На правах рукописи

НИКИШИН Денис Александрович

ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ

ДОНЕРВНОЙ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ШПОРЦЕВЫХ ЛЯГУШЕК И МОРСКИХ ЕЖЕЙ

03.03.01 – физиология

03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена в группе эмбриофизиологии лаборатории проблем регенерации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, Шмуклер Юрий Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Балезина Ольга Петровна Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор Исаева Валерия Васильевна Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита состоится 27 мая 2013 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, аудитория М-

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 26 апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Один из классических нейромедиаторов, серотонин выполняет, помимо нейротрансмиссии, множество ненервных функций, в том числе участвует в важнейших процессах индивидуального развития. Серотонинергическая сигнальная система хорошо изучена на нервных клетках взрослых млекопитающих:

для всех ее компонентов известны гены, нуклеотидные и аминокислотные последовательности, исследованы структура и механизмы их функционирования.

Исследованы механизмы некоторых ненервных функций серотонина, в частности его роль в системе свертывания крови и регуляции тонуса сосудов. Особое место занимают открытые более 50 лет назад Г.А. Бузниковым функции серотонина в эмбриональном и личиночном развитии. За этот период накоплено большое количество физиологических и биохимических данных, свидетельствующих о присутствии серотонина в эмбрионах, начиная с самых ранних стадий развития, о многочисленных специфических эффектах этого вещества и его аналогов, на раннее эмбриональное развитие, а также о механизмах этих эффектов. В то же время молекулярно-биологические исследования компонентов эмбриональной серотонинергической системы до сих пор остаются немногочисленными и разрозненными.

В настоящее время исследования в области биологии развития, в том числе ранних этапов онтогенеза, ведутся чрезвычайно активно. Это связано как с общим интересом к собственно раннему развитию, так и, в частности, с большим сходством эмбриональных и опухолевых тканей. В свете современных достижений в этих областях на первый план выходит выяснение молекулярных основ раннего развития.

Важное место в этих работах занимает изучение сигнальных путей, контролирующих ранние этапы эмбриогенеза. Учитывая широкий спектр функций серотонина и множество его эмбриональных эффектов, можно полагать, что серотонин является одним из сигнальных веществ, регулирующих раннее развитие. Исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы на молекулярном уровне может пролить свет на механизмы регуляции процессов раннего эмбриогенеза.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в обзорном исследовании экспрессии компонентов донервной серотонинергической системы в раннем эмбриогенезе двух классических объектов биологии развития – шпорцевой лягушки Xenopus и морского ежа. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

исследовать экспрессию генов, гомологичных компонентам серотонинергической системы, в раннем развитии морских ежей и функциональную активность компонентов, экспрессирующихся на ранних стадиях развития;

исследовать экспрессию генов компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Xenopus и выявить гены, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития, для дальнейшего исследования;

исследовать количественно уровень и динамику экспрессии этих генов в течение раннего развития Xenopus;

исследовать пространственное распределение в ранних эмбрионах Xenopus мРНК генов серотонинергической системы;

исследовать на уровне трансляции экспрессию генов серотонинергической системы, выявленных в раннем эмбриогенезе Xenopus;

выявить возможные источники материнского (ооцитарного) серотонина путем анализа экспрессии генов ферментов синтеза серотонина.

Научная новизна. На классической экспериментальной модели – эмбрионах Xenopus впервые проведено комплексное исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы. Впервые была исследована экспрессия всех компонентов серотонинергической системы на одном экспериментальном объекте.

';

Показано, что на ранних стадиях развития Xenopus, в составе материнской мРНК экспрессируются основные компоненты, необходимые для осуществления сигнальной функции – везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7 и транспортер обратного захвата SERT, а также ферменты синтеза серотонина TPH2 и AAAD. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК HTR1E, HTR5 и SERT X. laevis (NCBI Nucleotide ID: KC477213, KC477214 и JQ001861). Количественно исследованы уровень, динамика экспрессии и пространственное распределение транскриптов основных компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus, и их экспрессия на уровне трансляции. Показано, что на ранних стадиях эмбриогенеза Xenopus не экспрессируется основной фермент деградации серотонина MAOA. Выявлено, что ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках.

Впервые проведен анализ экспрессии гомологов генов компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей, являющихся классическим объектом исследования донервных функций нейротрансмиттеров.

Показано, что на ранних стадиях развития экспрессируются гомологи рецепторов серотонина четырех типов, транспортера серотонина SERT, фермента деградации серотонина MAOA и в течение донервного развития начинают экспрессироваться гомологи везикулярного транспортера моноаминов VMAT, и ферментов синтеза серотонина. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК SERT, VMAT P. lividus. Функциональная активность компонентов систем синтеза и обратного захвата подтверждена экспериментально. Полученные результаты являются первыми молекулярно-биологическими свидетельствами экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей.

Научная и практическая значимость работы. В работе получены результаты, представляющие фундаментальный научный интерес. В частности, продемонстрировано, что рецепторы серотонина, экспрессирующиеся в раннем развитии, гомологичны или идентичны дефинитивным рецепторам нервных клеток.

Показана экспрессия на ранних донервных стадиях развития нейральной формы фермента синтеза серотонина. Показано, что набор типов рецепторов серотонина, экспрессирующихся в раннем развитии, консервативен, по крайней мере, среди позвоночных. Выполнено исчерпывающее сравнительное обзорное исследование, в результате которого выявлены гены серотонинергической системы, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития и, возможно, принимающие участие в реализации донервных функций серотонина. Полученные результаты могут быть использованы как основа для дальнейших практических и теоретических исследований донервных функций серотонина и других нейротрансмиттеров.

Разработанный методический подход может быть использован для исследования других нейротрансмиттерных систем в раннем развитии.

Личное участие автора. Автор непосредственно участвовал как в планировании работы, сборе материала, отработке экспериментальных методов, постановке экспериментов, получении всех результатов, так и в их дальнейшей обработке и интерпретации. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования и подготовке основных публикаций по выполненной работе.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на VII и VIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011), Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), VI и VII Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2010, 2011), II Объединенном симпозиуме Французского и Британского обществ биологии развития (Ницца, Франция, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 21 рисунок и 4 таблицы, состоит из следующих разделов: Список сокращений, Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы, включающий цитируемый источник.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, статья в сборнике и глава в монографии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение и фиксация проб. В работе использовали зародышей шпорцевых лягушек Xenopus laevis (Daudin, 1802) и Xenopus (Silurana) tropicalis (Gray, 1864) и средиземноморского морского ежа Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816).

Искусственное оплодотворение и инкубация зародышей, а также микрохирургические манипуляции (Рис. 3Г) проводились с использованием стандартных методик (Sive et al., 2010; Бузников, Подмарев, 1975). Для последующего выделения РНК образцы фиксировали в RNAlater (Ambion, США). Для проведения гибридизации in situ зародыши фиксировали в растворе MEMFA, и хранили в этаноле при –20C. Для иммуногистохимического исследования эмбрионы фиксировали в 4% параформальдегиде и хранили в метаноле при –20C.

Иммуногистохимическое окрашивание проводили поликлональными антителами против серотонина (Chemicon, США) и вторичными антителами, конъюгированными с Atto 633 (Sigma, США). Ядра докрашивали DAPI (Sigma, США).

Препараты просматривали на конфокальном микроскопе Olympus FluoView FV10i (Центр коллективного пользования МГУ им. М.В. Ломоносова). Интенсивность иммунофлуоресценции полученных изображений измеряли в программе ImageJ (NIH), статистическую обработку проводили в программе STATISTICA (StatSoft).

Выделение тотальной РНК проводили с применением TRI Reagent (Sigma, США). Полирибосомная и информосомная РНК была любезно предоставлена коллегами из лаборатории регуляции биосинтеза белка Института Биохимии им. А.Н.

Баха РАН. Для удаления примеси геномной ДНК, РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, Германия). РНК переосаждали в 4 M LiCl, концентрацию обработанной РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Евроген, Россия) и рандомных гексануклеотидов (Силекс, Россия).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили с помощью набора Colored-Taq (Силекс, Россия) и специфических олигонуклеотидов (Литех, Россия) на амплификаторе MJ Mini Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, США). ПЦР в реальном времени проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием смеси qPCRmix-HS SYBR+ROX (Евроген, Россия). Расчет относительной экспрессии гена проводили методом Ct с учетом эффективности ПЦР, определенной методом построения стандартных кривых (Bookout et al., 2005). Анализ продуктов ПЦР, плазмид и их фрагментов проводили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием (0, мкг/мл). Гели просматривали и фотографировали с помощью системы документации Gel Doc XR (Bio-Rad Laboratories, США), далее изображения обрабатывали в программе Quantity One 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories, США). Продукты ПЦР и рестрикционные фрагменты выделяли из кусочков агарозного геля, содержащих необходимую полосу, на спин-колонках с помощью набора Cleanup Mini (Евроген, Россия). Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили в компании Евроген, Россия.

Конструирование векторов. Продукты ПЦР для секвенирования (SERT, HTR1E) и синтеза РНК-зонда (HTR7, VMAT2) получали с помощью Pfu-полимеразы, после чего концы аденилировали с помощью Taq-полимеразы и клонировали в вектор pAL-TA (Евроген, Россия). Лигирование проводили с по мощью T4 лигазы (Fermentas, Германия). Для трансформации использовали компетентные клетки E. coli штамма XL-blue (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК из ночной культуры бактерий проводили с помощью Набора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия).

Гибридизация in situ. Синтез зонда проводили на продуктах ПЦР, полученных с использованием T7 и SP6 праймеров и плазмид pAL-HTR7 и pAL-VMAT2, с использованием дигоксигенин-11-УТФ (Roche, Германия) и РНК-полимераз T7 и SP (Fermentas, Германия). Процедуру гибридизации in situ на целых зародышах (WISH), проводили по стандартному протоколу (Harland, 1991). Выявление зонда проводили с использованием конъюгированных со щелочной фосфатазой антител к дигоксигенину (Roche, Германия) и субстрата для щелочной фосфатазы BM Purple (Roche, Германия).

Препараты обесцвечивали H2O2 и хранили в 96% этаноле при 4°С.

Рис. 1. ОТ-ПЦР анализ экспрессии компонентов серотонинергической системы в развитии морских ежей и шпорцевых лягушек. (А) Экспрессия рецепторов и транспортеров серотонина в эмбриогенезе P. lividus. 3 – зигота; Д – дробление; РБ – ранняя бластула; МБ – мезенхимная бластула; Пр – призма;

Пл - плутеус. (Б) Экспрессия компонентов серотонинергической системы в эмбриогенезе X. laevis. O – ооцит; 2 – 2 бластомера; 8 – средняя бластула; 9 – поздняя бластула; 10 – ранняя гаструла; Н – нейрула;

В – вылупление; Г – головастики; Oo – ооциты без студенистой оболочки; Об – студенистые оболочки. (В) Экспрессия компонентов серотонинергической системы в эмбриогенезе X. tropicalis. 3 – зигота; Д – дробление; 8 – средняя бластула; 9 – поздняя бластула; 10 – ранняя гаструла; Н – нейрула;

В – вылупление; Г – головастики. (Г) Экспрессия ферментов синтеза серотонина в яичнике X. laevis. Я – целый яичник; O – незрелые ооциты (стадии I-III); Ф – фолликулярная оболочка. (Д) Исследование трансляции мРНК генов HTR2C, HTR7 и VMAT2 на стадии средней гаструлы X. laevis. ПРС – фракция полирибосом; ИС – фракция информосом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей ОТ-ПЦР анализ экспрессии гомологов рецепторов и транспортеров серотонина показал, что в течение эмбриогенеза P. lividus, в том числе на самых ранних его стадиях, экспрессируются гены, гомологичные HTR1A, HTR2B, HTR4 и рецептору серотонина неизвестного типа (HTR), а также транспортеру SERT, тогда как ген, гомологичный VMAT, не экспрессируется до стадии гаструлы (см. Рис. 1А). Кроме того, BLAST-анализ базы данных NCBI EST выявил клоны, выделенные из эмбрионов морских ежей на ранних стадиях развития, и гомологичные генам ферментов синтеза и деградации серотонина (фенилаланин/триптофан гидроксилазе, AAAD и MAOA).

Исследование функциональной активности компонентов серотонинергической системы проводили с помощью иммуногистохимического окрашивания серотонина в клетках бластул P. lividus. В контрольных эмбрионах, помимо слабого окрашивания цитоплазмы, выявляется яркое точечное иммуноокрашивание, распределенное равномерно по всей клетке. По всей вероятности, таким образом выявляется серотонин, накопленный в везикулах (см. Рис. 2А). Окрашивание эмбрионов, инкубированных в ингибиторе TPH парахлорфенилаланине (PCPA, 100мкМ), показало снижение уровня серотонина по отношению к контролю (см. Рис. 2Г и Д), что говорит об активности TPH на ранних стадиях развития морского ежа.

Иммуногистохимическое окрашивание бластул, инкубированных в предшественнике серотонина 5-гидрокситриптофане (HTP, 100мкМ), выявило значительное увеличение количества серотонина в клетках (см. Рис. 2Д), что говорит об активности AAAD. При этом значительно увеличивается число везикул, и часть из них локализуется вдоль латеральных поверхностей клеток (см. Рис. 2В). Для проверки активности обратного захвата серотонина мы провели инкубацию эмбрионов морского ежа в серотонине (100мкМ). Последующее иммуноокрашивание показало, что концентрация серотонина в клетках увеличилась (см. Рис. 2Д). Следует отметить, что добавление экзогенного серотонина не приводит к заметному увеличению количества везикул, в отличие от эндогенно синтезированного серотонина (см. Рис. 2Б).

Таким образом, на ранних стадиях развития морских ежей экспрессируются гомологи компонентов систем синтеза серотонина, рецепции, обратного захвата и деградации. Функциональная активность системы синтеза и обратного захвата серотонина подтверждена экспериментально.

Экспрессия компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Xenopus Временной характер экспрессии всех рецепторов серотонина в эмбриональном развитии X. tropicalis и X. laevis был экспериментально исследован методом ОТ-ПЦР (см. Рис. 1Б и В). На ранних стадиях развития выявлена экспрессия рецепторов HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7. После включения зиготического генома на донервных стадиях развития начинают экспрессироваться также рецепторы HTR1B, HTR3A и HTR3B. Экспрессия рецепторов HTR1A, HTR1D, HTR1F, HTR2A, HTR2B, HTR3C, HTR4 и HTR6 выявляется только на нейральных стадиях развития. Стоит отметить, что временной характер экспрессии рецепторов, исследованных на обоих видах Xenopus, совпадает.

ОТ-ПЦР анализ экспрессии транспортеров серотонина в эмбриональном развитии Xenopus (см. Рис. 1Б и 1В) показал, что на ранних стадиях развития X. laevis экспрессируется VMAT2, тогда как в раннем эмбриогенезе X. tropicalis – VMATN.

Остальные типы везикулярных транспортеров экспрессируются на нейральных стадиях развития. Анализ нуклеотидных последовательностей трех везикулярных транспортеров X. tropicalis в программе MegAlign показал, что VMATN имеет большее сходство с VMAT2, чем с VMAT1, поэтому можно предполагать, что этот тип транспортера является гомологом VMAT2. Анализ экспрессии SERT показал, что он экспрессируется на всех стадиях развития как X. tropicalis, так и X. laevis (см. Рис. 1Б и 1В).

Временной характер экспрессии генов ферментов синтеза и деградации серотонина был исследован методом ОТ-ПЦР в эмбриональном развитии X. laevis (см.

Рис. 1Б). мРНК TPH1 не выявляется до стадии ранней гаструлы, тогда как TPH2 и AAAD экспрессируются на всех стадиях развития. MAOA не экспрессируется на ранних стадиях развития X. laevis до стадии нейрулы (см. Рис. 1Б). Экспрессия MAOA, выявляемая в пробе ооцитов, связана со студенистыми оболочками, присутствующими в этой пробе и снятыми с более поздних стадий развития, что подтверждено анализом экспрессии MAOA в ооцитах со снятыми оболочками и в смывах оболочек (см. Рис. 1Б).

Для того чтобы выяснить возможный источник материнского серотонина, накопленного в ооцитах, были получены библиотеки кДНК из проб яичника, ооцитов на ранних стадиях оогенеза и фолликулярных оболочек, на которых был проведен ПЦР-анализ экспрессии ферментов синтеза серотонина (см. Рис. 1Г). В яичнике экспрессируются все ферменты синтеза серотонина. AAAD экспрессируется как в незрелых ооцитах, так и в фолликулярных оболочках. При этом TPH1 экспрессируется Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание серотонина (красный) в клетках бластул P. lividus (А) в контроле и после инкубации в (Б) 5HT, (В) HTP и (Г) PCPA. Ядра окрашены DAPI. Масштабный отрезок 10 мкм. (Д) Средняя интенсивность иммунофлуоресценции серотонина в клетках бластул, инкубированных в соответствующих веществах. Отмечена стандартная ошибка среднего.

Достоверность по U-критерию Манна–Уитни: * p < 0,001.

Рис. 3. Динамика и пространственное распределение экспрессии генов HTR1E, HTR2C, HTR5, HTR7, VMAT2 и SERT в эмбриогенезе Xenopus. (A) Профили экспрессии в течение эмбриогенеза. ХП – хвостовая почка, обозначения остальных стадий – как на Рис. 1. (Б) Анимально-вегетативное распределение транскриптов. АШ – анимальная шапочка; МЗ – маргинальная зона; ВШ – вегетативная шапочка. (В) Распределение экспрессии в пределах анимальной шапочки. ЭК – эпителиальные клетки; СЭК – субэпителиальные клетки. (Г) Схема получения проб из бластулы.

Количественное исследование проведено методом ПЦР в реальном времени. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормализован по гену ODC и пробе с максимальным уровнем экспрессии. Отмечено стандартное отклонение.

в фолликулярных оболочках и не экспрессируется в незрелых ооцитах, тогда как TPH2 наоборот, экспрессируется в незрелых ооцитах и не экспрессируется в фолликулярных оболочках.

Таким образом, проведенный ПЦР-скрининг экспрессии компонентов серотонинергической системы в эмбриогенезе шпорцевых лягушек, показал, что на ранних донервных стадиях их развития экспрессируются гены, составляющие системы синтеза (TPH2, AAAD), везикулярного транспорта (VMAT2 или VMATN), рецепции (HTR1E, HTR2C, HTR5, HTR7) и обратного захвата (SERT) серотонина.

Уровень и динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии Xenopus Рецепторы и транспортеры серотонина, которые экспрессируются в раннем эмбриогенезе Xenopus, исследовали количественно методом ПЦР в реальном времени.

Экспрессию HTR2C, HTR7 и VMAT2 количественно исследовали в развитии X. laevis, а HTR1E, HTR5 и SERT – в развитии X. tropicalis (см. Рис. 3А). Количество мРНК исследуемых генов на ранних стадиях развития существенно различается. Уровень экспрессии VMAT2 относительно ODC составляет 43,9%, HTR7 – 4,9%, HTR1E – 0,33%, HTR5 – 0,015%. HTR2C – 0,002%, SERT – 0,0015%. Исследуемые гены также обладают разной динамикой экспрессии в течение раннего развития. Уровень экспрессии HTR1E максимален на стадии зиготы, после чего постепенно уменьшается к стадии нейрулы. Такой же динамикой в раннем развитии обладает экспрессия HTR2C. Количество мРНК HTR5 в течение раннего развития держится на довольно низком уровне, а после среднебластульного перехода постепенно повышается, достигая максимума на стадии вылупления. HTR7 экспрессируется в течение раннего развития приблизительно на одном уровне. Уровень экспрессии VMAT2 максимален на ранних стадиях развития и резко уменьшается к стадии нейрулы. Количество транскриптов SERT максимально на стадии вылупления, а в течение всего раннего развития держится на довольно низком уровне.

серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus Для выявления пространственного распределения мРНК исследуемых количественно генов по анимально-вегетативной оси ранних эмбрионов, была выполнена ПЦР в реальном времени на пробах анимальных шапочек, маргинальных зон и вегетативных шапочек поздних бластул X. laevis и X. tropicalis (см. Рис. 3Б).

Анимально-вегетативным градиентом обладает экспрессия HTR5 и VMAT2, причем HTR5 больше в вегетативной области, а VMAT2 – в анимальной. Остальные гены выраженного анимально-вегетативного градиента экспрессии не имеют.

Пространственное распределение мРНК генов HTR7 и VMAT2, экспрессирующихся в ранних эмбрионах X. laevis на довольно высоком уровне, было исследовано методом гибридизации in situ (см. Рис. 4). мРНК HTR7 и VMAT выявляется в ооцитах и дробящихся эмбрионах преимущественно в анимальном полушарии. На стадии бластулы экспрессия HTR7 выявляется по периферии всего зародыша, за исключением области вокруг вегетативного полюса, тогда как VMAT2 выявляется только в анимальном полушарии, почти полностью локализуясь в крыше бластоцеля.

Методом ПЦР в реальном времени также исследовано количественное соотношение относительной экспрессии генов в эпителиальных и субэпителиальных клетках крыши бластоцеля (см. Рис. 3В). Значимое различие в уровне экспрессии имеет только VMAT2, который экспрессируется преимущественно в эпителиальном слое. Уровень экспрессии остальных генов в эпителиальных и субэпителиальных клетках существенно не различается.

Экспрессия компонентов серотонинергической системы на уровне трансляции В заключение, для того чтобы оценить, экспрессируются ли исследуемые гены на уровне трансляции, был проведен ОТ-ПЦР анализ полирибосомальной и информосомной фракций РНК, выделенных на стадии средней гаструлы X. laevis (см.

Рис. 1Д). В методике выделения фракций РНК используется фиксация формальдегидом, поэтому полученные пробы могут эффективно использоваться для ПЦР с короткими ПЦР-продуктами. В информосомной фракции выявлены мРНК всех исследуемых генов, тогда как в полирибосомальной фракции выявляются мРНК HTR2C и VMAT2, а мРНК HTR7 – не выявляется и полностью локализована во фракции информосом. Полученный результат свидетельствует о том, что на стадии средней гаструлы транслируется мРНК HTR2C и VMAT2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ключевым звеном в серотонинергическом сигнальном механизме являются рецепторы серотонина. Исследовав весь набор известных рецепторов серотонина у Xenopus, мы показали, что на ранних стадиях эмбриогенеза экспрессируется четыре рецептора – HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7. Типы рецепторов серотонина, к которым принадлежат эти гены, обладают разными механизмами трансдукции сигнала: HTR2С активирует фосфоинозитольную систему вторичных мессенджеров, тогда как HTR активирует аденилатциклазу, а HTR1E и HTR5 ингибируют ее.

Рис. 4. Распределение мРНК генов HTR7 и VMAT2 в ранних эмбрионах X. laevis. Гибридизация in situ для (А-В) HTR7 и (Г-Е) VMAT2 выполнена на ооцитах (А, Г), дробящихся зародышах (Б, Д) и бластуле (В, Е) Зародыши разрезаны. Стрелками обозначен выявленный сигнал.

На ранних стадиях развития морских ежей тоже был выявлен набор генов, которые в международном проекте GNOMON охарактеризованы как гомологи рецепторов серотонина. В состав пула материнской мРНК, как и у Xenopus, входят гомологи HTR1 и HTR2, а также гомолог HTR4, который по взаимодействию с системами вторичных мессенджеров аналогичен HTR7, и транскрипт гена, являющегося гомологом рецептора серотонина неопределенного типа. При более детальном анализе аминокислотных последовательностей этих генов с помощью сервиса HMMTOP (Tusndy, Simon, 2001) было выявлено, что эти гены кодируют семидоменные GPCR, однако ни один из них не содержит в третьем трансмембранном домене остатка аспартата, консервативного для метаботропных рецепторов серотонина (Shi, Javitch, 2002). С учетом этого факта, пока обсуждаемые рецепторы не охарактеризованы экспериментально, вопрос об экспрессии рецепторов серотонина на в раннем развитии морских ежей остается открытым.

С целью выявить общие закономерности, полученные результаты сопоставлены с имеющимися литературными данными. Для доимплантационного развития мыши показана экспрессия HTR1D, HTR5 и HTR7 (Vesel et al., 2003; Hinckley et al., 2005;

Amireault, Dub, 2005б). При этом, в отличие от Xenopus, в раннем развитии мыши не экспрессируется ни один из подтипов HTR2 (Amireault, Dub, 2005). Однако показано, что HTR2A экспрессируется в ооцитах хомячка и человека (Miyazaki et al., 1990;

Neilson et al., 2000). В пределах класса позвоночных подобное исследование проводилось также на данио, для которого показана экспрессия HTR1A (Nikishin et al., 2009). Сопоставив вышеизложенные данные, с учетом их неполноты, и допуская некоторые исключения, можно полагать, что для раннего развития позвоночных характерна экспрессия рецепторов серотонина 1, 2, 5 и 7 типов. Что касается беспозвоночных, то в раннем эмбриогенезе C. elegans и дрозофилы выявлена экспрессия гомологов HTR2 (Hamdan et al., 1999; Colas et al., 1999). Учитывая полученные нами данные о возможной экспрессии гомолога HTR2B в раннем развитии морских ежей, можно полагать, что экспрессия тех или иных подтипов HTR является характерной для раннего развития всех животных.

Как мы видим, донервная серотонинергическая система включает несколько возможных механизмов функционирования, опосредованных несколькими рецепторами серотонина, экспрессирующимися в ранних эмбрионах. Стоит отметить, что на ранних стадиях донервного развития, наряду с серотонином, присутствуют и функционально активны и другие нейротрансмиттеры – ацетилхолин, адреналин, норадреналин, дофамин, гистамин (Бузников, 1967; Шмуклер и др., 1988). Таким образом, для ранних стадий донервного эмбриогенеза характерна не только множественность трансмиттерных систем, но и их комплексность и, по всей вероятности, многофункциональность.

Очевидно, что для одновременного функционирования нескольких рецепторов серотонина в одной клетке, необходима сложная регуляция их функционирования, за счет чего эти рецепторы могут экспрессироваться на разном уровне, иметь разную локализацию, по-разному компартментализоваться. Исследование пространственной локализации мРНК рецепторов серотонина в ранних эмбрионах Xenopus показало, что анимально-вегетативным градиентом обладает экспрессия HTR5, которая максимальна в вегетативной области. С учетом того, что в этой области происходят важнейшие индукционные процессы, определяющие первичную разметку презумптивных частей зародыша, в частности, ньюкуповская мезодермальная индукция (Nieukoop, 1969 – цит. по Gilbert, 2006), не исключено, что серотонин вовлечен в эти процессы посредством HTR5.

Количественное исследование динамики экспрессии рецепторов серотонина показало, что уровень экспрессии HTR1E и HTR2C стремительно понижается в течение раннего развития, тогда как относительная экспрессия HTR7 до стадии нейрулы находится примерно на одном уровне. Существенно отличается динамика экспрессии HTR5, которая минимальна на ранних стадиях развития и начинает расти после стадии средней бластулы, т. е. после включения зиготического генома.

Исследование полирибосомальной и информосомной фракций мРНК, выделенных из гаструл и сопоставление полученных результатов с динамикой экспрессии этих генов на данной стадии выявило следующую закономерность: мРНК генов, экспрессия которых уменьшается на ранних стадиях развития, присутствуют в полирибосомальной фракции, т.е. транслируются. Другими словами, на ранних стадиях развития Xenopus процесс трансляции материнской мРНК сопровождается ее деградацией. Возможно, это связано с тем, что материнские мРНК на ранних стадиях эмбрионального развития маскированы белками, что предотвращает их деградацию и несвоевременную трансляцию (Spirin, 1994). В таком случае, демаскирование материнской мРНК, необходимое для ее трансляции, может привести и к ее деградации. С другой стороны, известно, что процесс трансляции мРНК зависит от длины «полиаденильного хвоста», которая регулируется регуляторными цисэлементами в составе 3 нетранслируемой области (3 UTR) мРНК: наличие CPE (cytoplasmic polyadenylation element) определяет полиаденилирование и активацию трансляции при активации созревания ооцита (Paynton, Bachvarova, 1994). Анализ последовательностей с помощью сервиса RegRNA (Chang et al., 2013) показал, что мРНК генов HTR1E и HTR2C имеют CPE в составе 3 UTR. Учитывая результаты исследования динамики их экспрессии в раннем развитии, HTR1E и HTR2C являются наиболее вероятными кандидатами на роль функциональных посредников серотонина в раннем развитии Xenopus.

Важными компонентами серотонинергической системы являются транспортеры серотонина, осуществляющие его активный транспорт через мембрану.

Транспортер серотонина SERT экспрессируется на протяжении всего эмбрионального развития обоих видов Xenopus. Гомолог SERT также экспрессируется в течение всего эмбриогенеза морского ежа P. lividus и функционально активен на ранних стадиях его развития. Учитывая, что экспрессия SERT и способность захватывать серотонин из окружающей среды показана экспериментально также для ранних эмбрионов млекопитающих (Amireault, Dub, 2005), можно предполагать, что клетки ранних эмбрионов Xenopus тоже способны к обратному захвату серотонина. SERT является важным компонентом, вовлеченным в процесс посттрансляционной модификации белков посредством серотонилирования (Brenner et al., 2007; Ziu et al., 2012). То, что SERT экспрессируется на ранних стадиях развития, является указанием на то, что процессы серотонилирования и внутриклеточной серотониновой сигнализации могут играть роль в раннем развитии Xenopus и морских ежей.

Результаты исследования экспрессии везикулярных транспортеров моноаминов показали, что на ранних стадиях развития X. laevis экспрессируется VMAT2, а на ранних стадиях развития X. tropicalis - VMATN. При этом, несмотря на то, что серотонин выявляется в ранних эмбрионах P. lividus точечно, гомолог VMAT начинает экспрессироваться только на стадии гаструлы. Исследование пространственной локализации мРНК VMAT2 показало, что его экспрессия обладает выраженным анимально-вегетативным градиентом, причем в эпителиальном слое клеток анимальной шапочки его экспрессия достоверно больше, чем в субэпителиальном. На стадии бластулы серотонин преимущественно локализован в анимальной шапочке и маргинальной зоне, причем в большей степени – в поверхностном эпителиальном слое клеток (Beyer et al., 2012). Таким образом, пространственное распределение экспрессии VMAT2 совпадает с распределением серотонина. Динамика экспрессии, присутствие транскриптов во фракции полирибосом на стадии гаструлы, наличие CPE в составе 3 UTR мРНК, свидетельствуют о том, что VMAT2 транслируется на ранних стадиях развития X. laevis, что также подтверждается литературными данными о его функциональной активности на ранних стадиях развития Xenopus (Beyer et al., 2012).

Таким образом, можно утверждать, что в клетках ранних эмбрионов Xenopus по всей вероятности осуществляется везикулярный транспорт серотонина. Этот механизм позволяет устранить серотонин из цитоплазмы, где он может осуществлять внутриклеточные функции и вовлекаться в процесс серотонилирования или же деградировать. С другой стороны, упаковка серотонина в везикулы необходима для осуществления им межклеточной сигнальной функции.

Проведенное исследование экспрессии ферментов синтеза серотонина показало, что на ранних стадиях развития Xenopus экспрессируются оба фермента, необходимые для синтеза серотонина из триптофана – TPH2 и AAAD. Также нами показано, что оба фермента синтеза серотонина функционально активны в ранних эмбрионах морского ежа P. lividus. То, что серотонин может синтезироваться при инкубации в HTP, показано экспериментально также на ранних эмбрионах моллюсков и кольчатых червей (Buznikov et al., 2003; Emanuelsson, 1974). Экспрессия TPH продемонстрирована на доимплантационных эмбрионах мыши (Basu et al., 2008). Как мы видим, наличие системы синтеза серотонина характерно для ранних эмбрионов самых разных групп животных. Полученные результаты свидетельствует о том, что ранние эмбрионы, возможно, способны как захватывать серотонин из окружающего пространства с помощью SERT, так и синтезировать его самостоятельно, причем как из HTP, так и непосредственно из триптофана.

Так называемый материнский (ооцитарный) серотонин, накопленный в яйцеклетках, характерен для множества видов (см. Бузников, 1987). Его источником могут быть как сами ооциты, так и окружающие ооцит фолликулярные оболочки.

Нами показано, что, ферменты синтеза серотонина экспрессируются и в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, и в фолликулярных оболочках Xenopus. Таким образом, серотонин может синтезироваться как в самих яйцеклетках в течение оогенеза, так и в окружающих их тканях яичника. В последнем случае серотонин может попадать в яйцеклетки путем обратного захвата из окружающей среды или же через щелевые контакты, связывающие во время оогенеза яйцеклетку с фолликулярными клетками (Browne, Werner, 1984). При этом на нокаутных моделях мыши показано, что именно материнский серотонин, который синтезируется в фолликулярных клетках, является важным регулятором эмбриогенеза (Ct et al., 2007).

Таким образом, мы показали, что на ранних стадиях развития шпорцевых лягушек и морских ежей экспрессируется набор компонентов серотонинергической системы, необходимых для осуществления им сигнальной функции. Серотонин и экспрессирующиеся компоненты серотонинергической системы, по всей вероятности, составляют функциональную сигнальную систему, регулирующую процессы раннего развития. Одним из таких процессов является созревание ооцитов, которое у позвоночных зависит от уровня цАМФ (Conti et al., 2002). На эмбрионах Xenopus также показано, что цАМФ через активность PKA регулирует такие ранние эмбриональные функции как клеточный цикл делений дробления (Grieco et al., 1994).

Также известно, что локальная активация PKC приводит к динамическим локальным изменениям кортикального цитоскелета (см. Larsson, 2006). Возможно, что серотонинергическая регуляция созревания ооцитов (Buznikov et al., 1993), клеточного цикла и состояния цитоскелета (Григорьев, 1988), происходит с участием рецепторов серотонина, экспрессирующихся на ранних стадиях развития Xenopus и модулирующих активность PKA и PKC. Известно, что серотонин влияет на процесс установления лево-правой асимметрии (ЛПА) зародышей Xenopus, причем в этот процесс вовлечен HTR3, взаимодействующий с каноническим Wnt-сигнальным путем (Beyer et al., 2012). Кроме того, фармакологические эксперименты показали активность антагонистов VMAT и ингибиторов H+-АТФазы в отношении ЛПА (Fukumoto et al., 2005). Опираясь на эти данные, можно полагать, что VMAT2, экспрессируемый на ранних стадиях развития Xenopus, также является одним из важных звеньев серотонинергической регуляции лево-правой асимметрии у Xenopus.

Экспрессия основных компонентов классического (синаптического) серотонинергического механизма на ранних стадиях развития морских ежей и шпорцевых лягушек, показанная в данной работе, дает основание предполагать существование на этом этапе системы, близкой по своим характеристикам к дефинитивной серотонинергической системе. При этом показана сложность донервной серотонинергической системы, имеющей несколько рецепторов, экспрессирующихся в одной клетке, что, в совокупности с множественностью трансмиттерных систем на ранних донервных стадиях эмбрионального развития, существенно отличает эмбриональную серотонинергическую систему от дефинитивной. Полученные результаты являются подтверждением той точки зрения, что более общие эмбриональные регуляторные функции серотонина являются филогенетическими предшественниками его более специализированной нейротрансмиттерной функции. Наконец, то, что при всех различиях, серотонинергическая система представлена в донервном эмбриогенезе таких эволюционно далеких групп животных, как амфибии и морские ежи, говорит о том, что донервные регуляторные функции серотонина являются фундаментальными и универсальными.

ВЫВОДЫ

На ранних стадиях эмбрионального развития морских ежей экспрессируются гены, гомологичные компонентам систем синтеза (фенилаланин/триптофан гидроксилаза, AAAD), рецепции (HTR1A, HTR2B, HTR4 и рецептор серотонина неизвестного типа HTR), обратного захвата (SERT) и деградации (MAOA) серотонина. Функциональная активность систем синтеза и обратного захвата серотонина подтверждена экспериментально.

На ранних стадиях эмбрионального развития Xenopus экспрессируются гены следующих компонентов серотонинергической системы: ферменты синтеза TPH и AAAD, везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы серотонина HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7, транспортер серотонина SERT.

Уровень экспрессии мРНК компонентов донервной эмбриональной серотонинергической системы Xenopus в пуле материнской мРНК различается приблизительно на порядок в ряду VMAT2 > HTR7 > HTR1E > HTR5 > HTR2C, SERT. Экспрессия VMAT2, HTR1E и HTR2C уменьшается в процессе раннего развития, тогда как экспрессия HTR5, HTR7 и SERT на ранних стадиях развития держится на одном уровне.

Экспрессия HTR1E, HTR2C, HTR7 и SERT не имеет выраженных различий вдоль анимально-вегетативной оси, тогда как экспрессия HTR5 и VMAT2 обладает выраженным анимально-вегетативным градиентом, причем HTR5 больше в вегетативной области, а VMAT2 – в анимальной. Экспрессия VMAT2 больше в эпителиальном слое клеток крыши бластоцеля, чем в субэпителиальном, тогда как экспрессия HTR1E, HTR2C, HTR5, HTR7 и SERT не различается между этими группами клеток.

На стадии гаструлы мРНК HTR2C и VMAT2 транслируются, тогда как мРНК HTR не транслируется и полностью локализована в информосомах. мРНК HTR1E, HTR2C и VMAT2 имеет мотив, необходимый для трансляции во время созревания ооцитов.

Ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках, причем в ооцитах экспрессируется TPH2, а в фолликулярных оболочках – TPH1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК:

Никишин Д.А., Семенова М.Н., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия генов трансмиттерных рецепторов в раннем развитии морского ежа Paracentrotus lividus Онтогенез.

2012. 43(3): 212-216.

Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Konduktorova V.V., Shmukler Y.B. Expression of serotonergic system components during early Xenopus embryogenesis. Int J Dev Biol. 2012. 56(5): 385-391.

Глава в монографии:

Shmukler Y.B., Nikishin D.A. Transmitters in Blastomere Interactions. In: Cell Interaction, Sivakumar Gowder (Ed.), InTech, 2012. Ch. 2, P. 31-65.

Статья в сборнике:

Никишин Д.А., Кремнёв С.В., Шмуклер Ю.Б. Паттерн экспрессии рецепторов серотонина в эмбриогенезе Xenopus laevis // Международная конференция “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” / Пущино, Тезисы конференций:

Nikishin D.A., Ivashkin E.G., Mikaelyan A.S., Shmukler Yu.B. Expression of serotonin receptors during early embryogenesis // Simpler Nervous Systems, IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology / St. Petersburg, 2009. С. 70.

Никишин Д.А., Кремнёв С.В. Экспрессия рецепторов серотонина в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010» / Отв. ред. И.А.

Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] – М.: МАКС Пресс, 2010. С. 90.

Никишин Д.А., Кремнёв С.В., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия рецептора 5-HT3A в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis // Первые Международные Беккеровские чтения. Сборник научных трудов по материалам конференции. В частях. Часть 2. Под ред. д.б.н., проф. В.А. Сагалаева. / Волгоград, 2010. С. 143 – Никишин Д.А., Кремнёв С.В., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия компонентов адренергической системы в эмбриогенезе Xenopus laevis // ХХI Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов / Калуга: БЭСТпринт, 2010. С. 439 – 440.

Никишин Д.А. Экспрессия компонентов серотонергической системы в эмбриогенезе Xenopus laevis // VI Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (16-17 декабря 2010 г., г. Москва):

тезисы докладов / Онтогенез. 2011. Т. 42. № 5. С. 328–329.

Никишин Д.А., Кремнёв С.В. Экспрессия транспортёров серотонина в эмбриогенезе Xenopus laevis // Ломоносов – 2011: XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; секция «Биология»; 11– 15 апреля 2011 г.; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов / Сост.: Н.П. Карасева. М.: МАКС Пресс, 2011. С.

Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Shmukler Y.B. Expression analysis of serotonergic signal system in Xenopus early embryogenesis // 2nd Joint Meeting of the French and British Societies for Developmental Biology / Campus Saint Jean d'Angly, University of Nice Sophia Antipolis, France, 2011. P-92.

Никишин Д.А. Компонентный состав донервной серотонергической системы в раннем эмбриогенезе Xenopus laevis и Xenopus tropicalis // VII Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (12- декабря 2011 г., г. Москва): тезисы докладов / Онтогенез. 2012. Т. 43. № 4. С. 235– Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Kudrin V.S., Shmukler Y.B. Transmitters in the embryogenesis of Xenopus laevis // X East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems" September 6-10, 2012, Moscow. P. 35.

Шмуклер Ю.Б., Никишин Д.А. Серотонергическая система и асимметризация в эмбриогенезе // Конференция «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия» 14-16 ноября 2012 г., Палеонтологический институт им. А.А. Борисяка РАН, Москва. С. 55-56.