На правах рукописи

Цыганова Елена Валерьевна

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ОСТРОГО ГЕПАТИТА НЕУТОЧНЕННОЙ ЭТИОЛОГИИ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ,

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ И ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ

МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.01.09 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА – 2010 2

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет Росздрава»

Научный руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, Ющук Николай Дмитриевич профессор к.х.н., ведущий научный сотрудник НИИ вирусологии Исагулянц Мария Георгиевна им. Д.И.Ивановского

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Кравченко Алексей Викторович профессор доктор медицинских наук, Никитин Игорь Геннадиевич профессор

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «26» ноября 2010 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д.208.114.01 ФГУН «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (111123, Москва, ул. Новогиреевская, д.3а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «» _ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич Актуальность проблемы.

Вирусные гепатиты традиционно являются одной из наиболее острых проблем здравоохранения. В качестве этиологических факторов вирусных гепатитов рассматриваются как минимум 8 агентов (HAV, HBV, HDV, HCV, HEV, HGV, TTV и SENV), 6 из которых передаются парентеральным путем.

Однако до настоящего времени роль отдельных вирусов (HGV, TTV, SEN) и их сочетаний в развитии поражения печени не вполне ясна и требует дальнейшего уточнения. Особое место в практике клинициста занимают острые гепатиты неуточненной этиологии (ОГНЭ). Известно, что в Российской Федерации удельный вес острых гепатитов неустановленной этиологии последовательно увеличивается - с 1-2,2% в 1993-1997 гг. до 4,1-4,2% в 2004-2005 гг. и 5,7-6,7% в 2006-2008 гг. (Онищенко Г.Г., 2009). Имеются сведения, что некоторая доля больных, перенесших явно посттрансфузионный гепатит, остается серонегативной в отношении всех маркеров известных вирусных гепатитов человека; в различных странах Запада эта доля достигает 15-20% (Михайлов М.И., 2009).

С одной стороны, в настоящее время, в связи с интенсивной миграцией населения увеличивается риск завоза «новых» гепатотропных вирусов, а с другой стороны, даже при применении самых современных методов диагностики, часть ОГНЭ все-таки остается неверифицированной, что определяет необходимость углубленного изучения ОГНЭ. Крайне актуально детальное изучение иммунного ответа на антигены вирусов – кандидатов в этиологические факторы гепатитов и выявление нуклеиновых кислот данных возбудителей с использованием специфических лабораторных методик.

Результаты подобных исследований помогут внедрить в практику здравоохранения новые методы обследования для уточнения этиологии ОГНЭ.

В исследованиях последнего десятилетия, посвященных изучению HCVинфекции, многими авторами показано, что при наличии РНК HCV в крови отсутствуют антитела к HCV (Alter H.J. et al, 1995; Hoofnagle J.H., 2002; Cox A.L. et al., 2005). В то же время, при ОГС на фоне виремии регистрируется мощный Т-клеточный ответ на стимуляцию антигенами HCV (Quinti I. et al, 1995; Takaki A. et al, 2000; Bronowiscki J.P. et al, 1997; Scognamiglio P. et al, 1999), который является предиктором реконвалесценции и также может регистрироваться в отсутствии как серологических маркеров HCV, так и при отсутствии РНК HCV в крови (Kamal S. M. et al, 2004; Hitziger T. et al, 2009; Bes M., 2009). В настоящее время регистрируемый специфическими методами Тклеточный ответ на антигены HCV в отсутствии антител к вирусу гепатита С рассматривается с одной стороны в качестве доказательства предшествующей встречи с HCV, а с другой стороны в качестве мощного защитного фактора, предотвращающего возможность повторного инфицирования индивидуумов.

(Hitziger T. et al, 2009; Bes M., 2009). Изучение Т-клеточного ответа на стимуляцию антигенами HCV лимфоцитов крови у больных ОГНЭ ранее не проводилось и в настоящем исследовании это сделано впервые. Кроме того, HCV-инфекция рассматривается в качестве этиологического фактора ОГНЭ.

Целью работы было оценить патогенетическое и диагностическое значение обнаружения компонентов (ДНК/РНК, антигенов) гепатотропных вирусов и противовирусного иммунного ответа при остром гепатите неуточненной этиологии методами ИФА, ПЦР и Т-клеточной пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигенами HCV.

1. Оценить долю гепатита неуточненной этиологии в структуре острых гепатитов, при исключении алкогольной и аутоиммунной этиологии заболевания.

2. Определить долю острого вирусного гепатита с отсроченной сероконверсией в структуре острого гепатита неуточненной этиологии.

3. Определить долю гепатита Е в структуре острого гепатита неуточненной этиологии.

4. Выявить значение некоторых гепатотропных вирусов: HGV, TTV, B-19, EBV, HHV-1, 2, 6 и 8 типов, CMV, NV-f в развитии гепатита неуточненной этиологии по результатам ПЦР и ИФА.

5. Оценить клинико-биохимическую картину острого гепатита неуточненной этиологии и сравнить ее с клинико-биохимической картиной острых гепатитов В и С.

6. Определить долю острой HCV-инфекции с атипичным серологическим профилем в этиологической структуре гепатита неуточненной этиологии по данным ИФА, ПЦР и Т-клеточной пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигенами HCV.

1. Впервые проведено комплексное обследование группы больных ОГНЭ в течение 6 – 12 месяцев, включающее динамическое определение генетических маркеров гепатотропных вирусов.

2. Впервые проведен сравнительный анализ клинико-биохимической картины у больных ОГНЭ, ОГС и ОГВ.

3. Впервые проведено комплексное обследование больных ОГНЭ экспериментальными методами с целью выявления иммунологических маркеров HCV.

4. Впервые создан алгоритм выявления пациентов с иммунологическими маркерами HCV-инфекции с применением мультипараметрического критерия по результатам экспериментального исследования.

5. Впервые проведено исследование сывороток больных ОГНЭ на наличие нового агента - NV-f, способного вызывать острый гепатит.

1. Впервые установлены доля острых гепатитов А и С с отсроченной сероконверсией в структуре острого гепатита неуточненной этиологии и сроки выявления сероконверсии.

2. Впервые определена доля вирусного гепатита Е среди жителей города Москвы, не выезжавших в эндемичные регионы и поступивших в стационар с клинической картиной острого вирусного гепатита.

3. Разработан алгоритм по уточнению этиологии заболевания у больных острым гепатитом неуточненной этиологии с рекомендациями по применению в диагностике экспериментальных методик ИФА и Т-клеточной пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигенами HCV.

4. Впервые оценен спектр лекарственных препаратов и биологически активных добавок, которые применяли 29,4% больных острым гепатитом неуточненной этиологии до начала заболевания.

Результаты проведенной работы позволили обосновать целесообразность комплексного динамического обследования пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии, выработать критерии постановки диагноза острого гепатита неуточненной этиологии, рекомендовать динамическое наблюдение пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии в течение 6 месяцев х лет.

Материалы проведенного исследования используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ на последипломном уровне образования врачей: включены в лекционный материал, разбираются на практических занятиях с врачами на курсах повышения квалификации. Результаты исследования поэтапно докладывались на заседаниях кафедры, на научно-практических конференциях и оформлены в виде статьи.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертация изложена на 177 листах машинописного текста и включает введение, 4 главы (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, а также обсуждение полученных результатов с выводами и практическими рекомендациями), список литературы (отечественных представлен таблицами и рисунками.

Работа выполнена в 2006-2009 гг. на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии Московского государственного медико-стоматологического университета (заведующий кафедрой – академик РАМН, профессор Н.Д.

Ющук) на базе Инфекционной клинической больницы № 1 г. Москвы (главный врач – профессор Н.А. Малышев).

В течение 2005-2006 гг. в Инфекционной клинической больнице №1 г.

Москвы были обследованы 1392 больных острым гепатитом. Этиологическая структура острых гепатитов представлена на рис.1.

Рис.1. Этиологическая структура острых гепатитов по данным ИКБ №1 в Данные, предсталенные на рис.1 характеризуют этиологическую структуру острых гепатитов,острый гепатит неуточненной этиологии был диагностирован в 7,5% случаев (n=105).

В исследование были включены следующие группы: больные острым гепатитом неуточненной этиологии (n=42), пациенты с острым гепатитом С (n=33) и острым гепатитом В (n=36), которые составили группы сравнения и здоровые лица, составляющие группу контроля (n=15). Исследуемая группа больных острым гепатитом неуточненной этиологии была сформирована с учетом критериев включения и исключения. Критерии включения: клиническая картина желтушной формы острого гепатита; более чем 10-кратное повышение уровня активности АлАТ; отсутствие маркеров острых вирусных гепатитов А, В, С при первичном обследовании, возможность динамического наблюдения за пациентом в течение не менее 6 месяцев; письменное информированное согласие пациента на участие в исследовании. Критерии исключения: тяжелые соматические и психические заболевания, в том числе онкологическая и аутоиммунная патологии по данным анамнеза; признаки острой и хронической алкогольной интоксикации, наркозависимость; химиотерапия и системная гормональная терапия в течение 6 месяцев перед заболеванием; наличие ВИЧинфекции и сифилиса. В группу контроля вошли здоровые лица с отсутствием маркеров вирусных гепатитов А, В, С по данным коммерческих тест-систем.

Обследование пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии осуществлялось по следующей схеме: в первые 10 дней желтушного периода, через 1, 3, 6 и 12 месяцев после выписки из стационара. В каждом образце крови определяли: биохимические показатели крови, HBsAg и anti-HCV методом ИФА. Трижды (в первые 10 дней желтушного периода и через 3 или месяцев) обследование на наличие нуклеиновых кислот гепатотропных вирусов методом ПЦР, определение антител к некоторым гепатотропным вирусам методом ИФА.

В качестве основных методов обследования больных применены: метод клинико-эпидемиологического обследования пациентов (сбор анамнеза, оценка состояния и жалоб пациента, физикальный осмотр); стандартный лабораторный метод (общеклинический и биохимический анализы крови); серологический метод (определение маркеров вирусных гепатитов А, В, С, D, Е, антител к EBV, PV В-19, вирусу клещевого энцефалита, вирусу лихорадки Западного Нила, вирусу лихорадки Денге, вирусу Крым-Конго геморрагической лихорадки методом ИФА); молекулярно-биологический метод (РНК вирусов гепатитов А, С, Е, G; ДНК вирусов гепатита В, TTV, CMV, EBV, HHV 1, 2, 6 и 8 типов, PV (определение иммунологические (лабораторные диагностические): раздельное определение специфических антител на спектр индивидуальных антигенов HCV, включающий структурные и неструктурные белки и пептиды из их состава, представляющих весь полипротеин HCV (всего 38 антигенов: 34 антигена HCV и 4 контрольных антигена) в сыворотке крови методом ИФА, исследование Тклеточного иммунного ответа на антигены HCV (core HCV и пулы из его состава; NS3 и пулы из его состава; NS4, NS5А и NS5В) методом бласттрансформации лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигенами HCV c количественной оценкой секреции цитокинов; инструментальный метод:

ультразвуковое исследование органов брюшной полости.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью статистической программы «STATISTICA 7.0» и «Microsoft Excel».

Для оценки статистической значимости результатов исследования применяли непараметрические методы, при этом определялись критерии Kruskall-Wallis and Mann-Whitney U tests. Определены процентное содержание ряда полученных данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (m).

В группе пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии (n=42) соотношение мужчины-женщины было 15:27 (36% и 63% соответственно).

Преобладали пациенты среднего возраста: 40-59 лет – 19 пациентов (45,2 %), в возрасте от 15-40 лет были 12 пациентов (28,6 %) и в старшей возрастной группе (60 лет и старше) было 11 пациента (26,5 %).

Больные ОГНЭ поступали в стационар от 3 до 18 дня болезни, в среднем, на 7,4±0,3 день, от 1 до 9 дня желтухи (в среднем 2,8±0,2 день). У 29 (69%) больных продолжительность преджелтушного периода, в среднем, составила 4,5±0,4 дней (от 1 до 14 дней), у 13 (31%) преджелтушный период отсутствовал.

Средняя продолжительность желтушного периода составила 13,8±0,7 дней. В продромальном периоде преобладали диспепсический и интоксикационный синдромы. В желтушном периоде интенсивность симптомов уменьшалась.

Из анамнеза больных острым гепатитом неуточненной этиологии известно, что 74% пациентов (n=31) имели парентеральные вмешательства в период не более 6 месяцев до возникновения первых симптомов заболевания.

Все больные ОГНЭ отрицали употребление алкоголя в количестве, большем г в сутки (в пересчете на этанол), и психоактивных веществ. На прием различных лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) в течение 6 месяцев до развития симптомов заболевания указывали 28,6% пациентов (n=12). Препараты с возможным гепатотоксичным действием (антимикробные, противопротозойные и НПВС) применяли 3 пациента длительностью не более 2-х дней в продромальном периоде. Среди антимикробных и противопротозойных препаратов были названы ципрофлоксацин и метронидазол, а НПВС – парацетамол. Группу биологически активных добавок, применяемых пациентами составляли: капилар антиоксиданты, эссенциальные полиеновые кислоты, ферменты, полисахариды, микроэлементы, витамины), а также концентрированный настой чистотела.

В группе пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии наблюдались сопутствующие заболевания желудочно-кишечного тракта (хронический дискинезия желчевыводящих путей, желчекаменная болезнь).

Средний койко-день составил 15±4,3 дней (от 6 до 22). После выписки из консультативном гепатологическом центре ИКБ №1 в течение не менее месяцев.

Результаты лабораторного обследования больных ОГНЭ в стационаре и при последующем динамическом наблюдении.

Средние показатели активности АсАТ и АлАТ в крови у больных ОГНЭ (n=42) в остром периоде составили 1369±94 (97-4193) и 1809±76 (603-5242) мкмоль/(мин.л), соответственно; средние значения показателей -ГТП и ЩФ в крови - 204±28 (149-528) и 322±36 (119-801) мкмоль/(мин.л), соответственно.

Содержание билирубина в крови, в среднем, составило 152±27 (64-408) млмоль/л. Параметры клинического анализа крови были в пределах нормальных значений (таблица 1).

Лабораторные показатели больных острым гепатитом неуточненной Количество эритроцитов, х 10 /мм 3,96-5,02 5,0± 0, Количество лейкоцитов, х 10 /мм 5,6-12,3 6,75± 0, Количество тромбоцитов, х 10 /мм 192-341 198,9± 14, Результаты определения нуклеиновых кислот (ДНК/ РНК) гепатотропных вирусов в крови у больных ОГНЭ в остром периоде заболевания.

Среди больных ОГНЭ (n=42) в желтушном периоде у 4 пациентов выявлена РНК HCV (9,5%), РНК HAV у 1 (2,4%), при повторном обследовании этих пациентов на маркеры вирусных гепатитов методом ИФА в стационаре были выявлены анти-HCV (4 пациента) и анти-HAV IgM (1 пациент), соответственно.

У 1 больного (2,4%) определялась в сыворотке крови РНК HGV, ДНК HHV 6 типа - у 1 (2,4%), сочетание РНК HEV и ДНК EBV выявлено у пациентки (2,4%), РНК HGV и ДНК EBV у 1 пациента (2,4%). У 2-х больных (4,8%) выявлена ДНК PV В19. Генетического материала HDV, HHV 1, 2 и типов, CMV, TTV, NV-f не выявлено ни у одного больного. Таким образом, генетический материал гепатотропных вирусов выявлен у 33,5% больных ОГНЭ.

Результаты верификации диагнозов: ГА, ОГС и ГЕ среди больных с острым гепатитом неуточненной этиологии.

При обследовании в первые 10 дней желтушного периода у больных ОГНЭ отсутствовали маркеры гепатитов А, В, С (анти-HAV IgM, HBsAg, антиHBcore IgM и G, анти-HCV). При повторном обследовании на маркеры вирусных гепатитов, к 12-му дню болезни у 1 пациента выявлены aнти-HAV IgM (2,4%), к 14 дню пребывания в стационаре у 4 пациентов выявлены aнтиHCV (9,5%). Ретроспективно в замороженных образцах сывороток крови больных ОГНЭ были выявлены антитела (IgM) к вирусу гепатита E (HEV) у 3-х пациентов (7,1%).

Таким образом, на основании результатов иммунологического исследования и прямой детекции нуклеиновых кислот гепатотропных вирусов, у 8 пациентов (19%) из группы больных ОГНЭ, диагноз был верифицирован как вирусный гепатит А, С или Е во время их пребывания в стационаре. После исключения пациентов с установленным диагнозом (гепатит А, С или Е), в группе пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии осталось пациента.

Данные эпидемиологического анамнеза и клинико-лабораторная После уточнения этиологии острого гепатита у 8 пациентов, группа больных ОГНЭ составила 34 человека. Соотношение больных по полу было мужчины-женщины 8:26 (23,5% и 76,5%, соответственно), преобладали пациенты среднего возраста (40–69 лет) - 67,7%. По данным анамнеза больных ОГНЭ, 70,6% пациентов (n=24) подвергались парентеральным вмешательствам в течение 6 месяцев до возникновения первых симптомов заболевания. За пределы Москвы в течение 3-х месяцев до начала заболевания выезжали (11,8%) пациента: 3 (8,8%) пациента – в Московскую область, 1 (2,9%) – в Дагестан.

Все пациенты отрицали употребление алкоголя в количестве, большем г в сутки (в пересчете на этанол), и психоактивных веществ. На прием различных лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) в течение 6 месяцев до развития симптомов заболевания указывали 29,4% пациентов (n=10).

Больные поступали в стационар от 4 до 18 дня болезни, в среднем, на 7,6±0,3 день, от 1 до 8 дня желтухи (ср. 2,7±0,2). Средняя продолжительность желтушного периода составила 12,9±0,7 дней.

Средние показатели активности АсАТ и АлАТ в крови у больных ОГНЭ в остром периоде составили 1294±84 (116-4293) и 1987±76 (638-5748) мкмоль/(мин.л), соответственно; средние значения показателей -ГТП и ЩФ в крови - 218±67 (118-511) и 348±41 (175-801) мкмоль/(мин.л), соответственно.

Среднее значение уровня билирубина в крови, в среднем, составило 163± млмоль/л (78-396). Во время пребывания в стационаре у всех больных ОГНЭ показатели клинического анализа крови и мочи, уровень общего белка, альбумина и белковых фракций, протромбинового индекса и тимоловой пробы в биохимическом анализе крови, а также параметры клинического анализа крови больных ОГНЭ были в пределах нормальных значений.

Аутоиммунную природу гепатита исключили у 100% больных ОГНЭ по результатам обследования на наличие аутоиммунных антител в крови - ни у одного из 34 пациентов АМА и ANA в крови не были выявлены в диагностическом титре. У лиц, выезжавших за пределы Москвы, были исключены геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и лептоспироз. У всех больных по данным УЗИ исключена механическая природа желтухи.

В стационаре больным проводилась дезинтоксикационная и симптоматическая терапия.

Средний койко-день у больных составил 14±5,3 дней (от 6 до 22). При динамическом наблюдении, через 1 месяц от начала желтушного периода у всех пациентов выявлено значительное уменьшение активности трансаминаз и содержания билирубина в крови. Среднее значение уровня билирубина составлял 24±8 млмоль/л (9-36), активность АлАТ 187±32 мкмоль/(мин.л) (65АсАТ 106±12 мкмоль/(мин.л) (89-156), произошла нормализация показателей -ГТП и ЩФ - 32±11 мкмоль/(мин.л) (21-45) и 117± мкмоль/(мин.л) (110-137), соответственно. При обследовании через 1, 3 и месяцев ни у одного пациента ОГНЭ не выявлены HBsAg, aнти-HCV в крови, а биохимические показатели к 6-му месяцу наблюдения были в пределах нормальных значений.

В остром периоде заболевания и при динамическом наблюдении было проведено определение антител к EBV, PV B-19 методом ИФА. У пациентов с наличием ДНК EBV в сыворотке крови отсутствовали иммуноглобулины к EBV классов А, М и G в остром периоде и при динамическом наблюдении. В то же время анти-EBV Ig M были выявлены у 2-х пациентов с наличием РНК HGV и ДНК HHV-6 в сыворотке крови в остром периоде заболевания.

У пациентки с определенными методом прямой детекции РНК HEV и ДНК EBV выявлены anti-EBV IgG и anti-HEV IgM и G в крови, что позволило диагностировать острый гепатит Е, но не позволило диагностировать реактивацию EBV- инфекции.

У пациентов с наличием ДНК PV B-19 в крови иммуноглобулины к парвовирусу В-19 классов М и G не выявлены в остром периоде, что не укладывается в типичную клинико-лабораторную картину острой парвовирусной инфекции.

Сравнительный анализ данных эпидемиологического анамнеза и клиникобиохимической картины заболевания у больных ОГНЭ, ОГС и ОГВ.

Группа больных ОГС включала 22 мужчин и 11 женщин, средний возраст составил 27 лет (от 17 до 54 лет). В группе больных ОГВ было 19 мужчин и женщин, средний возраст 38 лет (от 18 до 67 лет). В анамнезе у 78% и у 87% больных ОГС и ОГВ, соответственно, были указания на парентеральные вмешательства.

Сроки поступления в стационар больных ОГНЭ, ОГС и ОГВ достоверно не отличались, и составляли 7,6±0,3 день болезни (день желтухи - в среднем, 2,7±0,2), 5,4±0,6 день болезни (день желтухи - в среднем, 3,2±0,2), 8,4±0,2 день болезни (день желтухи - в среднем, 2,2±0,2), соответственно. Средняя продолжительность желтушного периода у больных ОГНЭ составила 12,9±0, дней, в группах пациентов с ОГС и ОГВ - 16,1±2,6 и 18±6,3 дней, соответственно.

диспепсического и интоксикационного синдромов, по сравнению с группами больных ОГНЭ и ОГС; в группе больных ОГВ чаще наблюдался артралгический синдром, а также кожный зуд и сыпь, но достоверных различий не выявлено. В группе больных ОГВ уровень трансаминаз был выше по сравнению с группами пациентов с ОГНЭ и ОГС, но достоверно не отличался.

Результаты обследования больных ОГНЭ на наличие иммунологических маркеров HCV-инфекции.

В группах больных ОГНЭ (n=23/34), ОГС (n=10) и контрольной группе (n=15) было проведено определение специфических антител на широкий спектр антигенов HCV, включающий структурные и неструктурные белки и пептиды из их состава, представляющих весь полипротеин HCV, методом ИФА.

Результаты исследования показали, что ни у кого из обследованных в контрольной группе не выявлены антитела ни на один из указанных антигены HCV (титр антител < 200). В то же время, у 15 из 23 пациентов ОГНЭ были выявлены антитела на ряд антигенов HCV в титре > 200: антитела к 5 и более антигенам HCV (core HCV и пептиды из его состава, E1 и Е2, пептиды, представляющие гипервариабельный участок 1 (HVR1) белка оболочки Е2 – HVR-N и HVR-C, пептиды из состава белка p7 HCV 1a и 1b, и неструктурных (NS3 и пептиды из его состава, NS4, NS5 a и b) в высоком титре (от 1000 и более). У 3-х пациентов были выявлены антитела к 4 антигенам HCV в титре от 200 до 4000. У 4-х пациентов были выявлены антитела менее чем к 4 антигенам HCV (0 – 3) в титре < 1000. В группе больных ОГС в высоком титре были определены антитела к core HCV и пулам из его состава, Е2, NS3 и пулам из его состава, NS4 и NS5b.

Соответственно полученным данным, больные ОГНЭ, у которых определялись 5 и более позитивных реакций на антигены HCV были объединены в группу I, а больные с количеством позитивных реакций менее 5 в группу II. Первая группа включала 14 пациентов, вторая – 8. Одна пациентка не была включена ни в одну из образовавшихся групп, так как ее серологический профиль на широкий спектр антигенов HCV резко выделялся на фоне других пациентов – титры антител к отдельным антигенам превышали 20 000, что возможно было связано с приемом гормональных препаратов.

Учитывая наличие/отсутствие в сыворотке крови пациентов ОГНЭ маркеров других гепатотропных вирусов (HAV, HBV, HEV, EBV, HSV-6, B-19), группы были разделены на две подгруппы: без коинфекции (а), с коинфекцией (б). В группе Iа у пациентов без коинфекции гепатотропными вирусами (n=12) в высоком титре выявлялись антитела к HCV core и пулам из состава HCV core, Е1 и E2, высокий титр антител определялся к NS3 и его пулам, NS4 и NS 5b, а так же к гипервариабельному участку HVR1 антигена Е2 (HVR-C) и пептиду из состава p7 HCV 1a. В группе Iб у пациентов с наличием гепатотропных вирусов в крови (n=3) были определены высокие титры (от 1000 и более) к core HCV и его пулам, Е1и Е2, NS3 и пептидам NS3, NS4, NS 5a и 5b.

В группах IIа и IIб определялись единичные позитивные реакции к антигенам HCV (core HCV и его пулы, NS4, NS5a и NS5b) в низком титре (менее 1000).

При сравнении титров антител к структурным антигенам HCV в группе I среди пациентов без коинфекции гепатотропными вирусами (Ia) и с наличием гепатотропных вирусов (Iб), выявлены лишь незначительные различия, в частности - более высокий титр антител к p7 HCV 1a у пациентов без коинфекции гепатотропными вирусами (p=0,03). Других достоверных различий в серологическом профиле выявлено не было. На основании этого далее пациенты группы Iа и Iб рассматривались в качестве одной группы пациентов с ярко выраженной серореактивностью к антигенам HCV.

Для исключения ложнопозитивных результатов за счет присутствия в крови антител к флавивирусам, родственным было проведено исследование сывороток крови больных ОГНЭ на наличие антител классов IgM и IgG к некоторым флавивирусам (вирусу клещевого энцефалита, вирусу лихорадки Западного Нила, вирусу лихорадки Денге) методом ИФА. С целью выявления возможной неспецифической серореактивности за счет полиспецифических антител, провели определение в крови больных ОГНЭ иммуноглобулинов классов M и G к вирусу, не принадлежащему к семейству Flaviviridae (Крым-Конго геморрагической лихорадки). Полученные результаты так же были отрицательными. Таким образом, были исключены перекрестные и неспецифические положительные реакции.

Исследование Т-клеточного иммунного ответа на антигены HCV методом бласттрансформации лимфоцитов и количественная оценка секреции В группе больных ОГНЭ исследование Т-клеточной пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигенами HCV было проведено 18 из пациентов, в группе больных ОГС – 10 пациентам, в группу контроля включены 10 здоровых лиц.

В группе больных ОГНЭ уровень индекса стимуляции (SI) 1,7 на 3 и более антигенам HCV был выявлен у 7 пациентов из 18 (39%), из них к антигенам (2 пула из состава HCV core и NS4) – у 1-го пациента, к 5 антигенам – у 2-х пациентов (у одного к пулам NS3, а так же к NS4, NS5A и NS5B; у другого – к пулам из состава HCV core, NS3, NS4), к 6 антигенам у 1-ой пациентки – к пулам из состава NS3 и NS5B), у 3-х пациентов к 10 и более антигенам – к пулам из состава HCV core и NS3, NS4, NS5A и NS5B.

В группе больных ОГС был зарегистрирован уровень SI 1,7 к 3 и более антигенам HCV; антигены представляли HCV core и NS3, а также пулы из их состава, NS4.

В группе контроля (здоровые лица) уровень SI 1,7 был выявлен в единичных случаях - у 1-го индивидуума к HCV core пул 1, у 2-х других к NS пул что не позволяет считать указанные образцы сывороток положительными, т.к. нет соответствия условию позитивности - величина SI 1,7 выявлялась как минимум к 3 индивидуальным антигенам HCV.

При сравнении результатов Т-клеточной пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигенами HCV группа больных ОГНЭ достоверно отличалась по уровню средних значений SI в ответ на стимуляцию NS3 пул (р=0,03), NS4 (р=0,001), NS5B (р=0,001) от группы здоровых лиц. Группа больных ОГС также достоверно отличалась по уровню SI в ответ на стимуляцию core HCV пул 3 (р=0,004), NS3 (р=0,005), NS4 (р=0,03), NS5A (р=0,01) от группы здоровых лиц и не отличалась от группы ОГНЭ.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что группы ОГНЭ и ОГС схожи как по качественному, так и по количественному показателю – среднему уровню SI 1,7, отражающему Т-клеточный иммунный ответ на антигены HCV, который выявляется методом бласт-трансформации лимфоцитов. В тоже время обе эти группы по указанным параметрам достоверно отличаются от группы контроля.

В изучаемых группах так же было проведено определение уровня секреции цитокинов (-ИФН, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и перфорин) в ответ на стимуляцию антигенами HCV. Результат считался положительным при уровне секреции цитокинов > 6,5 пкг/мл в ответ на стимуляцию 3-мя и более антигенами HCV.

В группе больных ОГС (n=10) и ОГНЭ (n=23) наблюдали секрецию ИФН в количестве 20 пкг/мл и более в ответ на стимуляцию антигенами HCV:

core HCV, NS3 и пулы из его состава, NS4, NS5А и NS5В. В группе здоровых лиц (n=10) уровень секреции -ИФН был значительно ниже (менее 6,5 пкг/мл) на единичные антигены HCV.

В группе больных ОГС наблюдали секрецию ИЛ-2 в количестве более пкг/мл в ответ на стимуляцию core HCV, NS3, NS5В; в группе больных ОГНЭ наблюдается продукция ИЛ-2 в концентрации более 60 пкг/мл на стимуляцию core HCV и пулы из его состава, NS3 и пулы из его состава, NS4, NS5А и NS5В.

В группе здоровых лиц секреция ИЛ-2 составляла менее 10 пкг/мл в ответ на стимуляцию core HCV пул 3.

В группе больных ОГС наблюдается секреция ИЛ-4 более 10 пкг/мл в ответ на стимуляцию core HCV пулы 2, 3, NS3 пулы 3, 6, 7, NS5В; в группе ОГНЭ – более 10 пкг/мл в ответ только на стимуляцию NS3 пул 1. В группе здоровых лиц секреция ИЛ-4 составляла менее 10 пкг/мл.

В изучаемых группах наблюдали низкую концентрацию ИЛ-10 (до пкг/мл), что ниже уровня cut-off по рекомендациям производителя тестсистемы.

В группе больных ОГНЭ наблюдали высокую концентрацию перфорина (более 1000 пкг/мл) в ответ на стимуляцию NS4, NS5 и пептидами из состава NS3; концентрацию до 100 пкг/мл - в ответ на стимуляцию core HCV, NS3. В группе больных ОГС перфорин в количестве 1000 пкг/мл и более регистрировали только в ответ на стимуляцию пептидами из состава NS3.

Выявленный высокий уровень секреции перфорина указывает на высокий фон неспецифических реакций.

Таким образом, регистрировалась идентичная картина при определении среднего уровня секреции цитокина -ИФН в ответ на стимуляцию антигенами HCV в группах больных ОГС и ОГНЭ; продукция ИЛ-2 в группе больных ОГНЭ резко отличалась от группы больных ОГС - в группе больных ОГНЭ наблюдалась продукция ИЛ-2 в большей концентрации по сравнению с группой ОГС в ответ на стимуляцию core HCV и пулы из его состава, NS3 и пулы из его состава, а также NS4, NS5А и NS5В, а в группе больных ОГС ИЛ- секретируется периферическими мононуклеарами только в ответ на стимуляцию core HCV, NS3.

При сравнении суммарной секреции цитокинов в ответ на стимуляцию антигенами HCV группа больных ОГС достоверно отличается от группы здоровых по среднему уровню суммарной секреции -ИФН (р=0,007), ИЛ- (р=0,02); в группе больных ОГНЭ по сравнению со здоровыми лицами наблюдается достоверно более высокий средний уровень суммарной секреции -ИФН (р=0,002), ИЛ-2 (р=0,0003), ИЛ-4 (р=0,02); при сравнении групп ОГНЭ и ОГС различий не выявлено, кроме достоверно более высокого среднего уровня секреции ИЛ-2 в группе больных ОГНЭ (р=0,0001).

Таким образом, группы больных ОГНЭ и ОГС отличаются от группы здоровых и не отличаются друг от друга по ряду параметров, характеризующих секрецию цитокинов лимфоцитами в ответ на стимуляцию антигенами HCV.

Исключение составляет показатель уровня суммарной секреции ИЛ-2 – в группе больных ОГНЭ суммарная секреция выше по сравнению с группой больных ОГС.

Алгоритм выявления пациентов с иммунологическими маркерами HCVинфекции с применением мультипараметрического критерия по результатам экспериментального исследования.

С целью корректной оценки полученных результатов для каждого пациента групп ОГНЭ и ОГС, а так же контрольной группы было введено понятие «суммарное количество позитивных реакций». В группе здоровых лиц среднее суммарное количество позитивных реакций (SI 1,7 в ответ на стимуляцию как минимум тремя индивидуальными антигенами HCV) при определении Т-клеточной пролиферации лимфоцитов было равным 0,2; в группе больных ОГС – 2,1; а в группе больных ОГНЭ – 1,9. Аналогичные параметры также были введены для оценки секреции цитокинов -ИФН и ИЛ-2.

Средние суммарные значения позитивных реакций при проведении Тклеточной пролиферации и секреции цитокинов в ответ на стимуляцию антигенами HCV в группах больных ОГНЭ, ОГС и здоровых лиц представлены на Рис. Рис.2. Средние суммарные значения позитивных реакций при проведении Т-клеточной пролиферации и секреции цитокинов в ответ на стимуляцию антигенами HCV в группах больных ОГНЭ, ОГС и здоровых лиц.

Учитывая результаты проведенного статистического анализа, было сделано заключение, что только уровень секреции цитокинов -ИФН и ИЛ-2, количество позитивных реакций при определении специфических антител на спектр индивидуальных антигенов HCV (core HCV, NS3, NS4, NS5a, NS5b) в сыворотке крови методом ИФА, а так же SI можно рассматривать в качестве критериев, позволяющих выявить пациентов с иммунологическими маркерами HCV-инфекции. По данным параметрам группы больных ОГНЭ и ОГС достоверно отличия от группы контроля, в особенности отличают обе эти группы от группы здоровых лиц. В связи с этим, для выявления пациентов с мультипараметрический критерий позитивности, включающий 6 параметров:

суммарные уровни секреции -ИФН и ИЛ-2, количество позитивных реакций при проведении Т-клеточной пролиферации лимфоцитов и секреции цитокинов в ответ на стимуляцию антигенами HCV, а также количество позитивных реакций при определении специфических антител на спектр индивидуальных антигенов HCV (core HCV, NS3, NS4, NS5a, NS5b) в сыворотке крови методом ИФА. Результат рассматривали как положительный при наличии 4-х и более параметров из 6-ти предложенных, причем учитывались различные их сочетания (Таблица 2).

Параметры выявления пациентов с иммунологическими маркерами HCVинфекции (по результатам экспериментальных методов исследования сывороток крови больных ОГНЭ) Количество позитивных реакций при определении секреции -ИФН Количество позитивных реакций при определении секреции ИЛ-2 Количество позитивных реакций при проведении Т-клеточной Количество позитивных реакций при определении специфических антител на спектр индивидуальных антигенов HCV (core HCV, NS3, NS4, NS5a, NS5b) в сыворотке крови методом ИФА После введения мультипараметрического критерия, были проанализированы результаты экспериментального исследования сывороток крови 23 больных ОГНЭ. Различные сочетания 4-х параметров и более из 6-ти были выявлены у 43,5% обследованных больных ОГНЭ.

Таким образом, полученные результаты позволили на основании введения мультипараметрического критерия позитивности, включающего параметров, выявить у 43,5% больных ОГНЭ, обследованных в динамике (1 и – 6 месяцев от начала заболевания) иммунологические маркеры HCVинфекции.

1. Гепатит неуточненной этиологии составил 7,5% (n = 104) среди больных, поступивших в Инфекционную Клиническую больницу № 1 г.

Москвы с диагнозом вирусный гепатит в период с 2005 – 2006 гг.

неуточненной этиологии» после исключения аутоиммунной и алкогольной этиологии заболевания у 10% пациентов выявлена отсроченная сероконверсия по анти-HCV, у 3% больных - по анти-HAV IgM.

3. В структуре больных острым гепатитом, не выезжавших в эндемичные регионы в выявлен вирусный гепатит Е, в 4,8% случаев с использованием метода ИФА, в том числе в 2,4% случаев одновременно методами ИФА и ПЦР.

4. Не подтверждена этиологическая роль EBV, HHV-6, PV B-19 в структуре острых гепатитов неуточненной этиологии.

5. Отсутствие в 100% случаев ДНК NV-F в крови больных острым гепатитом неуточненной этиологии не позволяет рассматривать этот агент в качестве этиологического фактора острого гепатита среди больных, включенных в исследование.

6. У больных острым гепатитом неуточненной этиологии в 9% случаев методом ПЦР выявлена РНК HGV.

7. Не выявлено достоверных различий в клинико-биохимической картине острого гепатита неуточненной этиологии по сравнению с острыми гепатитами В и С.

8. Доля острой HCV-инфекции с атипичным иммунологическим профилем составляет 43,5% у больных острым гепатитом неуточненной этиологии при условии введения мультипараметрического критерия, включающего:

количество позитивных реакций при определении специфических антител на спектр индивидуальных антигенов HCV (core HCV, NS3, NS4, NS5a, NS5b) в сыворотке крови методом ИФА; суммарные уровни секреции -ИФН и ИЛ-2, количество позитивных реакций при проведении Т-клеточной пролиферации лимфоцитов и секреции цитокинов в ответ на стимуляцию антигенами HCV.

1. При верификации острого гепатита неуточненной этиологии необходимо учитывать возможность отсроченной сероконверсии и проводить повторные исследования на маркеры вирусных гепатитов методом ИФА дважды с интервалом в 10 дней.

2. Диагноз «острый гепатит неуточненной этиологии» следует устанавливать только при исключении HAV-, HBV-, HCV-, HEV-инфекции, алкогольной, аутоиммунной и лекарственной патологии. При этом при наличии легкой и средней степени тяжести течения дальнейший диагностический поиск, направленный на выявление генетических маркеров некоторых гепатотропных вирусов, а именно - HGV, TTV, B-19, EBV, HHV-1, 2, 6 и 8 типов, CMV и нового кандидата в гепатотропные вирусы - NV-f, нецелесообразен, поскольку, как правило, регистрируется благоприятный исход заболевания.

3. В связи с тем, что в 43,5% случаев у больных острым гепатитом неуточненной этиологии выявляются маркеры острой HCV-инфекции, рекомендуется динамическое наблюдение пациентов с острым гепатитом неуточненной этиологии в течение как минимум 6 месяцев.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Tsyganova E., Znoiko O., Petrakova N. et al. Immune imprints of hepatitis C identified in clinical cases of hepatitis of unknown origin./ 24th IUSTI-Europe Conference on sexually transmitted infections and HIV/AIDS, Milano. – 2008. P. 79P.41.

Исагулянц М. Г., Озерецковская Н. Н., Знойко О. О., Цыганова Е. В. Роль организма хозяина в спонтанном выздоровлении от вирусного гепатита C:

состояние организма на момент инфекции./ Вопpосы виpусологии. – 2008. – Т.

53. - № 2. – С. 4-9.

Цыганова Е.В., Знойко О.О. Диагностический поиск при гепатите неуточненной этиологии./ Хирург. – 2009. - № 1. С. 11-14.

Цыганова Е.В. Клинико-лабораторная картина острого гепатита неуточненной этиологии с учетом результатов иммунологических, молекулярно-биологических и вирусологических методов исследования./ XXXI итоговая конференция молодых ученых МГМСУ. Труды конференции. - 2009. С. 380-382.

Солонин С.А., Цыганова Е.В., Исаева О.В. и др. Выявление генотипа I вирусного гепатита Е на территории Российской Федерации./ Мир вирусных гепатитов, Тезисы (часть 2) VIII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». – 2009. - С. 38-39.

Исагулянц М.Г., Знойко О.О., Цыганова Е.В. и др. Иммунологические маркеры HCV-инфекции у больных острым гепатитом с неуточненной Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика»). – 2009. - № 4. - С. 21-22.

Ющук Н.Д., Цыганова Е.В., Знойко О.О. и др. Острый гепатит неуточненной этиологии: этиологическая структура и клинико-лабораторные особенности./ Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2009. № 8. С. 12-18.

Цыганова Е.В., Знойко О.О., Солонин С.А. и др. Описание клинического случая острого гепатита с ретроспективным обнаружением маркеров вирусов гепатитов Е и С./ Мир вирусных гепатитов. – 2010. - № 1. С. 29 – 36.