На правах рукописи

Бабин Юрий Юрьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА

ПТИЦ ПОДТИПОВ Н3, Н4, Н5 И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

03.02.02 «Вирусология»

Aвтореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир – 2012 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по НИР и развитию ФГБУ «ВНИИЗЖ» Дрыгин Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Цыбанов Содном Жамьянович доктор биологических наук, заведующий лабораторией ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии, г. Щелково Матвеева Ирина Николаевна

Ведущая организация – Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва.

Защита диссертации состоится «» февраля 2012 г. в «» часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «ВНИИЗЖ».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан «» декабря 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор биологических наук, профессор О.В. Прунтова

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грипп птиц – вирусное заболевание диких и домашних птиц, характеризующееся, в первую очередь, поражением органов дыхания и пищеварения. На основании антигенных различий поверхностных белков вирус гриппа типа А подразделяют на 16 подтипов по гемагглютинину (НА) и 9 подтипов по нейраминидазе. Особую опасность для птицеводства представляют высокопатогенные штаммы вируса гриппа птиц (ВГП) подтипов Н5 и Н7, способные вызывать высококонтагиозное заболевание со смертностью до 100%.

Вспышки заболевания, вызванного ВГП подтипа Н5, регистрировались повсеместно как среди диких, так и домашних птиц в течение последних 60 лет.

Так, ВГП подтипа Н5 был выявлен в 1959 и 1991 гг. в Англии, в 1961 и 2004 г. в Южной Африке, в 1983г. в Ирландии [Alexander D.J., 2008], в 1967г. в России [Сюрин В.Н., 1972].

Начиная с 1996г., широкое распространение получил ВГП подтипа Н генетической линии A/goose/Guangdong/1/96 и вспышки высокопатогенного гриппа птиц были зарегистрированы на территории стран Европы, Африки и Ближнего Востока [Lupiani B. and Reddy S.M., 2008]. За последние 7 лет ВГП подтипа H5N1, относящийся к генетическим кладам 2.2 и 2.3.2 вызвал многочисленные вспышки заболевания как среди диких, так и домашних птиц в различных странах Европы и Азии [Львов Д. К., 2008; Reid S.M., 2011].

Anseriformes Считается, что птицы отрядов (гусеобразные) и Charadriiformes (ржанкообразные), являющиеся естественным резервуаром ВГП в природе, способны переносить вирус на значительные расстояния во время сезонных миграций [Sharov K., 2009; Prosser J.D., 2011]. В результате мониторинговых исследований, проведенных на территории Европы в период с 1998 г. по 2006 г. [Munster J.V., 2007], было установлено, что наиболее распространенными подтипами ВГП в популяциях диких птиц, являются подтипы Н3 и Н4.

При инфицировании домашних птиц некоторые изоляты ВГП подтипов Н3 и Н4 способны вызывать заболеваемость до 50% и смертность до 5%. Кроме того, смертность может достигать более высоких значений при инфицировании молодняка или ассоциированном течении заболевания [Swayne E.D. and PantinJackwood M., 2008].

Через территорию РФ пролегают пять основных путей миграции птиц, перелетающих на значительные расстояния [Львов Д.К., 2004; Si Y., 2009], причем на территории европейской части РФ и Сибири расположены зоны гнездования не менее 16 видов птиц семейства Anseriformes [Gilbert M., 2008], являющихся естественными хозяевами ВГП. Большинство птиц, имеющих зоны гнездования на территории РФ, мигрируют на зимовку в Африку и ЮгоВосточную Азию [Lvov D.K., 2004], неблагополучные по высокопатогенному гриппу птиц.

Учитывая широкую распространенность ВГП подтипов Н3 и Н4, а также возможность заноса дикими мигрирующими птицами вируса подтипа Н5, особую значимость приобретают мониторинговые мероприятия и изучение биологических свойств изолятов вируса.

Степень разработанности проблемы. Предложены системы ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления ВГП подтипа Н5 евразийской [Monne et al., 2008] и американской [Spackman et al., 2007] генетических линий, системы мультиплекс-ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипа H5N [Payungporn et al., 2006; Wu et al., 2008]. Разработаны системы мультиплекс ПЦР для выявления ВГП подтипов Н5, Н7 и Н9 [Chaharaein et al., 2007], H5 и H9 [Saberfar et al., 2007]. Отечественными исследователями разработан методы ОТ-ПЦР для выявления ВГП типа А и подтипов ВГП Н5 и Н7 [Киреев и др., 2007].

Применение метода дуплекс ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления ВГП типа А и подтипа Н5, а также методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов Н3 и Н4 позволяет сократить затраты времени, труда и реактивов, необходимых для определения подтипа вируса и оценки его вирулентности.

Цель и задачи исследования. Основная цель данных исследований заключалась в разработке методов выявления ВГП/A подтипов Н3, Н4 и Н5 с помощью метода ПЦР, изучении биологических свойств и филогенетической взаимосвязи изолятов ВГП подтипов Н3 и Н4, выявленных на территории РФ в период 2008-2010 гг.

следующие задачи:

1. Разработать метод обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в формате дуплекс в режиме реального времени (ОТ-дПЦР-РВ) для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.

2. Разработать методы выявления ВГП подтипов Н3 и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Изучить биологические свойства изолятов ВГП подтипов Н3 и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.

4. Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов гена НА изолятов ВГП подтипов Н3 и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.

Научная новизна исследований.

1. Разработан метод ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.

2. Разработаны методы выявления ВГП подтипов Н3 и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Изучены биологические свойства изолятов ВГП подтипов Н3 и Н4, выделенных в 2008-2010 гг., при их культивировании в куриных эмбрионах и монослое культуры клеток MDCK.

4. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена НА изолятов ВГП подтипа Н3 и 7 изолятов ВГП подтипа Н4, выявленных на территории РФ в течение 2008-2010 гг.

Практическая значимость исследования. Разработаны, одобрены Ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические рекомендации:

«Методические рекомендации по выявлению вируса гриппа А птиц и идентификации подтипа вируса гриппа птиц Н5 с помощью ОТ-дПЦР-РВ».

«Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц».

«Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации».

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2008гг., опубликованы на Международной научно-практической конференции молодых ученых (Россия, 2010 г.) и международной конференции «Грипп птиц и здоровье человека» (Великобритания, 2009 г.).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования – генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку методов диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВГП, а также исследования биологических и филогенетических свойств изолятов ВГП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 4, 6, 8, 10.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы - в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 258 источников. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 21 таблицей. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Метод выявления ВГП типа А и подтипа ВГП Н5 на основе ОТ-дПЦР-РВ.

2. Методы выявления ВГП/А подтипов Н3 и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Результаты изучения биологических свойств ВГП подтипов Н3 и Н4.

4. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена НА изолятов ВГП подтипов Н3 и Н4, выявленных в РФ в 2008-2010 гг.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.в.н. Чвала И.А., к.б.н.

Андриясову А.В., к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., биологу Елаткину Н.П. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. В работе использовали изоляты ВГП, выделенные от различных видов птиц на территории Российской Федерации в 2005-2010 гг., а также штаммы ВГП, полученные из NVSL (Ames, США). Также, в работе использовали штаммы вирусов инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и метапневмовируса птиц.

Куриные эмбрионы. Использовали 9-11-суточные эмбрионы СПФ-кур фирмы Lohman Tierzucht (Германия).

Лабораторные животные. В экспериментах использовали клинически здоровых 6-недельных цыплят, не имеющих антител к ВГП.

Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были синтезированы НПО «Синтол» (Россия).

Реактивы. В работе были использованы реактивы фирм «Promega», (США), «Fermentas» (Литва), «Invitrogen» (США), «Вектор» (Россия), «Applied Роспотребнадзора (Россия).

Выделение РНК. Вирусную РНК выделяли из образцов биологического материала с помощью набора «Рибо-Сорб» (ЦНИИЭМ, Россия), согласно инструкции изготовителя.

Обратная транскрипция.

реакционную смесь инкубировали в амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler («BioRad», США) при 42С в течении 45 мин.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler («BioRad», США). Реакционную смесь прогревали при 95С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при температурном режиме:

денатурация при 95С в течение 30 сек, отжиг праймеров при 57С в течение сек, элонгация при 72С в течение 1 мин.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Реакцию проводили в амплификаторе Rotor-Gene 6000 («Corbett Life Science», Австралия). Реакционную смесь прогревали при 95С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при температурном режиме: денатурация при 95С в течение 15 сек., отжиг праймеров при 55С в течение 30 сек., элонгация при 72С в течение 30 сек.

Получение плазмид, несущих последовательности генов М1 и НА.

Для клонирования генов М1 и НА использовали плазмидные вектора pGEMTEasy («Promega», США) и pTKP7,5 (НПО «Вектор», Россия).

фрагментов кДНК.

фрагментов кДНК ВГП осуществляли с помощью набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США), согласно инструкции производителя.

последовательности фрагментов гена НА. В работе были использованы последовательности гена НА штаммов ВГП из международной базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Для выравнивания последовательностей и построения дендрограмм использовали программы BioEdit 7.0 и MEGA 3.1., соответственно.

Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в куриных эмбрионах. Из образцов биологического материала готовили 10%-ную суспензию на стерильном ФБР, и центрифугировали в течение 15 мин. при 1000g. Затем добавляли антибиотики, инкубировали при температуре 20С в течение 60 мин и использовали для инокуляции эмбрионов СПФ-кур.

Инокулированные эмбрионы инкубировали при температуре 37С в течение 120ч. Выявление и идентификацию вируса проводили в РТГА.

Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в культуре клеток MDCK. В пробы биологического материала добавляли антибиотики и центрифугирования надосадочную жидкость отбирали и использовали для заражения монослоя клеток. Состояние монослоя контролировали под инвертированным микроскопом («Nicon», Япония). При появлении ЦПД культуральную жидкость исследовали в РГА, РТГА и ПЦР.

Определение титра инфекционной активности вируса гриппа птиц. В качестве тест-объектов для определения инфекционной активности вируссодержащего биоматериала использовали 11-суточные КЭ и монослой культуры клеток MDCK. Титр вируса в исходном материале определяли по методу Кербера и выражали в единицах lg ЭИД50/см3 или ЦПД50/см3.

Определение индекса патогенности вируса гриппа. Проводили путем внутривенного заражения 6-недельных цыплят в соответствии с методическими рекомендациями МЭБ (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, OIE, 2009).

Статистическая обработка результатов. Данные обрабатывались с использованием пакета прикладным программ StatSoft, версия 6.0.

2.3.1. Разработка ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5. Для создания тест-системы ОТ-дПЦР-РВ были выбраны праймеры на гены матриксного белка (М) и НА подтипа Н5, при одновременном использовании которых не наблюдается их взаимного ингибирования. Схемы расположения праймеров представлены на рис. 1.

Рис.1. Схема расположения праймеров для амплификации фрагмента гена Примечание: нумерация показана по последовательности генов М и НА изолята A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1). Для продукта амплификации указана длина. Буквами f и r обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно.

Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ. При тестировании десятикратных разведений аллантоисной жидкости, содержащей изоляты ВГП подтипов Н1-Н15, были определены минимальные титры вируса, выявляемые с использованием разработанного метода. Пределом чувствительности реакции считали инфекционный титр вируса в наивысшем разведении, имевшем положительный результат в ОТ-дПЦР-РВ (табл. 1).

Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ составила 1,1-3,1 lg ЭИД50/см3 для системы на ген М. Полученные данные указывают на возможность применения метода для выявления изолятов ВГП типа А, принадлежащих к различным подтипам. Для системы праймеров и зонда на ген НА подтипа Н5 чувствительность составила 3,0-3,4 lg ЭИД50/см3.

Оценка эффективности амплификации фрагментов генов M и НА в ОТ-дПЦР-РВ.

протестированы десятикратные разведения плазмид, несущих вставки генов НА эффективности амплификации представлены на рис.2 и 3. Для выявления ингибирования систем праймеров и зондов были протестированы разведения смеси плазмид, несущих вставки генов НА и М, и разведения плазмид в отдельности. Тестирование каждого разведения осуществлялось в трех повторностях. Была получена линейная регрессия зависимости числа циклов ПЦР от разведений. Подставляя коэффициенты наклона в формулу расчета амплификации (Е).

log10 разведения Рис.2. Линейность результатов при тестировании 10-кратных разведений Примечание: На графике 1 показаны результаты полученные при амплификации только участка вставки гена М, на графике 2 – результаты, полученные при одновременной амплификации участков вставок генов М и НА.

Рис.3. Линейность результатов при тестировании 10-кратных разведений Примечание: На графике 1 показаны результаты полученные при амплификации только участка вставки гена НА, на графике 2 – результаты, полученные при одновременной амплификации участков вставок генов М и НА.

эффективности реакции. Для системы на ген М эффективность амплификации снизилась с 95% до 90%, для системы на ген НА наблюдали меньшее снижение эффективности – с 93% до 92%.

разработанного метода ОТ-дПЦР-РВ были протестированы изоляты ГП, инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и метапневмовируса птиц. При тестировании данных вирусов, а также изолятов ВГП, неспецифических результатов получено не было.

Выявление ВГП/A подтипа Н5 в образцах биоматериала, отобранных от экспериментально зараженных птиц. Были протестированы клоакальные и ротоглоточные смывы, отобранные от птиц, экспериментально зараженных изолятом ВГП A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1. Десять цыплят 6-недельного возраста были заражены интраназально в дозе 6,0 lg ЭИД50/см3. Пробы отбирали ежесуточно и исследовали в ОТ-дПЦР-РВ, а также с помощью метода вирусовыделения в культуре клеток MDCK.

При исследовании 24 клоакальных смывов вирус был выявлен в пробах с помощью ОТ-дПЦР-РВ по гену М и в 17 пробах по гену НА. При исследовании ротоглоточных смывов было получено 23 положительных результата по обеим системам праймеров ОТ-дПЦР-РВ (табл. 2 и 3).

Результаты исследования клоакальных смывов, отобранных от цыплят, зараженных изолятом A/chicken/Primorsky/85/08 H5N Примечание: 1 - в числителе количество положительных результатов исследования, в знаменателе общее количество исследованных проб;

При исследовании клоакальных и ротоглоточных смывов с помощью метода вирусовыделения вирус был выделен из 19 и 20 проб, соответственно.

Результаты исследования ротоглоточных смывов, отобранных от цыплят зараженных изолятом A/chicken/Primorsky/85/08 H5N Примечание: 1 - в числителе количество положительных результатов исследования, в знаменателе общее количество исследованных проб;

Тестирование образцов биоматериала от различных видов диких птиц. С помощью разработанного метода ОТ-дПЦР-РВ в 2010г. было исследовано 124 пробы биологического материала от различных видов диких птиц, Вирус гриппа типа А был выявлен в 13 пробах, ВГП подтипа Н5 был выявлен в 3 пробах. Положительные результаты ОТ-дПЦР-РВ подтверждены с помощью метода вирусовыделения в СПФ-эмбрионах кур.

2.3.2. Изучение изолятов вируса гриппа птиц подтипов Н3 и Н Выделение вируса гриппа птиц подтипов Н3 и Н4. С помощью метода вирусовыделения в КЭ в течение 2008-2010 гг. из проб биологического материала, отобранных от диких птиц, было выделено 16 изолятов ВГП, относящихся к подтипам Н3 и Н4 (табл. 4).

Результаты выявления вируса гриппа птиц в 2008-2010 гг.

Гусеобразные (Anseriformes) (Passeriformes) От представителей отряда Anseriformes выделяли вирусы, принадлежащие к подтипам Н3 и Н4. От птиц отряда Passeriformes (воробьинообразные) в г. были выделены вирусы, относящиеся к подтипу Н4. По нашим данным, случаев выделения ВГП подтипа А/H4N6 от грачей и воробьев ранее не было описано.

Изучение биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц подтипов Н3 и Н4 при их культивировании в КЭ и монослое культуры клеток MDCK. С использованием 9-11 суточных КЭ и монослоя культуры клеток MDCK были определены инфекционные титры изолятов ВГП/А подтипов Н3 и Н4. При культивировании вирусов в КЭ значения инфекционных титров составили 6,2-8,1 lg ЭИД50/см3 для изолятов подтипа Н и 6,6-7,9 lg ЭИД50/см3 для изолятов подтипа Н4 (табл. 6).

Титр вирусов при их культивировании в монослое клеток MDCK не превышал значения 4,9 lg ЦПД50/см3 для изолятов подтипа Н3 и 5,0 lg ЦПД50/см3 для изолятов, относящихся к подтипу Н4. При этом титр ГА при культивировании вирусов подтипов Н3 и Н4 в монослое клеток MDCK не превышал значения 1:64. Максимальное накопление гемагглютинина в культуральной жидкости наблюдали через 4-5 сут после заражения монослоя клеток. Первые признаки ЦПД вируса в культуре клеток MDCK наблюдали через 3 сут после заражения монослоя.

Определение индексов патогенности изолятов ВГП подтипа H4N6.

Индексы патогенности были определены для изолятов, выделенных от грача и воробья: в каждом из экспериментов после инфицирования цыплят наблюдали слабо выраженные признаки заболевания. Инкубационный период болезни длился не менее 4 сут. Определенные индексы патогенности изолятов A/rook/Rostov/30/08 H4N6 и A/sparrow/Rostov/33/08 H4N6 имели значения 0, и 0,22, соответственно, что характеризует данные вирусы как низковирулентные.

2.3.3. Разработка методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов Н и Н4. В результате анализа нуклеотидных последовательностей вирусов ГП подтипов Н3 и Н4 из банка данных (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/ соответствующих подтипов (рис. 4).

Рис.4. Схема расположения праймеров для амплификации фрагмента гена Примечание: нумерация показана по последовательности гена НА изолятов AB A/duck/Ukraine/1/1963 (H3N8) (а) и GU052381 A/duck/Czechoslovakia/1956 (H4N6) (б) для систем праймеров, амплифицирующих фрагмент гена НА подтипов Н3 и Н4, соответственно.

Для продуктов амплификации указана длина. Буквами f и r обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно.

Аналитическая чувствительность методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов Н3 и Н4. Определение аналитической чувствительности разработанных методов ОТ-ПЦР проводили с использованием десятикратных разведений вируссодержащей аллантоисной жидкости изолятов ВГП подтипов Н3 (A/teal/Krasnoyarsk/1581/08 (H3N6), A/teal/Krasnoyarsk/501/10 (H3N8), A/mallard /Krasnoyarsk/453/10 (H3N8)) и Н4 (A/shoveller/Krasnoyarsk/1586/ (H4N6), A/mallard/Vladimir/446/09 (H4N2), A/pintail/Krasnoyarsk/508/ (H4N6)). Аналитическая чувствительность предложенных методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов Н3 и Н4 находилась на уровне 3,4-3,9 lg ЭИД50/см3.

Специфичность методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов Н3 и Н4. Для оценки специфичности разработанных методов ОТ-ПЦР были протестированы изоляты ГП, относящиеся к подтипам Н1-Н15 и, кроме того, штаммы других вирусов: инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и метапневмовируса птиц. При тестировании данных вирусов, а также изолятов ВГП, неспецифических результатов получено не было.

Выявление ВГП/A подтипа Н3 и Н4 в образцах биоматериала, отобранных у экспериментально зараженных птиц Были протестированы клоакальные и ротоглоточные смывы, отобранные от птиц, экспериментально сформировали 2 группы цыплят и провели заражение: 1) 10 птиц интраназально заразили в дозе 6,0 lg ЭИД50/см3 A/teal/Krasnoiarsk/515/10 (H3N8); 2) 10 птиц интраназально заразили в дозе 6,0 lg ЭИД50/см3 A/rook/Rostov/33/08 (H4N6). В качестве контроля содержали еще 5 цыплят. Пробы отбирали ежесуточно и исследовали в ОТ-дПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и с помощью метода вирусовыделения в культуре клеток MDCK.

При исследовании ротоглоточных смывов от цыплят, зараженных изолятом подтипа H3N8, положительный результат был получен для 4 проб в ОТ-дПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и вирусовыделении (табл. 5). Вирус в смывах выявляли на 3 и 4 сут после заражения с использованием всех использованных методов.

Результаты исследования ротоглоточных и клоакальных смывов, отобранных от цыплят, зараженных вирусом гриппа Примечание:

- в числителе количество положительных результатов исследования, в знаменателе общее количество исследованных проб;

При исследовании клоакальных смывов положительный результат был получен для 6 проб в ОТ-дПЦР-РВ, 4 проб – в ОТ-ПЦР и 5 проб в вирусовыделении. При этом вирус выявляли с 3 по 6 сут в ОТ-дПЦР-РВ, на 3 и 4 сут в ОТ-ПЦР, и на 3,4 и 6 сут с помощью метода вирусовыделения (табл. 5).

При исследовании ротоглоточных смывов от цыплят, зараженных изолятом подтипа H4N6, вирус выявляли со 2 по 5 сут в ОТ-дПЦР-РВ и ОТПЦР. С помощью метода выделения, вирус выявляли на 3 и 4 сут, при этом положительный результат был получен для 8 проб в методах ПЦР и для 6 в вирусовыделении. При исследовании клоакальных смывов вирус выявляли со по 4 сут с использованием всех методов, при этом положительный результат был получен для 8 проб в ОТ-дПЦР-РВ и 7 проб в ОТ-ПЦР и вирусовыделении (табл. 6).

Результаты исследования ротоглоточных и клоакальных смывов, отобранных от цыплят, зараженных вирусом гриппа Примечание: 1 - в числителе количество положительных результатов исследования, в знаменателе общее количество исследованных проб;

2.3.4. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов Анализ вариабельности последовательности гена НА вируса гриппа птиц подтипа Н3. На основе участка последовательности гена НА ВГП подтипа Н3 была построена дендрограмма (рис. 5), включающая вирусы, выделенные на территории РФ в период с 2008 по 2010 гг.

Вирусы A/teal/Krasnoiarsk 1581/08(H3N6), A/mallard/Krasnoiarsk /453/10(H3N8), A/teal/Krasnoiarsk/461/10(H3N8), A/teal/Krasnoiarsk/ /10(H3N8), A/teal/Krasnoiarsk/515/10(H3N8) и A/greyduck/Krasnoiarsk /528/10(H3N8) вошли в группу изолятов, выделенных на территории ЮгоВосточной и Средней Азии. В группу вирусов, выделенных на территории Европы и Африки, вошел изолят A/teal/Krasnoiarsk/501/10 (H3N8).

Вирусы, отнесенные к азиатской группе, имели максимальную степень гомологии (97-99%) по изучаемому фрагменту гена с изолятами, выделенными ранее на территории Сибири и Монголии. Изолят A/teal/Krasnoiarsk/501/ A/commonteal/Sweden/1/2003(H3N3) и А/mallard/Switzerland /WV4060167/ (H3N5).

Рис.5. Филогенетическое положение изолятов ВГП подтипа Н3 по Вирусы подтипа Н3, выделенные от птиц, имели консервативную аминокислотную последовательность сайта расщепления НА: PEKQTRGLF, характерную для низковирулентных изолятов.

Анализ вариабельности последовательности гена НА вируса гриппа птиц подтипа Н4. На основе участка последовательности гена НА ВГП подтипа Н4 была построена дендрограмма (рис. 6), включающая вирусы, выделенные на территории РФ в период с 2008 по 2010 гг.

Изоляты A/teal/Krasnoiarsk/506/10(H4N6), A/pintail/Krasnoiarsk /508/ (H4N6), A/mallard/ Krasnoiarsk/517/10(H4N6), A/w_duck/Vladimir/534/10 (H4N6) выделенных на территории Азии. Изоляты A/rook/Rostov/30/08 (H4N6) и A/mallard/Vladimir/446/09 (H4N2) вошли в группу вирусов, выделенных на территории Европы и Африки.

Рис.6. Филогенетическое положение изолятов подтипа Н4 по фрагменту Изоляты ВГП А/Н4, вошедшие в азиатскую группу, имели 97% сходства наибольший процент сходства (97%) наблюдали с вирусами, выделенными на A/mallard/Vladimir/446/09 (H4N2) имел наибольший процент сходства (97%) с A/mallard/Netherlands/7/2007 (H4N2).

В таблице 9 представлена аминокислотная последовательность сайта расщепления НА изолятов ВГП подтипа Н4, выделенных в период 2008- гг.

Структура сайта расщепления НА изолятов ВГП подтипа Н A/shoveller/Krasnoiarsk/1586/08 (H4N6) KESRGLF Примечание: жирным шрифтом выделена аминокислота-маркер принадлежности к группе.

Большинство известных сайтов изолятов ВГП A/H4 имеют вид KAXRGLF, где X – одна из аминокислот: Т-для изолятов из Северной Америки, P - для вирусов, выявляемых в Сибири, и S - для вирусов, циркулирующих на территории Евразии. Аминокислотная последовательность сайта расщепления вирусов подтипа Н4, выделенных в период 2008-2010 гг. представлена в табл. 7.

1. Разработан метод ОТ-дПЦР-РВ, позволяющий одновременно выявлять вирус гриппа птиц типа А и подтипа Н5. Аналитическая чувствительность разработанного метода составила 1,1-3,1 lg ЭИД50/см3 для системы праймеров на ген М и 3,0-3,4 lg ЭИД50/см3 для системы праймеров на ген НА.

2. В течение 2008-2010 гг. из образцов биологического материала с помощью метода вирусовыделения в куриных эмбрионах получено 7 изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н3 и 9 изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4.

3. Изучены биологические свойства изолятов вируса гриппа птиц подтипов Н и Н4 при их культивировании в куриных эмбрионах и монослое культуры клеток MDCK. Полученные значения инфекционных титров вирусов подтипа Н3 составили 6,2-8,2 lg ЭИД50/см3, изолятов подтипа Н4 - 6,7-7,9 lg ЭИД50/см3.

Титр вирусов при их культивировании в монослое клеток MDCK не превышал значения 4,6 lg ЦПД50/см3 для изолятов подтипа Н3 и 5,0 lg ЦПД50/см3 для изолятов, относящихся к подтипу Н4.

4. Разработаны методы ОТ-ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов Н3 и Н4. Аналитическая чувствительность методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов Н3 и Н4 составила 3,4-3,9 lg ЭИД50/см3.

5. Определена первичная нуклеотидная последовательность фрагмента гена НА 7 изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н3 и 7 изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4. В результате проведенного молекулярно-генетического анализа показано, что данные изоляты входят в группы европейских и азиатских вирусов. Анализ аминокислотной последовательности сайта расщепления гена НА изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4 выявил наличие аминокислоты Ser в позиции 342 белка НА1, являющейся маркером вирусов евразийской генетической линии.

6. Изученные изоляты ВГП подтипа Н4 имели аминокислотную структуру сайта расщепления НА: RASRGLF, KESRGLF и KASRGLF, изоляты подтипа Н3 – KQTRGLF. Данная структура сайта расщепления изолятов ВГП характерна для низковирулентных вирусов. Значения индексов патогенности изолятов ВГП подтипа H4N6, выделенных в 2008г. от синантропных птиц, составили 0,19 и 0,22, что также подтверждает низкую вирулентность данных вирусов.

Для практического использования предлагаются одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:

1. Методические рекомендации по выявлению вируса гриппа А птиц и идентификации подтипа вируса гриппа птиц Н5 с помощью ОТ-дПЦР-РВ.

2. Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц.

3. Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации.

1. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции / Д.Е. Киреев, Д.С. Аканина, Т.В.

Гребенникова [и др.] // Вопросы вирусологии. – 2007. - Т.52, №4. – С. 17-22.

2. Об эпизоотологическом потенциале вируса гриппа птиц / В.Н. Сюрин, Н.Г. Осидзе, З.Я. Чистова, Ю.В. Родин // Ветеринария. – 1972. – № 8. – С. 41-43.

3. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке / Д.К. Львов, М.Ю. Щелканов, Н.А.

Власов [и др.] // Вопросы вирусологии. – 2008. – Т.53, № 5.– С. 4-9.

4. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002гг.) / Д.К.

Львов, С.С. Ямникова, И.Т. Федякина [и др.] // Вопросы вирусологии. – 2004. – Т. 49, №3. – С. 17-24.

5. Alexander D.J. An overview of the epidemiology of avian influenza // Vaccine. – 2008. – Vol. 25, N 30. – P.5637-5644.

6. A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1 / C. Wu, X. Cheng, J. He [et al] // J.

Virol. Methods. – 2008. – Vol. 148, № 1-2. – Р.81-88.

7. Analytical validation of a real-time reverse transcription polymerase chain reaction test for Pan-American lineage H7 subtype Avian influenza viruses E.

Spackman, H.S. Ip, D.L. Suarez [et al] // J. Vet. Diagn. Invest. – 2008. – Vol. 20, № 5. – P. 612-616.

8. Avian influenza in Hong Kong 1997-2002 / L.D. Sims, T.M. Ellis, K.K. Liu [et al] // Avian Diseases. – 2003. – Vol. 47. – P. 832-838.

9. Avian influenza (H5N1) outbreak among wild birds, Russia, 2009 / K.

Sharov, N. Silko, I. Sousloparov [et al] // Emerg Infect. Dis. – 2010. – Vol. 16. – P.

349-51.

10. Detection of H5, H7 and H9 subtypes of avian influenza viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction / B. Chaharaein, A.R.

Omar, I. Aini [et al] // Microbiol Res. – 2007. Vol. 164. – P. 174-179.

11. Development of a realtime reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 haemagglutinin subtypes / E. Spackman, D.A. Senne, T.J. Myers [et al] // J. Clin. Microbiol. – 2002. – Vol. 40. – P. 3256– 3260.

12. Evolution of H4, H5 influenza A viruses in natural ecosystems in Northern Eurasia (2000-2002) / D.K. Lvov, S.Y. Yamnikova, I.T. Fedyakina [et al.] // International Congress Series. – 2004. – Vol. 1263. – P. 169-173.

13. First reported incursion of highly pathogenic notifiable avian influenza A H5N1 viruses from clade 2.3.2 into European poultry / S.M. Reid, W.M. Shell, G. [et al] // Transbound Emerg Dis. – 2011. – Vol. 58, N 1. – P. 76-78.

14. Gilbert M., Slingenbergh J., Xiao X. Climate change and avian influenza // Rev. Sci Tech. - 2008. - Vol. 27, N 2. - P. 459-466.

15. Lupiani B., Reddy S. M. The history of avian influenza // Comp. Immunol.

Microbiol // Infect. Dis. – 2008. – Vol. 32. – P. 311-323.

16. Saberfar E., Forghani-Fard M.M., Mosavi M. Multiplex reverse transcriptase-PCR assay for typing and subtyping of influenza A (H5 & H9) virus in Iran // Iran Biomed. J. – 2007. – Vol. 11, № 2. – P. 69-74.

17. Single step multiplex real-time RT-PCR for H5N1 influenza A virus detection / S. Payungporn, S. Chutinimitkul, A. Chaisingh [et al] // J. Virol. Methods.

– 2006. – Vol. 131, N 2. – P. 143-147.

18. Spatial, temporal, and species variation in prevalence of influenza A viruses in wild migratory birds / V.J. Munster, C. Baas, P. Lexmond [et al] // PLoS Pathog. – 2007. – Vol.3, № 5. – P. 630-638.

19. Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns / Y. Si, A. K. Skidmore, T. Wang [et al] // Geospatial Health. – 2009. – Vol.

4, N 1. - P. 65-78.

20. Swayne D.E., Pantin-Jackwood M. Pathobiology of avian influenza virus infections in birds and mammals // Avian Influenza / ed. D.E. Swayne. – Ames, Iowa, USA etc., 2008. – Chap. 5. - P. 87-122.

21. Wild Bird Migration across the Qinghai-Tibetan Plateau: A Transmission Route for Highly Pathogenic H5N1 / D.J. Prosser, P. Cui, J.Y. Takekawa [et al] // PLoS ONE. – 2011. – Vol. 6, N 3.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Биологические свойства вируса гриппа А/H4N6, выделенного от синантропных птиц в Ростовской области / Л.Ю. Абрамова, И.А. Чвала, А.В.

Андриясов, И.П. Пчёлкина, С.Н. Колосов, Ю.Ю. Бабин // Ветеринария и кормление. - 2010. - № 6. - С. 6-7.

2. ОТ-дуплекс-ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса гриппа птиц типа А и идентификации подтипа А/Н5 / Ю.Ю. Бабин, И.А. Чвала, А.В. Андриясов // Труды федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, - 2011. - Т. 9. - С. 55-62.

3. Инфекция гриппа птиц, вызванная вирусом подтипа H7N1 / Л.Ю.

Абрамова, И.А. Чвала, Ю.Ю. Бабин, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Н.А. Власов // Ветеринария. - 2010. - № 10. - С. 26-30.

A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 / И.А. Чвала, Л.О. Щербакова, М.И. Шульпин, Ю.Ю. Бабин, А.В. Варкентин, М.Ю. Щелканов, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Л.Ю. Абрамова, Н.А. Власов // Ветеринария. - 2009. - № 10. - С.

25-26.

A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 virus in mallards / I.A. Chvala, L.O. Scherbakova, L.Y. Abramova, M.I. Shulpin, A.V. Varkentin, Y.Y. Babin, N.S. Mudrak, V.V.

Drygin // BirdFlu 2009: Avian Influenza and Human Health. Oxford, UK. - 2009. - P.

23-25.