нанострукутрированных средах, в том числе внутри мицелл и липосом [7-9], в среде обратных мицелл [10, 11], в пористом стекле [12]. Теоретическое описание безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения в дистанционной зависимости скорости аннигиляции при расчёте кинетики реакции. Важность учёта наноструктуры при расчёте безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения также была доказана в работах [14, 15]. Где показаны изменения кинетики люминесценции компонент зависимость интенсивности замедленной флуоресценции в полидисперсной пористой наноструктуре от структурных параметров (среднего размера пор и величины дисперсии распределения радиусов пор) [15].

различных белков на безызлучательный перенос энергии, например, макромолекулы ДНК [16, 17], альбумина сыворотки человека [18].

экспериментально регистрировались, но и были теоретически описаны, например, в работе [19] произведено описание изменений кинетики переноса энергии между молекулами зонда, сорбированными на стохастически колеблющейся в жидкости полимерной цепи.

Обменно-резонансный перенос энергии.

Теория Фёрстера хорошо описывает перенос энергии электронных возбуждений на расстояниях порядка фёрстеровского радиуса, то есть 20-. Но в некоторых случаях, в том числе при необходимости исследовать меньшие расстояния начинает давать расхождения с экспериментом. В этом случае для описания процессов передачи энергии между фотоактивными центрами необходимо использование другой теории. Существуют различные способы выхода за теорию Фёрстера, но одним из наиболее эффективных оказалась теория переноса энергии электронного возбуждения по обменному механизму. Она была предложена ещё в 1953 году Д. Декстером [20], именно как расширение резонансной теории Фёрстера. Существенное отличие теории Декстера состоит в том, что перенос энергии электронного возбуждения в этом случае происходит не из-за диполь-дипольного взаимодействия донор-акцепторной пары (ДА-пары) (по индуктивнорезонансному механизму), а из-за перекрытия их электронных оболочек (по обменно-резонансному механизму). В дальнейшем было показано, что в случае близко расположенных хромофоров теория Фёрстера даёт ошибочные данные для скорости передачи энергии электронного возбуждения, иногда на два порядка превышающие наблюдаемую [21-24].

Методы регистрации сигналов бинарного зонда и последующий их анализ Для анализа происходящих в исследуемом образце фотопроцессов необходимо регистрировать какие-либо выходные характеристики этого процесса, такие как, анизотропия, время жизни, интенсивность люминесценции донора (акцептора).

Для переноса энергии электронного возбуждения независимо от механизма переноса характерным является снижение интенсивности свечения и сокращение времени жизни донора при одновременном увеличении интенсивности акцептора, если акцептор флуоресцентный.

Таким образом, измерение каждого события может предоставить прямые доказательства передачи энергии, которая, в свою очередь, свидетельствует о пространственных отношениях флуорофоров. Эффективность передачи энергии определяется как доля энергии возбуждения, которое передается от донора к акцептору [25, 26].

Наиболее прямой метод, используемый для измерений переноса энергии, является регистрация изменений люминесцентных характеристик донора (спектра или времени жизни) в присутствии и в отсутствии акцетпора. Чаще всего используется измерение не интенсивности люминесценции донора, а именно время жизни возбуждённого состояния.

Такой метод считается одним из наиболее точных для определения эффективности донор-акцепторного переноса, поскольку позволяет избежать искажений, вносимых фоновой люминесценцией и концентрационными различиями [27-30]. Особенно ценными данные свойства оказываются в случае применения микроскопии для исследований живых клеток, потому что проконтролировать концентрацию флуорофора в клетке практически не возможно [31, 32].

люминесценции донора и акцептора, когда затруднительно разделение их спектров, удобно использование спектральной информация пары. С помощью спектральных изображений производится одновременная фиксация спеткральных характеристик излучений донора и акцептора [33], из которой можно выделить не только информацию об эффективности переноса, но и другие параметры, как, например, концентрация доноров и акцепторов в исследуемом образце. Чаще же в таком случае используется одновременно измерение и спектральных и временных люминесцентных характеристик ДАпары, несущее в себе большую информативность [34].

Возбуждение акцептора происходит не путём поглощения фотона флуоресценция акцептора зависит не от характеристик возбуждающего излучения, а от люминесцентных характеристик донора. Исследования систем с помощью регистрации времени жизни флуоресценции акцептора становятся всё более популярными [31, 32, 35-39].

Измерение интенсивности люминесценции акцептора не просто даёт информацию о наличии переноса или его отсутствии, но и позволяет вычислить эффективность донор-акцепторного переноса. Для этого необходим запрет прямого возбуждения акцептора, либо его учёт при анализе люминесцентных сигналов. Тем не менее применение метода измерения интенсивности люминесценции акцептора активно применяется, например, при измерении характеристик FRET в одно-молекулярных исследованиях [40], в исследованиях жидкостей в кювете [41], в флуоресцентной микроскопии [31, 32].

Оценка эффективности переноса энергии осуществляется также по изменению анизотропии люминесценции донор-акцепторной пары по отношению к излучению чистого донора [42]. Также по остаточной анизотропии можно оценить структурные параметры среды [43].

Ещё одним методом для определения характеристик ДА-переноса является метод фотообесцвечивания акцептора [44, 45]. Техническое преимущество этого метода – отсутствие необходимости в калибровке, которая обязательна при регистрации прочих параметров.

Правильный подбор метода измерения характеристик процессов с участием электрон-возбуждённых молекул одно из необходимых условий для проведения успешных измерений. Однако, немаловажным фактором для экспериментальных исследований является правильный подбор Д-А-пары, который должен осуществляться непосредственно для конкретного эксперимента, учитывая все его особенности. Обязательным условием является наличие хорошего спектрального перекрытия спектра поглощения акцептора со спектром излучения донора (рис. 1.3.), а также отсутствие (или наличие минимального) поглощения акцептора на длине волны возбуждения донора именно в исследуемой среде (смена среды может значительно влиять на спектры молекул). Необходимость регистрации спектра люминесценции донора накладывает ограничения на выбор акцептора, в частности его спектр люминесценции. В этом случае акцептор должен быть не флуоресцирующим, либо его спектр излучения максимально «разведён» со спектром характеристик донора. Кроме того, в зависимости от поставленной исследовательской задачи может возникать необходимость, чтобы молекулы донора и акцептора располагались в определённом месте структурированной среды, например, внутри поры, вблизи наночастицы, в определённой области внутри клетки или связывались определённым образом с выделенными белками. Для биологических применений чаще всего используют аминреактивные красители. Очень распространены они для приготовления различных конъюгатов для иммунохимии, гистохимии, отслеживания гибридизации по флуоресценции (fluorescence in situ hybridization - FISH) и других биологических приложений. Их популярность для биологических исследований, в том числе и в живых клетках, обусловлена лёгкостью введения в большом количестве аминогрупп в клетки, и их закреплению на определённых клеточных структурах внутри [46-48]. Также для биологических приеменеий, в основном для исследования структуры и функции белков, используют красители, содержащие тиоловую группу [49, 50]. Одними из необходимых требований, предъявляемых к флуорофорам для биологических применений, являются высокий квантовый выход люминесценции и инертность к участию в естественной биологической активности.

Кроме указанных хромофоров для биоисследовний часто применяются также флуоресцентные белки: GFP (green fluorescent protein) [51], CFP (cyan fluorescent protein) [52, 53], YFP (yellow fluorescent protein) [52, 53], RFP (red fluorescent protein) [54]. Такие белки по своей природе в биологических средах хорошо себя проявляют, не токсичностью и свойствами закрепления [55-57]. Но, в то же время, белки такого рода обладают и значительными Рис. 1.4. Спектры поглощения и люминесценции различных КТ, c) фотография, отображающая проводилось на длине волны 365 нм d) сравнение размеров КТ с макромолекулой MBP (maltose binding proteins – связывающий мальтозу белок) яркость, светостойкость и коэффициент поглощения, а также удобный для возбуждения спектр поглощения и узкий спектр люминесценции [59, 60].

люминесцентных красителей со спектрами КТ различных размеров показаны на рис.1.4. а) и b).

Не смотря на относительно большие размеры ~ 60 (рис. 1.4. d)) КТ активно используются как доноры в FRET [61-63]. Их популярность в данном качестве обусловлена их широкими спектрами поглощения, что позволяет подобрать длину волны возбуждения таким образом, чтобы свести к минимуму прямое возбуждение акцептора. Также узкий спектр излучения, плавно изменяющийся с размером и составом композита [59], позволяет подобрать КТ (наглядное изменение люминесценции растворов с изменением размеров КТ показано на рис. 1.4. с)), максимально оптимизируя интеграл перекрытия. Кроме того, большую площадь поверхности КТ можно использовать для оптимизации эффективности переноса, размещая вблизи одного донора (КТ) несколько акцепторов.

Как в случае обычных органических красителей, так и в случае КТ в зависимости от расстояний и условий протекания перенос энергии с донора на акцептор может происходить по диполь-дипольному и обменному механизму, которые могут быть конкурирующими. Например, в работе [64] показано, что между КТ CdTe и дигидрохлоридом мезо-тетрапорфирина перенос энергии происходит преимущественно по обменному механизму, так как экспериментальная кинетика затухания люминесценции КТ-донора в присутствие акцептора хорошо согласуется с выражением, выведенным в теории Декстера.

Но на этом популярность КТ не ограничивается, не смотря на широкую полосу поглощения их эффективно используют и в качестве акцепторов энергии [65-67]. Возможность выбора донора, правда, в этом случае ограничивается некоторыми специальными классами: лантаноиды [68], химические люминофоры [69] и биолюминесцентные белки [70]. Основным преимуществом в данном случае является широкий спектр поглощения КТ, благодаря чему получается большой интеграл перекрытия. Кроме того, увеличению вероятности переноса энергии способствуют и большие размеры КТ, позволяющие расположить Рис. 1.5. Схематическое изображение люминесцентного комплекса, состоящего из квантовой точки - акцептора и лантаноидов (Tb) – донора [75] комплексов лантанидов с КТ были опубликованы Хильдебрандтом с сотрудниками [75, 76]. За счёт составления такого люминесцентного комплекса, приведённого на рис. 1.5., авторы получили эффективную передачу энергии от Tb комплексов на КТ с чрезвычайно большим радиусом Ферстера – 81. Большое время жизни люминесценции Tb донора и высокий инструментом для проведения анализа биологических и биохимических взаимодействий.

В традиционных конфигурациях FRET пар органических красителей с КТ, последние представляют собой акцепторы низкого качества. Из-за своей инициирующим излучением вместе с донором. К тому же, КТ имеют время жизни возбуждённого состояния значительно большее, чем органические красители (более 10 нс, против менее 5 нс для большинства красителей). В результате этого, большая часть возбуждённых молекул красителей успевает вернуться в основное состояние, в то время, как КТ ещё остаются в возбуждённом [77]. Лантаноиды же, напротив, обладая значительно большим временем жизни (340-680 мкс комплекс Eu3+ и 1, 48 мс – Tb3+), приводят к тому, что КТ за это время успевают дезактивироваться в основное состояние и могут выступать в качестве акцептора [76].

Рис.1.6. Зависимость времяразрешённого сигнала люминесценции от формы и расстояния (подобно прочим донорразмера КТ [78] и форму самих КТ. Этот анализ проводится на основе времяразрешённых сигналов люминесценции, примером может служить рис. 1.6.

В то время как диапазон передачи энергии между донором и акцептором эффективно ограничивается 1,5 R0, чистое расстояние, на котором происходит передача энергии может быть увеличено за счёт использования нескольких последовательных шагов передачи энергии. Такие системы с каскадом передачи энергии называют FRET-трансляторами из-за выполнения, по крайней мере, одним красителем функции и донора и акцептора, то есть «точки-ретранслятора». Впервые о FRET-трансляторах было упомянуто в работе [81] об использовании КТ и FRET для биодатчиков.

FRET-ретрансляция была использована для увеличения эффективности передачи энергии между КТ-донором и Cy 3.5., из-за расположения которого передача энергии от КТ без промежуточно расположенного Cy 3ретранслятора не происходила вовсе, что показано на рис. 1.7.

Рис. 1.7. Схематическое изображение критического радиуса переноса энергии по механизму Фёрстера с фёрстеровским радиусом R0 = 48 [81] Такие FRET-трансляторы позволяют не только увеличивать расстояния передачи энергии, но и могут давать дополнительную информацию о конформационных состояниях, например ДНК [82, 83].

Кроме описанных линейных FRET трансляторов, позволяющих увеличить расстояние между конечными донором и акцептором, существует ещё один вид – концентрические FRET трансляторы. Обычно они представляют собой наличие нескольких флуорофоров вокруг центральной КТ [84-86]. Такой тип флуоресцентных комплексов в сочетании с «долго живущими» лантаноидами позволяет наблюдать передачу энергии во временно закрытой системе. Преимущества такого подхода состоят в следующем: устранение фоновой флуоресценции, мультиплексирование биодатчиков на основе спектральноразрешённого FRET без использования КТ нескольких цветов. В работе [86] была показана возможность использования концентрического FRET-транслятора для определения межфазного распределения пептидов в сборке с КТ.

Применение Высокая чувствительность переноса энергии электронного возбуждения к расстояниям и изменениям свойств среды позволяет широко использовать их в качестве «наноизмерителей», позволяющих измерять расстояния и проводить мониторинг структурных и конформационных изменений на наномасштабах. Определение параметров исследуемых образцов, как было описано выше, может осуществляться путём измерения спектральных или временных характеристик системы. После разработки теории Фёрстером [1, 2], первоначально задуманную для понимания эффективности фотосинтеза, были проведены пробные экспериментальные работы [4, 87], показавшие справедливость теории и возможность её применения для исследования биологических наноструктур в живой клетке.

FRET идеальный метод для определения молекулярного расстояния или обнаружения присутствуют ли молекулярные комплексы, эта техника все чаще занимает центральное место в биомедицинских науках [88, 89]. На этой основе появилось множество работ по применению FRET в биологии [90-97].

Использование FRET для определения конформации белков и взаимодействий в живых клетках достаточно распространено в различных живых организмах начиная от дрожжей [98], до животных [99, 100] и растений [101].

Чаще всего для измерений с помощью FRET дополнительно пользуются методами микроскопии. В частности в биологических исследованиях очень популярно использование микроскопии визуализации времени жизни, в англоязычной литературе – fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) [26, 102-104]. Этот метод представляет собой измерение среднего времени жизни флуоресценции хромофора в каждой пространственно-разрешимой точке изображения микроскопа.

Преимущество измерения FLIM-FRET состоит в том, что время жизни флуоресценции напрямую зависит от протекания реакции безызлучательной передачи энергии от донора к акцептору, но не зависит от длины светового пути и концентрации фотоактивных центров, что особенно ценно в биологии, так как контролировать количество молекул хромофора в клетке достаточно сложно. К тому же FLIM достаточно быстрая, чтобы сделать возможным измерения процессов, происходящих в живых клетках.

Эти свойства FRET FLIM были использованы для определения различных параметров, таких как рН [105], концентрация Са2+ [106], ассоциация молекул [107], непосредственно в живых клетках. Кроме того, с его помощью можно наблюдать за распределением определённых белков и рецепторов в клетке, а также за их участием в реакциях [108]. Кроме того, в последнее время FRET FLIM используют и для клинических исследований, таких как раннее выявление рака или других заболеваний и патологий, в частности молочной железы [109, 110], желудочно-кишечного тракта [111], рака кожи [112, 113].

Измерение времени жизни люминесценции очень удобный метод для исследований, но не менее распространён и метод определения параметров наносистемы по оценке эффективности безызлучательного переноса энергии по интенсивности люминесцентных сигналов донора и акцептора. Например, для определения взаимодействий [114], размещений белка в клетке [115] или взаимодействия белков [116].

Также для исследований используется флуоресцентная микроскопия спектрального изображения, который использует спектральный подход к количественной оценки изменений в акцепторной интенсивности на длинах внутриклеточной локализации белков и рецепторов [117], взаимодействия белков [118], кроме того для зондирования происходящих в клеточных системах или мембранах процессов [119].

увеличения разрешения сканирующего ближнепольного микроскопа, что впервые было предложено в работе [120]. В отличие от классического сканирующего микроскопа в случае использования FRET технологии пространственное разрешение микроскопа определяется не диаметром отверстия острия иглы, а радиусом Фёрстера, составляющим порядка 1-5 нм.

Такого рода микроскопия даёт изображение с большим разрешением [121, 122].

Ещё одним вариантом применения FRET является использование его в качестве датчика, сигнализирующего о наличии какого-либо процесса.

Например, в работе [123] по сигналу FRET определили открытие «коробки», состоящей из самоорганизующихся ДНК. Донор и акцептор закреплялись в Рис. 1.8. FRET мониторинг «наноразмерной коробки» с регулируемой крышкой, состоящей из самоорганизующихся ДНК [123].

из-за увеличения расстояния между донором и акцептором, что позволило Рис. 1.9. Мембран-ассоциированная тест система для апоптоза, основанная на наличии FRET и его прерывании 1.9.

исследования клеточных структур и улучшения характеристик микроскопа.

Его применение возможно и для бытовых приложений. Например, для зондирования жёсткости воды путём определения концентрации кальция и магния в воде [125].

Кроме того, с развитием высокоточных регистрационных приборов стало возможным новое интенсивно развивающееся направление – одно молекулярный FRET (single molecular - smFRET). Измерение обычного FRET даёт лишь усреднённый по всем донорам и акцепторам сигнал, из-за чего часть важной информации теряется при усреднении. В противовес этому использование одной пары донор-акцептор в smFRET позволяет проводить более тонкие измерения. Первые работы по применению smFRET были проведены ещё в 1999 году для регистрации конформационных изменений рибонуклеиновых кислот и рибонуклеиновых белков [126]. Развитие высокоточных методов регистрации люминесцентного сигнала сделало возможным использовать этот метод для регистрации изменений диффундирующих макромолекул непосредственно в жидких средах, наблюдать их сворачивание и денатурацию [127-131]. Также с помощью smFRET проводятся исследования внутри живых клеток, при этом сложность состоит в возможности их трёхмерного перемещения. Но в некоторых случаях ограниченность области исследования позволяет проводить изучение. Например, smFRET активно используется для исследования ядерных процессов [132, 133].

Также активно применяется возможность разрешения расстояний меньше традиционных оптимальных для FRET 10 нм за счёт использования FRET транслятора, состоящего из трёх хромофоров (тройной комплекс) и более, когда хотя бы один из них является и донором и акцептором [134, 135]. Или, напротив, для увеличения расстояния передачи энергии [81]. В том числе тройные комплексы применяются для диагностики компонент растворов [136-139]. А в работе [140] предлагается использование FRET трансляторов для улучшения характеристики солнечных элементов. Для построения солнечных элементов авторами просчитывается возможность использования сорбентов с полостями цилиндрической и сферической формы в сочетании с FRET трансляторами рис. 1.10.

Рис. 1.10. Геометрия цилиндрической (а) и сферической (б) поры диаметром 2RP.

Молекулы красителя-транслятора распределены по всему внутреннему объему поры, сенсибилизирующий краситель плотно покрывает стенки поры. (с) Расчетная эффективность передачи энергии в цилиндрической (пунктирная кривая) и сферической (сплошная линия) поре в отсутствие диффузии в зависимости от соотношения критического расстояния Rc передачи энергии в поре с диаметром 2RP В этой работе [140] также показано, что при правильном подборе красителей сенсибилизаторов и трансляторов FRET в порах можно добиться 90% увеличения эффективности поглощения падающего света, что для солнечных батарей с органическими элементами очень хороший показатель.

Рис. 1.11. (а) Схема анодированного алюминия, (b) SEM изображение сверху на правильное расположение нанопор в шаблоне анодированного алюминия (c) Схемы слой за слоем осаждения для сборки многослойных конструкций в каждой отдельной нанопоре-матрице [141] Кроме того, для создания комплексов трансляторов используются различные системы. В работе [141] предлагается с помощью послойного осаждения в порах анодированного алюминия (рис. 1.11.) и последующего их растворения создавать цилиндрические системы квантовых точек (рис. 1.12.).

Рис. 1.12. а) цилиндрическая сборка квантовых точек, b) спектры люминесценции гибридных многослойных структур: нижняя кривая – 5 двойных слоёв КТ, средняя – 10, верхняя - 15 c) спектры фотолюминесценции хромофора Cy5 после гибридизации ДНК от переноса энергии с многослойного зонда (1) и от прямого возбуждения (2) [141] Такая структура значительно увеличивает эффективность FRET, при этом происходит четырёхкратное усиление интенсивности люминесценции при линейном увеличении количества двойных слоёв КТ. Такую систему авторы предлага-ют использовать для выявления гибридизации ДНК, помеченной Cy 5. Из рис. 1.12. с) видно, что интенсивность люминес-ценции в комплексе с многослойной структурой КТ значительно выше. В то время как в отсутствие этой системы люминесценцию от Cy 5 при прямом возбуждении зарегистрировать довольно сложно.

Перенос энергии электронного возбуждения очень чувствительный процесс, который сильно зависит от свойств используемых хромофоров и окружающей среды. Изменение этих свойств приводит к значительным изменениям характеристик флуоресценции, таких как анизотропия, интенсивность, время жизни. Поэтому данный процесс активно используется биологических и постоянно совершенствуется.

1.2. Особенности процесса кросс-аннигиляции Т-центов с Молекулы атмосферного кислорода находятся в невозбуждённом возникновения процесса кросс-аннигиляции, сопровождающегося замедленной флуоресценцией, необходимо протекание двух бимолекулярных фотореакций с участием люминофора в электронно-возбужденном триплетном (Т) состоянии и молекулой кислорода [142-144]. Первая реакция протекает по схеме:

где S0, S1 - основное и первое возбужденное синглетные состояния люминофора; 3g – основное триплетное состояние молекулы O2. По своей сути данная реакция представляет собой процесс триплет-триплетного переноса, обнаруженный ещё А.Н. Терениным и В.Л. Ермолаевым в году [145].

Образование синглетного кислорода путём триплет-триплетного переноса энергии от молекулы красителя к молекуле О2 было описано в работах [146, 147]. В ходе протекания этого процесса возникают электронновозбужденные 1g -состояния молекул O2, которые часто коротко называют «синглетным кислородом» (основное состояние молекул O2 - триплетное).

Люминесценция синглетного кислорода малоинтенсивна (квантовый выход q~0,010,1), и приходится на инфракрасную область спектра ( 1,27·10-6 м), что значительно осложняет ее измерение. Большая часть 1g -возбуждений дезактивируется по безызлучательному каналу. Однако часть g возбуждений O2 вступает во вторую реакцию с Т-центрами [142-144], избежавшими дезактивации:

Данная реакция сопровождается замедленной флуоресценцией (ЗФ) органического соединения (излучательный переход S1 S0) [142-144].

Впервые о наблюдении такого типа реакции сообщили Каутский и Мюллер в работе [148].

Кроме того, для некоторых систем, в том числе для группы фталоцианинов, характерным является другой тип взаимодействия, когда для высвечивания одного кванта ЗФ необходима реакция триплетного центра с двумя синглет-возбуждёнными молекулами кислорода [149, 150]. Впервые такую димольную реакцию Т-центров с молекулами кислорода в 1968 году описали Огризло и Пирсон [151].

Однако, в работе [152] напротив доказано прохождение реакции кроссаннигиляции именно одной молекулы кислорода с одним Т-центром по линейным зависимостям ЗФ, сенсибилизированной кислородом. Также о протекании реакции взаимодействия Т-центров с молекулами кислорода по типу Каутского-Мюллера говорится и в других работах [153, 154].

За счёт формирования особого неэйнштейновского блуждания молекул кислорода в наноструктурированных средах кинетика замедленной флуоресценции, сопровождающая процесс кросс-аннигиляции, будет чувствительной к геометрическим особенностям системы. Такая особенность процесса кросс-аннигиляции была исследована как экспериментально [155], так и теоретически [156].

Кроме наноструктурированности процесс кросс-аннигиляции Тцентров с кислородом чувствителен также и к другим факторам окружающей среды, например вязкости раствора или плёнки. По ЗФ, сопровождающей данный процесс, можно провести количественные оценки диффузии кислорода, например, в плёнках стеклообразных полимеров полистирола и полиметилметакрилата [157].

Зависимость ЗФ, сопровождающей кросс-аннигиляцию Т-центров с кислородом, от концентрации молекул О2 может быть использована для создания основанного на этом принципе датчика кислорода. Такого рода датчики молекулярного кислорода состоят из участвующих в процессе кроссаннигиляции с кислородом фотоактивных молекул, иммобилизованных на некоторой основе, как правило, пористой или наноструктурированной для увеличения площади взаимодействия.

отмечены в работах [158, 159]. В первой из них показывается, что использование в качестве регистрируемого сигнала ЗФ, для измерения концентрации кислорода обеспечивает увеличение интенсивности полезного сигнала в люминесцентном датчике, при одновременном сохранении высокой чувствительности сенсора к содержанию кислорода в среде. Во второй отмечается возможность мониторинга за концентрацией кислорода как в основном триплетном, так и в возбуждённом синглетном состоянии в том числе и в естественных условиях, что позволяет применять датчик на основе ЗФ для исследования биологических систем.

Создание датчика кислорода на основе анализа сигналов ЗФ, сопровождающих процесс кросс-аннигиляции, предлагается также и в ряде других работ [160, 161]. В них предлагаются как модификация фотоактивных концентрации кислорода, температуре и жёсткости полимерной среды [160], так и создание новых наноструктурированных материалов, например, тетрафенилпорфирином [161].

Кроме того, сигнал ЗФ, сопровождающий процесс кросс-аннигиляции Тцентров с молекулами кислорода, можно применять не только для мониторинга непосредственно концентрации кислорода в системе, но и для визуализации как пространственного распределения молекул фотоактивных центров,так и миграции молекул кислорода, например, внутри и снаружи нановолокон из полистирола [162]. В этой работе в качестве основных преимуществ такого метода отмечаются: возможность исследования тетрафенилпорфирина (ТРР) без дополнительного добавления каких-либо зондов; одновременная визуализация молекул кислорода в синглетном состоянии как внутри нановолокон так и снаружи; пространственный мониторинг фотофизических процессов.

Однако, из-за высокой чувствительности сенсибилизированной концентрации кислорода в наше время популярен другой оптический метод, основанный на тушении люминесценции (dynamic fluorescence quenching) красителя молекулами кислорода. Это явление было открыто ещё в 1935 г.

Каутским и Хиршем [163], но интенсивное развитие получило после создания новых люминофоров, а также измерительной техники и источников возбуждения. Такую популярность данному методу измерения концентрации кислорода обеспечило использование в качестве хромофоров рутениевых [164-166] и платиновых комплексов [167-169], а также КТ [170, 171].

Отличает данные комплексы от органических красителей [172-174] высокий квантовый выход люминесценции, низкий уровень фотохимической деградации и высокая эффективность [175]. Однако, основным минусом таких датчиков можно считать непрозрачность происходящих там процессов переноса энергии и невозможность их математического описания и предсказания результатов работы датчика.

1.3. Изменения в протекании безызлучательного переноса энергии в присутствии металлической поверхности Металлические наночастицы, особенно благородных металлов, обладают рядом уникальных свойств, как колометрическических и проводниковых, так и нелинейных оптических. Эти свойства представляют возможным создание на их основе разнообразных датчиков в том числе и оптических [176]. Наибольшее распространение получили исследования FRET вблизи сферических наночастиц золота и серебра. Это связано прежде всего с относительной простотой их синтеза [177, 178], в том числе и непосредственно внутри биологических объектов [179], и возможностью стабилизации, кроме того в отличие от прочих металлов, например, железа Ag и Au наночастицы не окисляются на воздухе. Кроме того эти наночастицы обладают уникальными оптическими свойствами, которые к тому же сильно зависят от их размера и формы, что даёт дополнительную возможность управления фотопроцессами. Распространённость их использования в биологии и медицине обусловлена их свойствами связывания с традиционными биомолекулами, такими как антитела, нуклеиновые кислоты, рецепторы, антигены и пр. При этом наночастицы возможно наблюдать в сканирующий ближнепольный микроскоп. А в случае использования сканирующего ближнепольного микроскопа, основанного на принципе FRET металлические наночастицы могут выступать в качестве дополнительного фактора усиливающего сигнал, либо увеличивающего контрастность изображения.

Возможность влияния металлических поверхностей и наночастиц на радиационные переходы в фотоактивных молекулах, а также на процесс переноса энергии обуславливаются возможностью возникновения в металле плазмонных колебаний. Плазмонные свойства металлических наночастиц обусловлены, прежде всего, их формой, размером и составом.

Расстояния, на которых FRET протекает эффективно, ограничены