На правах рукописи

ПИСКУНОВ Антон Валерьевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И

ИДЕНТИФИКАЦИИ LISTERIA MONOCYTOGENES

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология»

Aвтореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир – 2013 2

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Прунтова Ольга Владиславовна

Официальные оппоненты: Пирожков Михаил Константинович – доктор ветеринарных наук, ФГБУ «ВГНКИ», ведущий научный сотрудник лаборатории качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств для ветеринарного применения.

Потехин Андрей Владимирович – кандидат ветеринарных наук, ФГБУ «ВНИИЗЖ», ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота.

Ведущая организация – Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г.

Покров).

Защита состоится 17 декабря 2013 г. в 1000 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Автореферат разослан 15 ноября 2013г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», кандидат биологических наук Жбанова Татьяна Валентиновна 1

Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы Listeria monocytogenes является причиной возникновения листериоза у животных и человека. В настоящее время данное заболевание все чаще регистрируется в виде пищевой токсикоинфекции. Это обусловлено повсеместным распространением листерий в природе, полиморфизмом клинических признаков болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, возрастающими объемами оборота кормов и пищевых продуктов (в частности продуктов быстрого питания). Учитывая способность листерий размножаться в готовых к употреблению пищевых продуктах, хранящихся в холодильниках при низких температурах (при +4С), перерабатывающая и пищевая промышленность вынуждена расходовать огромные средства для предотвращения выпуска контаминированной продукции [5, 7].

Работы по изучению биологических свойств листерий показывают, что L.

monocytogenes адаптируется к условиям окружающей среды, особенно под воздействием антропогенных факторов (применение антибиотиков в медицине и пищевой промышленности, консервантов, дезинфицирующих средств и т.п.).

Адаптация листерий выражается в изменении биологических свойств. В основном эти изменения проявляются невосприимчивостью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью образовывать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных форм бактерий [4, 11, 12, 13].

В РФ испытания пищевого сырья и пищевых продуктов на контаминацию L.

проводят в соответствии с ГОСТ Р бактериологическими методами, которые включают в себя выделение, идентификацию чистой культуры и постановку биопробы [3]. За рубежом для идентификации бактерий вида L. monocytogenes, помимо классических методов, спектрометрия).

Учитывая вышеизложенное, усовершенствование методов выделения и идентификации изолятов и штаммов L. monocytogenes, выделенных на территории РФ и за рубежом, имеет научное и практическое значение. Наша работа позволит дать в будущем качественную оценку циркуляции возбудителя пищевого листериоза, а усовершенствование методов выделения и идентификации листерий даст возможность выявлять возбудителя в пищевых продуктах и продуктах животного происхождения в кратчайшие сроки.

1.2. Степень разработанности проблемы Отечественными и зарубежными учеными опубликовано значительное число работ по изучению биологических свойств изолятов L. monocytogenes классическими методами (выделение чистой культуры и идентификация). В то же время за рубежом происходит совершенствование методов идентификации листерий в пищевых продуктах и в объектах окружающей среды, в частности с использованием ПЦР-РВ и масс-спектрометрического метода.

1.3. Цель и задачи исследований Основной целью данной работы являлось усовершенствование методов выделения и идентификации бактерий рода Listeria, в частности вида L.

monocytogenes, полученных из различных пищевых продуктов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства референтных штаммов и изолятов L. monocytogenes и L. innocua при помощи традиционных бактериологических методов.

2. Охарактеризовать штаммы и изоляты по патогенности и вирулентности на белых мышах.

3. Усовершенствовать схему выделения и идентификации L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.

4. Оптимизировать метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.

5. Создать базу данных для идентификации бактерий рода Listeria методом MALDI-TOF.

1.4. Научная новизна работы monocytogenes и 5 изолятов L. innocua.

Изучены биологические свойства 14 референтных штаммов и 27 штаммов и изолятов L. monocytogenes.

Усовершенствована схема выделения L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.

Оптимизирована полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.

спектрометрическим методом (MALDI Autoflex).

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы В результате проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома L. monocytogenes в пищевых продуктах методом ПЦР-РВ», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13), и «Методические рекомендации по идентификации L. monocytogenes с применением масс-спектрометра Autoflex MALDI biotyper», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13).

В коллекцию бактериальных культур ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», референтной лаборатории болезней КРС, после изучения биологических свойств заложены следующие изоляты: L. monocytogenes «L-1», «Lи L. innocua «I-1», «1228 (P)» «1229 (F)», «1231 (M)», «1232».

1.6. Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения биологических свойств 27 штаммов и изолятов L.

monocytogenes, 14 референтных штаммов L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua;

- определение патогенности и вирулентности изолятов и референтных штаммов L. monocytogenes на белых мышах;

- оптимизация ПЦР-РВ для идентификации бактерий рода Listeria;

спектрометрическим методом.

1.7. Соответствие диссертации паспорту научной специальности В диссертационной работе приведены результаты исследований по исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 06.02.02 – 1, 4, 5, 6, 1.8. Степень достоверности и апробация результатов исследования большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, а их достоверность подтверждена комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 28.06.13. Основные материалы доложены и опубликованы в «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2010 г.), «Трансмиссивные заболевания животных:

актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (г. Алушта, Украина, 2012 г.), «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2009-2012 гг.

1.9. Публикации результатов научных исследований По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.10. Структура и объем работы Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практические предложения. Список литературы включает 226 источников, в том числе 86 отечественных и 140 зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 20 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

1.11. Место выполнения работы Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2013 гг. в референтной лаборатории болезней КРС ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

1.12. Личный вклад соискателя Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с Шадровой Н.Б., Спрыгиным А.В., Третьяковым А.В., Егоровой И.Ю., за что автор выражает им сердечную благодарность.

В работе использовали:

- референтные штаммы: E. coli штамм №338, Bacillus subtilis штамм №6633, Staphylococcus aureus штамм №6538 (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), Salmonella dublin штамм №373 (ФГБУ «ВГНКИ»);

- 24 штамма L. monocytogenes: «СЭС-33», «рыба №6», «К-4», «1кр11», «1кр23», «1кр12», «1кр22», «1кр24», «1кр14», «СЭС-36», «СЭС-37», «1кр6», «1кр9», «1кр10», «СЭС-30», «243-09», «191», «1кр1», «1кр2», «1кр3», «1кр4», «1кр5», «1кр7», «634»; 14 референтных штаммов L. monocytogenes: №15, №17, №5348, №57, №5214, №10528, №66, №10527, № 71, №10888, №74, №19118, №4883, №82 (ГНУ «ВНИИВиМ»); 3 изолята L. monocytogenes: «L-1», «L-2», «№608»; 5 изолятов L. innocua: «I-1», «1228 (P)», «1229 (F)», «1231 (M)», «1232»;

- для культивирования и изучения биологических свойств листерий использовали следующие ростовые среды: МПБ, МПБ с добавлением 1% раствора глюкозы, МПА, ХА, ХБ, кровяной агар, PPLO-агар, Колумбийский агар, среду Эндо, оксфордский агар, ПЖА, PALCAM-агар, PALCAM-агар с добавлением крови, лецитин-агар, бульон Фрайзера, агар Агости-Оттавиани;

- набор реагентов «РИБО-сорб» для выделения ДНК листерий в реакции ПЦР (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва);

- в экспериментальной работе использовали следующие виды животных:

- белые мыши массой 15-20 г. (для постановки биопробы);

- бараны 2-летнего возраста (для взятия крови).

Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

Биомассу листерий получали в результате культивирования на МПА, Колумбийском агаре и агаре Хоттингера при температуре 37C в течение 24 часов.

Суточную культуру пересевали на агар Агости-Оттавиани и инкубировали при температуре 37C в течение 24-48 часов.

Культурально-морфологические свойства штаммов и изолятов бактерий изучали при выращивании на различных жидких, полужидких и твердых питательных средах при 37C в течение 24-48 часов.

Световую микроскопию мазков-отпечатков проводили на микроскопе BOPTIKA», Италия) при увеличении в 1000 раз. Микроскопировали под иммерсионным маслом.

Биохимические свойства определяли посредством системы (СИБ), сред Гисса и с помощью автоматического бактериологического анализатора VITEK Compact при использовании карт GP (для грамположительных бактерий) в соответствии с инструкциями по их применению.

Концентрацию бактерий в заражающих дозах определяли посредством титрования исследуемых культур на плотных питательных средах и выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Гемолитическую активность листерий определяли на кровяном агаре с содержанием 5% дефибринированной крови барана. Инкубировали в течение 24- часов при 37C.

дифференциальную среду Агости-Оттавиани. Инкубировали в течение 24-48 часов при 37C.

Для определения патогенности использовали белых мышей массой 15- г. Культуры бактерий выращивали на МПБ в течение 24 часов при 37C.

Полученную суспензию вводили 3 мышам внутрибрюшинно в дозе 1109 КОЕ в объеме 0,5 см3. Наблюдение вели в течение 72 часов после инокуляции культуры.

Для оценки вирулентности определяли летальную дозу LD50. Для этого формировали животных в группы по 6 мышей в каждой группе (7 групп) для каждого разведения. Культуру, выращенную на агаре Хоттингера, смывали 0,9% NaCl, готовили последовательные десятикратные разведения с концентрацией 1109 КОЕ, 1108 КОЕ, 1107 КОЕ, 1106 КОЕ, 1105 КОЕ, 1104 КОЕ, 1103 КОЕ соответственно, в объеме 0,5 см3 (табл. 2). Животных заражали внутрибрюшинно.

Наблюдение вели в течение 10 суток со времени заражения. Концентрацию определяли посредством титрования культур на плотных питательных средах.

Летальную дозу LD50 определяли по формуле Кербера в модификации И.

Ашмарина.

Выделение бактериальной ДНК для постановки ПЦР проводили методом нуклеосорбции с использованием коммерческого «Набора ДНК-сорб» (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Москва) согласно прилагаемой инструкции. Все исследования были выполнены в 3-х повторностях.

Для исключения ложноположительных результатов применяемый метод тестировали на специфичность с близкородственными бактериями.

monocytogenes [14] в объеме 1 мкл на пробу, предназначенные для hlyA гена.

Анализ проводили на ДНК-амплификаторе в режиме реального времени фирмы Rotor GeneQ, USA. Температурный режим реакции ПЦР-РВ представлен в табл. 1.

Таблица Структура праймеров и зонда для L. monocytogenes:

hlyA MF (TGCAAGTCCTAAGACGCCA);

hlyA MR (CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA);

hlyA Mprobe (CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG).

Пробоподготовку для масс-спектрометрического метода проводили согласно инструкциям MALDI «Bruker» Daltonik (Германия) и методическим спектрометра «microflex MALDI Biotyper» при исследовании продовольственного сырья и пищевых продуктов» [6, 16].

Калибровку масс-спектрометра проводили перед каждым экспериментом, согласно инструкциям [16] ((«Bruker» Daltonik, Германия), используя в качестве калибранта Bruker Bacterial Standard («Bruker» Daltonik, Германия).

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре «MALDI Autoflex III Biotyper» («Bruker» Daltonik, Германия), используя линейный режим.

Параметры анализа оптимизировали для диапазона масс от 2000 до 20137 m/z (масса/время), записывали спектр, полученный в результате суммирования одиночных спектров. Для записи, обработки и анализа полученных масс-спектров использовали программное обеспечение FlexControl, MALDI biotyper версия 3.0 и MALDI Biotyper RTC («Bruker» Daltonik, Германия).

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов определяли среднее арифметическое при количестве опытов (n), стандартное отклонение среднего арифметического и коэффициент рангов Спирмана [2].

2.3.1. Определение биологических свойств культур (штаммов и На первом этапе нашей работы исследовали образцы пищевой продукции строго в соответствии с нормативными документами.

бактериологического анализа были внесены следующие изменения (рис. 1, зеленым цветом показаны изменения, которые были включены в общую схему).

патологического материала и чистой лиофилизированной культуры позволило существенно сократить количество этапов выделения и идентификации бактериологического анализа, а именно: этап двойного селективного обогащения пищевых продуктов (48-72 часа), этап обогащения патологического материала (+4C – «холодовое обогащение») при отрицательном первичном результате ( суток), этап посева чистой лиофилизированной культуры на питательные среды (24-48 часов) (рис.1).

Рис. 1. Схема выделения и идентификации L. monocytogenes из патологического материала, пищевых продуктов и лиофилизированных Использование масс-спектрометрического метода позволило сократить следующие этапы идентификации L. monocytogenes: вторичное селективное обогащение в пищевых продуктах (24-48 часов), а также идентификацию листерий при микроскопии мазков-отпечатков, по морфологическим, культуральным, биохимическим признакам и постановке биопробы (24-72 часа) (рис. 1).

Установлено, что культуры листерий по тинкториальным свойствам соответствуют характеристикам бактерии рода Listeria, а именно, клетки в мазках имели форму овоидов, не образовывали спор и окрашивались по Граму положительно в синий цвет. Множество бактерий вида L. monocytogenes под микроскопом выглядели в виде английской литеры “V”.

При определении подвижности установлено, что все культуры листерий, за исключением штамма L. monocytogenes «1кр14», обладали подвижностью при культивировании в условиях комнатной температуры – 22°C. У большинства культур, выросших при 37°С, подвижность отсутствовала. Штамм «1кр14» не обладал подвижностью при обоих температурных режимах. Штаммы L.

monocytogenes «1кр10» и «1кр4», «рыба №6» и изоляты L. innocua «1228», «1229», «1231», «1232», «I-1», наоборот, обладали подвижностью как при 22°C, так и при 37°C.

Определение бихимических свойств L. monocytogenes и L. innocua:

При определении способности продуцировать каталазу выявлено, что все исследуемые штаммы и изоляты образуют каталазу, кроме референтных штаммов L. monocytogenes «66», «10527» и «10888».

При исследовании биохимических свойств листерий с использованием наборов СИБ, сред Гисса все штаммы имели отрицательную реакцию по оксидазе, индолу и сероводороду. Кроме того, реакция была отрицательной по уреазе.

Изолят L. innocua 1231 отличался от других штаммов и изолятов по D-маннозе.

Была показана мономорфность проявления ферментативной активности в отношении многих сахаров, а именно: сахарозе (штамм L. monocytogenes положителен по сахарозе), -галактозидазе, - галактозидазе,, маннозе, салицину и D-трегалозе (L. innocua «I-1» положителен по D-трегалозе) при испытании исследуемых культур на бактериологическом анализаторе VITEK2 Compact. В отличие от других штаммов, положительную реакцию по аспарат-ариломидазе наблюдали у штаммов L. monocytogenes «рыба №6», «СЭС-36», «СЭС-37», «1кр3», «1кр7», «1кр10», «1кр14», «1кр24» и «634», а также у изолятов L. innocua 1228, 1232. Все штаммы не образовывали кислоту из D-галактозы и D-рибозы, за исключением штамма L. monocytogenes «1кр10» и изолята L. innocua 1231.

2.3.2. Гемолитическая и фосфолипазная активность Основными факторами патогенности листерий являются листериолизин О и фосфолипаза С.

При изучении гемолитической и фосфолипазной активности были получены следующие результаты:

23 из 41 культуры L. monocytogenes продуцировали гемолизины на высоком уровне, 15 - на среднем уровне. Штаммы «1кр14», «82» вырабатывали гемолизины на низком уровне. Штамм «10528» L. monocytogenes не вырабатывал экзотоксины, вызывающие деградацию красных кровяных телец.

38 из 41 штамма и изолята L. monocytogenes продуцировали фосфолипазу С на высоком уровне, 2 штамма L. monocytogenes – на низком уровне. Штамм L.

monocytogenes «10528» не продуцировал данный экзотоксин. У всех изолятов L.

innocua фосфолипазная активность отсутствовала, т.к. данный вид бактерий не является патогенным для макроорганизмов.

При определении патогенности на белых мышах выявлено, что все штаммы и изоляты L. monocytogenes, при введении суспензии суточной культуры в концентрации 1109 КОЕ в объеме 0,5 см3 внутрибрюшинно, были патогенны [1, 8].

При заражении штаммами L. monocytogenes «1кр14», «10528», «82» и «15»

падеж подопытных животных отсутствовал, но наблюдали следующие клинические признаки: взъерошенный шерстный покров, угнетение и нарушение координации движения.

С целью подтверждения специфичности заболевания во все опытах по изучению патогенных свойств проводили отбор проб головного мозга, крови и внутренних органов. Все исследуемые культуры, выделенные от павших и вынужденно убитых мышей, были идентифицированы как бактерия вида L.

monocytogenes.

Вирулентность листерий определяли по значению летальной дозы LD50. В зависимости от величины LD50 штаммы и изоляты листерий разделили на 5 групп [10]:

- высоковирулентные штаммы – LD50 в пределах от 104 до 105 КОЕ;

- вирулентные штаммы – LD50 в пределах 106 КОЕ;

- умеренновирулентные штаммы – LD50 составляет 107 КОЕ;

- слабовирулентные штаммы – LD50 составляет 108- 109 КОЕ;

- авирулентные штаммы – показатель LD50 не титруется (LD100 свыше КОЕ).

Большинство исследуемых штаммов и изолятов L. monocytogenes были высоковирулентные (табл. 2) по отношению к белым мышам, 6 – вирулентные, штаммов умеренно вирулентные при экспериментальном заражении, 9 были слабовирулентные.

По полученным данным (табл. 2), 3 штамма из 41, а именно штаммы «82», экспериментальном заражении белых мышей составляла >109 КОЕ.

Оценку взаимосвязи между гемолитической, фосфолипазной активностью и вирулентностью определяли с использованием коэффициента корреляции рангов Спирмена [2].

С вероятностью 99% установлена умеренная степень прямой корреляции (rs=0,402) уровня продукции фосфолипазы C с вирулентностью L. monocytogenes.

Также была показана умеренная степень прямой корреляции (rs=0,386) уровня продукции листериолизина О с вирулентностью L. monocytogenes с вероятностью 98%.

Кроме того, была отмечена средняя степень прямой корреляции (rs=0,478) между гемолитической активностью L. monocytogenes и ее способностью продуцировать фосфолипазу С.

Таблица Дифференциация штаммов и изолятов L. monocytogenes по Примечание: в/в – высоковирулентный; в – вирулентный; у/в – умеренновирулентный;

с/в – слабовирулентный; а/в – авирулентный.

2.3.4. Оптимизация ПЦР-РВ для идентификации L. monocytogenes Следующим этапом работы была оптимизация ПЦР-РВ.

При идентификации L. monocytogenes была разработана собственная система праймеров, но данная система оказалась менее чувствительной, чем праймеры L.T.

Nguyen (2004) на два цикла (одно разведение) [15].

Оптимальный температурный режим реакции представлен в табл. 1.

Таблица Оценка специфичности праймеров для L. monocytogenes в ПЦР-РВ Примечание: « – » - отрицательная реакция;

идентификации с близкородственными бактериями. Было показано, что у всех бактерий, принадлежащих к виду L. monocytogenes, регистрировали рост флуоресценции выше порогового значения. При исследовании геномов бактерий других родов, а также вида L. innocua уровень сигнала флуоресценции не превышал порогового значения (табл. 3). Полученные результаты соответствуют данным литературных источников [15].

Рис. 2. Определения аналитической чувствительности ПЦР-РВ при идентификации L. monocytogenes (десятикратные разведения) (ось х – количество циклов; ось у – уровень флуоресценции).

Суточную культуру штамма L.monocytogenes «К-4», выращенную на КА, использовали при определении чувствительности метода ПЦР-РВ.

Чувствительностью метода считали титр выделенной ДНК в наивысшем разведении, имевшим положительный результат в ПЦР-РВ. Для этого делали семь 10-кратных разведений: 1107 КОЕ/см3, 1106 КОЕ/см3, 1105 КОЕ/см3, КОЕ/см3, 1103 КОЕ/см3, 1102 КОЕ/см3 10 КОЕ/см3 соответственно. Согласно полученным данным (рис. 2), рост флуоресцентного сигнала свидетельствует о присутствии генома L. monocytogenes в исследуемой пробе. По результатам исследования чувствительность метода составила 1102 КОЕ/см3.

Следующим этапом работы было испытание 33 образцов сырого молока и 134 образцов мясной продукции в ПЦР-РВ для обнаружения генома L.

monocytogenes.

В результате проведенных исследований геном L. monocytogenes был выявлен в 10 пробах мясной продукции. Эти данные подтверждены параллельными испытаниями этих же образцов в бактериологическом анализе [3].

С помощью средних значений Ст (пороговый цикл) была получена линейная регрессия зависимости числа порогового цикла ПЦР от разведения в 3-х повторностях для выделенной ДНК L. monocytogenes (рис. 3).

Рис. 3. Линейность результатов ПЦР-РВ при тестировании 10-кратных Эффективность амплификации составила (Е) 91,4%, которая показывает количество полученных копий на единицу матрицы за 1 цикл.

2.3.5. Усовершенствование идентификации L. monocytogenes массспектрометрическим методом Завершающим этапом работы, для получения достоверных результатов, было создание базы данных, состоявшей из 14 референтных штаммов L.

monocytogenes, относящихся к 9 серотипам. Данная база была создана и обозначена как MSP_1 и при дальнейшей работе была включена в общую библиотеку Library BDAL «Bruker» как дополнительная ячейка.

Для создания базы данных использовали сумму из 40 единичных спектров для каждого референтного штамма, отобранных в ручном режиме с мощностью лазера 70%.

При создании базы данных с использованием референтных штаммов L.

monocytogenes было выявлено, что все исследуемые штаммы имели общий пик с массой белка 4325±1,7 m/z и интенсивностью не менее 50% (табл. 4).

Таблица Определение масс белков, с высокой интенсивностью, референтных № Название Сероти Характерист.бел № Номер Сероти Характерист.бел Примечание: m/z – масса/время, % - интенсивность, в качестве примера использовались белки с интенсивностью более 40%.

Штаммы №10528 (сер. 4ab), №10888 (сер. 4d), №19118 (сер. 4e), №4883 (сер.

4с), №5348 (сер. 1-2с), №71 (сер. 4d) и №74 (сер. 4e) имели интенсивность данного пика 100% (табл. 4).

При идентификации 16 штаммов и изолятов L. monocytogenes посредством базы данных производителя «Bruker» (табл. 5) установлено, что логарифмический показатель видовой принадлежности L. monocytogenes находится в границах от 1,500 до 2,200. Полученные результаты свидетельствовали о возможной вероятности определения вида бактерии (рис. 4). Близкое межвидовое родство бактерий рода Listeria (имеющихся в базе данных «Bruker») повлияло на идентификацию исследуемых 16 штаммов и изолятов L. monocytogenes. 7 из штаммов были идентифицированы как бактерии вида L. innocua, а именно штаммы L. monocytogenes «634», «1кр11», «1кр5», «1кр7», «1кр10», рыба №6 и изолят «Lкоторые на самом деле таковыми не являются (идентифицированы как бактерия вида L. monocytogenes бактериологическим анализом).

При исследовании с помощью созданной базы данных MSP_1 (табл. 5) все 16 исследуемых штаммов и изолятов были идентифицированы как бактерия вида L.

monocytogenes. Логарифмический показатель при идентификации находился в пределах от 2,444 до 2,721. Это свидетельствовало о высокой вероятности определения вида бактерии (рис. 4). По данным, представленным в табл. 5, видно, что большинство штаммов и изолятов L. monocytogenes, а именно штамм «К-4», «1кр9», «СЭС-33», «рыба №6», «1кр10», принадлежали к серотипу 1-2b.

3. Гарантированная идентификация рода, возможная идентификация вида 2. 1. 1. Рис. 4. Обработка полученных результатов на масс-спектрометре При анализе видового родства по белковому составу имеющихся в базах данных микроорганизмов получены следующие результаты: единственный штамм бактерий вида L. innocua, имеющийся в базе данных «Bruker», обладал тесным межвидовым родством с референтными штаммами бактерий вида L. monocytogenes (также заложенных в базу данных прибора) (рис. 4). Возможно, это обусловлено наличием одного набора белков, но с разной степенью интенсивности. Следствием этого являлась большая погрешность при идентификации вида с использованием базы данных «Bruker». Представленная шкала на дендрограмме показывает относительное межвидовое родство белковому составу) между микроорганизмами и выражается в условных единицах (рис. 5, 6, 7) (максимальное значение равно 2000 условных единиц (у.е.)).

На рис. 5 показано, что дистанция между штаммом L. innocua DSM 20649Т и штаммом L. monocytogenes DSM 20600Т базы данных производителя («Bruker») составляла 140 у.е. Результаты сравнительного анализа штамма L. innocua базы данных «Bruker» с созданной ячейкой MSP_1 представлены на рис. 6.

Результаты, представленные на рис.6, позволяли заключить, что штамм L.

innocua DSM 20649Т сильно отличается по белковому составу от референтных штаммов L. monocytogenes MSP_1, в отличие от штаммов L. monocytogenes базы данных «Bruker» (рис. 5).

Рис. 5. Межвидовое родство бактерий L. innocua и L. monocytogenes базы Дистанция между штаммом L. innocua DSM 20649Т и L. monocytogenes ячейки MSP_1 составляла 1570 у.е. (рис. 6). Исходя из полученных результатов, межвидовая специфичность бактерий в ячейке MSP_1 по отношению к бактериям вида L. innocua была в 11,2 раза выше, чем у базы данных «Bruker» (рис 5, 6).

Таблица Идентификация и серотипирование бактерий вида L. monocytogenes с использованием базы данных производителя («Bruker») и п/п штаммы и Принадлеж-ть Идентифиц-ый Достов-ть Логарифмич. Принадлеж-ть Идентифиц-ый Достов-ть Логарифмич.