Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 576.591

КУЛИБИН АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ОТВЕТ ГЕНЕТИЧЕСКИ НЕСТАБИЛЬНОЙ

СПЕРМАТОГЕННОЙ СИСТЕМЫ УСКОРЕННО

СТАРЕЮЩИХ МЫШЕЙ ЛИНИИ SAMP1 НА

МУТАГЕННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

03.00.30 – “биология развития, эмбриология”

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

С.Т. Захидов доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Е.И. Домарацкая доктор биологических наук А.А.Иванов доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита диссертации состоится 21 ноября 2006г в 15 ч 30 мин на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, д.1 корп. 12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан _ 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Е.Н. Калистратова кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сперматогенез – высокопродуктивный, многофазный, имеющий строгую пространственно-временную организацию биологический процесс, регуляция которого очень сложно организована. Актуальность его всестороннего изучения очевидна. Кроме того, система развития мужских половых клеток представляет собой удобную модель для изучения разных проблем экспериментальной эмбриологии, клеточной биологии, генетики, биологии размножения.

Несмотря на то, что многие фундаментальные закономерности процессов становления, развития и дифференцировки сперматогенных клеток уже хорошо изучены на всех уровнях организации живого, исследовательская активность в области мужского гаметогенеза продолжает оставаться очень высокой. Это связано не только с чисто познавательным интересом к этой узловой проблеме биологии, но диктуется необходимостью решения постоянно расширяющегося круга актуальных практических задач, имеющих большое медико-биологическое и социальное значение. А именно – преодоление мужского бесплодия, изучение последствий действия повреждающих факторов окружающей среды, в том числе фактора времени, химеотерапии, а также усовершенствование методов искусственного оплодотворения, криоконсервации, трансплантации половых клеток, эффективного управления размножением сельскохозяйственных животных и вредных насекомых (Рузен-Ранге, 1980; McCarrey, 1998; Захидов, 1998; Hovatta, 2001; Khorram et al., 2001; Brinster, 2002; Hardy et al., 2002;

Gosden, Nagano, 2002; Liu, Handelsman, 2003).

Ускоренно стареющие мыши SAM (senescence-accelerated mouse), проявляющие все признаки раннего физиологического угасания, были получены японскими исследователями (Takeda et al., 1981, 1994, 1997) путем близкородственного скрещивания и длительного отбора мышей линии AKR/J, страдающих наследственной формой вирусной лейкемии. В последние годы линии мутантных ускоренно стареющих мышей широко используются как модель для изучения механизмов, лежащих в основе нормального старения и его патологических форм, причин возникновения возрастных старческих болезней, а также для проверки эффективности средств, направленных на улучшение качества жизни и ее продление (Takeda et al., 1997; Захидов, 2003).

Уникальной особенностью мышей линий SAM, выгодно отличающей их от других моделей ускоренного старения (Takeda et al., 1981; Troen, 2003; Warner, Sierra, 2003), является передача признака ускоренного старения по наследству.

стареющих мышей SAM, в том числе мышей линии SAMP1 (senescence-accelerated mouse prone), создали надежную основу для развертывания широких экспериментальных исследований (Гордеева и др., 2001; Захидов и др., 1999, 2001, 2002; Гопко и др., 2003; Кулибин и др., 2005). Сперматогенная система мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, имеет свои специфические особенности, основной среди которых является сочетание сравнительно нормального течения сперматогенного процесса с высоким уровнем генетической нестабильности, значительно превышающим интенсивность спонтанного, естественного мутагенеза у нормально стареющих животных (Захидов и др., 2001, 2002, 2005).

До сих пор никто не анализировал перспективу развития мужских половых клеток у ускоренно стареющих мышей линии SAMP1 после мутагенного вмешательства.

Между тем, важность таких исследований не вызывает сомнения, поскольку многое реальное в структуре строго детерминированного сперматогенного процесса остается закрытым для прямых наблюдений. Экспериментальный мутагенез позволяет глубоко проникнуть в сущность многих генетических и биологических явлений, индуцировать аномальное течение морфогенетических процессов и нарушение их регуляции. На этом фоне можно увидеть и познать закономерности, действующие только в условиях катастрофических изменений в строении и функционировании сложных биологических систем, неопределенности и нестабильности их развития.

Ранее было показано (Захидов, 1993; Захидов, Гордеева, 1998; Захидов и др., 1999), что в гонадах грызунов под влиянием генетически активных соединений разворачиваются два процесса – разрушительный, ведущий к появлению большого числа генетически аномальных клеток и массивной клеточной гибели, и созидательный, восстанавливающий нормальное течение сперматогенеза за счет пула стволовых сперматогониальных клеток; удалось впервые показать способность к пролиферации высокодифференцированных клеток Сертоли (Захидов и др., 1995), что принципиально меняет представления не только о свойствах данной клеточной популяции, но и о возможных путях восстановления сперматогенеза.

В этой связи исследования сперматогенеза у мышей SAMP1, развивающихся по механизму ускоренного старения, проводимые на базе химического мутагенеза, имеют огромную познавательную ценность. Они, в частности, дают возможность достичь результатов, отвечающих на принципиальный вопрос: будет ли после мутагенного воздействия динамически неустойчивая сперматогенная система «вдвойне мутантна» или и без того чрезвычайно высокий уровень генетической нестабильности преодолеть не удастся.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы – изучение динамики сперматогенеза у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, подвергшихся однократному воздействию модельного мутагена дипина.

Цель исследования предусматривает решение следующих основных задач:

• Изучение особенностей индуцированного мутагенеза в системе развития мужских половых клеток.

• Количественная характеристика сперматогенных клеток различных типов и фолликулярных клеток Сертоли.

• Изучение особенностей строения сперматогенного эпителия.

• Цитоспектрофотометрический анализ содержания ДНК в мейотических и постмейотических клетках.

• Изучение пролиферативной активности клеток Сертоли.

Научная новизна работы. Впервые с помощью системного подхода изучена динамика развития генетически нестабильной сперматогенной системы у мутантных ускоренно стареющих мышей линии SAMP1 после мутагенного вмешательства.

Впервые показано, что у ускоренно стареющих мышей процессы хаотизации и распада сперматогенной системы, происходящие под действием дипина в генетически активной дозе, не носят необратимого характера. Мужские половые клетки сохраняют способность развиваться в условиях нарастающей хромосомной нестабильности в стволовых сперматогониях.

Впервые показана способность к пролиферации клеток Сертоли у ускоренно стареющих мышей в ответ на повреждающее сперматогенез действие мутагена.

Впервые установлено, что одним из источников регенерации сперматогенной системы в условиях индуцированного химического мутагенеза являются предшествен-ники стволовых сперматогониев и клеток Сертоли, расположенные в сети семенника (rete testis).

Практическая ценность работы. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций по эмбриологии, биологии размножения и геронтологии для студентов университетов и медицинских вузов, а также при составлении методических пособий к курсам лекций по гистологии тканей в норме и при патологии.

Результаты настоящей работы представляют интерес для врачей – андрологов и специалистов в области репродуктивных технологий.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука в России в начале XXI века:

итоги, задачи, перспективы» (Москва, 2003), на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Москва, 2005), на конференции “Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты” (Москва, 2005), на семинарах кафедры эмбриологии МГУ и Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН.

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав обзора литературы, описания материала и методов исследования, пяти глав собственных результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 24 рисунка, шесть таблиц.

В списке цитированной литературы упомянуто 400 работ, из них 55 отечественных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. В работе использованы половозрелые мыши линии SAMP1 (86 самцов) в возрасте 3-4 мес. В эксперименте со сравнительной оценкой пролиферативной активности популяции клеток Сертоли были использованы также половозрелые мыши-гибриды F1 (CBAC57/Bl6) (7 самцов).

Постановка эксперимента. Отобранных для эксперимента самцов разделили на контрольную и опытную группы. Опытным животным однократно внутрибрюшинно вводили 0.2 мл дипина (разбавленного в 5% диметилсульфоксиде (ДМСО)) из расчета мг/кг веса животного. Контрольным животным также однократно внутрибрюшинно инъецировали 0.2 мл 5% ДМСО. Забой животных производили путем дислокации шейных позвонков на 3, 7, 14, 21, 28, 35, 56 и 100 сут после инъекции.

Фиксация материала, приготовление и окрашивание препаратов. Для цитогенети-ческого и количественного цитохимического изучения один из извлеченных семенников, разрезали пополам и готовили отпечатки сперматогенных клеток. Препараты фиксировали в 10% забуференном растворе формалина (pH 7.2) в течение 10-15 мин. После отмывали в проточной воде высушивали на воздухе и окрашивали по Фельгену в стандартных условиях: гидролиз в 5N HCl при 37С в течение 12 мин с последующим окрашиванием в реактиве Шиффа в течение одного часа при комнатной температуре.

Для гистологического исследования половинки семенника фиксировали в растворе Буэна в течение 4 сут. После проведения по спиртам восходящей концентрации и ксилолу, заливали в парафиновые блоки. Готовили срезы толщиной 5 мкм, высушивали и окрашивали гематоксилин-эозином по методу Эрлиха.

Для количественного анализа сперматогенеза целый семенник помещали в уксусно-глицириновую смесь на 2-3 нед. Затем гонады механически разрушали и суспендировали; полученную суспензию сперматогенных клеток анализировали в камере Горяева с помощью фазово-контрастного устройства при общем ув. 400.

Микроядерный тест. Изучение интенсивности мутационного процесса в сперматогенезе у мышей проводили с помощью метода учета сперматогониальных и мейотических микроядерных аберраций, сигнализирующих о наступлении грубых изменений в структуре хромосомного материала.

Для определения частоты встречаемости клеток с микроядрами подсчитывали 300-500 сперматогониев и не менее 1000 округлых сперматид от каждого животного.

Число генетически аномальных клеток выражали в промилле.

Метод учета аномалий форм головок спермиев (АФГC). В последние годы мутагенез широко изучается с помощью метода учета АФГC. Увеличение частоты встречаемости аберрантных гамет на терминальных стадиях развития рассматривается как результат генных мутаций и/или микроделеций, возникающих в клетках базального компартмента (сперматогониев и ранних сперматоцитов).

Частоту встречаемости сперматозоидов с морфологически аномальными головками определяли на 28 и 100 сут фиксации; для этого подсчитывали не менее 300 клеток от каждого животного и долю АФГC выражали в процентах.

Цитоспектрофотометрия. Количественное определение содержания ДНК-фуксина на 3 и 100 сут после введения дипина (у контрольных и подопытных мышей) в ядрах пахитенных сперматоцитов, округлых сперматид и тестикулярных сперматозоидов проводили с помощью метода прямой сканирующей денситометрии (при длине волны =540 нм). Для этого был использован микроденситометр ВиккерсМ86 (Англия). Количество ДНК-фуксина измеряли дифференциальным методом, вычитая из интегральной плотности объекта интегральную плотность фона такой же площади (Агрозкин и др., 1976).

Авторадиография. Ранее было показано, что одним из следствий однократного введения дипина на сперматогенез является резкое увеличение числа клеток Сертоли (Захидов и др., 1995; Гордеева и др., 2001; Маршак и др., 2002). Для оценки способности к пролиферации клеток Сертоли контрольным и подопытным мышам линии SAMP и мышам-гибридам F1 (CBAC57/Bl6) на 14 сут эксперимента однократно водили H3тимидин из расчета 1 мкг/г веса (37 кБр/г). Через 1 ч мышей забивали, извлекали семенники и готовили отпечатки сперматогенных клеток по уже описанной выше схеме. Препараты затем окрашивали по Фельгену и покрывали эмульсией тип М (НИИ Химфото). Экспозицию проводили в течение 1 мес при 4°С.

Статистическая обработка данных. Весь полученный цифровой материал обрабатывался с помощью статистического пакета STATISTICA 6.0. При оценке достоверности различий средних, использовали параметрический критерий Стьюдента и непараметрический критерий Вилкоксона при стандартном уровне значимости p0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Цитогенетический анализ развивающихся сперматогенных клеток.

Результаты цитогенетического анализа представлены на рис. 1.

Видно, что у мышей, подвергшихся однократному воздействию дипина, частота встречаемости сперматогониев с микроядрами на 3-28 и 56 сут фиксации почти не изменяется по сравнению с контролем. И, наоборот, частота мутантных форм в популяции сперматогониальных клеток на 35 и 100 сут последействия резко возрастает и статистически достоверно превышает контрольные значения.

Далее из рис. 1 видно, что у подопытных мышей частота встречаемости округлых сперматид с микроядерными аберрациями на 3, 7 сут не выходит далеко за пределы установленного для этих животных уровня спонтанного мутагенеза, но достоверно возрастает на 14 сут фиксации. На 21-35 сут после начала эксперимента частота встречаемости аберрантных округлых сперматид не отличалась от контроля. Статистически достоверное превышение частоты встречаемости ранних постмейотических клеток со следами хромосомных поломок над контролем вновь наблюдалась на 56 и 100 сут, причем в последнем случае эффект воздействия мутагена проявился особенно сильно.

Использованный в работе тест на аномалии форм головок спермиев показал (таблице 1), что на 28 сут фиксации в гонадах подопытных мышей частота Таблица 1. Частота встречаемости тестикулярных спермиев с аномальными формами головок (в %) у мышей SAMP1 контрольной и подопытной групп.

Примечание: * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны

‰ СПЕРМАТОГОНИИ

Число клеток с микроядрами

ОКРУГЛЫЕ СПЕРМАТИДЫ

Число клеток с микроядрами Примечание: * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны встречаемости аберрантных форм в популяции тестикулярных спермиев увеличивается в 3 раза по сравнению с контролем, а на 100 сут последействия снижается до уровня, свойственного уровню спонтанного мутагенеза. Тот факт, что на 28 сут после начала эксперимента число морфологически аномальных гамет значительно возрастает, подтверждает, что клетки, находящиеся в момент воздействия мутагенов на стадии Рис. 2. Многообразие головок спермиев у мышей SAMP1, активного премейотического синтеза ДНК (прелептотены-лептотены) проявляют повышенную генетическую чувствительность.

Весь спектр морфологически аномальных ядер спермиев, выявленный в семенниках мышей SAMP1, подвергшихся геннотоксическому эффекту дипина, представлен на рис 2.

II. Количественный анализ клеток сперматогенного эпителия.

Результаты подсчетов числа сперматогенных клеток различных типов, а также клеток Сертоли у мышей контрольной и подопытной групп на разных сроках фиксации представлены в таблице 2.

На 3 сут после введения самцам дипина число сперматогониев, пахитенных сперматоцитов и округлых сперматид достоверно меньше, чем в контроле, тогда как снижение числа тестикулярных спермиев и клеток Сертоли не существенно. На 7 сут фиксации в семенниках подопытных животных только число сперматогониев статистически значимо отличалось от контроля. Повреждающий эффект наиболее ярко проявился на 14 сут последействия, о чем свидетельствует практически полное отсутствие в образцах семенников сперматогониев, пахитенных сперматоцитов и клеток Сертоли; снижение числа округлых сперматид и морфологически сформировавшихся спермиев было не столь катастрофично. Между тем у части изученных животных число округлых сперматид и клеток Сертоли достигало нулевых значений. На 21 сут после действия дипина значительно возрастало число сперматогониев, тестикулярных Таблица 2. Количественный состав клеток сперматогенного эпителия у мышей SAMP1 контрольной и опытной групп (106).

Примечание: СГ – сперматогонии, ПС – пахитенные сперматоциты, ОС – округлые сперматиды, СП – сперматозоиды, КС – клетки Сертоли, * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p0.05.

спермиев и клеток Сертоли. На 28 сут в семенниках подопытных мышей пул постмейотических клеток вновь резко уменьшался по сравнению с контролем. На 35 сут последействия сумарное число всех изученных типов клеток достигает минимального значения, по сравнению с предыдущими сроками фиксации. На 56 сут фиксации у мышей, подвергшихся мутагенному воздействию, наблюдается увеличение числа сперматогониальных, мейотических, постмейотических клеток и клеток Сертоли.

Через 100 сут с начала эксперимента число клеток всех изученных типов в семенниках подопытных и контрольных мышей уже не различалось.

III. Содержание ДНК-фуксина в сперматогенных клетках.

Цитоспектрофотометрическое изучение содержания ДНК-фуксина в сперматогенных клетках контрольных и подопытных мышей SAMP1, результаты которого представлены в таблице 3, показало, что через 3 дня после введения животным Таблица 3. Содержание ДНК-фуксина (у.е.) в сперматогенных клетках контрольных и подвергшихся воздействию дипина мышей.

Примечание: ПС – пахитенные сперматоциты, ОС – округлые сперматиды, * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p0.05.

дипина количество ДНК в пахитенных сперматоцитах и тестикулярных спермиях было достоверно ниже, чем в контроле; в то время как, содержание ДНК в округлых сперматидах соответствовало теоретически ожидаемому гаплоидному уровню (различия по сравнению с контролем недостоверны). На 100 сут эксперимента различий между контролем и опытом по всем типам изученных клеток не было обнаружено.

IV. Гистологический анализ структуры сперматогенного эпителия.

На рис. 3. показаны структурные эффекты влияния дипина на сперматогенез мышей SAMP1 в разное время после начала эксперимента.

Гистологическая картина сперматогенеза у контрольных мышей линии SAMP практически на всем протяжении эксперимента была близка к таковой у нормально стареющих мышей в норме (рис. 3А); и лишь на 100 сут последействия у этих животных появляется большое число канальцев со значительными нарушениями морфологии сперматогенного эпителия (результаты не показаны).

В опыте на 3 и 7 сут фиксации структура сперматогенного эпителия сохраняет вполне нормальный упорядоченный вид. В большинстве случаев дифференцирующиеся половые клетки разных генераций располагаются сравнительно правильными концентрическими слоями вокруг просвета канальцев (рис. 3Б).

На 14 сут последействия у подопытных мышей сперматогенный эпителий сильно редуцирован: практически полностью отсутствуют клетки мейотического ряда, редко встречаются сперматогонии, причем в некоторых канальцах они вовсе отсутствуют;

превалируют популяции округлых сперматид и клеток Сертоли (рис. 3В).

На 21 сут в эксперименте нарушения морфологии сперматогенного эпителия носили еще более выраженный характер, чем на 14 сут фиксации (рис. 3Г). Обширные пласты мейотических и постмейотических клеток отслаивались от стенки канальца и/или слущивались в просвет. В некоторых участках сперматогенного эпителия отсутствовали все типы клеток, кроме клеток Сертоли и сперматогониев.

У подопытных животных структурные нарушения сперматогенеза были максимальными на 28 сут фиксации: нормальное течение сперматогенного процесса было нарушено во всех без исключения канальцах. Первое, что бросается в глаза – отсутствие в большинстве канальцев тех или иных типов сперматогенных клеток:

можно выделить канальцы, содержащие только клетки Сертоли, или только клетки Сертоли и сперматогонии (рис. 3Е), канальцы без мейотических клеток, или канальцы без сперматид и спермиев (рис. 3Д).

На 35 сут последействия во многих канальцах отмечено появление большого числа сперматогониев, встречаются пахитенные сперматоциты, а также округлые сперматиды и спермии. Между тем в большинстве канальцев сперматогенная система проявляет все признаки беспорядочного и регрессивного развития (рис. 3З), а в некоторых канальцах процессы дегенерации заходят так далеко, что исчезают все следы сперматогенеза.

На 56 день фиксации в канальцах у подопытных животных прогрессивные положительные процессы преобладают над регрессивными, отрицательными.

Целостность сперматогенного эпителия в основных чертах восстанавливается (результаты не показаны).

На 100 сут после действия дипина регенерация сперматогенной системы у подопытных самцов завершалась формированием семенных канальцев по структуре сперматогенного эпителия не отличающихся от контроля (рис. 3И). Важно отметить, что у подопытных самцов, как и у контрольных самцов этого же срока фиксации, отмечено большое число канальцев с полностью разрушенной структурой (результаты не показаны).

В ряде случаев на срезах семенников подопытных мышей вблизи от rete testis выявились новообразованные молодые семенные канальцы, содержащие клетки похожие на гоноциты и молодые клетки Сертоли (рис. 3Ж).

V. Изучение пролиферативной активности клеток Сертоли. Как показало радиоавтографическое исследование, у подопытных самцов линии SAMP1, в отличие от контроля, на отпечатках семенников среди интерфазных клеток Сертоли встречались ядра, меченные H3-тимидином (рис.4А,Б). Кроме того, на срезах были обнаружены единичные митотические фигуры клеток Сертоли (рис. 4В). У подопытных мышейгибридов CBAC57/Bl6 пролиферативная активность этих клеток была более высокой.

Рис. 3. Срезы семенников контрольных – А и подопытных – Б-И мышей.

Б – 7 сут, В – 14 сут, Г, Ж – 21 сут, Д, Е – 28 сут, З – 35 сут, И – 100 сут фиксации.

Обозначения: * – ядра клеток Сертоли, § – каналец, содержащий только удлиняющиеся сперматиды и клетки Сертоли, # – участок канальца, содержащий только клетки Сертоли и сперматогонии, † – каналец без мейотических клеток, ‡ – каналец без постмейотических клеток, ДСЭ – дезорганизация сперматогенного эпителия, МК – каналец похожий на молодой, МП – межклеточные пространства, ОТ – отслоение сперматогенного эпителия, ПС – ядра пахитенных сперматоцитов, СГ – ядра сперматогониев, СК – слущивание сперматогенных клеток в просвет канальца, ЦВ – цитоплазматические вакуоли.

Рис. 4. Ядра пролиферирующих и интерфазных клеток Сертоли на отпечатках (А,Б) и срезах (В) семенников подопытных мышей линии SAMP1.

Обозначения: * - интерфазные ядра клеток Сертоли, ДКС - деление клетки Сертоли.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно (Mller, Streffer, 1994), что в норме в гонадах самцов млекопитающих число клеток с микроядерными аберрациями обычно не превышает 2-4‰, но увеличивается в 5-10 раз при индуцированном радиационном или химическом мутагенезе (Luhdetie et al., 1986; Allen et al., 1994, 1996; Kunugita et al., 2002). У ускоренно стареющих мышей линий SAM развитие половых клеток происходит на фоне высокой частоты спонтанных микроядерных аберраций, которая приближается к уровню индуцированного мутагенеза (Гопко и др., 2003; Гордеева, 2000; Захидов и др., 2001, 2002). Результаты настоящей работы подтверждают эти данные: у контрольных животных на всех сроках фиксации частота сперматогониев и округлых сперматид с хромосомными нарушениями не опускалась ниже 7‰, а в среднем составляла 14.5‰.

(микроядерного) эффекта в популяции сперматогониев с 3 по 28 сут после действия дипина скорее всего связано с угнетающим действием этого высокоактивного молекулярного мутагена на развитие стволовых и активно пролиферирующих клеток, с остановкой последних на разных фазах митотического цикла, и последующей элиминацией большого числа клеток вследствие глубоких, необратимых нарушений в структуре их генетического аппарата. В то же время, достоверное увеличение доли генетически аномальных форм в популяции сперматогониев у подопытных мышей на 35 сут эксперимента, вероятно, является следствием, очищения стволового компартмента от наиболее дефектных клеток; оставшиеся же после отбора сперматогонии, хотя и несут хромосомные нарушения, сохраняют способность к дифференцировке.

Неодинаковая частота выхода округлых сперматид с микроядрами на 3, 7 и 14 сут фиксации говорит о различной генетической чувствительности мейотических клеток, которые в момент воздействия дипина, согласно кинетике сперматогенеза у мышей, находились, соответственно, на стадиях мейотических делений, средней пахитены и прелептотены-лептотены. Более высокая восприимчивость последних по сравнению с продвинутыми в развитии мейоцитами связана, вероятно, с проходящей в них репликацией и, следовательно, с большей доступностью ДНК для взаимодействия с мутагеном. Тест на аномалии форм головок спермиев на 28 сут фиксации отчасти подтверждает это положение.

Тот факт, что у подопытных мышей на 35-100 сут существенно увеличивается частота микроядерных форм в популяции округлых сперматид, может быть следствием либо увеличения доли генетически аберрантных стволовых клеток, и/или нарушения механизмов клеточного отбора в процессе дифференцировки сперматогониев. Однако скачки частот сперматогониальных и мейотических микроядер на отдаленных сроках последействия свидетельствуют в пользу первого предположения. Похоже самые пластичные, базисные структуры сперматогенной системы, а именно стволовые клетки, подвергшись воздействию дипина, получили дополнительную порцию генетической нестабильности, которая, как известно (Захидов, 2004), усиливает мутационную составляющую.

Первое, что открывается при анализе результатов количественного и гистоморфологического исследования сперматогенеза у подопытных животных – это фактически полное несоответствие этих результатов между собой у некоторых самцов на 14 сут после мутагенного вмешательства. Так, если в суспензии клеток, полученной при механическом разрушении гонад, округлые сперматиды и клетки Сертоли отсутствовали, то на гистологических срезах они довольно легко выявлялись в большом числе. Скорее всего, это является следствием того, что химический мутаген дипин, наделенный большим потенциалом разрушения, нарушает структуру клеток и ядер, что делает их неустойчивыми к механическим воздействиям.

Далее, исходя из данных по кинетике сперматогенеза у мышей (Meistrich, 1986) следует, что, обнаруженные на 14 сут фиксации сперматогонии несут свое происхождение от поврежденных дипином стволовых клеток. Таким образом, гибель значительного числа сперматогониев к данному моменту времени является еще одним доказательством того, что дипин усилил генетическую нестабильность стволовых клеток, наследственные структуры которых и так наделены повышенной мутабильностью (Захидов и др., 2002; Гопко и др., 2003). Усиление генетической нестабильности, как известно, влечет за собой продукцию аномальных белков и ферментов, что, в свою очередь, приводит к гибели наиболее чувствительных клеток. Однако быстрая репопуляция семенников дифференцирующимися сперматогониальными клетками уже на 28 сут эксперимента свидетельствует о высокой пролиферативной активности сохранивших целостность стволовых клеток. Такое поведение стволовых сперматогониев, является ответной реакцией на массовую гибель дифференцирующихся половых клеток и было отмечено при воздействии различных химических мутагенов и радиации (Oakberg, 1975; Erickson, 1985; van Beek et al., 1990; Jiang, 1998; Kanatsu-Shinohara et al., 2003). Повышенная пролиферация стволовых сперматогониев снижается на 35 сут.

Среди дифференцирующихся сперматогенных клеток, у подопытных самцов линии SAMP1, наиболее восприимчивыми к воздействию мутагена оказались сперматогонии типа A 2-4. Только этим, по-видимому, можно объяснить резкое снижение общего числа сперматогониев на 3 сут эксперимента, практически в раза по сравнению с контролем, а также еще более значительное уменьшение числа пахитенных сперматоцитов и округлых сперматид, соответственно, на 14 и 21 сут фиксации. Значительная потеря половых клеток на этой стадии дифференцировки сперматогониев продолжается еще примерно 7 нед с момента воздействия, на это указывает тот факт, что восстановление числа пахитенных сперматоцитов до уровня контроля происходит только на 56 сут эксперимента. Гибель большого числа половых клеток в сперматогониальном компартменте в целом широко распространенное явление (Lu et al., 1979; Erickson, 1985; Meistrich, 1993; Захидов 1993; Захидов и др., 1994; Nakagawa et al., 1997; Seaman et al., 2005) и рассматривается как один из механизмов элиминации генетически аберрантных половых клеток. Отсюда вполне понятно, что за массовую гибель дифференцирующихся сперматогониев после 3 сут с начала эксперимента повинны возникшие в стволовых клетках мутации.

Картина хаотизации упорядоченной структуры сперматогенного эпителия на 14 и 21 сут последействия хорошо согласуется с массовой элиминацией клеток в это время. Самыми частыми структурными нарушениями в поврежденных дипином семенниках были отслоения и слущивания половых клеток в просвет канальца, а также образование пространств между ними. По-видимому, эти процессы происходят в результате разрушения адгезивных контактов (adherens junctions) между половыми клетками и клетками Сертоли, из-за уменьшения мутагеном стероидогенной функции клеток Лейдига, или непосредственного воздействия на клетки Сертоли, что косвенно доказывается их повышенной “хрупкостью” на 14 сут фиксации.

Другой возможной причиной этих аномалий у подопытных самцов может быть деление дифференцированных клеток Сертоли. Возможность перехода этой, в норме стабильной популяции клеток, к пролиферации при некоторых патологических состояниях (Zhang et al., 2004, 2006; Chaudhary et al., 2005), а также после действия дипина на мышей-гибридов (Захидов и др., 1995; Гордеева и др., 2001; Маршак и др., 2002) сейчас хорошо доказана. Воздействие дипина на мышей-гибридов приводило к увеличению числа клеток Сертоли у этих животных на 14 и 21 сут фиксации в раза по сравнению с контролем. В настоящей работе в течение всего эксперимента число этих клеток практически не увеличивалось по сравнению с контролем. Тем не менее, на гистологических срезах семенников, мы встречали единичные митозы этих клеток и, на отпечатках окрашенных по Фельгену, меченные H3-тимидином ядра. Возможным объяснением отсутствия количественного выражения массивной пролиферации клеток Сертоли в наших результатах является гибель большей их части, скорее всего в G1 или G2 периодах клеточного цикла, т.е. еще до вступления в митоз, от полученных после воздействия мутагена сильных генетических повреждений.

Нарушение развития мужских половых клеток происходило и в профазе I мейоза. Здесь наиболее чувствительными клетками оказались сперматоциты на стадии ранней пахитены, о чем свидетельствует сравнительно низкое число продвинутых в развитии клеток (средние и поздние пахитены) на 3 сут фиксации.

Количественное определение содержание ДНК-фуксина в пахитенных сперматоцитах на 3 сут последействия подтверждает это предположение. В то же время, число пахитенных сперматоцитов и округлых сперматид на 7 сут не отличается от такового в контроле, что говорит о резистентности к воздействию дипина, соответственно, прелептотенных-зиготенных сперматоцитов и сперматоцитов на стадии поздней пахитены. Судя потому, что число ранних постмейотических клеток у подопытных мышей на 3 сут и тестикулярных спермиев в течение первой недели эксперимента значительно не изменялось, а на второй неделе число последних уменьшалось по сравнению с контролем более чем в 2 раза можно заключить, что дипин не оказывал цитотоксического действия на спермии и удлиняющиеся и округлые сперматиды, но в то же время приводил к гибели делящихся сперматоцитов. Эти наши наблюдения хорошо коррелируют с результатами полученными другими авторами при исследовании действия на сперматогенез радиации и алкилирующих агентов (Oakberg, 1975; Erickson, 1985; Lu, Meistrich 1979; Meistrich et al., 1982; Meistrich, 1993;

Codrington et al., 2004).

Количественное восстановление сперматогенеза у ускоренно стареющих мышей после однократного введения дипина начинает проявляться на 56 сут последействия.

Первым свидетельством этого является повышение числа сперматогониальных клеток до максимального уровня, после 28 сут, у мышей подвергшихся действию дипина. К 56 сут фиксации число пахитенных сперматоцитов достигает нормы, что говорит о нормализации развития клеток в сперматогониальном компартменте.

Полное же восстановление пулов всех типов клеток происходит только к 100 сут эксперимента, но при этом общее число этих клеток не достигает такового на 3 сут после воздействия дипина. В результатах количественного анализа сперматогеного эпителия контрольных мышей линии SAMP1 также обращает на себя внимание достоверное, в сравнении с 3 сут, снижение числа всех типов клеток, регистрируемое на 100 сут фиксации. Необходимо отметить, что к последнему сроку фиксации подопытные и контрольные самцы достигают критического, для этих ускоренно стареющих животных, возраста 6-7 мес, когда в семенниках мышей SAMP1 начинают преобладать семенные канальцы с нарушенным течением сперматогенеза. Эффект этот временный, у мышей из следующих возрастных групп структура сперматогенного эпителия восстанавливается (Гордеева, 2000; Захидов и др., 2001). Гистологическая характеристика сперматогенеза как у подопытных, так и контрольных самцов на сут эксперимента полностью согласуется с этими данными: часть канальцев имеет нормальную структуру и в то же время есть много семенных канальцев с полностью разрушенным сперматогенным эпителием. Таким образом, к концу эксперимента у подопытных животных происходит не только количественное восстановление сперматогенного эпителия, но и его организация полностью соответствует той, какая характерна для мышей SAMP1 в возрасте 6-7 мес. Это дает возможность заключить, что этап временной дезорганизации сперматогенного эпителия, ранее не описанный как фаза его онтогенетического развития у других линий животных, строго детерминирован для сперматогенной системы мышей линии SAMP1, является ее характерной особенностью. Если учесть, что у этих животных после 7 мес в большинстве случаев репродуктивная способность существенно снижается (Hosokawa et. al., 1997; Takeda et. al., 1997), то дальнейшее изучение механизмов регрессии сперматогенеза в этот период может оказаться плодотворным для понимания причин развития мужской стерильности.

Как видно из полученных результатов, хаотизация и распад сперматогенной системы у мышей линии SAMP1 под действием дипина не носят необратимого характера. Разрушения внутриканальцевых пространств стимулируют пролиферацию и дифференцировку стволовых сперматогониальных клеток. Благодаря активности последних старые дифференцированные канальцы довольно быстро пополняются половыми клетками новых поколений.

Еще одно важное наблюдение, сделанное в настоящей работе, состоит в том, что в ситуации, когда возникает угроза распада семенных канальцев, приходят в движение клеточные элементы rete testis, дающие начало молодым канальцам с гоноцитами и молодыми клетками Сертоли. Аналогичное явление было описано ранее при изучении семенников у крыс, подвергшихся локальному рентгеновскому облучению (Курносова, Райцина, 1987) и у мышей-долгожителей, склонных к ускоренному старению (Кулибин и др., 2005). Все это говорит о весьма большом запасе прочности зародышевого пути.

Суммируя данные количественного и гистологического анализов, можно заключить, что в восстановлении нарушенной мутагеном сперматогенной системы у ускоренно стареющих мышей принимают участие оба известных источника регенерации сперматогенного эпителия: стволовые клетки, расположенные на базальной мембране семенных канальцев, как это было отмечено у мышейгибридов, подвергшихся действию дипина (Захидов, 1993; Захидов и др., 1994), и предшественники сперматогенных клеток и клеток Сертоли, расположенные в rete testis. Существенно, что второй из указанных источников у животных с нормальной продолжительностью жизни включается только в случае практически полного нарушения сперматогенеза (Курносова, Райцина, 1987).

ВЫВОДЫ

1. Генетическая чувствительность к действию дипина развивающихся сперматогенных клеток у ускоренно стареющих мышей линии SAMP неодинакова. Наиболее уязвимыми оказались профазные сперматоциты (стадия прелептотены-лептотены) и стволовые сперматогонии.

2. Хромосомные повреждения, индуцированные в клетках стволового компартмента, носят необратимый характер. Количество сперматогониальных и мейотических микроядерных аберраций на отдаленных сроках последействия (35-100 сут фиксации) существенно превышает уровень спонтанной хромосомной мутабильности.

3. Регрессивные количественные и морфологические изменения в сперматогенном эпителии после мутагенного вмешательства развиваются постепенно: только на 28 и 35 сут фиксации клеточные потери и дезорганизация системы развития мужских половых клеток достигают пика. Восстановление сперматогенеза в большинстве канальцев происходит на 56 сут последействия.

4. Повышенную цитотоксическую чувствительность к действию мутагена проявили часть стволовых клеток, сперматогонии типа A 2-4, сперматоциты на стадии ранней пахитены и диплотены-диакинеза; более устойчивыми оказались сперматогонии типа Apr-Aal, сперматоциты на стадии прелептотены-зиготены, поздней пахитены, а также округлые, удлиняющиеся сперматиды и спермии.

Массивная гибель половых клеток приводит к усилению пролиферации уцелевших стволовых сперматогониев.

5. Восстановление сперматогенной системы происходит за счет деятельности двух систем регенерации: стволовых сперматогониальных клеток и клеточных элементов сети семенника (rete testis).

6. Появление у подопытных мышей линии SAMP1 в популяции клеток Сертоли единичных митотических фигур и меченных H3-тимидином ядер указывает на способность этих высокодифференцированных клеток к пролиферации.

Эта тенденция выражена значительно слабее, чем у мышей, развивающихся по механизму нормального физиологического старения.

7. Усиление генетической нестабильности стволовых сперматогониальных клеток в результате мутагенного воздействия не приводит к необратимой дезинтеграции структуры сперматогенного эпителия. В конечной точке эксперимента ( сут фиксаци) количественная, морфологическая и цитохимическая картина сперматогенеза принципиально не отличается от контроля.

8. У контрольных и подопытных животных в возрасте 6-7 мес одинаково наступает фаза дезорганизации сперматогенного эпителия, что доказывает ее детерминированность для сперматогенного процесса у ускоренно стареющих мышей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кулибин А.Ю., Захидов С.Т. Морфологические изменения сперматогенного эпителия у ускоренно стареющих мышей SAMP1 в ответ на действие химического мутагена дипина // Тезисы Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука в России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы». Москва. 2003. С.234.

2. Кулибин А.Ю. Цитогенетические изменения сперматогенных клеток у мышей линии SAMP1 (Senescence-accelerated mouse prone) под влиянием химического мутагена дипина // Тезисы Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». Москва. 2005. С.61.

3. Кулибин А.Ю., Захидов СТ. Нарастание потенциальных генетических повреждений в стволовых клетках и развитие сперматогенного процесса у ускоренно стареющих мышей SAMP1 после мутагенного вмешательства // Тезисы конференции “Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты”. Москва. 2005. С.42-43.

4. Маршак Т.Л., Кулибин А.Ю., Захидов С.Т. Источники регенерации сперматогенного эпителия у мышей // Тезисы конференции “Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты”. Москва. 2005. С.46-48.

5. Захидов С.Т., Кулибин А.Ю. Усиление генетической нестабильности сперматогенной системы у ускоренно стареющих мышей SAMP1 под влиянием модельного мутагена дипина // ДАН. 2006. Т.407. №3. С.411-413.

6. Кулибин А.Ю., Захидов С.Т., Маршак Т.Л., Сабурина И.Н. 2006.

Экспериментальное изучение динамики сперматогенеза у ускоренно стареющих мышей SAMP1 // ДАН. 2006. Т.410. №6.