На правах рукописи

Шадрин Андрей Михайлович

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ

ГЕНОВ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ B. CEREUS

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино и в лаборатории молекулярных механизмов транскрипции прокариот Института микробиологии им. Ваксмана, г. Пискатавэй, шт. Нью Джерси, США.

Научные руководители: доктор биологических наук Северинов Константин Викторович кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук Озолинь Ольга Николаевна кандидат биологических наук Кошелева Ирина Адольфовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г.

Москва

Защита диссертации состоится _декабря 2010 года в _часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г.

Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «_» ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат фармацевтических наук Л.С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. По данным организации «European Food Safety Authority» Bacillus cereus является четвертой по распространенности причиной пищевых отравлений. Вид Bacillus cereus входит в состав группы B. cereus представителями которой являются B. anthracis, вызывающий сибирскую язву; B.

thuringiensis, продуцирующий параспоральные кристаллы токсина, действующего на определенные виды насекомых, и, сравнительно недавно охарактеризованный как отдельный психротолерантный вид, B. weihenstephanensis. Бактерии этой группы широко распространены в природе и часто встречаются в почве. Гены, предающие специфические свойства и локализованы на B. anthracis B. thuringiensis, макроплазмидах. Однако отдельно взятый штамм представителя группы B. cereus может синтезировать до десятка токсинов, гены которых расположены на бактериальной хромосоме. Некоторые из этих токсинов могут вызывать тяжелые отравления у людей, в том числе – со смертельным исходом. Особый интерес вызывают два пороформирующих токсина - гемолизин II и цитотоксин К.

Аминокислотная последовательность гемолизина II сходна с последовательностью цитотоксина К (37% идентичности). Оба токсина относятся к семейству -складчатых пороформирующих токсинов. К другим представителям этого семейства относят гемолизин, лейкоцидины, -гемолизин Staphylococcus aureus и -токсин Clostridium perfringens. Однако регуляция экспрессии генов гемолизина II и цитотоксина К осуществляется независимо. Ген цитотоксина К находится под контролем транскрипционного активатора PlcR, включающего экспрессию большинства токсинов B. cereus по механизму «чувства кворума» («quorum sensing»), в то время как экспрессия гемолизина II репрессируется транскрипционным регулятором HlyIIR.

Для того чтобы обеспечить быстрое переключение экспрессии генов в ответ на контролируется. Стадия инициации транскрипции является главным этапом контроля промоторами генов и влияния на это взаимодействие транскрипционных факторов является важнейшей задачей молекулярной биологии, позволяющей определить механизмы реализации информации, заложенной в геноме организма. Большинство накопленных к настоящему времени данных, описывающих инициацию транскрипции, базируются на результатах, полученных на моделях РНК-полимераз E. coli и Thermus thermophilus, функциональных отличий от РНК-полимераз микроорганизмов группы B. cereus.

Понимание механизмов регуляции экспрессии, в особенности, генов токсинов Bacillus cereus и детальное изучение взаимодействия РНК-полимеразы с их промоторами, несомненно, представляют интерес для молекулярной биологии. Актуальность исследования регуляции генов токсинов бактерий рода Bacillus не вызывает сомнений.

Более того, впоследствии, результаты исследований могут послужить основой для создания новых лекарственных препаратов используемых при терапии инфекционных заболеваний.

Цели и задачи исследования:

Целью данной работы являлось изучение особенностей механизма регуляции генов пороформирующих токсинов гемолизина II и цитотоксина К у микроорганизмов группы B. cereus. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Оценить разнообразие и особенности распределения аллелей генов цитотоксина К, гемолизина II и его транскрипционного регулятора hlyIIR в большой популяции штаммов B. cereus, выделенных из различных природных источников.

Охарактеризовать взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами генов гемолизина II, цитотоксина K, plcR и papR.

3) Определить для генов цитотоксина К и гемолизина II этапы транскрипции, на которые влияют HlyIIR и PlcR.

Научная новизна работы. Впервые определены частоты встречаемости аллелей генов цитотоксина К, гемолизина II и его транскрипционного репрессора HlyIIR у 40 штаммов группы B. cereus, выделенных на территории стран СНГ. На модели B. subtilis установлено что, в случае отсутствия контроля экспрессии гена гемолизина II регулятором HlyIIR, гемолитическая активность, наблюдаемая в культуре клеток, увеличивается в 200 раз, что не менее чем в 5 раз превышает гемолитическую активность родительского штамма B. cereus ВКМ В-771. Впервые детально охарактеризованы комплексы, формируемые РНК-полимеразой в ходе инициации транскрипции на промоторах генов гемолизина II, цитотоксина К, plcR и papR. Впервые определены стадии инициации транскрипции, на которые оказывают влияние HlyIIR и PlcR для промоторов генов гемолизина II, цитотоксина К, plcR и papR.

Научно-практическая значимость работы. Представленная работа является частью серии работ, направленной на исследование регуляции инициации транскрипции у грамм-положительных микроорганизмов. Используемый в данной работе метод стабилизации открытого комплекса с помощью нуклеотидов позволяет четко отслеживать механизм инициации транскрипции для промоторов с коротким (несколько секунд) временем полураспада открытого комплекса. Предложенный вариант анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена цитотоксина К может быть использован при разработке тест-систем, позволяющих детектировать штаммы, несущие смертельно опасный для человека аллель cytK1 гена цитотоксина К.

При моделировании регуляции экспрессии гена гемолизина II был создан штамм B.

subtilis – суперпродуцент гемолизина II, который может послужить прототипом для суперпродуцентов других пороформирующих токсинов. Полученные в ходе данного исследования результаты имеют несомненное практическое значение и могут с успехом найти применение, как в медицинской диагностике, так и послужить основой для дальнейших научных исследований регуляции экспрессии генов Bacillus cereus.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 10-, 11-, 12-, 13- и 14-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука 21 века», Пущино, 2006 – 2010; CSHL Meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, NY, August 20-24, 2008; International Conference on Gram-positive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8, 2008; International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld 2009), 2009;

институтских конференциях ИБФМ РАН, где в 2008 и 2009 годах была отмечена призовыми местами, и в 2009 – премией Г.К. Скрябина.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 178 наименований. Работа содержит 18 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды для экспрессии белков PlcR B. cereus ATCC 4342, RpoA(wt) B. subtilis BD170, RpoA(60) B. subtilis BD170 и SigA B. cereus ATCC 4342 были получены путем амплифицированных методом ПЦР. Плазмида для экспрессии HlyIIR на основе pET28b была любезно предоставлена Олегом Ковалевским. В качестве PapR, лиганда PlcR, использовали химически синтезированный пептид H-LPFEH-OH. РНКП Bacillus subtilis была очищена из штамма Bacillus subtilis BD170 методом, описанным Хелманном (Helmann, 2002). РНКП E. coli дикого типа и РНКП E. coli без С-концевых доменов субъединиц, была любезно предоставлена Екатериной Богдановой. Для рутинного клонирования использовались штаммы E. coli XL1blue, DH5, JM109, JM110. Для экспрессии белков использовались штаммы E. coli BL21(DE3), Tuner(DE3) pLysS. Для определения распространенности и разнообразия генов токсинов и регулятора HlyIIR использовалась 40 штаммов представителей группы B. cereus из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов. В качестве матриц для транскрипции in vitro и футпринтинга использовались линейные молекулы ДНК промоторов, синтезированные методом ПЦР: hlyII370 [-172/+108; -119/+89]; hlyII771 [-204/+108; -151/+89]; cytK [papR [-326/+100; -193/+100]; plcR [-145/+143; -101/+143]; T7A1 [- 105/+77]. В скобках указано положение концов фрагмента ДНК относительно сайта старта транскрипции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

пороформирующих токсинов цитотоксина К, гемолизина II и его регулятора.

Для оценки разнообразия генов было решено сопоставить сходство штаммов, определенное ПЦР фингерпринтным методом (Reyes-Ramirez and Ibarra, 2005), со сходством кодирующей области генов токсинов, определенным методом Полиморфизма Длины Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ). Было проанализировано 40 штаммов, представителей группы B. cereus, обнаруженных на территории стран СНГ на протяжении всего ХХ века. Штаммы были взяты из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ).

При анализе ПЦР фингерпринтов на электрофореграмме выявлялось от 4 до амплифицированых фрагментов ДНК длиной от 500 пн до 4000 пн (не показано). Среди 40 фингерпринтов насчитывалось 39 продуктов ПЦР с отличимой молекулярной массой. Каждый продукт считался отдельным таксономическим признаком. Штаммы со сходством более 70% были объединены в кластеры «A», «B», «C», «D» (см. рис. 1a).

Каждый кластер содержал от 4 до 8 штаммов. В целом, распределение штаммов по кластерам на основании ПЦР фингерпринтов не всегда совпадало с данными об их видовой принадлежности. Подобная ситуация наблюдалась и при использовании штаммов, ранее охарактеризованных как B. cereus, группировалась со штаммами B.

thuringiensis (Ko et al, 2004).

Рис. 1. (a) Дендрограмма, отображающая результаты кластерного анализа группоспецифических фингерпринтов штаммов. Справа напротив коллекционных номеров штаммов, указаны группы последовательностей промоторов hlyII, ПДРФ-группы генов cytK и hlyII, а также наличие генетической детерминанты hlyIIR. Далее, в колонке “психротолерантность”, указана минимальная температура, при которой наблюдается рост соответствующего штамма. Буквами «A», «B», «C» и «D» обозначены выделенные нами ПЦР кластеры. «-» обозначает отсутствует гена, «+» – наличие гена, «н.а.» – наличие гена не анализировали. (b, c) Дендрограммы, отображающие сходство генов hlyII (c) и cytK(b) по данным ПДРФ анализа. Для ПДРФ-анализа использовались эндонуклеазы рестрикции AluI, Sau3AI и RsaI. В скобках, за названием группы, указано количество штаммов имеющих обозначенный тип гена. Помимо указанных штаммов в состав групп входили аллели cytK: C1b: cytK B. thuringiensis шт. 97-27, cytK-2 B.

cereus ATCC 10987, cytK-2 B. cereus шт. 23, cytK-2 B. cereus шт. FM-1; C1c: cytK B. cereus шт. E33L; C3a:

cytK-2 B. cereus ATCC 14579T; C3b: cytK-2 B. cereus шт. 1230-88; cytK1: cytK-1 B. cereus шт. 391-98 и аллели hlyII: H2: B. cereus ATCC 14579T, B. thuringiensis шт. 97-27; H4: B. anthracis шт.'Ames Ancestor', B.

anthracis шт. Ames, B. anthracis шт. Sterne, B. cereus шт. E33L. (d) Дегдрограмма отображающая сходство последовательности участков разделяющих кодирующие области генов N-acetylmuramoyl-L-alnine amidase и hlyII, содержащий промотор гена гемолизина II.

Методом ПЦР гены гемолизина II и его регулятора были выявлены у 56% проанализированных штаммов, а ген цитотоксина К - у 61%. В исследованной ранее коллекции клинических и ассоциированных с пищевыми отравлениями изолятов гены cytK и hlyII были выявлены у 45% и 21% штаммов, соответственно (Fagerlund et al., 2004). Вероятно, что относительно высокая частота встречаемости анализируемых ПФТ в нашей коллекции обусловлена спецификой источников выделения штаммов.

Так, значительная часть микроорганизмов, использованных в нашей работе, была выделена из почвы и насекомых.

Вполне ожидаемая закономерность прослеживается между частотами встречаемости генов гемолизина II и его регулятора hlyIIR. Так у всех 15 штаммов, не содержащих ген hlyII, не обнаруживался и ген hlyIIR, а у 21 штамма детектировались оба гена одновременно. Такой характер распределения генов hlyII и hlyIIR у штаммов B. cereus обусловлен близким расстоянием (около 300 пн) между этими генами, что, в свою очередь, повышает вероятность одновременного участия их в рекомбинационных событиях или совместной передачи при горизонтальном переносе генов.

Анализ Полиморфизма Длин Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ) cytK и hlyII Специфические ампликоны длиной 813 пн генов цитотоксина К были получены для 23 (57.5%) из 40 протестированных штаммов. Кроме того, проведен анализ вариантов гена cytK, имеющихся в GenBank. Проанализированные штаммы были разделены на 10 групп по типам ПДРФ генов cytK. В каждую группу входили от 1 до штаммов (см. рис. 1b). Гены, ранее идентифицированные как cytK2, вошли в группы C1b, C3a и C3b. В 23 проверенных нами штаммах не обнаружено генов цитотоксина К, сходных со смертельно опасным cytK1. Наиболее близкие к аллелю cytK1 - cytK группы генов C1a отличались от него по 8 из 15 сайтов рестрикции (53%), а от ранее описанных генов cytK2 – лишь на 1 из 15 сайтов рестикции (6.8%). Таким образом, все протестированные гены cytK следует рассматривать как варианты менее опасного для млекопитающих цитотоксина К2. Поскольку предложенный нами метод ПДРФ позволяет различить аллели cytK1 и cytK2 по 8-ми признакам (сайтам рестрикции), он может быть использован как надежный тест для выявления смертельно опасных штаммов, обладающих редким аллелем cytK1.

Фрагменты гена hlyII были амплифицированы с помощью праймеров HF2 и HR у 56% штаммов. Все продукты ПЦР имели размер, соответствующий расчетному – пн. Анализ последовательностей hlyII из GenBank позволил использовать для исследования еще семь вариантов гена hlyII. По результатам анализа ПДРФ генов hlyII 28 штаммов были объединены в 5 групп (см. рис. 1с). Полученные группы содержали от 2 до 12 штаммов. Отметим, что гены штаммов B. anthracis, несущие мутацию сбивки рамки считывания, и полноценные гены B. cereus E33L и ВКМ B-771, нуклеотидные последовательности которых доступны в GenBank, группировались в один кластер H4, а B. cereus ATCC 14579T, B. thuringiensis шт. 97-27 – в кластер Н2.

Штаммы с генотипами hlyII+ и cytK+ не формировали четких кластеров (см. рис.

1a). Отсутствие корреляции между филогенетическим положением штаммов и их кластеризацией, основанной на наличии и полиморфизме определенных генов токсинов и их регуляторов, является характерным для представителей группы B. cereus.

Например, филогенетическая взаимосвязь штаммов, основанная на MLST консервативных генов, не совпадает с кластеризацией штаммов, основанной на последовательности plcR – гена, кодирующего транскрипционный активатор факторов патогенности микроорганизмов группы B. cereus. Соответствие классов совместимости «чувства кворума» для пар plcR-papR так же не совпадает с филогенетическим положением штаммов, определенным методом MLST. Все вышеперечисленные особенности обусловлены панмиктическим характером популяции B. cereus.

микроорганизмы обладали одинаковыми типами генов hlyII и cytK. Однако в ПЦРфингерпринтных кластерах присутствуют штаммы без этих генов. Так в кластере «В»

гены cytK отсутствуют y 3 из 8 штаммов, а гены hlyII отсутствуют у штамма ВКМ B- в кластере «D» и ATCC 35646 в кластере «B». Полученные данные свидетельствуют, скорее всего, об утере генов в предшествующих поколениях, но предполагают их наличие у предка группы.

Гемолизин II – основной гемолизин B. cereus разрушающий эритроциты человека, при отсутствии контроля HlyIIR Как известно, штаммы B. cereus секретируют около десятка белков, проявляющих Гемолитическую Активность (ГА). Именно поэтому сложно оценить индивидуальный вклад каждого токсина в общую ГА, наблюдаемую в культуре клеток.

Для того чтобы определить вклад гемолизина II в общую ГА, ген hlyII и его регуляторные элементы были интегрированы в локус amyE хромосомы штамма B.

subtilis BD170. B. subtilis BD170 не проявляет ни гемолитической, ни цитотоксической Рис. 2. Экспрессия гена гемолизина II в B. subtilis. Зоны гемолиза оставляемые штаммами EH2 и EH2R на чашке с кровяным агаром после 17 часов (a) и 25 часов (b) инкубации. (с) Схема конструирования рекомбинантных штаммов EH2 и EH2R. (d) Изменение гемолитическая активность штаммов в ходе роста культур.

внеклеточных активностей и имеет сходные с B. cereus процессы регуляции транскрипции, трансляции и белковой секреции. Следовательно, B. subtilis может служить удобным модельным организмом для изучения экспрессии генов гемолизинов, в частности hlyII.

Было создано два штамма B. subtilis: EH2, несущий ген гемолизина II; и EH2R – содержащий тандемно расположенные гены hlyII и hlyIIR – ген регулятора гемолизина II (см. рис. 2с). В полученных штаммах гемолитическая активность детектировалась только в культуральной жидкости, но не в клеточных экстрактах, как это происходило при экспрессии hlyII в E. coli.

Эффекты, связанные с наличием гена гемолизина II, были протестированы на чашках с кровяным агаром. Оба полученных штамма проявляли гемолитическую активность, однако активность штаммa EH2 была выше. Зоны гемолиза EH2 можно было детектировать раньше, чем бактериальные колонии становились видимыми невооруженным глазом (рис. 2a,b). Секретируемая гемолитическая активность была измерена на протяжении всех фаз роста культуры. Для штаммов B. cereus ВКМ В-771 и EH2 наблюдался сходный характер изменения ГА, с максимумом в конце экспоненциальной фазы (30 и 1500 ед./А600 соответственно), и последующим постепенным уменьшением в стационарной фазе. Кинетика экспрессии гена hlyII в культуре штамма EH2R отличалась более поздним достижением максимальной ГА ( ед./А600), которая наблюдалась в начале стационарной фазы. Максимальный уровень экспрессии гемолизина II в штамме EH2 в 200 раз выше, чем в EH2R, и в 50 раз превышает ГА родительского штамма B. cereus ВКМ В-771, вклад в которую также вносят и другие пороформирующие токсины Эти результаты являются первым доказательством того, что в случае утраты контроля HlyIIR над экспрессией гемолизина II гемолитическая активность, разрушающая человеческие эритроциты, главным образом, представлена гемолизином II.

Аллель гена гемолизина II c делецией 32 нуклеотида в промоторной области.

При секвенировании промоторных областей гена гемолизина II у микроорганизмов группы B. cereus был обнаружен новый аллель hlyII с делецией от - до -60 (32 пн) нуклеотида относительно ранее определенного старта транскрипции для промотора B. cereus ВКМ В-771 (PhlyII771). Делеция в этом районе затрагивает участки, с которыми взаимодействуют РНК-полимераза и HlyIIR (см. рис. 3a) (Budarina et al, 2004). Таким аллелем обладали 4 из 23 (17%) проанализированных штаммов.

Были определены последовательности генов hlyII и hlyIIR штамма B. cereus ВКМ B-370. Оба гена не содержат мутаций сбивки рамки считывания, а длина их кодирующих областей совпадает с ранее описанной для hlyII и hlyIIR штамма ВКМ BГен гемолизина II B. cereus ВКМ B-370 (с делецией в области промотора -29..-60) был введен в штамм B. subtilis на плазмидном векторе. Наличие гена hlyII370 предавало гемолитическая активность детектировалась в супернатанте культуральной жидкости (32-64 гемолитических единицы).

Для определения уровня экспрессии двух аллелей промоторы гемолизина II штаммов B. cereus ВКМ B-370 и ВКМ B-771 были транскрипционно слиты с открытой рамкой считывания -галактозидазы и введены в B. subtilis в виде производных плазмиды pHT304-18Z. Активность -галактозидазы в случае PhlyII771 составляла 21000±6000 ед. Миллера, а в случае PhlyII370 ~47±20 ед. Более чем стократная разница активности промоторов говорит о важности взаимодействия РНК-полимеразы с участком -29…-60 для обеспечения эффективной экспрессии hlyII.

Для проверки этой гипотезы была создана серия укороченных вариантов промотора PhlyII771 (см. рис. 3a). При их анализе методом транскрипции in vitro количество продуктов образующихся с PhlyII771-30, содержащего только «-10» элемент, и PhlyII771-40, содержащего «-10» и «-35» элементы, значительно ниже, чем с промоторов Рис. 3. Организация промоторов гена гемолизина II и их взаимодействие с РНК полимеразой. (a) Структурная организация двух аллелей PhlyII771 и PhlyII370 промоторов гена гемолизина II. В скобках, за названием промотора указано количество выявленных штаммов обладающих этим аллелем. Ниже приведены последовательности укороченных вариантов промотора PhlyII771. Рамками обозначены «- удлиненный» элемент и участок, защищаемый HlyIIR от ДНКазы I, одновременно представляющий собой инвертированный палиндром длиной 44 пн. Серым цветом выделены консервативные для всех определенных 23 последовательностей нуклеотиды. (b) Влияние ДНК локализованной позади «-35»

элемента промотора на эффективность абортивной транскрипции in vitro с укороченных промоторов гена гемолизина II. Расстояние между сайтом старта транскрипции и задними концами ДНК-ДНК дуплексов указано над треками. Использована РНКП B. subtilis. (c) Футпринтинг -субединцы РНКП B. subtilis при помощи ДНКазыI на промоторе PhlyII771. «+» добавлена 4 мкМ -субъединица. Черной линией указана область защиты ДНК, слева – расположение инвертированного повтора. (d) Влияние CTD РНКП на однократную транскрипцию in vitro с PhlyII711 и PhlyII370 осуществляемую РНКП E.coli без CTD (треки 1-3) с CTD (дорожки 4-6). Дорожки 1, 4 промотор PhlyII370, дорожки 2, 5 – PhlyII771, дорожки 3, 6 – промотор T7A1.

укороченных до -54, -78 и -204 позиции заднего дуплекса ДНК (см. рис. 3b). Известны случаи, когда РНКП способна взаимодействовать с ДНК промотора локализованной выше «-35» элемента, так называемым UP-элементом, формируя контакты посредством CTD. ДНК в районе -35/-90 PhlyII771 содержит более 90% пар аденин-тимин, что также характерно для элементов промотора взаимодействующих с CTD РНК-полимеразы.

Следовательно, можно выдвинуть предположение о наличие UP-элемента у PhlyII771, делеция которого, в случае PhlyII370, приводит к нарушению контактов с CTD.

ДНКазный футпринтинг -субъединицы РНКП B. subtilis (см. рис. 3c) выявил участок экранирования ДНК PhlyII771 в районе -30/-65. Обычно длина участка, защищаемого CTD, равна приблизительно двум виткам ДНК, а сам участок локализован в районе -45/-65. Обширную зону защиты от ДНКазы I в случае PhlyII можно объяснить наличием в инвертированном повторе длиной 44 пн дополнительного взаимодействовать, поскольку в отличие от целой молекулы РНКП не фиксирована на «-10» элементе промотора. Относительно высокая транскрипционная активность в случае PhlyII771 укороченного до -54 позиции, по-видимому, обусловлена его взаимодействием с CTD-I РНКП. Вероятно, этого взаимодействия достаточно для увеличения эффективности инициации.

Поскольку за взаимодействие РНКП с UP-элементом отвечает CTD, мы использовали РНКП E. coli, содержащую мутантную -субъединицу, без С-концевого домена. На рисунке представлен радиоавтограф продуктов однократной транскрипции in vitro полученных РНК-полимеразой E. coli, лишенной (дорожки 1-3) и содержащей CTD (дорожки 4-6). В случае контрольного промотора T7A бактериофага Т7, не содержащего классического UP-элемента, продукты транскрипции видны обоих типов РНКП. Однако в случае промоторов гена гемолизина II продукты транскрипции детектируются лишь для интактной РНКП и PhlyII771, но не PhlyII370.

Эти наблюдения подтверждают гипотезу о важной роли UP-элемента в экспрессии гена hlyII771.

Особенности Транскрипционных Комплексов (ТК) формируемых РНКП Bacillus subtilis на промоторах гена гемолизина II в ходе инициации транскрипции.

Ранее было показано, что Открытый Комплекс (ОК) образуемый РНКП E. coli на промоторе PhlyII771 не разрушался при добавлении гепарина (100 мкг/мл) и мог быть легко детектирован методами задержки в геле и футпринтинга с использованием ДНКазы I или KMnO4 (Budarina et. al, 2004). При использовании РНКП B. subtilis, для промотора гена гемолизина II, введение гепарина (4 мкг/мкл) приводило к полной остановке реакции абортивной инициации (не показано). РНКП бацилл, в отличие от РНКП E. coli, образует короткоживущие открытые комплексы на большинстве промоторов (Whipple and Sonenshein, 1992, Artsimovitch et. al., 2000). Это явление обусловлено структурным отличием РНК-полимераз, а именно отсутствием ’-SI домена в РНКП B. subtilis. Свойства РНКП E. coli, с делецией ’-SI3 домена (Ec’(943или примыкающего к нему домна ’-челюсти (jaw, Ec’(1149-1190) по многим параметрам напоминают свойства РНКП B. subtilis. Делеция домена ’-челюсти не является летальной для E. coli, однако приводит к значительным изменениям в регуляции транскрипции большого числа генов, опосредованных дестабилизацией ОК (Ederth et al., 2002; Atrtsimovitch et al., 2003).

Рис. 4. Свойства комплексов РНКП-промотор, образующихся в ходе инициации транскрипции. (a) 100 мкМ нтф увеличивают количество продуктов при однократной транскрипции in vitro. (b) Кинетика диссоциации стабилизированных Транскрипционных Комплексов (ТК). Остаточное количество ТК выявлено методом однократной транскрипции. (с, d) Футпринтинг РНКП и ТК формируемых на промоторе PhlyII771 с помощью KMnO4 и ДНКазы I, соответственно (слева - матричная цепь; справа нематричная цепь). (e) Общая схема. Черной полосой указаны зоны защиты ДНК промотора до ДНКазы I. Черными треугольниками – сайты чувствительности к KMnO4.

образование Закрытого Комплекса (ЗК), образование Открытого Комплекса (ОК), стадию абортивной инициации, и завершающую стадию - покидание РНК-полимеразой промотора – образование Элонгационного Транскрипционного Комплекса (ЭТК).

Введение неполного набора нуклеотидов, на стадии формирования Транскрипционного Комплекса (ТК), позволяющих РНК-полимеразе начинать синтез молекулы РНК на промоторах PhlyII370 и PhlyII771 приводило к увеличению количества полноразмерных продуктов однократной транскрипции in vitro (рис 4a). Такой эффект достигается в присутствии нуклеотидов GTP+ATP, GpA+UTP+ATP и GTP+ATP+UTP, что можно объяснить образованием дополнительных комплексов, содержащих молекулы РНК длиной до 2 нт (ТК-2), 7 нт (ТК-7) и 12 нт (ТК-12) соответственно. При проверке устойчивости этих ТК к гепарину выяснилось, что комплексы, формирующиеся в присутствии вышеуказанных смесей НТФ, отличаются от ОК более длительным временем полураспада (рис 4b).

Транскрипционные комплексы, стабилизированные за счет образования РНКДНК гетеродуплексов, оказалось возможным охарактеризовать при помощи KMnO4 и ДНКазного футпринтинга (см. рис. 4(c-e), рис. 5f). Задняя граница транскрипционного пузырька в ТК-2 совпадает с задней границей в ОК, в то время как передняя граница продвигается вперед до +4 нуклеотида, что отражает появление 2 пн РНК-ДНК гетеродуплекса. По сравнению с ТК-7 и ТК-12, ТК-2 демонстрирует наиболее длинную (-64/+20) зону защиты от ДНКазы I, и участок гиперчувствительности в позиции - матричной цепи. Такое расположение зон футпринтинга характерно для ОК и ТК находящихся на стадии абортивной Инициации (ИТК). Зоны защиты ДНК лежащей позади сайта инициации транскрипции одинаковы для ОК и ИТК, поскольку до перехода в стадию элонгации контакты между задним ДНК-ДНК дуплексом и РНКП не изменяются (Revyakin et. al, 2006; Kapanidis et. al, 2006). Внутри зоны защиты ТК- детектируется область, соответствующая позиции отдельно взятой -субъединицы в районе -55/-64 (см. рис. 4e, рис. 3с).

В ТК-7 происходит сдвиг границ области чувствительности к KMnO транскрипционного пузырька и сокращение участка защиты от ДНКазы I до ~40 пн.

Перемещение задней границы транскрипционного пузырька можно трактовать как её схлопывание, что в совокупности с потерей контактов с задним ДНК дуплексом говорит о превращении транскрипционного комплекса в элонгационный (Hsu, 2002).

Однако ТК-7 обладает сравнительно небольшим периодом полураспада (~15 мин), что нехарактерно для элонгационных комплексов. С другой стороны, длина молекулы РНК в ТК-7 составляет всего 7 нт. Вероятно, РНК-ДНК гетеродуплекс длиной 7 пн может диссоциировать, что приводит к образованию тупикового комплекса, который, поскольку короткая мРНК, может самостоятельно покидать активный центр, постепенно распадается на молекулы РНКП и ДНК промотора. Таким образом, ТК- вернее будет рассматривать как переходное состояние ИТК-ЭТК.

При образовании ТК-12 происходит дальнейшее перемещение вперед зон чувствительности к KMnO4 и ДНКазе I. Период полураспада ТК-12 превышает минут. Таким образом, параметры ТК-12 соответствуют характеристикам элонгационных комплексов.

Итак, в присутствии 100 мкМ GTP и ATP образуется инициирующий ТК-2, с помощью которого можно моделировать ОК, а в присутствии 100 мкМ GpA, UTP, ATP и 100 мкМ GTP, ATP, UTP формируются соответственно переходный ИТК-ЭТК ТК-7 и элонгационный ТК-12 комплексы.

Влияние транскрипционного регулятора HlyIIR на экспрессию гена гемолизина II.

Оператор HlyIIR находится на 26 пн выше старта инициации транскрипции и совпадает с инвертированным повтором длиной 44 пн для PhlyII771. Несмотря на то, что инвертированный повтор содержит 3 сайта узнавания HlyIIR, с оператором взаимодействуют только два димера регулятора (Rodikova et al., 2007). По результатам выравнивания нуклеотидных последовательностей регуляторных областей PhlyII771 и PhlyII370 можно передоложить, что PhlyII370 сохраняет один потенциальный участок связывания HlyIIR, соответствующий дистальному сайту PhlyII771 (см. рис. 5a). В результате делеции 32 пн потенциальный оператор HlyIIR в случае PhlyII располагается на один виток ДНК ближе к сайту инициации транскрипции проксимального оператора HlyIIR PhlyII771.

Для того чтобы определить действие HlyIIR на транскрипцию hlyII771 и hlyII370, в штаммы B. subtilis, содержащие соответствующие транскрипционно слитые промоторы гена гемолизина II с ОРС -галактозидазы, был введен ген hlyIIR. Для этого участок гена hlyIIR с его регуляторными областями был интегрирован в локус amyE.

Активность -галактозидазы в штамме с PhlyII771 после введения HlyIIR снижалась приблизительно в 100 раз (рис 5b). Введение HlyIIR в штамм, несущий PhlyII370, не влияло на активность промотора гемолизина II in vivo. В экспериментах по задержке в геле выявлено, что HlyIIR не формирует специфические комплексы с PhlyII370промотором (рис. 5c). ДНКазный футпринтинг также не выявил зоны защиты HlyIIR на PhlyII370 (не показано). HlyIIR не оказывал влияния на транскрипцию in vitro с PhlyII (см. рис. 5d).

демонстрирующая альтернативный вариант выравнивания промоторов гена гемолизина II PhlyII771 и PhlyII370. «Ohalf» - олигонуклеотид минимального размера достаточный для связывания HlyIIR (Rodikova et al, 2007). (b) Активность -галактозидазы в штаммах несущих транскрипционно слитые промоторы PhlyII771 (столбцы 3, 4) и PhlyII370 (1, 2), содержащие ген HlyIIR (1, 3) и без него (2, 4). (с) Методом задержи в геле показано, что HlyIIR формирует специфические комплексы только с PhlyII771. Над треками указана концентрация HlyIIR, нМ; «СД» - свободная ДНК; «СК» - специфические комплексы; «НК» неспецифические комплексы. (d) Влияние HlyIIR на инициацию транскрипции на промоторах PhlyII370 и PhlyII771. Для получения транскрипционных комплексов ДНК промотора и нуклеотиды необходимые для формирования соответствующего комплекса инкубировали 5 минут с белком указанным в строке «1».

Далее добавляли белок указанный в строке «2», продолжали инкубацию 5 минут и добавляли субстратную смесь нуклеотидов и гепарин. В результате определяли количество транскрипционных комплексов по количеству продуктов однократной транскрипции in vitro. Для выявления продуктов транскрипции каждого комплекса использована индивидуальная экспозиция. (e) Комплексы, формируемые HlyIIR с РНК полимеразами, детектированные методом задержки в геле. Образцы содержали избыток HlyIIR (дорожки 1-2, 4-5, 7-8) и РНК полимеразы Thermus thermophilus (дорожки 2, 3) B. subtilis (дорожки 5, 6) и E. coli (дорожки 7, 8). (f) Комплексы, формируемые HlyIIR, РНКП B. subtilis на промоторе PhlyII771 выявленные методом ДНКазного футпринтинга. Справа показана матричная цепь, слева – нематричная. Использовался Na-глутаматный буфер, время стадий инкубаций с HlyIIR, гепарином и ДНКазой I было сокращено до 10 секунд. Для формирования ТК-2+HlyIIR HlyIIR добавляли к заранее сформированному ТК-2. Белой полосой выделена зона защиты HlyIIR, черной полосой – зоны защиты стабилизированной РНКП (ТК-2).

В случаях, когда РНКП добавлялась к заранее сформированному комплексу HlyIIR-PhlyII771, HlyIIR уменьшал количество образуемых продуктов транскрипции даже в присутствии нуклеотидов позволяющих формировать более стабильные, чем ОК транскрипционные комплексы (см. рис. 5d). Однако когда HlyIIR добавлялся к комплексам РНКП-промотор, ингибирование транскрипции наблюдалось на стадиях ОК, ТК-2 и, незначительно, ТК-7. Принимая во внимание, что степень ингибирования обратно пропорциональна периоду полураспада транскрипционных комплексов, можно предположить, что для проявления эффекта ингибирования HlyIIR необходима стадия, где он может конкурировать с РНКП за участок взаимодействия с ДНК.

Ранее, исходя из данных, полученных для РНКП E. coli, высказывалось предположение, что HlyIIR влияет на процесс изомеризации ЗК ОК. Также было показано, что HlyIIR способен формировать тройной комплекс: HlyIIR-РНКП-PhlyII (Budarina et. al, 2004). В этой работе мы выявили свойство HlyIIR формировать комплексы с РНКП Bacillus subtilis, Escherichia coli и Thermus thermophilus (см. рис. 5e).

Тройные комплексы РНКП B. subtilis–HlyIIR–PhlyII771, ввиду их малого периода полураспада, было невозможно зафиксировать. Однако, методом ДНКазного футпринтинга, удалось выявить четверной комплекс, где РНКП стабилизирована РНКДНК гетеродуплексом длиной 2 пн (ТК-2-HlyIIR) (см. рис. 5f). Зона защиты от ДНКазы I РНКП B. subtilis в составе ТК-2 на промоторе PhlyII771 отличалась от зоны защиты, описанной Будариной и др. для РНКП E. coli (Budarina et. al, 2004). Так, видны более четкие участки защиты в районе UP-элемента: в позициях матричной -64, -55, -45 и нематричной цепей; сайт гиперчувствительности наблюдается только в положении -39 матричной цепи; участок защиты четверного комплекса представляет собой сумму зон защиты отдельно взятых ТК-2 и HlyIIR. Поскольку, при добавлении HlyIIR к ТК-2, происходило дополнительное экранирование зон -70, -49/-50 и - матричной цепи и -38, -60/-65 нематричной цепи, HlyIIR в четверном комплексе взаимодействует с дистальным и проксимальным операторами. Принимая во внимание быстрый распад ЗК и ОК можно предположить, что, после добавлении HlyIIR к заранее сформированному ТК-2, HlyIIR связывается с оператором, вытесняя CTD РНКП с UPэлемента, но молекула РНКП удерживается в области «-10» элемента за счет 2 пн РНКДНК гетеродуплекса.

Достижение динамического равновесия при формировании ОК на промоторах PhlyII370 и PhlyII771 и период их полураспада составляют менее 20 секунд при 36 оС (рис 4b, дорожки 1, 2). Снижение температуры вызывает постепенное уменьшение количества формирующегося ОК и оказывает одинаковый эффект на PhlyII370 и PhlyII771, приводя к приблизительно двух- трехкратному уменьшению количества продуктов транскрипции при снижении температуры на каждые 3 оС (рис 6a). При проведении реакции при 24 оС удается отслеживать накопление ОК для PhlyII370, которое происходит значительно медленнее по сравнению с PhlyII771 (рис 6b). Причина этого эффекта, по-видимому, связана с отсутствием специфического контакта между CTD-РНКП в ОК, формируемом на PhlyII370. HlyIIR, несмотря на то что формирует комплексы с РНКполимеразами, не стабилизирует ТК-2 на промоторе, поскольку периоды полураспада ТК-2 и ТК-2-HlyIIR сопоставимы (не показано). При выбранных нами условиях не зафиксировано значительного эффекта HlyIIR на скорость покидания РНКП промотора PhlyII771 (не показано).

Поскольку оба промотора формируют одинаковые стабильные тройные (РНКПпромотор-РНК) ТК, обладающие сходным периодом полураспада, и скорости покидания РНК-полимеразой промоторов PhlyII370 и PhlyII771 одинаковы, можно предполагать одинаковый ход инициации транскрипции на стадиях после образования ОК. По-видимому, необходимость взаимодействия CTD – UP-элемент важна только на ранних стадиях инициации транскрипции – до образования ОК.

Из вышеприведенных результатов можно выдвинуть следующую модель ингибирования транскрипции белком HlyIIR на PhlyII771. HlyIIR связывается с промотором на участке, который одновременно отвечает за взаимодействие с CTD РНКП (см. рис. 5f). Таким образом, HlyIIR, находясь на своём операторе, блокирует доступ CTD РНКП к ДНК UP-элемента. Поскольку HlyIIR и ТК-2 могут присутствовать на ДНК промотора одновременно, а транскрипционную активность РНКП проявляет даже на матрице укороченной до -30 нуклеотида, диссоциация HlyIIR для формирования ИТК с РНКП не является обязательной. Однако без контактов с промотором, образуемых посредством CTD, снижается скорость формирования ОК до скорости, характерной для промотора PhlyII370, где РНК-полимераза взаимодействует лишь с «-10» элементом промотора.

Регуляция гена цитотоксина К: PlcR стимулирует образования открытых комплексов на промоторах генов цитотоксина К, plcR и papR.

Известно, что для активации экспрессии гена цитотоксина К in vivo, необходим PlcR и его коактиватор PapR. Однако до сих пор экспериментально не изучены механизмы взаимодействия РНКП с промотором cytK и, как следствие, влияние PlcR на это взаимодействие. Поскольку PlcR является автоактиватором, т.е. активирует экспрессию своего собственного гена и гена papR, кодирующего пептид активирующий PlcR, для изучения эффекта, оказываемого PlcR на инициацию транскрипции, использовали промоторы cytK, а также plcR и papR. В случае CRP E. coli смещение оператора лишь на 1 нт, относительно сайта инициации транскрипции, может привести к смене активации на репрессию (Davis at al., 2005). Однако в случае активации, опосредованной PlcR, расстояние между задней границей «-10» элемента промотора и оператором PlcR варьирует в диапазоне от 19 пн до 38 пн (Gohar et. al, 2008). В частности, для гена cytK оно составляет 27 пн, а для papR и plcR - 22 пн. Еще одной особенностью PlcR-зависимых промоторов является отсутствие четко выраженных последовательностей «-35» элементов.

Участки взаимодействия PlcR c промоторами были подтверждены методом ДНКазного футпринтинга и полностью совпадали с позицией PlcR-бокса (см. рис. 7а, с). ДНКазный футпринтинг не выявил ОК, формируемые на промоторах cytK, papR и plcR, в отсутствии PlcR, а KMnO4 футпринтинг позволил детектировать лишь ОК промоторов генов cytK и papR, и лишь при использовании 20 вместо 1 мМ KMnO4 (см.

рис. 7b). По-видимому, РНКП B. subtilis более эффективно взаимодействует с промоторами генов cytK и papR, поскольку в отличие от промотора plcR они содержат «-10 удлиненные» элементы (см. рис. 7с). В случае одновременного присутствия PlcR и PapR наблюдалось увеличение количества ОК. Расстояние между задними границами транскрипционных пузырьков и PlcR-боксами для промоторов papR и cytK составляло 23 пн и 28 пн, соответственно, подтверждая, что расстояние между PlcR и РНКП на активируемых промоторах может варьировать. Можно предполагать, что PlcR способен взаимодействовать с несколькими эпитопами молекулы РНКП, например, такими как Рис. 7. (a) Картирование районов взаимодействия PlcR с промоторами генов plcR, papR и cytK при помощи ДНКазного футпринтинга (показаны матричные цепи). Над треками указаны концентрации PlcR (нM) и названия промоторов. (b) KMnO4 футпринтинг РНКП на промоторах papR и cytK. (c) Схема, описывающая взаимодействия PlcR и РНК-полимеразы с промоторами. Жирным шрифтом выделены консенсусные элементы промотора и сайт связывания PlcR (5’-ATGhAwwwwTdCAT-3’, где h – A или Т или С; d – А или Т или С; W – А или Т). Подчеркнутым курсивом выделена последовательность ДНК, совпадающая с последовательность мРНК. Закрашенными треугольниками обозначены участки чувствительности к KMnO4. Прямоугольниками обозначены зоны защиты PlcR при ДНКазном футпринтинге. Символом «Н» обозначены участки гиперчувствительности к ДНКазе I.

CTD, NTD, 4.2, выбирая наиболее предпочтительный в зависимости от расстояния между сайтом старта транскрипции и PlcR-боксом.

Методом нативного электрофореза в градиентном полиакриламидном геле удалось выявить комплексы PlcR с РНК-полимеразами B. subtilis и E. coli, но не Thermus thermophilus (cм. рис. 8a). Формирование комплексов PlcR с РНК-полимеразой B. subtilis наблюдалось при концентрации PlcR 4-8 мкМ и не зависело от наличия PapR (см. рис. 8b). Образование комплексов с промоторами детектировалось при концентрации 100-200 нМ, только в присутствии 0.1 мМ PapR (см. рис. 8c). Поскольку PlcR, образует комплексы с промоторами при более низкой концентрации, чем с РНКП, по-видимому, на первом этапе активации происходит связывание PlcR с ДНК. В результате чего на промоторе появляется дополнительный аффинный к РНКполимеразе участок, который позволяет более прочно удерживать РНКП на промоторе, что приводит к увеличению количества продуктов транскрипции.

Рис. 8. (a, b) Электрофореграммы комплексов PlcR и РНКП T. thermophilus, B. subtilis и E. coli, разделенных в градиентном полиакриламидном геле 4-15% (GE healthcare). (c) Комплексы PlcRзависимых промоторов и PlcR разделенные в 2% агарозном геле, содержащем 0.1 мМ PapR. (e) Влияние PlcR на образования открытых комплексов, детектированное методом однократной транскрипции in vitro. Черными стрелками маркированы продукты транскрипции соответствующие ранее определенным промоторам; незаполненной стрелкой отмечен продукт образующегося с промотора PpapRas, ингибируемого PlcR.

Несмотря на то, что РНК-полимеразы E. coli и B. subtilis формировали комплекс с PlcR, активация транскрипции происходила только в случае РНКП B. subtilis (см. рис.

8d). Это наблюдение можно объяснить, как отсутствием «правильного» взаимодействия между PlcR и РНКП E. coli на выбранных для эксперимента промоторах, так и кинетическими особенностями инициации транскрипции РНКП этих видов бактерий.

Отдельно взятые субъединицы РНК-полимеразы B. subtilis не формировали комплексов с PlcR (не показано). Следовательно, можно предполагать, что эпитоп(ы) РНКП отвечающие за взаимодействие с PlcR присутствуют только на целой молекуле РНКП и/или может состоять из участков нескольких субъединиц РНКП.

PlcR ингибирует синтез антисмыслового транскрипта к собственной мРНК.

Вблизи промотора PpapR был выявлен дополнительный промотор PpapRas.

Транскрипционный пузырек, соответствующий этому промотору локализован на расстоянии 8 пн от PlcR-бокса (см. рис 7(b,c)). Расстояние между границами транскрипционных пузырьков PpapR и PpapRas составляет не более 6 нуклеотидов. Таким образом, две молекулы РНКП не могут одновременно находиться на этих двух промоторах. Однако оба промотора детектируются методом KMnO4 футпринтинга, поскольку в ходе реакции образуется смесь двух открытых комплексов. Исходя из длин дополнительного продукта наблюдаемого в реакции транскрипции in vitro, промотор PpapRas является дивергентным по отношению к PpapR. Следовательно, синтезирующаяся с PpapRas молекула РНК, является антисмысловой по отношению к мРНК гена plcR (гены plcR и papR расположены тандемно) и, по этой причине, может влиять на его экспрессию. В случае активации PpapR вызванной PlcR-PapR происходит снижение количества открытого комплекса соответствующего PpapRas (рис. 7b) и количество соответствующего продукта транскрипции (рис. 8d). Можно предположить, что молекула РНК, синтезирующаяся с промотора PpapRas, является важным элементом PlcR-регулона, функция которого сводится к подавлению экспрессии гена plcR, до момента «включения» регуляции «чувства кворума» опосредованной накоплением PapR.

Кинетические особенности PlcR-зависимых промоторов При проведении реакции формирования ОК при температуре 36 оС, равновесие достигается менее чем через 30 секунд после введения РНКП (см. рис. 9a). В случае понижения температуры реакционной смеси до 18 оС удается более детально отследить кинетику: скорость формирования ОК в случаях, если PlcR присутствует на промоторах, увеличивается (см. рис. 9c-e). В тоже время, PlcR незначительно влияет на скорость диссоциации ОК. Период полураспада ОК для промотора cytK равен приблизительно 30 секундам, как в присутствии, так и в отсутствии PlcR (см. рис. 9b).

Отсутствие зоны защиты при ДНКазном футпринтинге РНКП на промоторах генов plcR, papR и cytK также косвенно указывает на их малый период полураспада, повидимому, равный нескольким секундам. Таким образом, быстрый обмен молекул РНКП на PlcR-зависимых промоторах напоминает поведение РНКП на промоторе гена гемолизина II.

Рис. 9. Характеристика кинетики взаимодействия РНКП с промоторами генов токсинов. (a, b) Кинетика ассоциации и диссоциации с промотором cytK при 36 оС. (c-d) Кинетика ассоциации РНКП c промоторами генов plcR (c), papR (d) и cytK (e) при 18 оС. Количество сформировавшегося ОК определяли методом однократной транскрипции in vitro. Внизу графика показаны фрагменты радиоавтографов; чувствительность радиоавтографов выровнены для каждой кинетической реакции.

Непрерывная линия графика радиоавтограф отмеченный «+» соответствует реакции в присутствии PlcR и PapR; «-» и штриховая линия – реакции без PlcR и без PapR.

Можно предположить следующий механизм действия PlcR. В присутствие PapR, он связывается со своим оператором вблизи «-10» элемента промотора. Вследствие связывания PlcR РНК-полимераза получает дополнительный контакт с ДНК и, как следствие, увеличивается скорость образования ЗК и/или скорость изомеризации ЗКОК.

1. Определены частоты встречаемости генов cytK, hlyII, hlyIIR среди 40 природных изолятов бактерий группы Bacillus cereus и описан полиморфизм генов токсинов.

Показано, что близкими ПДРФ типами генов обладают штаммы из одних и тех же фингерпринтных кластеров. Ген hlyIIR встречается только совместно с геном гемолизина II.

2. Выявлено, что гемолизин II – доминирующий гемолитический фактор Bacillus cereus, в отсутствии HlyIIR.

3. Обнаружена группа близкородственных микроорганизмов B. cereus и B. thuringiensis несущих аллель гена гемолизина II с делецией двух регуляторных элементов промотора: cis-активирующего UP-элемента и оператора для HlyIIR.

4. Охарактеризованы транскрипционные комплексы, образующиеся на промоторе гемолизина II, и содержащие РНК-ДНК гетеродуплексы длиной 2, 7 и 12 пн.

5. Установлено, что для открытых комплексов, формируемых на промоторах генов hlyII, cytK, plcR и papR B. cereus, характерен малый период полураспада.

6. Для промоторов генов cytK, plcR, papR и hlyII определены стадии инициации транскрипции, на которые оказывают влияние регуляторы PlcR и HlyIIR.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Шадрин А.М., Шапырина Е.В, Сиунов А.В., Северинов К.В., Солонин А.С.

Пороформирующие токсины Bacillus cereus гемолизин II и цитотоксин К: полиморфизм и распределение генов среди представителей цереусной группы. Микробиология. Июль-Август; том 76(4): с. 462-70.

2. Sineva E.V., Andreeva-Kovalevskaya Z.I., Shadrin A.M., Gerasimov Y.L., Ternovsky V.I., Teplova V.V., Yurkova T.V., Solonin A.S. Expression of Bacillus cereus hemolysin II in Bacillus subtilis renders the bacteria pathogenic for the crustacean Daphnia magna. FEMS Microbiol Lett. 2009 Jul 31. vol. 299 issue 1, p. 110-119.

3. Cmara B, Liu M, Reynolds J, Shadrin A, Liu B, Kwok K, Simpson P, Weinzierl R, Severinov K, Cota E, Matthews S, Wigneshweraraj SR. T7 phage protein Gp2 inhibits the Escherichia coli RNA polymerase by antagonizing stable DNA strand separation near the transcription start site. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 2;107(5):2247-52.

4. Шадрин А.М., Шапырина Е.В., Поларшинова О.Н., Сиунов А.В., Солонин А.С.

распределение генов бета-складчатых-пороформирующих токсинов в изолятах группы B. cereus: цитотоксина К и гемолизина II. Сборник тезисов 10-ой Международной 5. Родикова Е.А., Майоров С.Г., Шадрин А.М., Солонин А.С. Белок Fur – негативный регулятор транскрипции гена гемолизина II. Сборник тезисов 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века».

Пущино. 2006.

6. Шадрин А.М., Шапырина Е.В., Родикова Е.А., Проценко А.С., Солонин А.С. UPэлемент промотора гена гемолизина II B. cereus необходим для его экспрессии.

Сборник тезисов 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века». Пущино. 2007.

7. Шапырина Е.В., Шадрин А.М. Редокс-чувствительная система сигнальной трансдукции ResDE участвует в регуляции экспрессии гемолизина II цереусной группы микроорганизмов. Сборник тезисов 12-ой Международной Пущинской школыконференции молодых ученых «Биология – наука 21 века». Пущино. 2008.

8. Shadrin A., Shapyrina E., Rodikova E., Kovalevskiy O., Protsenko A., Solonin A., Severinov K. The mechanism of regulation of Bacillus cereus hemolysin II gene promoter.

CSHL Meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, NY, August 20-24, 2008.

9. Andreeva-Kovalevskaya Z.I., Sineva E.V., Ternovsky V.I., Shadrin A.M, Gerasimov Y.L., Teplova V.V., Nesterenko V.F. and Solonin A.S. Functional importance of B. cereus hemolysin II: molecular mechanism of phatogenesis. International Conference on Grampositive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8, 2008.

10. Solonin A.S., Shadrin A.M., Kovalevskiy O.V., Rodikova E.A., Shapyrina E.V., Budarina Z.I., Protsenko A.S., Sineva E.V. Transcription factors interplay in the regulation of hemolysin II gene expression. International Conference on Gram-positive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8, 2008.

11. Шапырина Е.В., Шадрин А.М., Солонин А.С. Регуляция экспрессии гена гемолизина II цереусной группы микроорганизмов двухкомпонентной системой сигнальной трансдукции ResDE. Сборник тезисов 13-ой Международной Пущинской школыконференции молодых ученых «Биология – наука 21 века». Пущино. 2009.

12. Zh. I. Andreeva-Kovalevskaya, E. V. Sineva, V. I. Ternovsky, A.M. Shadrin, Y. L.

Gerasimov, V. V. Teplova, V. F. Nesterenko, A. S. Solonin. Bacillus cereus hemolysin II and its various applications. Book of abstracts III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2009), 2009, p. 778.

13. Шадрин А.М., Солонин А.С., Северинов К.В. Регуляция экспрессии генов токсинов Bacillus cereus. Сборник тезисов 14-ой Международной Пущинской школыконференции молодых ученых «Биология – наука 21 века». Пущино. 2010.