На правах рукописи
Кирютин Алексей Сергеевич
РАЗВИТИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ХПЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СПИНСЕЛЕКТИВНЫХ РЕАКЦИЙ РАДИКАЛОВ БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ
МОЛЕКУЛ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
01.04.17 – химическая физика, в том числе физика горения и взрыва
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Новосибирск – 2009
Работа выполнена в Институте «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук
Научный руководитель: доктор физико-математических наук Юрковская Александра Вадимовна (Институт «Международный томографический центр» СО РАН)
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Лешина Татьяна Викторовна (Институт химической кинетики и горения СО РАН) доктор химических наук, профессор Талзи Евгений Павлович (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН)
Ведущая организация Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
Защита состоится «17» июня 2009 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 003.014.001 при Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.
Автореферат разослан «11» мая 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук Онищук А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Одной из фундаментальных задач химической физики является установление механизма протекания элементарного акта химических реакций для последующего целенаправленного воздействия на химические процессы. С этой целью изучаются свойства активных короткоживущих промежуточных частиц биологически важных молекул – аминокислот и нуклеотидов. Метод химической поляризации ядер (ХПЯ) позволяет исследовать процессы формирования и распада неравновесных ядерно-спиновых состояний продуктов спин-коррелированных радикальных реакций по спектрам ЯМР. Актуальным является развитие и применение высокочувствительных импульсных методов магниторезонансной спектроскопии, основанных на явлении ХПЯ, что начали делать относительно недавно и всего в нескольких лабораториях мира. Импульсный метод ХПЯ позволяет разделить вклад от геминальных процессов и провести количественный кинетический анализ радикальных реакций на микросекундной временной шкале.
Установленная в работе линейная зависимость между сигналами в геминальных спектрах ХПЯ и константами СТВ открывает путь для определения структуры очень короткоживущих радикалов, регистрация которых традиционными методами ЭПР затруднена вследствие их низкой стационарной концентрации. Получение кинетической информации о протекании реакции восстановления радикалов нуклеотидов аминокислотами в широком диапазоне значений рН как модельной реакции для «химического» пути быстрой и эффективной репарации нуклеиновых кислот, защищающей их от повреждений, является актуальным.
Обычно для получения данных о подвижности частиц используют зависимость ядерной релаксации от напряженности магнитного поля. При интерпретации не рассматривается спинспиновое взаимодействие, потому что данные получают при низком спектральном разрешении, что является существенным недостатком. Развитие метода быстрого переключения поля с высоким спектральным разрешением при регистрации позволяет выявить влияние скалярного спин-спинового взаимодействия на релаксацию и ХПЯ в слабых магнитных полях.
Целями диссертационной работы являются:
1. Установление линейной зависимости между интенсивностями сигналов в геминальных спектрах ХПЯ и константами сверхтонкого взаимодействия в радикалах с большим числом магнитных ядер.
2. Применение метода ХПЯ для определения относительных констант СТВ с ядрами 1Н и 13С в короткоживущих катион-радикалах триптофана и с ядрами 15N аденозин-5'-монофосфата.
3. Исследование реакции переноса электрона с аминокислот (триптофан, тирозин, метионин и гистидин) на радикалы гаунозин-5'-монофосфата в широком диапазоне значений рН и определение констант скоростей этой реакции.
4. Изучение влияния скалярных спин-спиновых взаимодействий на зависимость ядерной Т1релаксации от напряженности магнитного поля и когерентный перенос ХПЯ.
Методы исследования. Все экспериментальные данные получены методом ядерного фотохимических реакций, инициированных импульсным лазерным излучением.
Научная новизна работы. Впервые создана установка ХПЯ с временным разрешением на базе ЯМР спектрометра с магнитным полем 14.1 Тл для регистрации сигналов ЯМР 1Н, 13С и N. При использовании новой установки была установлена линейная зависимость сигналов геминальной ХПЯ от констант СТВ в многоспиновых радикальных парах и впервые зарегистрированы геминальные спектры ХПЯ 13С и 15N. В работе впервые определены знаки и относительные величины констант сверхтонкого взаимодействия для С в короткоживущих катион-радикалах триптофана и N для катион-радикалов нуклеотида АМР. Методом ХПЯ с аминокислотами в водных растворах и получены константы скорости этих реакций для четырех различных радикалов GMP при рН от 1.3 до 13.3. Впервые продемонстрировано влияние скалярного спин-спинового взаимодействия на зависимость ядерной релаксации от напряженности внешнего магнитного поля и выявлен когерентный перенос ядерной поляризации между скалярно-связанными ядрами на примере аденозин-5'-монофосфата.
Практическая ценность работы. Полученные результаты будут использованы для дальнейших фундаментальных исследований в области спиновой химии в институтах МТЦ СО государственном университете, Институте химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Казанском физико-техническом институте им. Е.К. Завойского РАН и в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
1. Пропорциональную зависимость интенсивностей геминальной ХПЯ от констант СТВ в радикалах с большим числом магнитных ядер, в которых ширина спектра ЭПР намного больше, чем константа СТВ любого из ядер.
2. Кинетику ХПЯ в трехкомпонентной системе, содержащей 2,2'-дипиридил, гуанозин-5'монофосфат и аминокислоту (триптофан или тирозин) в водных растворах при значениях 3. Влияние спин-спиновых взаимодействий на полевую зависимость ХПЯ и дисперсию Т1релаксации.
Личный вклад соискателя. Автор участвовал в разработке плана исследований, в постановке задач диссертационной работы, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций по теме диссертационной работы. Основная часть экспериментальных исследований выполнена лично автором. Часть экспериментов проведена совместно с к.х.н.
с.н.с. Морозовой О.Б. при непосредственном участии автора.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждались на российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, апрель 2003 г.), 69-70th Annual Meeting of the Deutsche Physikalische Gesellschaft (DPG) (Берлин, Дрезден, Германия, 04-09 марта 2005 г., 27-31 марта 2006 г.), International Symposium on Modern Problems of Chemical Physics (Казань, Россия, 31 октября – 04 ноября 2006 г.), Modern Development of Magnetic Resonance (Казань, Россия, 24-29 сентября 2007 г.), 10th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effect in Chemistry and Related Phenomena (Венеция, Италия, 18-21 июня 2007 г.), 11th Chianti Workshop on Magnetic Resonance “Methods for biomolecular magnetic resonance” (Валамброса (Флоренция), Италия, 3-8 июня 2007 г.), The 5th Conference on Field Cycling NMR Relaxometry (Турин, Италия, 30 мая – 3 июня 2007 г.), 6th Asia Pacific EPR/ESR Symposium (Каирнс, Австралия, 13-18 июля 2008 г.), Central European Conference on Photochemistry (Бад Хофгастайн, Австрия, 10–14 февраля 2008 г.), 49th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference (Асиломар, Калифорния, США, 9- Марта 2008 г.), Современные проблемы химической физики (Ереван, Армения, 21-24 октября 2008 г.) Публикации. Материалы диссертации изложены в 5 статьях, а также в 15 тезисах международных и российских конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 169 наименований, и приложения. Работа изложена на 160 страницах, содержит 84 рисунка и 19 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.
Первая глава посвящена обзору литературы. В первом разделе обсуждается роль радикалов триптофана в процессах, протекающих в биологических системах. Особое внимание уделено проблеме детектирования радикалов триптофана. Второй раздел посвящен недавно обнаруженной неэнзиматической репарации ДНК и нуклеотидов по так называемому «химическому пути» восстановительной репарации ДНК, который эффективно конкурирует с относительно медленными ферментативными процессами для защиты генетической информации. В третьем и четвертом разделе описываются основы метода химической поляризации ядер (ХПЯ) с временным разрешением. Подробно описано формирование неравновесной химической поляризации ядер по радикально-парному механизму. Приведены примеры кинетических зависимостей ХПЯ при различных параметрах. Показано, как проявляются эффекты ХПЯ в спектрах ЯМР и от чего зависит знак поляризации. В пятом разделе представлен обзор фотохимических реакций с участием дипиридила, триптофана, тирозина и гуанозин-5'-монофосфата. Рассмотрены известные на сегодняшний день фотохимические свойства перечисленных реагентов. Представлены результаты проведенных ранее кинетических экспериментов ХПЯ с участием триптофана, тирозина и гуанозин-5'монофосфата. Рассмотрено влияние реакции внутримолекулярного переноса электрона на кинетику ХПЯ в дипептиде триптофан-тирозин.
Во второй главе описаны принципы работы и характеристики установок, на которых были проведены эксперименты ХПЯ и эксперименты по изучению Т1-релаксации. Особое внимание уделено созданной автором работы установки ХПЯ с временным разрешением 1 мкс на базе ЯМР-спектрометра (B0 = 14.1 Тл, H = 600 МГц). Данная установка позволяет регистрировать спектры ХПЯ на ядрах 1Н, 13 разрешением. Описана установка с быстрым переключением магнитного поля, позволяющая изучать эффекты ХПЯ и ядерную Т1-релаксацию в зависимости от магнитного поля в широком диапазоне от 0.1 мТл до 7 Тл.
В третьей главе рассмотрена теоретическая модель, объясняющая линейную зависимость геминальной ХПЯ от констант СТВ. Показано, что для многоспиновых радикальных пар интенсивность ХПЯ (Pi) пропорциональна константам СТВ (ai). Это соотношение выполняется в том случае, когда ширина спектра ЭПР или эффективная константа СТВ всей радикальной пары намного больше, чем константа СТВ на любом отдельно взятом ядре. Использование квантово-механического расчета ХПЯ по модели Адриана в сильном магнитном поле показало, что увеличение числа ядер в радикальной паре приводит к пропорциональности интенсивности ХПЯ от констант СТВ (рис. 1).
Рисунок 1. Зависимость расчетной интенсивности ХПЯ от констант СТВ при gB = 5 Гс, Amax = 10 Гс а) N = 3, б) N = 4, в) N = 6, г) N = 10.
Ограничения на использование пропорциональности Pi = Cai с целью определения неизвестных констант СТВ из геминальных спектров ХПЯ получены на основании теоретического моделирования.
При соблюдении всех условий, точность определения констант СТВ составит менее 0. Гс, а коэффициент определения R2 0.99.
Примечания: Выбор такого значения магнитного поля связан с существующими установками для измерения ХПЯ, большая часть которых построена на базе спектрометров с магнитным полем выше или равным 4.7 Тл (Н=200 МГц). Наблюдения, полученные в ходе данной работы показывают, что вероятность встречи радикальной пары со значением g < 0.0002 крайне низкая.
Данное соотношение пропорциональности экспериментально проверено на модельных системах с известными константами СТВ. В качестве модельной системы была выбрана радикальная пара тирозина с 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном. Тушение триплетной молекулы тетракарбоксибензофенона (TCBP) тирозином (TyrOH) при pH = 8.1 приводит к образованию спин-коррелированной радикальной пары {TyrO• + TCBP • } в триплетном состоянии. Последующая рекомбинация синглетной пары дает поляризованные диамагнитные продукты TyrOH и TCBP. На рисунке 2 (а) представлены эффекты ХПЯ для TyrOH и TCBP, зарегистрированные после рекомбинации геминальной радикальной пары. Значительные эффекты ХПЯ наблюдались для -CH2 протонов, ароматических протонов H2, H3, H5, H6 в тирозине и для протонов H2, H2', H5, H5', H6, H6' в TCBP. Из спектра ХПЯ были получены интенсивности сигналов всех протонов (табл. 1).
На рисунке 2 (б) показана зависимость интенсивности ХПЯ от констант СТВ для данных радикалов. Поскольку знак ХПЯ меняется при изменении знака g, то данные ХПЯ для TCBP были помножены на -1. Это дает возможность одновременно проверить линейность для TyrOH Рассчитанная по методу наименьших квадратов прямая линия, показанная на рисунке 2 (б), соответствует экспериментальным данным с коэффициентом корреляции 0.955.
Рисунок 2.
(а) Спектр 1H ХПЯ для TyrOH (5 мM) и TCBP (0.1 мM) при pH = 8.1 (200 МГц). Число накоплений: 128, =0, длительность РЧ-импульса 3 мкс, что соответствует /4-импульсу.
(б) Зависимость интенсивности 1H ХПЯ для протонов TyrOH и TCBP от констант СТВ. Результаты вычисления для протонов TyrOH и TCPB показаны черными и белыми символами соответственно. Прямая линия – наилучший расчет по функциям Pi = Cai и Pj = – Cbj Таблица 1. Интенсивности ХПЯ протонов TCBP и TrpH, константы СТВ радикалов соответствующих радикалов.
Ядро (молекула) Интегралы ХПЯ, отн. ед.а Константы СТВ, мТл (ХПЯ)б Константы СТВ, мТл (ЭПР) Примечание. a Значения нормированы на -100 для Н3,5. б Значения констант СТВ получены делением интегралов ХПЯ на -154 (Н2(ТСВР); Н6(ТСВР); Н5(ТСВР)), 154 (Н2,6(TyrOH); Н3,5(TyrOH)) и на 77 (1-СН2; 1-СН2) для перевода в единицы мТл и учета числа эквивалентных ядер. в Для двух бета-протонов использовалось среднее арифметическое значение.
Аналогичные эксперименты ХПЯ были проведены с тирозином, обогащенным обогащенного тирозина. Оказалось, что как и в случае протонов, интенсивности сигналов ХПЯ для каждого углерода пропорциональны соответствующим константам СТВ в радикале тирозина TyrO•.
Полученные экспериментальные результаты подтверждают теоретические предсказания, что открывает возможность определения констант СТВ для короткоживущих радикалов с помощью интегрирования сигналов в геминальном спектре ХПЯ. Таким образом, ХПЯ с временным разрешением – высокочувствительный инструмент для количественного анализа распределения спиновой плотности в короткоживущих радикалах, для которых зачастую невозможно получить данные методом ЭПР.
Катион-радикал триптофана TrpH•+ образуется в реакции переноса электрона с аминокислоты на триплетный краситель TD аналогично реакции с тирозином. В качестве красителя использовали фламинмононуклеотид (FMN) и 2,2'-дипиридил (Dp). Формирование ядерной поляризации происходит в ходе синглет-триплетной эволюции с последующей рекомбинацией синглетной радикальной пары S[TrpH•+ D•–]:
Обнаруженная геминальная ХПЯ отражает магнитные свойства катион-радикала TrpH•+, а не его депротонированную форму радикала Trp•, в котором отсутствует протон в положении N1. Депротонирование TrpH•+ (pKa 4.3) при рН = 79 должно проходить за более долгий период по сравнению со временем жизни этого радикала в геминальной паре, которое в Рисунок 3. Вверху – геминальный 13С спектр ХПЯ (150.9 МГц), полностью обогащенного 13С, 15N L-триптофана (С = 3мМ) c FMN (С = 0.3 мМ) в D2O при рН = 9.0. Во время накопления сигнала 13С включалось широкополосное подавление сигналов протонов. Энергия лазера на выходе 100 мДж; длительность регистрирующего импульса мкс; угол поворота 90°; 512 накоплений. Внизу – моделированный спектр 13С ХПЯ, полученный при использовании параметров из таблицы 2.
низковязких растворах составляет около 10 нс. На рисунке 3 приведены экспериментально полученный геминальный 13С спектр ЯМР L-триптофана в D2O, обогащенного изотопами 13С и N, с широкополосным подавлением протонного резонанса [1H] и расчетный спектр ХПЯ. В силу низкого природного содержания 13С (1.1%) сигналы ХПЯ от FMN отсутствуют.
Таблица 2. 13С константы СТВ для катион-радикала триптофана.
Углерод Интегралы Константы СТВ, мТл Константы СТВ, мТл Константы СТВ, мТл Примечание. a Значения нормированы на -100 для С3. б Значения констант СТВ получены делением интегралов ХПЯ на -69 для перевода в единицы мТл.
константами СТВ, были определены относительные константы С СТВ короткоживущего катион-радикала триптофана. При сравнении их с DFT-расчетами были получены значения констант СТВ, приведенные в таблице 2. По-видимому, это первая экспериментальная характеристика магнитных свойств свободного катион-радикала триптофана на момент написания диссертационной работы (вне стабилизирующей среды белка). Отсутствие в литературе до 2008 года данных об ЭПР-спектрах свободного катион-радикала триптофана TrpH•+ (или его нейтральной формы Trp•) может объясняться многими факторами, приводящие к уширению спектра и ослаблению сигнала.
Удостоверившись в высокой точности простого соотношения пропорциональности между ХПЯ и константами СТВ, мы применили метод ХПЯ для характеризации распределения спиновой плотности в радикале нуклеотида AMP. В этом радикале имеется только два поляризуемых протона (H2 и H8), в то время как спиновая плотность в основном распределена между ядрами азота. Следовательно, необходимо измерить константы СТВ для азота.
Поскольку основной изотоп азота N является квадрупольным ядром, то для характеризации распределения спиновой плотности в радикале мы использовали обогащенный изотопом N по всем положениях AMP. Насколько нам известно, это первые результаты по ХПЯ с изучалась только в стационарном варианте метода.
Реакция между AMP и фотовозбужденным 2-метилнафтохиноном (MeNQ), в водном растворе приводит к формированию триплетной радикальной пары {AMP •+ + MeNQ• }. В результате обратного переноса электрона образуются поляризованные молекулы AMP и MeNQ.
химические сдвиги соответствуют ранее опубликованным. Можно сделать вывод, что только три ядра азота имеют значительную спиновую плотность, а именно: N1, N3 и N10, для которых из спектра ХПЯ (рис. 4) было получено следующее соотношение интенсивностей поляризации:
PN1:PN3:PN10=0.25:1:2.07. В радикале АМР, помимо трех ядер азота, имеются протоны и атомы дейтерия, поэтому число магнитных ядер достаточно велико для того, чтобы обеспечить пропорциональность между ХПЯ и СТВ. В результате получаем следующее соотношение для констант СТВ 15N: aN1:aN3:aN10=0.12:0.48:1.00.
Рисунок 4. 15N-ЯМР спектр (вверху) и спектр 15N-ХПЯ (внизу) для полностью 15N изотопно-обогащенного AMP (С = 3.6 мM) с 2-метилнафтохиноном при pH = 7.9 (60.8 МГц). Число накоплений: 39000 (ЯМР), 8400 (ХПЯ); =0;
длительность РЧ-импульса 30 мкс, что соответствует /2-импульсу.
В четвертой главе приведены результаты изучения реакции переноса электрона с триптофана и тирозина на радикалы гуанозин-5'-монофосфата в широком диапазоне значений.
С целью изучения механизма химической репарации ДНК (РНК) была выбрана модельная система, состоящая из трех компонентов: пуриновое основание (гуанозин-5’-монофосфат), восстанавливающего агента для радикала гуанозина и краситель (2,2'-дипиридил) для инициирования фотохимической реакции. Измерения кинетики ХПЯ проводились в ходе обратимой фотореакции, сопровождаемой последовательным окислением и восстановлением основания РНК – GMP. Целью исследования было выявить влияние рН на механизм радикального восстановления, определить структуру образующихся интермедиатов и получить детальную информацию об их реакционной способности в диапазоне значений рН от 1.3 до 13.3.
На рисунке 5 показан ароматический участок спектров ХПЯ, полученных в фотореакциях DP с GMP, DP с Tyr и DP с обоими реагентами. Вертикальная шкала для спектров подобрана таким образом, чтобы верхняя левая пара спектров имела одинаковую интенсивность сигнала Н8 GMP, а правая – сигнала Н3,5 Tyr. Спектры, полученные при задержках 0 и 100 мкс, имеют одинаковую вертикальную шкалу.
Рисунок 5. Ароматический участок спектров ХПЯ 1H CIDNP, полученных в фотореакциях 2,2-дипиридила с гуанозин-5-монофосфатом (С = 23 мМ) (слева), N-ацетилтирозина (С = 35 мМ) (справа) и со смесью гуанозин-5монофосфата (С = 20 мМ) и N-ацетилтирозина (С = 10 мМ) (в середине); pH = 7.5. Верхние спектры получены сразу после лазерного импульса, нижние – через 100 мкс после лазерного импульса.
Сигналы в спектре ХПЯ наблюдались для протонов, не обменивающихся с водой, и имеющих ненулевые константы СТВ в промежуточных радикалах. Знаки сигналов ХПЯ соответствуют правилам Каптейна. В данном случае наблюдалась усиленная абсорбция для Н3,4 и Н5 дипиридила, Н2,6 тирозина и эмиссия Н8 гуанозина и Н3,5 тирозина (усиленная абсорбция также обнаружена для непоказанных -СН2 протонов тирозина). При других значениях рН наблюдались качественно те же спектры ХПЯ, что и в нейтральном растворе.
«