ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ

МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ К.И. СКРЯБИНА»

На правах рукописи

ЕПИШИНА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

Совершенствование способов повышения воспроизводительных качеств свиней и овец 06.02.07 - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор с.-х. наук, член-корреспондент РАСХН, профессор В.Д. Кабанов Москва - Список сокращений АЛТ – аланинаминотрансфераза АОА – антиоксидантная активность АОС – антиоксидантный статус АОФ – антиоксидантный фермент АСТ – аспартатаминотрансфераза АТФ – аденозинтрифосфат БАТ – биологически активные точки БАВ – биологически активные вещества ГЖУК–глицерино-желточно-углеводно-комплексонатно-трис-буферная среда ГПО – глутатионпероксидаза ГР – глутатионредуктаза ГЦ – глюкозо-цитратная среда ГЦЖ – глюкозо-цитатно-желточная среда ГХЦ – глюкозо-хелато-цитратная среда ГХЦС – глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная среда ГЦХЖ – глюкозо-цитратно-хелато-желточная среда ДНК – дизоксирибонуклеиновая кислота ЛДГ - лактатдегидрогеназа ЛГ – лактозо-глицериновая среда ЛГЖ – лактозо-глицерино-желточная среда ОГСБ-2М – оттаиватель глубокозамороженной спермы баранов в гранулах ОГСБВ - оттаиватель глубокозамороженной спермы баранов водный ПОЛ – пероксидное окисление липидов СЖК – сыворотка жиребых кабыл СОД – супероксиддисмутаза СРО - свободнорадикальное окисление ТБК – тиобарбитуровая кислота ТХУ – трихлоруксусная кислота ХГ – хориогонин ХЛ - хемилюминесценция ЩФ – щелочная фосфотаза ЭДТА – этилендиамиттетрауксусная кислота Sa – абсолютный показатель живучести SH – сульфгидрильные группы

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….. 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.……………………………………………………....

1.1.ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ

ПРИ ОХЛАЖДЕНИИ И ЗАМОРАЖИВАНИИ.……………………………………………… 1.1.1. Механизмы криоповреждения сперматозоидов в процессе их охложнения до плюсовых температур и глубокого замораживания………..… 1.1.2. Современные методы хранения спермы животных в глубокозамороженном состоянии…….………………………………………..... 1.1.3. Хранение спермы хряков и баранов охлаждённой до плюсовых температур…...…………………………………………………..… 1.1.4. Физические способы обработки спермы.………………………………… 1.1.5. Режимы замораживания и оттаивания спермы.…………………………..

1.2. ЭФФЕКТИВНОСТЬ СТИМУЛЯЦИИ И СИНХРОНИЗАЦИИ ЭСТРУСА

У СВИНЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ..…….………………... 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.…...…………………… 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…...…………………………………...

3.1. ИЗУЧЕНИЕ ВИДОВЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ИЗМЕНЕНИЯ

МЕТАБОЛИЗМА ГАМЕТ ХРЯКОВ И БАРАНОВ

ПРИ ХРАНЕНИИ IN VITRO………………………………………………………………… 3.1.1. Сравнительные биохимические исследования семенной плазмы нативной и разбавленной спермы хряков и баранов сохраняемой в охлажденном состоянии………………………………………………………….. 3.1.2. Влияние температурных режимов хранения на уровень содержания продуктов пероксидного окисления липидов в сперме хряков и баранов.………………

3.1.3 Исследование активности антиоксидантных ферментов в семенной плазме нативной и разбавленной сперме хряков и баранов при хранении в охлажденном состоянии.…………………...……………………..

3.2. ИЗУЧЕНИЕ ЗАЩИТНОГО ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ

В СОСТАВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ СРЕД ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ

СПЕРМЫ ХРЯКОВ В ОХЛАЖДЕННОМ СОСТОЯНИИ………………………….....…... 3.2.1. Выяснение защитного действия натуральных и синтетических антиоксидантов в составе разбавителей для спермы хряков…………………. 3.2.1.1. Влияние новых синтетических жирорастворимых фенольных антиоксидантов ИХФГАН на хранение спермы хряков в охлаждённом состоянии……………………………………………………………………….... 3.2.1.2. Изучение влияния этилового спирта в составе ГХЦС среды на живучесть и фертильность сперматозоидов в охлажденной сперме хряков………………………….……………………………………….... 3.2.1.3. Изучение влияния сукцината хитозана на живучесть сперматозоидов в охлажденной сперме хряков…………………………………………………………...……………...… 3.2.1.4. Влияние препаратов селена на живучесть сперматозоидов хряков сохраняемых при температуре 40С и 170С.…….………………..….. 3.2.1.5. Изучение влияния гиалуроновой кислоты на криоустойчивость спермы хряков.……………………………………………... 3.2.1.6. Эффективность использования бычьего сывороточного альбумина и восстановленного глутатиона в составе ГХЦС среды для длительного хранения спермы хряков при температуре 170С…………...

3.3. ИЗУЧЕНИЕ ЗАЩИТНОГО ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ

В СОСТАВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ СРЕД ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ

СПЕРМЫ БАРАНОВ……………………………………………………….………………… 3.3.1. Действие синтетических и натуральных антиоксидантов на сперму баранов.……………………………………………………………… 3.3.1.1. Влияние синтетических жирорастворимых фенольных антиоксидантов ИХФГАН на криорезистентность и фертильность спермы баранов …………………………………………………………………. 3.3.1.2. Антиоксидантная активность препарата ИХФГАН-3.………………. 3.3.1.3. Влияние солей янтарной кислоты на биологическую полноценность криоконсервированной спермы баранов….…...…………….. 3.3.1.4. Изучение защитного действия сукцинита хитозана на хранение спермы баранов в охлажденном и глубокозамороженном состоянии.…………………………………………….. 3.3.2. Исследование защитного действия на сперму баранов биологически активных веществ и других криопротекторов……………….. 3.3.2.1 Влияние гиалуроновой кислоты на криоустойчивость спермы баранов.…………………………………………………………………. 3.3.2.2 Изучение криопротективного действия костного клея в составе среды для замораживания спермы баранов….………………..….….. 3.3.2.3 Влияние этиленгликоля на криоустойчивость спермы баранов.……. 3.3.2.4 Криопротективная активность полиэтиленгликолей с разной молекулярной массой.………………………………………………… 3.3.2.5 Защитное действие различных эфиров глицерина при глубоком замораживании спермы баранов………….……………………. 3.3.2.6 Способ повышения оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы баранов с применением препарата ФЛПГ.………………………………………..……………………….

3.4 ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ И ФЕРТИЛЬНОСТЬ СПЕРМЫ

БАРАНОВ И ХРЯКОВ.…………………………………………………………….. 3.4.1. Влияние лазерного излучения на биологическую полноценность и оплодотворяющую способность спермы баранов сохраняемой при 40С...………………..…….…………………………………. 3.4.2. Влияние лазерного излучения на биологическую полноценность спермы баранов сохраняемой при температуре 160С…..…..……………………………..…….. 3.4.3. Изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на абсолютный показатель живучести сперматозоидов в охлажденной до температуры 170С сперме хряков………………………….

3.5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОТТАИВАНИЯ СПЕРМЫ БАРАНОВ

В МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЭЛЕКТРО- И ГИДРООТТАИВАТЕЛЯХ…..………….. 3.5.1. Эффективность оттаивания спермы баранов в модифицированном электрооттаивателе ОГСБ-2М………………….……….. 3.4.2. Результативность оттаивания спермы баранов в гидрооттаивателях ОГСБВ с различной модификацией.....…………..….........

3.6. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ И

БИОЛОГИЧЕСКИХ СПОСОБОВ СТИМУЛЯЦИИ ЭСТРУСА У СВИНЕЙ..….…..….. 3.6.1. Эффективность электропунктурной стимуляции эструса у свиноматок с применением аппарата «ДЭНАС»………………..…. 3.6.2. Влияние электростимуляции биологически активных точек аппаратом «ДЭНАС» на индуцирование эструса у ремонтных свинок.……………………………………

3.6.3. Стимуляция эструса у свиноматок с применением однократной внутримышечной инъекции синтетического антиоксиданта амбиола...…………….…………………………………………………………... 3.6.4. Влияние однократной инъекции препарата амбиола на стимуляцию половой доминанты у ремонтных свинок...….…………….... 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.…………………………...……………..... ВЫВОДЫ.……...…………………………………………………….…………... ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.…………………………..……………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………..……………….………..…………..……….. ПРИЛОЖЕНИЯ...………………………………………………………………...

ВВЕДЕНИЕ

наиболее актуальных является повышение эффективности воспроизводства стада путем максимального использования высокоценных племенных производителей, что имеет большое значение для обеспечения дальнейшего прогресса в животноводстве. Важное направление улучшения репродукции – применение метода искусственного осеменения. Одним из определяющих совершенствование методов хранения спермы животных в охлажденном или глубокозамороженном состоянии.

При технологической обработке спермы, разбавлении ее синтетическими средами и хранении в охлажденном или глубокозамороженном состоянии происходят значительные структурные и биологические повреждения плазматических мембран и выхода из сперматозоидов ряда ферментов и других компонентов клеточного метаболизма, что значительно снижает фертильность спермы (Курбатов А.Д., Платов Е.М., и др., 1988; Ерохин А.С., 1995;1996; Шапиев И.Ш., 1998; Нарижный А.Г. и др. 1995; 2005). В качестве нашей рабочей гипотезы служило предположение, что степень выхода ферментов из сперматозоидов зависит от вида животных, локализации фермента и прочности связывания его со структурами сперматозоида, состава используемой среды, режимов хранения и др. Поэтому выяснение состояния аминокислотно-белкового, углеводного, липидного и липопротеидного обмена, системы ферментативной антиоксидантной защиты, развитие биологической полноценности сперматозоидов при краткосрочном и долговременном хранении спермопродукции. Решению этой важной проблемы могут послужить сравнительные исследования межвидовых особенностей термодинамические процессы, а, следовательно, на формирование защитных реакций и адаптационных свойств при хранении вне организма.

В этой связи представляется перспективным разработать по результатам биохимических исследований более эффективные синтетические среды для краткосрочного и долговременного хранения спермы хряков и баранов с применением антиоксидантов, биологически активных веществ и других криопротекторов.

Приобретает большое значение применение физических способов обработки спермы, в частности, с использованием низкоинтенсивного лазерного излучения, и улучшение технологии оттаивания спермы баранов.

Актуальной и важной задачей является совершенствование методов повышения воспроизводительной способности свиноматок. В условиях промышленных технологий нередко отмечается замедление полового созревания свинок и задержка наступления эструса у свиноматок после очередного отъема поросят. Результативность осеменения и многоплодие маток в данных условиях тоже понижены.

Кроме того, в летнее время у большинства свиноматок наступает депрессия половой функции, что проявляется длительным анэструсом и снижением результативности осеменения животных. Это приводит к нарушению ритмичности циклов производства продукции в крупных свиноводческих комплексах. В этой связи, необходимы дальнейшие исследования по совершенствованию способов стимуляции эструса у основных свиноматок и ремонтных свинок.

Цель исследований: совершенствование методов краткосрочного и длительного хранения спермы хряков и баранов, повышение эффективности стимуляции эструса у свиноматок и разработка на этой основе результативных способов улучшения репродуктивных качеств свиней и овец.

Достижение поставленной цели осуществлялось путем решения следующих задач:

- изучить видовые особенности изменения активности ферментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы (АСТ, АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), содержания общего белка, альбумина, мочевины, триглицеридов, холестерина и системы ферментативной антиоксидантной защиты – супероксид-дисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и каталазы в семенной плазме нативной спермы хряков и баранов, а также влияние хранения разбавленной спермы на выход указанных высокомолекулярных биохимических соединений из сперматозоидов в семенную плазму;

- определить концентрацию продуктов пероксидного окисления липидов в нативной, а затем в разбавленной и сохраняемой при температуре 160С сперме сравниваемых видов животных, и в оттаянной после глубокого замораживания до -1960С сперме баранов;

- осуществить поиск и изучить влияние на сперму хряков и баранов новых синтетических и натуральных антиоксидантов, биологически активных веществ и других криопротекторов;

краткосрочного хранения спермы хряков, сохраняемой при температуре 16С;

сперматозоидов баранов при глубоком замораживании спермы;

- провести сравнительное исследование криопротективного влияния низкоинтенсивного излучения гелий-неонового и арсенид-галлиевого лазеров на биологическую полноценность сперматозоидов хряков и баранов;

модифицированных электрооттаивателе ОГСБ-2М и гидрооттаивателе ОГСБВ;

- выяснить эффективность стимуляции эструса у основных свиноматок и ремонтных свинок с помощью однократной электропунктуры биологически активных точек с применением аппарата «ДЭНАС», или однократной внутримышечной инъекции антиоксиданта амбиола.

Научная новизна исследований.

сравнительных исследованиях спермы хряков и баранов выявлены видовые особенности изменения метаболизма и защитных свойств гамет, сохраняемых in vitro при различных температурных режимах хранения во времени, выражающиеся в выходе окислительных и гидролитических ферментов и других компонентов клеточного метаболизма из сперматозоидов в семенную плазму, инициацией ПОЛ, и ингибированием ферментативной антиоксидантной активности (АОА).

Выявлено, что активность ферментов АСТ, АЛТ, ЩФ, СОД, ГПО, ГР и содержание общего белка, альбумина, мочевины, триглицеридов, холестерина в семенной плазме нативной спермы баранов выше, чем хряков, активность ЛДГ выше у хряков, чем у баранов. Хранение разбавленной спермы индуцирует выход из сперматозоидов в семенную плазму изученных ферментов и других компонентов клеточного метаболизма и усиливает пероксидное окисление липидов преимущественно в сперме баранов.

Замораживание-оттаивание спермы баранов приводит к более глубоким изменениям метаболизма сперматозоидов.

На основе полученных результатов биохимических исследований разработаны усовершенствованные синтетические среды для хранения спермы хряков, охлажденной до температуры 16-17С, и спермы баранов, сохраняемой при температуре -196С с применением антиоксидантов, биологически активных веществ и других криопротекторов.

В практику свиноводства внедрены новые синтетические среды для долговременного (до 5-ти суток) и краткосрочного хранения спермы хряков при температуре 16-170С (патент № 2370033).

В практику овцеводства внедрены новые усовершенствованные синтетические среды для глубокого замораживания спермы баранов (патенты:

№ 2048796, № 2083183, № 2323702, № 2198622) и на основании изучения оптимального режима оттаивания спермы баранов внедрены модифицированные электрооттаиватель ОГСВ-2М и гидрооттаиватель ОГСБВ.

Разработан новый способ повышения оплодотворяющей способности спермы баранов после глубокого ее замораживания с применением препарата ФЛПГ (патент № 2297197).

Выявлены видовые различия воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматозоиды хряков и баранов. При этом установлено, что обработка спермы сравниваемых видов животных оказывает защитное действие на биологическую полноценность спермы баранов и не оказывает влияния на сперму хряков, а действие арсенид-галлиевого лазера более эффективно по сравнению с гелий-неоновым лазером.

Разработан и внедрен в практику свиноводства способ стимуляции эструса у свиней, однократной электропунктурой биологически активных точек, с использованием нового электростимулятора «ДЭНАС» или однократной внутримышечной инъекцей синтетического антиоксиданта амбиола.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результаты на основе биохимических исследований по изучению антиоксидантного статуса гамет с избыточным образованием свободных радикалов и конечных метаболитов типа ТБК (тиобарбитуровая кислота) – реагирующих продуктов положены в основу разработки новых, более эффективных способов усовершенствования синтетических сред, повышающих криорезистентность, биологическую полноценность и совершенствовании методов разбавления и хранения спермы других видов животных. Экспериментальное использование полученных научных разработок будет способствовать дальнейшему развитию теории биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных на молекулярном уровне с учетом новых достижений в биохимии и генетике.

Усовершенствованные синтетические среды для долговре-менного и краткосрочного хранения спермы хряков при температуре 16-170С, и глубокого замораживания спермы баранов, сохраняемой при температуре С, способствуют повышению биологической полноценности и оплодотворяющей способности спермы.

Применение низкоинтенсивного лазерного излучения позволяет повысить результативность искусственного осеменения овец охлажденной спермой.

Улучшенная технология оттаивания замороженной спермы баранов в электро- и гидрооттаивателе оказывает положительное влияние на качество и фертильность спермы.

Однократная стимуляция половых функций свиноматок и ремонтных свинок электропунктурным методом с применением аппарата «ДЭНАС» или внутримышечной инъекцией антиоксиданта амбиола ускоряет наступление эструса и повышает результативность искусственного осеменения.

Широкое использование в зоотехнической практике выполненных в диссертации научных разработок и предложений производству будет способствовать решению важной научно-хозяйственной проблемы повышения биологической полноценности и оплодотворяющей способности спермы хряков и баранов, улучшению воспроизводительных качеств свиней и овец, сохранения и рационального использования генофонда племенных животных, повышению эффективности свиноводства и овцеводства.

Реализация результатов исследований. Материалы, полученные в данной работе, использованы при разработке научно-методических документов:

1. Наставление по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы барановпроизводителей. – Разработано во ВНИИплем (1992) в соответствии с решением Госагропрома, одобрено и рекомендовано в практику Ветеринарным фармакологическим советом ГУВ Госагропром.

2. Монография «Повышение репродуктивных качеств свиней и овец».Москва 2009 г.

3. Национальная технология искусственного осеменения овец – Одобрена и рекомендована в практику Ученым Советом ВНИИплем (2010) 4. Синтетические среды для длительного и краткосрочного хранения спермы хряков в охлажденном состоянии внедрены в хозяйствах Владимирской области и республики Мордовия.

5. Усовершенствованные среды для глубокого замораживания спермы баранов применяются в хозяйствах Саратовской области, республики Калмыкия, Ставропольского края и Горного Алтая.

6. Оттаиватель ОГСБ-2М для спермы баранов, замороженной в виде гранул, широко применяется в хозяйствах Саратовской области и республики Калмыкия.

7. Стимуляция эструса у свиней электропунктурным методом аппаратом «ДЭНАС» применяется в хозяйствах Владимирской области и республики Мордовия.

производственных испытаний и внедрений.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

- координационных совещаниях по воспроизводству овец на ВДНХ СССР и ВВЦ (1990-1995 г.г.); - совещании зооветспециалистов Хакасского племобъединения (1994); - конференции «Научнопроизводственные аспекты развития отрасли свиноводства», Бугульма (2000);

- 5-ой Европейской конференции по биологии размножения домашних животных, Вена (2001); - Международной научно-практической конференции « К 100-летию со дня рождения академика В.К.Милованова и профессора И.И.Соколовской», Дубровицы (2004); - Международной научнопрактической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы (2004); Международной научно-практической конференции по биологии размножения животных, ВИЖ, Дубровицы (2007);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных», ВИЖ, Дубровицы (2008); Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии в свиноводстве», Геленджик (2008); - межкафедральном заседании ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина» (2010).

Основные положения выносимые на защиту:

- результаты биохимических исследований видовых особенностей сперматозоидов хряков и баранов по активности ключевых ферментов и других компонентов клеточного метаболизма, изучение антиоксидантного статуса гамет при хранении спермопродукции;

- разработка и практическое применение усовершенствованных сред для краткосрочного и длительного хранения спермы хряков в охлажденном состоянии и при глубоком замораживании спермы баранов;

- физические способы повышения биологической полноценности спермы хряков и баранов, сохраняемой в охлажденном до плюсовых температур состоянии, с применением низкоинтенсивного излучения арсенид-галлиевого и галий-неонового лазеров, и установление оптимальной технологии оттаивания глубокозомороженной спермы баранов в электро – и гидрооттаивателях ОГСБ-2М и ОГСБВ;

- новые способы стимуляции половой доминанты у свиноматок и ремонтных свинок с применением однократной электропунктуры аппаратом «ДЭНАС» или однократного внутримышечного введения синтетического водорастворимого антиоксиданта амбиола.

Публикации получено 6 патентов на изобретение; опубликованы:

- монография «Повышение репродуктивных качеств свиней и овец» (2009); - статьи в журналах «Зоотехния», «Ветеринария», «Свиноводство», «Овцы, козы, шерстяное дело», «Сельскохозяйственная биология», «Доклады РАСХН», «Ветеринарная патология», «Ветеринария и кормление», в тематических сборниках Международных научно-практических конференций. Рекомендации по технологии замораживания спермы баранов включены в «Наставление по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов производителей» (1992), и «Национальная технология искусственного осеменения овец» (2010). Всего по теме диссертации опубликовано 60 работ, из которых 17 в центральных рецензируемых журналах ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 293 стр. машинописного текста и включает таблиц и 30 иллюстраций. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 467 источников, в том числе 166 на иностранных языках.

1.1 ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ

ОХЛАЖДЕНИИ И ЗАМОРАЖИВАНИИ

1.1.1 Механизмы криоповреждения сперматозоидов в процессе их охлаждения до плюсовых температур и глубокого замораживания невозможно без применения метода искусственного осеменения животных.

Метод глубокого замораживания спермы позволяет накапливать от одного производителя большой запас спермодоз и использовать, в основном, низкотемпературной консервации биологических объектов, и в частности, спермы различных животных, необходимо знание причин и механизмов криоповреждения клеток в процессе их охлаждения до плюсовых температур и замораживания - оттаивания.

Вопрос о том, какой фактор является главенствующим в механизме повреждения сперматозоидов при охлаждении и замораживании в настоящее время окончательно не выяснен (Лозино-Лозинский А.К., 1978; Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Цветков Ц.Д., 1984; Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988; Нарижный А.Г., Галич С.К., и др., 1994; Деряженцев В.И., Епишина Т.М., 2008; Епишина Т.М., 2009; Mazur P., 1977; 1987).

На основании изучения влияния физико-химических факторов, действующих в процессе охлаждения и замораживания на метаболизм и структуру биологических объектов, было сформулировано несколько теорий, объясняющих механизмы повреждения клеток при замораживании.

Механическая теория (Luyet B.I., 1940), объясняет гибель клеток при замораживании повреждением их мембран и протоплазмы образующимися кристаллами льда.

Липопротеидная теория (Lovelock I.E., 1959), связывает гибель клеток концентрированными растворами солей.

Теория минимального объема (Maryman H.T., 1977) объясняет причину низкотемпературного повреждения клеток тем, что при дегидратации может снижаться их минимальный объем и происходить денатурация мембран.

Согласно сульфгидрильной теории (Levitt J., 1962), причиной гибели клеток при замораживании является денатурация белков при их дегидратации, что может быть следствием образования дисульфидных связей при окислении SН-групп.

температуры вызывают очень большое многообразие биологических влияний на клетку, которые не могут быть объяснены какой-либо одной теорией (Осташко Ф.И., 1978; Кононов В.П., 1984; Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988; Watson P.F., Anderson W.J., 1983).

При криоконсервации клеток можно выделить два важных интервала температур, которые оказывают различное физико-химическое воздействие на клетки (Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Цветков Н.Д., 1984):

1-й - охватывает температуры от физиологических значений до градусов;

2-й - от 0 до -196 градусов и ниже.

Первый диапазон температур может вызывать повреждение клеток, в том числе и половых, через механизм термального шока. Например, при быстром охлаждении семени от 37 до 0 градусов наблюдается проявление термального шока (Милованов В.К., 1962; Осташко Ф.И., 1978), так называемого холодового удара.

Предложено несколько теорий, объясняющих причину термального шока при охлаждении спермиев (Милованов В.К., Соколовская И.И., 1959;

Платов Е.М., Ойвадис Р.Н., Сааб-Фарес А.С., 1976; Наук В.А., 1982;

Осташко Ф.И., 1978, 1988).

По теории В.К. Милованова и И.И.Соколовской (1959 г), необратимые изменения в семени при холодовом ударе происходят в результате затвердевания метаболически важных фосфолипидных компонентов клетки, в частности, плазмологена.

По мнению Ф.И. Осташко (1978; 1988), последствия температурного шока объясняются с позиций осмотических явлений. В процессе охлаждения спермы, в результате протекания метаболических процессов, половые клетки имеют более высокую температуру по сравнению с окружающей средой, биодеструктивным изменением клеточной мембраны.

Согласно теории Е.М.Платова (1973), при снижении температуры до 0°С, внутриклеточная вода в спермиях переходит в более упорядоченное состояние, что способствует конформационным изменениям белков и других макромолекул. А это может способствовать морфологическим изменениям в фибриллах и других клеточных структурах.

Большинство исследователей полагают, что термальный шок клетки состояние структурной лабилизации мембраны, возникающее в результате (Осташко Ф.И., 1978; Наук В.А., 1982; Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Цветков Ц.Д., 1984; Кононов В.П., 1982, Hackenbrock C.R., Hocxhli M., Chau R.M., 1976; Saacke R.G., Amann R.R., Marshall C.E., 1986).

В основе термального шока клетки лежит несколько мембранных механизмов, включающих фазовые переходы липидов и их разделение в плоскости бислоя. Авторы этой теории выделяют четыре этапа в данном процессе: первый - фазовые переходы из жидкокристаллического состояния в гелеобразное: второй- образование кластеров; третий - латеральное разделение; четвертый - обратимые или необратимые изменения в белках Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987; Платов Е.М. 1988; Cavin A.T., Buhr M.M., 1995; Holt W.V., Nort R.D., 2002; Wolf D.E., et.al., 2003).

сопровождающиеся изменением ее структуры.

Существуют сведения о том, что фазовые переходы виценальной воды Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987; Платов Е.М. 1987).

На втором этапе замораживании клеток от 0°С до 196°С главными кристаллизация воды и осмотические эффекты (Смирнов И.В., 1964;

Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987). Механизм повреждения клеток при образовании, росте и рекристаллизации кристаллов в настоящее время окончательно не выяснен (Белоус А.М., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П., 1987; Белоус И.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987).

сперматозоидов кристаллами льда, маловероятно из-за малого их размера и эластичности мембран (Осташко Ф.И.,1978).

Высказано предположение (Смирнов И.В., Емец А.З., 1978), что в определенных условиях при замораживании возможно одновременное протекание кристаллизации и витрификации воды. По данным других (Белоус И.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987).

В процессе вымерзания воды увеличивается концентрация солей в межклеточной жидкости. Это ведет к возникновению градиента осмотического давления на клеточной мембране и вызывает выход воды из клетки. В результате наблюдаются дегидратация клетки и уменьшение ее объема (Милованов В.К., Соколовская И.И. 1984; Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988). При глубоком охлаждении с повышением концентрации солей разрушительному действию подвергаются мембранные структуры клетки, в особенности липопротеидные комплексы мембран (Maryman H.N., et.al., 1977; Hammerstedt R.H. et.al., 1978). Нарушение белок липидного взаимодействия может быть следствием действия гиперконцентрации электролитов. Под влиянием этого фактора белки претерпевают такие же изменения, как и от обычного воздействия раствора, с высокой ионной силой; одни из них могут денатурировать и выпадать в осадок, а растворимость других может повышаться (Кононов В.П., 1984, Луговой В.И., Моисеев В.А., 1987). Кроме того, межмолекулярное взаимодействие концентрированных молекул может приводить к изменению структуры белков. При этом сближение белковых молекул на расстояние межмолекулярного взаимодействия может индуцировать образование дисулъфидных связей, в результате окисления сульфгидрильных групп и вызывать денатурацию белков (Прокопцев В.М., 1974; Наук В.А., Борончук Г.В., Дмитриенко Н.Г., 1986; Levitt J. 1962).

В процессе низкотемпературного воздействия в мембранах клеток и биологических реакций, углубляющих их повреждение. К их числу относятся:

перекисное окисление липидов, активация внутриклеточных фосфолипаз и лизосомных гидролаз, элиминация основных фосфолипидов из состава Цветков Н.Д.,1984; Hanstein W.G, Hatefi Y., Tejada P., 1970; Maryman H.N., 1977).

определенная последовательность развития криоповреждений (Белоус А.М., 1987; Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988):

1. термодинамические - проявляются в ослаблении гидрофобных взаимодействий при снижении температуры и фазовых переходов в липидах.

2. физико-химические - проявляются в изменении концентрации электролитов, в процессах кристаллизации, повышении осмотического давления и т.д.

3. биохимические - сопровождаются окислением SН-групп белков, активацией различных фосфолипаз и перекисного окисления липидов.

На основании вышеизложенного можно заключить, что наиболее уязвимыми структурами при криоконсервации клеток являются их мембраны.

(Варнавский А.Н. 1978; Данов Д.Т., Ковачев К.Д., Попов Д.В., 1983;

Prendergast E., Vishwanath R., Shannon P. e.a., 1994).

сельскохозяйственных животных показала, что наибольшим повреждениям подвергаются плазматическая мембрана клеток, наружная мембрана акросом, акросома и ее внутренняя мембрана (Варнавский А.Н., Турбин В.Ф., Осадчук В.С., 1972; Jones R., Stewart D., 1979). Кроме того, наблюдаются изменения в области шейки и тела сперматозоидов (Лопырин А.И., 1971;

Милованов В.К., Соколовская И.И., 1984; Корбан Н.В., 1988). Наиболее (Наук В.А., 1982).

повреждения сперматозоидов: больше всего морфологическим изменениям подвергаются сперматозоиды баранов и хряков, и в меньшей степени – быков.

(Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш., Корбан Н.В., 1978; Златорев С.Г., Маринов П.И., 1983; Holt W.V., Nort R.D., 2002).

По наблюдениям исследователей: Варнавского А.Н. (1970; 1972; 1978);

Курбатова А.Д. с соавт. (1988), разница между числом подвижных сперматозоидов и числом сперматозоидов с поврежденной акросомой у баранов достигает десятикратной величины, в то время как у быков - не более трехкратной.

оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы баранов (Соколовская И.Т., Абилов А.И., 1981; Абилов А.И., 1984).

Морфологические изменения акросомы происходят на всех этапах технологической обработки спермы баранов (Варнавский А.Н., 1970;

Thomson J.G., Cummins J.M., 1985).

На характер повреждений сперматозоидов барана значительное влияние оказывает состав криоконсервирующей среды (Желтобрюх Н.А. 1972;

Prendergast E., Vishwanath R., Shannon P. e.a., 1994; Holt W.V., Nort R.D., 2002).

Замораживание спермы барана в триладиловом и сахарозном разбавителе приводило к набуханию мембран в области головки и жгутика.

Наиболее лабильными структурами были акросома и плазматическая мембрана клетки (Данов Д.Т., Ковачев К.Д., Попов Д.В., 1983).

Степень повреждения отдельных структур сперматозоидов также зависит от применяемых режимов замораживания и оттаивания спермы. Они должны быть оптимальны, учитывая видовые особенности сперматозоидов (Корбан Н.В., 1988; Платов Е.М. 1973; 1986).

Вышеизложенные исследования свидетельствуют, что сперматозоиды баранов и хряков, и особенно их мембранные структуры более подвержены криогенным повреждениям по сравнению со сперматозоидами быка.

Установлено, что в процессе криообработки в сперматозоидах может изменяться концентрация и скорость синтеза внутриклеточной АТФ (Платов Е.М., 1973; 1986.).

В начальных работах по исследованию биохимических изменений в криоконсервированных сперматозоидах животных большое внимание было уделено изучению сохранности ДНК (Кононов В.П., Соколовская И.И., 1968).

Была установлена высокая криостабильность ДНК в сперматозоидах различных видов животный (Кононов В.П., 1968; Наук В.А. и др., 1970; Nath I.

1972).

Полагают, что криоустойчивость ядерного материала сперматозоидов обусловлена высоким содержанием в хроматине ядерных белков, образующих в соединении с ДНК губчатую сеть, препятствующую криоповреждениям (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988, Наук В.А., 1991).

Так как в отличие от ядра, плазматическая мембрана и акросома сперматозоидов представляет собой липопротеидные и гликолипопротеидные образования, содержащие много воды, они оказываются наиболее лабильными структурами и в первую очередь подвергаются криогенным изменениям (Варнавский А.Н., 1970; Наук В.А, 1982; Гуськов А.М., Дмитриенко Н.Г., Букарчук М.Г., 1989).

Позднее было установлено, что в семени баранов криогенным изменениям подвергаются аминокислоты, входящие в состав липопротеинов.

При этом отмечено значительное снижение содержаний оксиаминокислот, моноаминомонокарбоновых и моноаминодикарбоновых кислот (Наук В.А., 1982; Желтобрюх Н.А., Ивахненко В.К., 1986).

Исследования влияния охлаждения на сперму быков и баранов (Осташко Ф.И., Губин Н.М., Канцедаль В.И., 1984) показали, что при этом происходит нарушение активного транспорта ионов. По наблюдениям, других авторов нарушение транспортной функции и проницаемости мембран сперматозоидов проявляется не только в отношении ионов, но и молекул.

Антонюк В.С. (1984), Наук В.А. (1991), Гуськов А.М. (1993) указывают, что после холодового шока и замораживания-оттаивания сперматозоидов, наряду со снижением подвижности, происходит резкое снижение содержания липидов, фосфолипидов и их фракций в половых клетках и увеличение в семенной плазме в среднем на 11-60%.

В.К. Милованов и авт. (1970, 1981) отмечают, что при охлаждении сперматозоиды баранов и быков теряют аминокислоты, входящие в состав протоплазматических белков. Причем менее устойчивые к действию замораживания сперматозоиды баранов теряют их вдвое больше, чем сперматозоиды быков (20% против 11%). По данным В.А.Наука (1991) охлаждение спермы быка, разбавленной в лактозо-глицериновой среде, не вызывает существенного изменения общего содержания аминокислот. После замораживания-оттаивания наблюдается снижение общего количества аминокислот на 11%. В то же время охлаждение и замораживание спермы баранов в той же ЛГ- среде вызывает уменьшение аминокислот на 15% и 20% соответственно. Снижение содержания аминокислот наблюдалось и при замораживании-оттаивании сперматозоидов хряков. Эти потери объясняются не только нарушением проницаемости мембран клеток, но и нарушением в липопротеидных комплексах. Биохимические исследования показали, что низкие температуры ускоряют распад липопротеидного покрова сперматозоидов.

Нарушение проницаемости мембран в результате криогенных повреждений приводит к утечке из сперматозоидов ряда ферментов и увеличению их активности в семенной плазме (Наук В.А., 1991; Шапиев Н.Ш., 1998; Нарижный А.Г., Ерохин А.С., 1995; Ерохин А.С., Сейдахметов Б.С., 1996; Ерохин А.С., 2002; Nath I., 1972). Известно, что ферменты занимают важное место как самого крупного и наиболее высокоспециализированного класса белковых молекул. Они участвуют в процессах гликолиза и дыхания, которые обеспечивают половые клетки энергией для жизнедеятельности и движения, катализируют тысячи химических реакций, из которых слагается клеточный обмен и, в конечном счёте, реализуется генетическая информация, закодированная в молекуле ДНК.

Особенно чувствительны к различным манипуляциям со спермой акросомальные ферменты. Наибольшим изменениям подвержена активность гиалуронидазы, аспартатаминотрансаминазы, сукцинатдегидрогеназы, акрозина, кислой и щелочной фосфатаз (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988; Успенский А.Н., 1991; Mahmoud M.F. et.al., 1986).

Ряд исследователей отмечают значительные видовые различия в изменении активности акросомальных ферментов в процессе замораживания спермы. Наибольшим изменениям подвержена активность гиалуронидазы, акрозина, кислой и щелочной фосфатазы в сперме хряков и баранов (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988).

Выход ферментов из половых клеток может служить одной из причин утраты оплодотворяющей способности сперматозоидов, даже при сохранении их подвижности (Антонюк В.С., 1980).

Исследование зависимости функциональной полноценности сперматозоидов после замораживания-оттаивания от выхода ферментов из сперматозоидов, выявило наличие корреляционной связи между сохранностью фермента аспартатаминотрансферазы и качеством сперматозоидов с оплодотворяющей способностью (Hillman K., True H., 1983; Crabo B.G., Bower R.E., Graham E.F., 1984).

Установлено, что в сперме быка активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) в плазме после криоконсервации увеличивается в 3 раза, активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) – в 0,5 раза, гиалуронидазы – в 5 раз. В сперме хряков активность ферментов в семенной плазме изменилась следующим образом: АСТ увеличилась в 14 раз, ЛДГ – в 4 раза, а активность гиалуронидазы уменьшилась в 13 раз. Криоконсервированная сперма индюков и жеребцов показала увеличение активности АСТ в 3 и 2 раза, остальные показатели были почти без изменений (Грехем Е.Ф., 1977).

Охлаждение и процесс замораживания-оттаивания вызывают изменение активности ферментов гликолиза. Установлено уменьшение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гуксокиназы, глюкозофосфатизомеразы, альдолазы, цитохромоксидазы в сперме хряков, быков и баранов в результате выхода этих ферментов в плазму (Курбатов А.Д., 1988; Семаков В.Г., 1991).

В процессе криоконсервации спермы баранов происходит значительная утечка из сперматозоидов антиоксидантных ферментов (Нарижный А.Г., Ерохин А.С., 1995; Ерохин А.С., Сейдахметов Б.С., 1997).

Многие исследователи в качестве теста степени повреждения семени в процессе замораживания используют изменение проницаемости мембран, о чем судят по утечке некоторых ферментов и других органических и неорганических компонентов сперматозоидов в плазму (Hillman K., True H., 1983; Crabo B., Brown K., Graham E., 1984) Нарушение избирательной проницаемости мембран сперматозоидов сопровождается перераспределением ионов между клеткой и средой: калий и магний выходят из сперматозоидов в плазму, а натрий и кальций - наоборот, перемещаются в сперматозоиды (Жильцов Н.З., Голубь В.С., 1984).

Нарушение в распределение ионов приводит к изменению поверхностного отрицательного заряда сперматозоидов, что может быть причиной снижения их резистентности при охлаждении (Кононов В.П., 1984).

Установлено, что универсальную роль в регуляции клеточного метаболизма и проницаемости мембран играют ионы кальция и циклические мононуклеотиды - цАМФ и цГМФ (Успенский А.Н., 1991). В сперме баранов после эквилибрации и замораживания - оттаивания выявлено исчезновение аденилатциклазной активности. С нарушением синтеза циклических нуклеотидов связывают причину ухудшения регуляции проницаемости мембран и метаболизма в криоконсервированных сперматозоидах баранов (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988).

Обнаружены криогенные изменения белок - липидного соотношения в мембранах сперматозоидов (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988, Наук В.А., 1991). При этом в клетках быка соотношение белок: липиды снижалось, а у барана - повышалось.

Важным показателем, характеризующим устойчивость мембран к холодовому удару, является содержание холестерина, а также соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и фосфолипидов. Холестерин, взаимодействуя с жирнокислотными цепями, понижает текучесть мембран (Клебанов Г.И., Смирнов А.А., Акимов О.В., 1990; Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Цветков Н.Д., 1984; White J. 1976).

В процессе криоконсервации сперматозоидов баранов отмечено значительное изменение концентрации холестерина в их мембранах (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988).

Соотношение холестерин:фосфолипиды в мембранах клеток является (Клебанов Г.И., Смирнов А.А., Акимов О.В., 1990, Prendergast E., Vishwanath R., Shannon P., e.a., 1994).

В сперматозоидах быков, хряков и баранов отношение холестерин:

фосфолипиды составляет меньше единицы, с чем некоторые авторы связывают их низшую устойчивость к холодовому шоку по сравнению со спермиями Корбан Н.В., Мороз Л.Г., 1988).

сулъфгидрильных групп различных белков (Мороз Л.Г., Корбан Н.В., Рустенова Р.М., 1983; Прокопцев В.М., Рустенов А.Р., Мороз Л.Г., 1998).

При замораживании сперматозоидов баранов и хряков с необратимой потерей подвижности происходит значительное снижение активности (Profirov J.I., 1986). В физиологических условиях регуляцию содержания SH- групп в активных центрах белков и их защиту от окисления и инактивации продуктами метаболизма осуществляют низкомолекулярные SH – соединения:

глутатион, эрготионеин и цистеин, естественные биоантиокислители содержащиеся в клетке и окружающей её среде (Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В. и др.,1988; Остапив Д.Д., Ващина А.Г., 1994).

снижением в них восстановленного глутатиона (Остапив Д.Д., Ващина А.Г., 1994). Введение в сперму восстановленного глутатиона увеличивало переживаемость и оплодотворяющую способность сперматозоидов. Показано, что аэробная инкубация спермы, холодовое воздействие на клетки и их замораживание - оттаивание приводит к накоплению продуктов пероксидного окисления липидов, альдегидов, кетонов и т.д. (Jones R., e.a., 1979).

Интенсификация пероксидного окисления липидов в клетке увеличивает проницаемость мембран, изменяет активность ферментов, встроенных в мембраны, стимулирует нарушения в электрон-транспортной системе митохондрий, разобщает дыхание и фосфолирирование, нарушает синтез АТФ (Белоус А.М. и др., 1987).

фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот в мембранах сперматозоидов.

Наиболее интенсивно идет процесс окисления липидов в сперме хряков и баранов. Сперма быков практически не подвержена пероксидации липидов (Наук В.А., Гуськов А.М., 1983; Гуськов А.М., Дарий Г.Е., Пузына Г.И., 1993;

Ерохин А.С., и др., 1997; Нарижный А.Г., и др., 1994, 2002, 2005).

Установлено, что сульфгидрильные соединения разрушают перекиси в олеиновой кислоте и метилолеате, т.е. являются активными антиоксидантами.

Тиоловые соединения дитиотреитол, мэркаптоэтанол, цистеамин, цистеин, унитиол, отличающие высокой реактивной способностью SH- групп, могут предохранять липиды от свободнорадикального окисления, генетический аппарат клетки от радиационного повреждения, а также стабилизировать окислительные ферменты и механизмы синтеза АТФ. Взаимодействие сульфгидрильных соединений с перекисями в мембранных структурах клеток сопровождается взаимным разрушением и перекисей и SH - групп (Журавлев А.И., 1982; Самарцев В.Н., Зелди И.П., 1995) свободнорадикального окисления (СРО), образующиеся в клеточных структурах при окислении ненасыщенных жирных кислот. Как известно, свободнорадикальное окисление протекает во всех тканях живых организмов.

Поскольку “свободнорадикальное окисление непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов, и свободнорадикальные процессы при их низкой интенсивности являются одним из типов нормальных метаболических метаболизма, а ускорение СРО приводит к патологии Журавлев А.И., 1982).

биологической значимости пероксидного окисления липидов мембран не случайно. Установлено, что накопление продуктов пероксидного окисления липидов в мембранах меняет структуру мембран, их проницаемость, устойчивость липид - белковых комплексов и в результате происходит нарушение функциональной деятельности мембранных структур клетки (Храпова Н.Г., 1982).

Имеется ряд причин вызывающих активизацию свободнорадикального окисления, накопление в клетках и тканях живых организмов продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и снижение антирадикальной активности липидов. Одной из этих причин является холодовое воздействие на клетки, и их замораживание – оттаивание. Так, при охлаждении и замораживании спермы баранов, быков и хряков наблюдается накопление токсичных продуктов в результате ПОЛ (Наук В.А., Гуськов А.М., 1983) и изменение активности антиоксидантных ферментов (Ерохин А.С. и др., 1996).

В результате таких изменений происходит нарушение белково-липидных комплексов мембран и гомеостаза клеток.

Таким образом, результаты многочисленных исследований показывают, что под действием криообработки индуцируется ряд морфологических, биохимических и биофизических изменений, ведущих к значительному снижению биологической полноценности сперматозоидов и их оплодотворяющей способности. Видовые различия устойчивости спермиев к охлаждению и замораживанию обусловливаются особенностями химического состава плазмы, молекулярной организации мембран сперматозоидов, ферментного набора и метаболизма. Все это необходимо учитывать при разработке сред и технологии криоконсервации спермы.

Эффективность низкотемпературного замораживания спермы в электролиты, фосфолипиды, антиоксиданты, криопротекторы, биологически активные вещества, антибиотики и другие вещества, которые призваны обеспечить сохранение биологической полноценности сперматозоидов в процессе их технологической обработки (Платов Е.М., 1986; Наук В.А., 1991).

Такой широкий набор препаратов обусловлен тем, что физико-химические процессы происходящие в сперме при охлаждении до 0°С и дальнейшем замораживании весьма многообразны.

Установлено, что солевые компоненты защищают сперматозоиды в интервале температур до 0°С, а сахара, полисахариды и глицерин - при температуре ниже 0°С (Платов Е.М., 1986; Осташко Ф.И., 1988).

Особая роль в предохранении сперматозоидов от холодового удара отводится желтку куриного яйца (Милованов В.К., Соколовская И.И., 1959;

В.К.Милованова и И.И.Соколовской (1959), криозащитное действие желтка на сперматозоиды объясняется способностью лецитина проникать в клетки и понижать точку плавления липидов.

Ф.И.Осташко (1978) полагает, что защитное действие желтка при осмотический и диффузионный обмен между средой и клеткой.

По мнению Е.М. Платова (1973;1986), фосфолипиды желтка образуют с плазматической мембраной сперматозоидов ионные или водородные связи.

Современные исследования показали, что криозащитное действие желтка на сперматозоиды животных обусловлено его разупорядочивающим действием на липиды их плазматической мембраны (Кононов В.П., 1984).

замораживающих сред на другие липидные компоненты (Милованов В.К., 1962; Платов Е.М., 1973; Ерохин А.С. и др, 1994; 2004; 2009).

При изучении действия на сперматозоиды баранов и быков таких фосфолипидов, как: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол, было обнаружено, что только фосфатидилхолин связывается с их плазматической мембраной (Evans R.M., 1978).

При испытании криозащитного действия на сперматозоиды барана липопротеинов, полученных из бобов сои, гомогената плодов облепихи, икры минтая и лосося было установлено, что они обладали более слабым защитным действием, чем цельный желток (Семенова В.А., 1987) Проверка криозащитного действия сухих яйцепродуктов (сухого желтка и яичного порошка) при замораживании семени баранов, показала их высокое криозащитное влияние. Эти вещества защищали сперматозоиды барана в той же степени, что и цельный желток (Ерохин А.С., Петрова Т.И., Ткачева О.П., 1989; Ерохин А.С., 1990; 1994).

В практике криоконсервации спермы баранов желток вводят в состав сред в концентрации 10-20% (Желтобрюх Н.А., Ивахненко В.К., 1986;

Платов Е.М., 1986; Tervit H.R., Goold P.G., James R.W., 1984).

Помимо липидов, обнаружено также криозащитное действие на сперматозоиды различных белков, таких как: альбумин, казеин, белки желтка и т.д. (Наук В.А., 1982; Платов Е.М., 1986; Семенова В.А., 1987). Механизм защитного действия белков на сперматозоиды предположительно объясняется их способностью связывать токсичные для клеток ионы металлов (Кононов В.П., 1984; Harrisen R.A., 1984).

Имеется сообщение, что добавление сыворотки крови в состав среды для спермы баранов, повышало результативность осеменения овец замороженной спермой (Желтобрюх Н.А., Ивахненко В.К., Айбазав М.М., 1981).

В период технологической обработки перед замораживанием важное значение имеет введение в состав синтетических сред для замораживания спермы баранов некоторых электролитов, в частности таких, как: трисоксиметил) - аминометана и двунатриевой соли этилендиамин-тетрауксусной кислоты (Наук В.А., 1991; Saacke R.G., Aman R.R., Marshall C.T., 1986). Их положительное действие можно объяснить, способностью стабилизировать рН антиокислительное влияние на сперматозоиды животных (Ерохин А.С., 1994).

Испытание криозащитного влияния на клетки барана различных