На правах рукописи

Козина Елена Александровна

ПЛАСТИЧНОСТЬ НИГРОСТРИАТНОЙ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ

СИСТЕМЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПАРКИНСОНИЗМА У МЫШЕЙ

03.03.01. – физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН Угрюмов Михаил Вениаминович

Официальные оппоненты:

Раевский Владимир Вячеславович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, руководитель лаборатории нейроонтогенеза Ковалев Георгий Иванович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории радиоизотопных методов исследований

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научноисследовательский институт психиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 18 » апреля 2012 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул.

Вавилова, Автореферат разослан « » марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова e-mail: [email protected]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее распространенных нейромедиаторов в мозге является дофамин. Нарушение метаболизма дофамина при гибели синтезирующих его нейронов у человека приводит к развитию одного из тяжелейших нейродегенеративных заболеваний - болезни Паркинсона (БП) (Bernheimer et al., 1973; Agid, 1991). В основе патогенеза БП лежит деградация дофаминергической нигростриатной системы мозга, обеспечивающей регуляцию двигательных функций. Характерной особенностью БП является длительное бессимптомное течение на протяжении многих лет, что, предположительно, обусловлено включением механизмов пластичности мозга. Появление со временем симптомов БП связывают не только со значительной деградацией нигростриатной системы, но и с практически полным истощением компенсаторных резервов мозга (Agid, 1991).

В силу невозможности изучения эндогенных процессов, протекающих в мозге человека на досимптомной стадии БП, вопрос о развитии нейродегенеративных и компенсаторных процессов на ранних стадиях заболевания до сих пор остается открытым и является актуальной проблемой нейронауки. Важно отметить, что фармакотерапия БП, которая начинает проводиться только после появления двигательных нарушений, со временем становится менее эффективной и приводит к появлению ряда осложнений (Mones et al., 1971; Poewe, 2006). В данной ситуации становится очевидной необходимость разработки доклинической диагностики и превентивного лечения БП. Однако создание подобных технологий невозможно без комплексного изучения механизмов пластичности мозга на ранней досимптомной стадии заболевания. Единственно возможным способом изучения ранних нейродегенеративных и компенсаторных изменений в мозге является экспериментальное моделирование БП на животных, причем основной акцент при моделировании необходимо сделать на длительное развитие нейродегенеративных процессов. В большинстве экспериментальных исследований БП, создаются модели, при которых у животных в течение короткого времени развивается симптомная стадия заболевания. При таких способах моделирования невозможно оценить не только компенсаторные процессы, включающиеся на длительной досимптомной стадии, но и те изменения, которые запускают переход заболевания из одной стадии в другую.

Именно эти изменения могут служить в дальнейшем мишенью для поиска лекарственных средств, предотвращающих появление симптомов заболевания.

Таким образом, вопрос о разработке экспериментальной модели пролонгированной досимптомной стадии БП до сих пор остается актуальным, причем особый акцент при моделировании необходимо сделать на медленное и постепенное развитие патологических процессов в нигростриатной дофаминергической системе.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка экспериментальной модели пролонгированной во времени досимптомной стадии БП, а также изучение механизмов пластичности мозга на досимптомной стадии различной протяженности (коротко- и длительно-развивающейся).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. С помощью нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) разработать модель пролонгированного развития БП.

2. На моделях досимптомной и симптомной стадий БП в черной субстанции и в стриатуме оценить:

а) содержание моноаминов и их метаболитов;

б) количество тел дофаминергических нейронов и терминалей их в) содержание мРНК и белка тирозингидроксилазы, а также ее г) Содержание мРНК Д2-рецепторов 3. Провести анализ иннервации дорзального стриатума при моделировании 4. Оценить метаболизм МФТП в дофаминергической нигростриатной системе при его хроническом введении.

Научная новизна. Впервые путем введения нейротоксина МФТП в течение длительного времени смоделировано несколько последовательных фаз хронической досимптомной стадии БП и ее дальнейший переход в симптомную стадию. Получен ряд важных данных о замедлении скорости развития нейродегенеративного процесса, а именно - замедлении скорости снижения уровня дофамина и дегенерации дофаминергических терминалей в стриатуме, а также активации компенсаторных процессов в нигростриатной системе и за ее пределами при длительном введении МФТП.

Впервые показано, что при моделировании БП с помощью МФТП у животных развиваются адаптационные процессы, происходящие на уровне изменения захвата нейротоксина в дофаминергические нейроны и направленные на выработку устойчивости нейронов к токсическому действию МФТП.

Научная и практическая значимость работы. Разработанная модель хронической досимптомной стадии БП в дальнейшем может быть использована для:

а) поиска периферических эндогенных маркеров досимптомной стадии БП;

б) разработки превентивной лекарственной терапии, основанной на снижении чувствительности нейронов нигростриатной системы к действию экзогенного или эндогенного токсина и направленной на остановку или замедление дегенерации дофаминергических нейронов.

Личное участие автора. Автором были спланированы и выполнены все эксперименты, описанные в работе, за исключением части экспериментов по анализу моторного поведения животных и высокоэффективной жидкостной хроматографии, которые были проведены совместно с Институтом патологии и общей патофизиологии РАМН и Институтом фармакологии РАМН.

Поставленные задачи были решены с применением современных методов физиологии, клеточной и молекулярной биологии. Выводы сформулированы на основе собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на российских и международных симпозиумах: конференция «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций» (Москва, 2008); «2-й Съезд физиологов СНГ» (Кишинев, 2008); конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга»

(Санкт-Петербург, 2008); «39th annual meeting Society for Neuroscience» (Чикаго, 2009); «The Second International Workshop on Image Mining - Theory and Applications» (Lisboa, 2009); «XXI съезд Физиологического общества им. И.П.

Павлова» (Калуга, 2010); «II Национальный Конгресс по болезни Паркинсона и расстройствам движений» (Москва, 2011); «41st annual meeting Society for Neuroscience» (Вашингтон, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК, 1 статья в зарубежном рецензируемом журнале, 1 глава в коллективной монографии и 27 тезисов конференций.

Работа поддержана грантами: РФФИ 09-04-12106-офи_м; Российский фонд гуманитарных наук 09-06-00543a; Научные школы 2110.2008.4; Программа Президиума РАН “Фундаментальные науки - медицине”; РФФИ-10-04-93108НЦНИЛ_а.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника.

Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит рисунков и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Животные, схема эксперимента. В работе использовано мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяца и весом 22-26 г на момент начала эксперимента. Для моделирования хронически развивающегося паркинсонизма животным однократно раз в неделю подкожно вводили МФТП (Sigma, США) в дозе 12 мг/кг в течение 5, 7 и 10 недель (обозначается как 5х12, 7х12, 10х12). В контроле животным, по аналогичной опытным животным схеме, вводили физиологический раствор (0.9% NaCl). В экспериментах по определению активности тирозингидроксилазы (ТГ) опытным и контрольным животным за 30 минут до декапитации внутрибрюшинно вводили ингибитор второго фермента синтеза дофамина (ДА) – декарбоксилазы ароматических Lаминокислот (ДАА) - 3-гидроксибензилгидразин (NSD-1015) (Sigma, США) в концентрации 100 мг/кг (Carlsson, 1973).

Для воспроизведения модели быстроразвивающегося паркинсонизма («острая» модель) использовались следующие схемы введения МФТП: (а) двукратно с 2-х часовым интервалом в дозе 12 мг/кг для моделирования поздней досимптомной стадии (обозначается как 2х12); (б) четырехкратно с 2-х часовым интервалом в дозе 12 мг/кг для моделирования ранней симптомной стадии (обозначается как 4х12).

Оценка поведения. В хронических экспериментах каждые 7 дней (накануне перед следующей инъекцией МФТП) животных тестировали в "открытом поле" (Opto-Varimex-3, "Columbus instruments", США). В течение 3-х минут измеряли пройденный путь, время без движений и число вертикальных стоек (Kryzhanovsky et al. 1997). Дополнительно определяли длину шага (Tillerson et al. 2003). Используемые поведенческие тесты позволяют выявить основные симптомы БП – гипокинезию, атаксию и ригидность (Muralikrishnan and Mohanakumar 1998; Sedelis et al., 2001).

Взятие материала. В хронических экспериментах сбор материала проводили через неделю после последней инъекции МФТП. Животных из экспериментальных и контрольных групп декапитировали, извлекали мозг и разрезали его по среднесагиттальной плоскости. Из правой половины мозга выделяли черную субстанцию (ЧС) и стриатум (Козина и др., 2010), а затем в образцах измеряли содержание моноаминов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД).

Левую половину мозга фиксировали иммерсией в 4% параформальдегиде, промывали в фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20%-й сахарозе и замораживали в гексане (Lecbiopharm, Россия). Для проведения ПЦР и определения активности ТГ, ЧС и стриатум выделяли из обоих полушарий мозга. В экспериментах с использованием острой модели БП (2х12 и 4х12) сбор материала проводили через 2 недели после введения МФТП.

ВЭЖХ. Определение содержания ДА, метаболитов ДА дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), а также норадреналина (НА), серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-ГТ) и метаболита серотонина - 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в ЧС и в стриатуме проводили на обращнно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, «Элсико», Россия) в 0.1M цитратно-фосфатном буфере, содержащем 1.1 мM октансульфоновую кислоту, 0.1 мM ЭДТА и 9% ацетонитрил с последующей электрохимической детекцией на стеклоугольном электроде (+0.85 V). В экспериментах по определению активности ТГ в собранных образцах оценивали содержание L-3,4дигидроксифенилаланина (L-ДОФА), которое является показателем активности данного фермента.

Кроме этого, после десяти недель введений МФТП в опыте и 0.9% NaCl в контроле определяли содержание 1-метил-4-фенил-пиридин иона (МФП+) в ЧС и в стриатуме. Для этого всем животным на 11-й неделе дополнительно однократно вводили МФТП в дозе 12 мг/кг и через 20 минут после инъекции выделяли ЧС и стриатум. Определение содержания МФП+ проводили при помощи ВЭЖХ-УФ по модифицированной методике, описанной ранее Кавасаки с соавторами (Kawasaki et al., 2007). Измерение проводили на хроматографе Agilent 1100 с диодно-матричным детектором при длине волны поглощения 295 нм. В состав мобильной фазы входили 50 мМ KH 2PO4 и 15% ацетонитрил. Все биохимические данные представлены в виде изменения содержания измеряемых веществ в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%.

Стереотаксические инъекции. Для анализа иннервации стриатума при моделировании БП через 2 недели после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг (4х12) в опыте и 0.9% NaCl в контроле проводили стереотаксические инъекции флуоресцентного ретроградного трейсера в стриатум. Инъекции (0.5 мкл) 10% раствора трейсера (FluoroRuby, Invitrogen, США) проводили в область дорзального стриатума правой половины мозга.

Через неделю после инъекции трейсера проводили транскардиальную перфузию сначала 0.02 М фосфатно-солевым буфером в течение 15 минут, а затем охлажденным (до +4°С) 4% параформальдегидом на 0.2 М фосфатном буфере в течение 15 мин. После этого мозг постфиксировали погружением в тот же фиксатор, промывали в 0.02 М фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20% сахарозе и замораживали в гексане.

Иммуноцитохимия. Для моно-иммуномечения ТГ на криостате Leica (Leica CM1850, Германия) приготавливали фронтальные серийные срезы ЧС толщиной 20 мкм и фронтальные срезы стриатума толщиной 12 мкм. В работе использовали кроличьи поликлональные антитела к ТГ (1:2000) (предоставлены проф. Тибо, Франция), вторые биотинилированные антитела (1:200) (Vector Laboratories, США) и авидин-биотиновый комплекс, связанный с пероксидазой (Vector Laboratories, США). Пероксидазу авидин-биотинового комплекса выявляли инкубацией с диаминобензидином (Sigma, США) и H2O2.

Для двойного иммунофлуоресцентного мечения ТГ и ДАА в аксонах стриатума на «плавающих» срезах толщиной 30 мкм использовали овечьи поликлональные антитела к ТГ (1:700) (Chemicon, США), поликлональные антитела к ДАА (1:300) (Abcam, США), вторые антитела, меченные флуоресцеинизотиоционатом (FITC) (1:40) (Sigma, США) и вторые антитела, меченные цианином (Су3) (1:500) (Sigma, США).

Микроскопия, анализ изображений. Срезы ЧС после моноиммуномечения на ТГ исследовали в микроскопе Olympus BX51 (Япония), оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Япония), при увеличении объектива 10. Изображения срезов анализировали с помощью программы АnalySIS 5.0. (Olympus, Япония): на каждом срезе обводили область компактной части ЧС, содержащей тела ДА-ергических нейронов, после чего подсчитывали число нейронов, причем только с видимым ядром. Для исключения двойного подсчета нейронов, расположенных на соседних срезах, использовали метод Аберкромби (Abercrombie, 1946).

Для количественного анализа терминалей аксонов срезы стриатума после двойного иммуномечения на ТГ и ДАА исследовали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP1 (Германия). Полученные в конфокальном микроскопе «оптические» срезы толщиной 0.2 мкм анализировали с помощью программы ImageJ (NIH, США). Аксональные терминали подсчитывали в дорзальном стриатуме на площади среза 900 мкм2.

Для полуколичественного анализа ТГ в нейронах ЧС на каждом десятом срезе обводили все нейроны в компактной части ЧС. Оптическую плотность нейронов, коррелирующую с концентрацией ТГ, определяли как «уровень серого» по следующей формуле: оптическая плотность = log (уровень серогофона /уровень серогосигнала). Для полуколичественного анализа ТГ в волокнах стриатума использовалась разработанная совместно с Вычислительным Центром им. А.А. Дородницына РАН в ходе данной работы программа «Striatum Image Analysis» (Gurevich et. al., 2010).

ПЦР в реальном времени. Содержание мРНК ТГ и Д2-рецепторов в ЧС и в стриатуме оценивали методом ПЦР в реальном времени. После выделения РНК из образцов проводили реакцию обратной транскрипции с помощью кита RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, США), после чего проводили ПЦР с использованием интеркалирующего красителя SYBRGreen (Maxima SYBR Green Kit, Fermentas) на приборе IQ5 Cycler (Biorad, США). Для определения содержания мРНК ТГ использовали следующие GTCAGAGGAGCCCGAGGTC-3' (Синтол, Россия). Для определения содержания мРНК Д2-рецепторов использовали следующие праймеры: 5'GTGGTGACTGGGAGGGATGG-3', 5'-GTGAACAGGCGGAGAATGGATG-3'.

При стандартизации реакции определяли содержание мРНК актина (housekeeping gene) по двум последовательностям праймеров: 5'CCAGAGGCATACAGGGACAGC-3' и 5'-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3'.

Количественную разницу в экспрессии между опытными и контрольными образцами определяли по формуле: 2-C(t).

Определение активности транспортера дофамина в срезах мозга ex vivo. После десяти недель введений МФТП для определения активности транспортера ДА использовали метод инкубации срезов ЧС и стриатума с меченым тритием ДА (3Н-ДА), описанный ранее (Хакимова и др., 2011).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью F-теста для определения однородности выборки и t-теста Стьюдента для определения достоверности различий.

Двигательная активность животных. Через неделю после инъекций МФТП в дозе 12 мг/кг в течение 5 и 7 недель в экспериментальных группах по сравнению с контрольными не обнаружено различий по всем используемым показателям двигательной активности (Табл. 1). Однако через 10 недель введений МФТП наблюдались изменения двух показателей из четырех пройденный путь и длина шага снизились по сравнению с контролем на 23% и 17% соответственно (Табл. 1). Таким образом, через 5 и 7 недель введений МФТП была получена модель досимптомной стадии паркинсонизма, а через недель - модель ранней симптомной стадии.

Биохимические изменения в нигростриатной системе. Через 5 недель введений МФТП содержание ДА в ЧС увеличилось на 40%, а в дальнейшем наблюдалось снижение его содержания – через 7 недель введений МФТП - до уровня контроля, а через 10 недель - на 40% относительно контроля (Рис. 1А).

Табл. 1. Показатели двигательной активности животных через 5, 7 и 10 недель введений МФТП в эксперименте и 0.9% NaCl в контроле.

Показатель Схема МФТП 7х12 мг/кг 1000,2 111,7 1008,6 125,6 14,5 2,1 10,6 2,3 42,7 4,6 45,4 7,9 4,7 0,4 4,6 0, 10х12 мг/кг 989,3 57,1 756,7 51,6* 18,8 2,9 14,1 1,7 51,8 5,3 64,2 5,9 5,2 0,2 4,3 0,2*