона состав витаминной смеси ПКР представлен в табл. фосфорнокислый, однозамещенный Изучение активности апоптоза у крыс, получавших генно-инженерномодифицированную (ГМ) кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa проводили на 20 крысах самцах линии Вистар, с массой тела 90-100 г. Животные получали свободный доступ к корму и воде, содержались в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в вентилируемом помещении, по 4-5 особей в клетке.

Животные были произвольно разделены на 2 группы (по 10 особей в каждой группе): животные опытной группы получали с рационом ГМ кукурузу, животные контрольной группы – традиционный аналог ГМ кукурузы. Измельченное зерно кукурузы включали в состав корма из расчета ~10-12 г на крысу в сутки, заменяя ингредиенты рациона по принципу изокалорийности и идентичности химического состава (табл. 9).

Состав экспериментальных рационов с включением кукурузы Ингредиенты Опытная группа, ГМ кукуруза устойчивая к вредителям Контрольная группа, традиционный аналог ГМ кукурузы состав солевой смеси ПКР представлен в табл. 6 и 7.

в состав в/р витаминов ПКР входит L-метионин в количестве 500 мг/кг рациона состав витаминной смеси ПКР представлен в табл. Исследования включали несколько последовательных этапов, структура экспериментов представлена в табл. 9.

Опыт-2 CCl4 – 0,48 мг/кг 3. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально Опыт-2 CCl4 – 0,02 мг/кг Опыт-3 CCl4 – 0,04 мг/кг Дизайн эксперимента разработан совместно с в.н.с., к.м.н. Н.В. Тышко.

4. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз CCl Опыт-1 CCl4 – 0,04 мг/кг 5. Изучение влияния дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия CCl4 и витаминной 6. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза в норме Опыт-1 Фитостероиды Опыт-2 Фитостероиды 7. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза после стрессорного Контроль – Опыт-1 Стрессорное 8. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa Эксперимент 1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия АКТГ. В первой серии исследований на классической модели активации апоптоза под действием АКТГ были отработаны оптимальные методы определения ключевых белков апоптоза – p53, Вах, Bcl-2, активности каспазы-3, а также метод ДНК-комет для определения степени фрагментации ДНК в органах крыс. Эксперимент проведен на 70 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 312,4±10,8 г. Животные были разделены на 3 группы: Первой опытной группе (исходно – 30 крыс) внутрибрюшинно вводили водный раствор АКТГ в дозе 4 МЕ на кг массы тела, второй опытной группе (исходно – 30 крыс) внутрибрюшинно вводили водный раствор АКТГ в дозе 75 МЕ на кг массы тела. Контрольной группе животных (исходно – 10 крыс) вводили равный объем физиологического раствора (0,14 М NaCl). Эвтаназию животных первой и второй опытных групп проводили через 6, 12 и 24 часов после введения раствора. Животных контрольной группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. После выведения животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг). Активность апотоза определяли биохимическим методом (определение активности каспазы-3), иммуногистохимическим методом (определение белков апоптоза p53, Bax, Bcl-2) методом ДНК-комет (определение степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза).

Эксперимент 2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия CCl4. В данной серии исследований на модели токсического действия низких доз тетрахлорметана (CCl4) определены наиболее чувствительные методы оценки активности апоптоза. Эксперимент проведен на половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 312,4±10,8 г.

Животные были разделены на 3 группы: Первой опытной группе (исходно – крыс) внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,08 мг на кг массы тела, второй опытной группе (исходно – 30 крыс) внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,48 мг на кг массы тела.

Контрольной группе животных (исходно – 10 крыс) вводили равный объем жидкого парафина. Эвтаназию животных первой и второй опытных групп проводили через 6, 12 и 24 часов после введения раствора. Животных контрольной группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. После выведения животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг). Активность апотоза определяли биохимическим методом (определение активности каспазы-3), иммуногистохимическим методом (определение белков апоптоза p53, Bax, Bcl-2) методом ДНК-комет (определение степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза).

Эксперимент 3. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз CCl4 лабораторным животным. Эксперимент проведен на 40 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 304,0±8,3 г. Животные были разделены на 3 опытные и 1 контрольную группу по животных в каждой из них. 3 опытным группам животных внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,04. 0,02 и 0,01 мг на кг массы тела соответвенно. Контрольной группе животных вводили равный объем жидкого парафина. Животных всех группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг). Активность апотоза определяли биохимическим методом (определение активности каспазы-3), иммуногистохимическим методом (определение белков апоптоза p53, Bax, Bcl-2) методом ДНК-комет (определение степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза).

Эксперимент 4. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз CCl4 Эксперимент проведен на 30 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 289,5±7,9 г. Животные были разделены на 2 опытные и контрольную группу по 10 животных в каждой из них. Первой опытной группе внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,08 мг на кг массы тела, второй опытной группе внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в минимально действующей дозе 0,04 мг на кг массы тела.

Контрольной группе животных вводили равный объем жидкого парафина.

Животных всех группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг, селезенка, семенники, тонкая и толстая кишка). Активность апотоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апоптоза.

Эксперимент 5. Изучение влияния дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия CCl4 и витаминной недостаточности. Эксперимент длительностью 30 дней проведен на 30 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 325,0±11,3 г.

Животные были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группу по 10 животных в каждой из них. Животные первой и второй опытной группы получали полусинтетический казеиновый рацион дефицитный по пантотеновой кислоте, животные конторольной группы получали полноценный рацион. Второй опытной группе за 24 часа до эвтаназии вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,08 мг на кг массы тела. При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг, селезенка, семенники, тонкая и толстая кишка). Активность апотоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК.

Эксперимент 6 1. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза в норме. Исследование, продолжительностью 30 дней проводили на половозрелых крысах-самцах линии Вистар полученных из питомника «Столбовая». После семидневного карантина животные были взвешены и разделены на 3 группы, по 8 животных в каждой из них. Средние значения исходной массы тела животных контрольной группы, опытной группы №1 и опытной группы № достоверно не различались и составляли 111,0±2,1 и 109,0±1,7 соответственно. Все животные содержались в отдельных клетках и получали стандартный общевиварный рацион (ОВР). Животным опытных групп №1 и №2 ежедневно в воду добавляли экстракт из листьев Серпухи Венценосной (Serratula coronata) из расчета 5,0 и 15, мг фитостероидов (20 гидроксиэкдизона (20Е) и 25S-инокостерона) на кг массы тела соответственно. Контроль выпитой жидкости проводили ежедневно. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента питьевую воду. На сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. У животных отбирали для исследований образцы внутренних органов (тимус, мозг, сердце). Активность апоптоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апоптоза.

Выполнено совместно с научным сотрудником лаборатории физиологии и биохимии пищеварения Сидоровой Ю.С.

Эксперимент 71. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза после стрессорного воздействия электрическим током. Исследование, длительностью 30 дней проводили на 16 половозрелых крысах-самцах линии Вистар. После семидневного карантина животные были взвешены и разделены на группы, по 8 животных в каждой из них. Средние значения исходной массы тела животных контрольной и опытной группы достоверно не различались и составляли 111,0±2,1 и 109,8±1,8 г соответственно. Животные содержались в отдельных клетках и получали стандартный общевиварный рацион (ОВР). Животным опытной группы ежедневно в воду добавляли экстракт из листьев Серпухи Венценосной (Serratula coronata) из расчета 2 мг фитостероидов (20 гидроксиэкдизона (20Е) и 25Sинокостерона) на кг массы тела соответственно. Контроль выпитой жидкости проводили ежедневно. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента питьевую воду.

В последний день эксперимента крыс обеих групп подвергали стрессорному воздействию. Их помещали в светлый отсек специальной камеры камеры спиной к темному отсеку (стартовое положение). Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 секунд). Затем крысу переводили в жилую клетку. Для определения активности апотоза методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апотоза отбирали образцы внутренних органов: тимус, мозг, сердце.

Эксперимент 8. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa20.

Исследования длительностью 182 дней проведены на 30 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 93,1±2,0 г. Крысы получали свободный доступ к корму и воде, содержались в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в вентилируемом помещении, по 5 особей в клетке. Животные были разделены на 2 группы, по 15 животных в каждой из них: крысы опытной группы получали рацион с включением ГМ кукурузы, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa20 Кукурузу включали в состав корма из расчета ~10-12 г на крысу в сутки.

При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг, селезенка, семенники, тонкая и толстая кишка). Активность апотоза определяли методом ДНКкомет по степени фрагментации ДНК и индексу апоптоза.

2.3. Биохимический метод определения активности каспазы- Активность каспазы-3 в тканях лабораторных животных определяли фотометрическим методом с применением тест-систем «Caspase 3 Colorimetric Kit»

(кат. № BF3100) фирмы R&D System, США.

Принцип метода основан на расщеплении искусственного субстрата AcDEVD-pNA (Ac-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide) каспазой-3 после остатков аспарагиновой кислоты и регистрации продукта реакции – хромофора pнитроанилина (pNA) при длине волны 405 нм (mM = 10,5).

Гомогенаты печени, почек, тимуса, мозга и костного мозга готовили в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком в среде 50 мМ TrisHCl (pH=7,4), в соотношении 1:2 (ткань:среда). Для отделения клеток и ядер гомогенат центрифугировали 5 мин. при 10000 g при температуре 2°С на рефрижераторной центрифуге (Eppendorf 5415 R) и отбирали супернатант (образец) [116].

Определение активности каспазы-3 проводили в в среде, общим объемом мл, следующего состава:. К 850 мл реакционного буфера, содержащего 20 мM Хепес, pH 7,4; 2 мM ЭДТА, 0,1% ЧАПС (3-((3-хлорамидопропил)диметиламмонио)пропансульфонат), 5 мM дитиотреитол, добавляли 100 мкл супернатанта и инкубировали при 37 оС в течении 10 минут. Реакцию запускали добавлением мкл субстрата – 4 мM Ac-DEVD-pNA.

Определение количества отщеплённого хромофора pNA проводили на спектрофотометре «StatFax 1904+» при 405 нм через 60 мин после начала реакции.

Полученные данные нормировали по количеству белка в пробе, который определяли с помощью коммерческой системы «iT Protein Assay Kits» фирмы Invitrogen, США, активность каспазы-3 выражали в пмоль/мин/мг белка.

иммуногистохимический методы.

Подготовка препаратов. Кусочки печени крыс фиксировали в 4% растворе параформальдегида в фосфатном буфере (рH 7,2-7,4) в течение 48 ч. Проводку, заливку в парафин и приготовление парафиновых блоков выполняли по стандартной методике [15, 24, 30]. Из каждого блока получали 10-12 серийных срезов толщиной 4 мкм и помещали их на стекла, обработанные поли-L-лизином (Menzel-Glaser®, 7626 мм). Подготовленные к окрашиванию микропрепараты (по 3-4 среза на стекло) использовали в гистологических и иммуногистохимических исследованиях.

гематоксилином и эозином по [30]. Гистологические исследования включали выявление клеток с начальными признаками апоптотического распада ядра (конденсация хроматина, инвагинации (вдавления) ядерной мембраны, фрагментация ядра) и свободно лежащих апоптозных телец (рис. 2). Расчета индекс апоптоза (ИА) проводили по формуле (стр. 43). На основании результатов гистологических исследований, отбирали препараты для иммуногистохимических исследований с ИА 1,5.

Для иммуногистохимического исследования методом двойных антител с иммунопероксидазной (стрептовидин-биотиновой) меткой применяли моноклональные антитела: Bcl-2 (кат. № ab7973), Bax (кат. № ab7977), р53 (кат. № ab4060) фирмы Abcam, Великобритания.

иммунопероксидазной (стрептовидин-биотиновой) меткой включает проведение депарафинизации и гидратирования срезов, ингибирования эндогенной (неспецифической) сывороткой и первичными антителами, визуализации результатов реакции. В качестве первичных антител применяли моноклональные антитела: Bcl-2 (кат. № ab7973), Bax (кат. № ab7977), р53 (кат. № ab4060) фирмы Abcam, Великобритания.

Микропрепараты депарафинировали в двух сменах ксилола, смеси ксилола и абсолютного этанола (1:1), с последующей гидратацией срезов в батарее спиртов нисходящей концентрации (95%, 70%, 50%) по 3 мин в каждом и промыванием срезов в дистиллированной воде (5 мин). Микропрепараты в течение 10 мин обрабатывали раствором «Hydrogen Peroxide Block» (кат. № ab64264), блокирующим эндогенную пероксидазу, с целью уменьшения фона и снижения неспецифического окрашивания. Демаскировку антигенов проводили в водяной бане буфером «10x Citrate Buffer» pH 6.0 (кат. № ab64214) в разведении 1:10 в дистиллированной воде при температуре 95° С в течении 30 мин.

Для предотвращения неспецифического фонового окрашивания за счет связывания первичных антител с компонентами ткани микропрепараты обрабатывали нормальной (неспецифической) сывороткой «Protein Block» (кат. № ab64264) в течение 5 мин при комнатной температуре. Далее срезы обрабатывали первичными антителами. Для разведения всех первичных антител использовали буфер «Antibody Diluent» (кат. № ab64211) в соотношении 1:100. Обработанные микропрепараты оставляли на ночь во влажной камере при температуре 4°C.

Визуализация результатов иммуногистохимической реакции включала обработку срезов вторыми (биотилинированными) антителами «Anti-Mouse & Rabbit» (кат. № ab64264) и инкубацию с конъюгатом стрептавидин-биотинилированной пероксидазы «Streptavidin Peroxidase» (кат. № ab64264) в течение 10 мин с последующей окраской хромогеном «DAB Chromogen» (кат. № ab64264). В качестве дополнительного красителя использовали гематоксилин Майера. Готовые микропрепараты заключали в среду «Mounting Medium» (кат. № ab64230) (рис. 2).

иммуногистохимических микропрепаратов проводили с помощью микроскопа Zeiss AxioImager Z1 в проходящем свете при увеличении 400, программное обеспечение Zeiss AxioImager Version 4.7. С каждого препарата анализировали не менее клеток. Содержание белков определяли как число окрашенных клеток деленное на 1000 клеток и умноженное на 100%.

Рисунок 2. Срезы печени крыс (увеличении 400):

a-Окраска uемотоксилином и ‘озином (стрелкой указано апоптозное тельце), b-Иммуногистохимическая реакция на белок p53, b-Иммуногистохимическая реакция на белок Bcl-2, b-Иммуногистохимическая реакция на белок Bax.

2.5. Гель-электрофореза изолированных клеток «ДНК-комет»

Для оценки степени фрагментации ДНК и расчета индекса апоптоза был использован метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (ДНКкомет) [11, 136]. Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель: в постоянном электрическом поле ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода состоит из следующих этапов: выделения клеток, получения гель-слайдов (подложки), получения микропрепаратов, лизиса, щелочной денатурации, электрофореза, фиксации, окрашивания и микроскопического анализа.

Получение микропрепаратов. Клетки выделяли методом механической дезагрегации тканей, для этого 150-200 мг ткани измельчали на льду, переносили в стеклянные пробирки, содержащие буфер для суспензии клеток (0,1 М ФСБ, раздавливали стеклянной палочкой в свежем буфере. Гель-слайды получали путем нанесения 1%-го агарозного геля (агароза, тип 4, tпл. 60 С) на стандартные предметные стекла (Menzel-Glaser®, 7626 мм). Для подготовки микропрепаратов 60 мкл клеточной суспензии переносили в микроцентрифужные пробирки, содержащие 240 мкл 1%-ого агарозного геля (агароза, тип 1, tпл. 42 С), тщательно перемешивали, наносили на гель-слайды при температуре 42 С и оставляли на мин при 4 С на льду. После затвердевания геля микропрепараты подвергали лизису в буфере (2,5 M NaСl, 100 мМ ЭДТА, 10мМ Трис, 0,14 М ДМСО, 1% Тритон Х-100, рН 10) в течение 1 ч при температуре 4 С, в процессе которого происходила диссоциация клеточных структур и выпетливание хроматина в поры агарозы. Далее микропрепараты обрабатывали щелочным денатурирующим буфером (1 мМ ЭДТА, 300 мМ NаОН, рН 13) в течении 20 мин при температуре 4 С, реализирующим щелочно-лабильные сайты в ДНК в однонитевые разрывы. Для электрофореза также использовали щелочной денатурирующий буфер, электрофорез проводили в электрофорезной камере (Bio-Rad 192) в течение 40 мин (4 С, напряжение 32 В, сила тока 300 мА). Под влиянием электрического поля, ДНК (в виде фрагментов и петель сверхполимерных молекул) мигрирует к аноду, формируя хвост кометы, ядром которой является полость, заполненная ДНК. После завершения электрофореза слайды фиксировали в 70% растворе этанола.

Микроскопический анализ проводили на микроскопе Zeiss Axio Imager Z при увеличении 400х. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system, «Metasystems GmbH» (рис. 3). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте).

Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы >30%.

С каждого микропрепарата анализировали не менее 200 клеток и рассчитывали индекс апоптоза (ИА) по формуле:

где А+ – количество апоптоз-положительных клеток.

Рисунок 3. Клетки печени крысы с различной степенью поврежденности ДНК.

a-клетка без повреждений (до 1% поврежденной ДНК), b-клетка с некоторыми повреждениями (до 10% поврежденной ДНК ), c-клетка со значительными повреждениями (до 30% поврежденной d-апоптоз-положительная клетка (более 30% поврежденной ДНК).

2.6. Статистическая обработка результатов исследований Обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета программ прикладного статистического анализа StatSoft STATISTICA 8.0. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью 2-критерия.

Проверка гипотезы о равенстве дисперсий проводилась с помощью критерия Левена. Вычисляли среднее значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (m). Данные представлены как M±m.

Сравнение количественных признаков двух независимых выборок, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий критерия ANOVA. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0, [26].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительная характеристика методов определения активности апоптоза у крыс на экспериментальных моделях токсического воздействия 3.1.1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона Изучены изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза – содержание белков Bcl-2, Bax и p53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.

После введения АКТГ у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо патологических проявлений. На вскрытии также не было выявлено каких-либо макроскопических изменений внутренних органов, массы внутренних органов крыс контрольной и опытных групп не имели статистически значимых различий на всех сроках отбора материала (табл. 10).

Результаты исследований уровня апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг представлены в табл. 11-13.

Как видно из табл. 11, после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг, содержание белков Bcl-2, Bax и p53 в печени крыс опытной группы не отличалось от контрольных значений на всех сроках отбора материала.

Через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг отмечено повышение