На правах рукописи

Гоголев Юрий Викторович

ФЕРМЕНТЫ ЛИПОКСИГЕНАЗНОГО КАСКАДА:

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА,

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ

03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Казань – 2013

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН)

Научный консультант: Гречкин Александр Николаевич академик РАН, доктор химических наук, директор КИББ КазНЦ РАН

Официальные оппоненты: Тишков Владимир Иванович профессор, доктор химических наук, профессор кафедры химической энзимологии химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Лось Дмитрий Анатольевич профессор, доктор биологических наук, зав. лаб. молекулярных основ внутриклеточной регуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева Российской академии наук Горшкова Татьяна Анатольевна профессор, доктор биологических наук, зав. лаб. механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение

Ведущая организация:

науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

Защита состоится 18 октября 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке КазНЦ РАН.

Автореферат разослан «_»2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д002.005.01, кандидат биологических наук Пономарева Анастасия Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является источником физиологически активных соединений – оксилипинов. У высших растений оксилипины отвечают за регуляцию роста, морфогенез, участвуют в формировании системной устойчивости к экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2002].

Кроме высших растений оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у бактерий, бурых и красных водорослей, кораллов, хордовых и пластинчатых [Lee et al., 2008].

Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада являются липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74 суперсемейства Р450. В зависимости от региоспецифичности действия липоксигеназы растений в основном разделяют на 9- и 13-специфичные, а также обладающие дуалистичными свойствами. Продукты липоксигеназной реакции – гидроперекиси жирных кислот – преобразуются при участии ферментов CYP74: алленоксидсинтаз (АОС), гидропероксидлиаз (ГПЛ), дивинилэфирсинтаз (ДЭС). Алленоксидсинтазы и дивинилэфирсинтазы являются дегидразами, в то время как гидропероксидлиазы – изомеразами. Разнообразие генов семейства CYP74 в геномах различных организмов предполагает и другие типы катализа. К настоящему времени охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, а также несколько ДЭС разных видов растений. Существует мнение, что ферменты последнего класса не имеют широкого распространения в природе.

Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в агропромышленном производстве и биотехнологии. Оксилипины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа ферментов липоксигеназного каскада, исследование их молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.

Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабораториях мира, существенно расширил представления о механизмах ферментативного катализа. Во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и ферментов CYP74 остается недостаточно охарактеризованным. Предложенные модели взаимодействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в частности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недостаточным.

Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ позволяет предположить их возникновение до цитохромов. Однако отсутствие функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в уже существующий метаболический процесс, в котором поступление данного субстрата происходило в результате неферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Филогения и систематика ферментов CYP74 до сих пор остается на стадии разработки. Использование стандартных алгоритмов классификации приводит к объединению в систематические группы функционально не связанных ферментов. Некоторые типичные представители CYP74 по биохимическим характеристикам не удовлетворяют принятым критериям принадлежности к семейству, в связи с чем их предложено включить в одноименный «клан» [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. При этом данный клан рассматривается как продукт поздней эволюции растений, связанной с их выходом на сушу. Однако открытия липоксигеназного каскада у животных, бурых водорослей и прокариот, свидетельствуют о древнем происхождении этого ферментативного пути и его фундаментальном физиологическом значении на ранних этапах развития жизни.

Данные противоречия могут быть следствием малой изученности ферментов CYP74.

Так, у классического объекта – льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с которого началось изучение ферментов данного семейства, недавно были выявлены новые оксилипины – необычные изомеры дивиниловых эфиров и их производные – линолипины [Chechetkin et al., 2008]. Однако фермент, ответственный за синтез дивиниловых эфиров, до настоящего времени оставался неизученным.

Выяснение эволюционных процессов, обусловливающих возникновение сложных реакционных комплексов, является одним из фундаментальных вопросов эволюции живых систем. С точки зрения молекулярной филогении ферменты липоксигеназного каскада представляют удобную модель, которая позволяет проследить коэволюцию двух типов ферментов, осуществляющих цепь сопряженных реакций. Детерминированность липоксигеназного каскада в небольшом количестве направлений биосинтеза оксилипинов при одновременной пластичности ферментов, способных к конверсии при минорных модификациях первичной структуры, дает возможность экспериментальной реконструкции эволюционных процессов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является выяснение механизмов каталитического действия ферментов липоксигеназного каскада и построение филогенетической модели, описывающей эволюционное развитие этих механизмов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Структурно-функциональная характеристика рекомбинантной липоксигеназы ZmLOX3 кукурузы (Zea mays).

2. Получение мутантных форм ZmLOX3; сравнение реакций превращения линолевой кислоты и других субстратов при участии фермента дикого типа и его мутантных форм.

3. Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и липоксигеназы GmLOX сои (Glycine max) с субстратами на основании экспериментальных данных и компьютерного моделирования.

4. Выявление особенностей механизма катализа рекомбинантной алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum) в сравнении с алленоксидсинтазами подсемейства CYP74A.

5. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез (5Z)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.); получение рекомбинантного фермента, его структурно-функциональная характеристика.

6. Получение мутантных форм LeAOS3 и фермента, ответственного за биосинтез (5Z)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с модификациями каталитически важных доменов. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

7. Получение мутантных форм гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula); сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

8. Проведение эволюционного анализа генетической информации, накопленной в отношении ферментов липоксигеназного каскада.

9. Построение филогенетических моделей, отражающих молекулярную эволюцию ферментов липоксигеназного каскада высших растений и их таксономическое положение.

Научная новизна работы. На основании экспериментальных данных и результатов компьютерного моделирования определены факторы, влияющие на специфичность окисления субстратов при участии (9S)- и (13S)-липоксигеназ растений (ZmLOX3 и GmLOX1, соответственно). Показано, что позиционирование субстратов в активном центре GmLOX1 и ZmLOX3 различается, однако в обоих случаях субстрат погружается в активный центр метильной концевой группой; инверсии субстрата под действием внешних факторов не происходит. Специфичность действия ZmLOX3 не определяется ориентацией субстрата в активном центре, а детерминируется объемом активного центра, его пространственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа.

Выявлены консервативные участки полипептидной цепи ZmLOX3 и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на каталитические свойства фермента. В результате единичной аминокислотной замены получена мутантная форма ZmLOX3 с измененной региоспецифичностью.

Впервые показано, что алленоксидсинтаза LeAOS3 подсемейства CYP74C цитохромов Р450 является многофункциональным ферментом и катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Показано, что продуктами LeAOS3 являются (9S)--кетол и рацемическая смесь цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

Выявлен ген дивинилэфирсинтазы LuDES льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), клонирована его открытая рамка считывания. LuDES идентифицирована как первый фермент подсемейства CYP74B, гомологичный 13-гидропероксидлиазам, входящим в состав данного подсемейства, и, вместе с тем, являющийся дивинилэфирсинтазой. На сегодняшний день LuDES является единственной известной 13-гидропероксид-специфичной дивинилэфирсинтазой.

Проведен сравнительный анализ первичных и третичных структур монооксигеназ Р450 и представителей семейства CYP74; выявлены гипотетические детерминанты катализа – сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих консервативные последовательности у ферментов с разным типом катализа – алленоксидсинтаз, гидропероксидлиаз и дивинилэфирсинтаз. Смоделированы модификации первичной структуры алленоксидсинтазы LeAOS3 томата, гидропероксидлиазы MtHPL люцерны, дивинилэфирсинтазы LuDES льна; проведен сайт-направленный мутагенез соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм ферментов. Впервые показано изменение механизмов каталитического действия ферментов семейства CYP74 в результате замены аминокислотных остатков, находящихся вблизи гема. Получены мутантные формы алленоксидсинтазы LeAOS3, обладающие гидропероксидлиазной активностью, что означает конверсию дегидразного типа реакции в изомеразный. Впервые дивинилэфирсинтаза LuDES превращена в алленоксидсинтазу, которая катализирует преобразование 13-гидроперекиси -линоленовой кислоты в 12-оксо-10,15-фитодиеновую кислоту и -кетол. Проведенные превращения ферментов CYP74 могут служить подтверждением дивергенции генов CYP74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Липоксигеназа ZmLOX3 кукурузы проявляет (9S)-специфичность при окислении линолевой кислоты в нейтральных и щелочных условиях в диапазоне pH 6,5-9,5. Анализ моделей взаимодействия липоксигеназ с субстратами показал, что для ZmLOX3 характерен единственный способ позиционирования субстрата в активном центре, обусловленный проникновением жирной кислоты в субстрат-связывающий карман метильной концевой группой. Аминокислотный остаток Ala562, расположенный в активном центре ZmLOX3, важен для проявления региоспецифичности действия; замена аланина на меньший по размерам глицин приводит к частичному проявлению (13R)-региоспецифичности.

2. Специфичность действия липоксигеназ высших растений не обнаруживает строгой взаимосвязи с общей первичной структурой, что характерно для липоксигеназ животных, грибов и прокариот.

3. 13-cпецифичные липоксигеназы являются анцесторной группой по отношению к 9-специфичным липоксигеназам, которые образовались монофилетически до дивергенции однодольных и двудольных растений.

4. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C, является многофункциональным. LeAOS3 катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Первичный продукт LeAOS3, окись аллена, после высвобождения из активного центра захватывается тем же ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно – стереоспецифический гидролиз с образованием (9R)--кетола и циклизацию с образованием рацемической цис-10-оксо-11фитоеновой кислоты.

5. Фермент LuDES льна является единственной дивинилэфирсинтазой, классифицируемой по общей первичной структуре как член подсемейства CYP74B цитохромов Р450, до сих пор включавшего только 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы.

Дивинилэфирсинтаза LuDES льна обладает строгой 13-региоспецифичностью к субстрату; предпочтительным субстратом для нее является 13-гидроперекись -линоленовой кислоты, основным продуктом является (5Z)-этероленовая кислота.

6. В формировании определенного типа катализа ферментов семейства CYP74 принципиальная роль принадлежит центральному домену I-спирали и ERR-триаде.

7. Все ферменты семейства CYP74 относятся к одной близкородственной филогенетической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций. Семейство CYP74 сформировалось на ранних этапах эволюции цитохромов Р450 до дивергенции эукариот от последнего общего предка. Предковая форма ферментов CYP74 высших растений дала начало трем большим группам. Первая включала 13-ГПЛ, вторая – 13-АОС, третья – 9/13-АОС, 9-АОС и 9/13-ГПЛ. Дивинилэфирсинтазы являются эволюционно наиболее молодыми ферментами, имеющими полифилетическое происхождение, не завершившееся формированием таксономически обособленных единиц. Субстратная специфичность наряду с типом катализируемой реакции является существенным таксономическим признаком представителей семейства CYP74; дивинилэфирсинтазы связаны с родственными группами общей субстратной специфичностью.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов липоксигеназной сигнальной системы – оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, а также в формировании ответа на стрессовые факторы. Многие оксилипины являются физиологически активными, бактерицидными соединениями.

В экономическом аспекте актуальными являются исследования липоксигеназного каскада масличных, зерновых и технических культур, а также лекарственных растений.

Оксилипины во многом определяют ценные технологические, органолептические и лечебные свойства растений, которые могут быть востребованы в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

Разработаны системы получения и препаративной очистки липоксигеназ и цитохромов растений, способные найти применение в промышленности. Ферменты с измененными каталитическими свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохозяйственного производства, и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.

Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в биоинженерии. Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2004 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74:

структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов – эндогенных биорегуляторов растений» (гос. рег. №: 01200901959). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 09-04а, 09-04-12222-офи_м, программой президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантом ведущей научной школы НШ № 6992.2010.4, Федеральной целевой программой «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров» (ГК № 14.740.11.0797 от 30.10.2010). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (Солт-Лейк-Сити, США, 2007); на 2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Вальядолид, Испания,2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины»

(Лозанна, Швейцария, 2009); на 35-ом и 36-ом конгрессах FEBS (Прага, Чешская республика, 2009; Турин, Италия, 2011); на VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011); на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); на 4-ом Съезде EMBO (Ницца, Франция, 2012); на 18-ой Международной конференции «Цитохромы Р450: биохимия, биофизика и биотехнология» (Сиэтл, США, 2013); на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2006-2013 гг.).

Публикации. По результатам работы опубликовано семь статей в отечественных и семь в зарубежных рецензируемых изданиях. Все издания входят в перечень ВАК РФ. По докладам на научных мероприятиях опубликовано 50 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 345 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В работе представлено 13 таблиц и 92 рисунка. Список литературы включает 395 источников.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы биоинформатики. Поиск аминокислотных последовательностей липоксигеназ и цитохромов P450 проводили с помощью программы PSI-BLAST в базе данных NCBI и банке данных д-ра Нельсона [http://drnelson.uthsc.edu/ CytochromeP450.html].

Множественные выравнивания проводили с применением программы Clustal Omega [Sievers et al., 2011]. Для филогенетического анализа использовали пакет программ MEGA 5 [Tamura et al., 2011]. Трехмерные модели белков строили с помощью пакета программ EsyPred3D [Lambert et al., 2002]. Позиционирование субстрата в активном центре исследовали с помощью программ Autodock 4.2 и AutodockTools 1.5.4 (The Scripps Research Institute). Модели лигандов получали с помощью программы ChemOffice (CambridgeSoft), визуализацию данных проводили с помощью программы PyMol APBS Tool (Carlson Group, University of Michigan). Праймеры конструировали с помощью программы Vector NTI 9 (Invitrogen, США).

Подготовка материала. Рекомбинантные плазмиды, содержащие открытые рамки считывания (ОРС) генов LeAOS3 [Howe et al., 2000] и ZmLOX3 [Wilson et al., 2001], были любезно предоставлены доктором Г. Хоу (Университет штата Мичиган, США) и Н. Кэллер (Университет штата Висконсин, США), соответственно. Для клонирования генов ферментов CYP74 льна-долгунца (Linum usitatissimum L., сорт Новоторжский) их экспрессию индуцировали инокуляцией клетками штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 растений, выращенных в течение 35 дней в открытом грунте.

Тотальную ДНК экстрагировали фенольным методом [Георгиев, 1959]; РНК выделяли с помощью коммерческого набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Для получения двуцепочечной кДНК использовали коммерческий набор MINT (Евроген, Россия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в стандартном температурном режиме, от 14 до 40 циклов. Праймеры синтезировали в НПО «Синтол» (Россия). Качество нуклеиновых кислот оценивали после их электрофоретического разделения в агарозном геле; количество определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США). Для выделения ДНК из агарозного геля использовали наборы MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили с помощью вектора pGem-T Easy (Promega, США). Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили на автоматическом капиллярном ДНК-анализаторе ABI Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для анализа и сопоставления секвенированных последовательностей применяли программы Sequencing Analysis 5.3.1. и SeqScape Software 2.6. (Applied Biosystems, США).

Для определения последовательностей полноразмерных кДНК использовали метод RACE (Rapid Amplification of cDNA End), основанный на гнездовой ПЦР. Мутации в клонированные гены вводили методом полноразмерной амплификации плазмид с модифицированными праймерами с помощью ПЦР с ДНК-полимеразой KOD (Novagen, США) или Pfu Turbo (Stratagen, США). Реакционную смесь обрабатывали рестриктазой DpnI (Fermentas, Литва), гидролизующей метилированную ДНК бактерий.

Получение рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки нарабатывали в клетках E. coli BL21(DE3)pLysS и Rosetta-gami(DE3)рLysS B с использованием векторов pETрЕТ-32 Ek/LIC, рЕТ-23а (Novagen, США). Протокол был составлен на основе общепринятых методик. Клетки продуцентного штамма E. coli выращивали в среде LuriaBertani (LB), разведенной равным объемом минеральной среды М9, до достижения культурой OD600 = 0,8-1,0. Клеточную культуру охлаждали до 20 оС и добавляли в нее 0,1 мМ ИПТГ. Для синтеза цитохромов добавляли предшественник гема – -аминолевулиновую кислоту – из расчета 115 мг/л. Индуцированные клетки инкубировали 18-24 часа при умеренной аэрации и 16-20 oC, после чего собирали центрифугированием, суспендировали и разрушали в лизирующем буфере BugBuster (Invitrogene, США).

Очистку ферментов CYP74 проводили металлоаффинной хроматографией на колонке Bio-Scale Mini Profinity IMAC (Bio-Rad, США). Содержащую белок фракцию подвергали ультрафильтрации через фильтр AmiconUltra 50k (Millipore, США). Рекомбинантную липоксигеназу ZmLOX3 собирали высоливанием ((NH4)2SO4, 20-50 % насыщения), диализовали и последовательно подвергали анионообменной (Q-Sepharose) и гидрофобной (Octyl-Sepharose) хроматографии.

Биохимическая характеристика ферментов. (9Z,11E,13S)-13-гидроперокси-(9,11)октадекадиеновую кислоту (13-гидроперекись линолевой кислоты, 13-ГПОД) и (13S)гидроперокси-(9Z,11E,15Z)-октадекатриеновую кислоту (13-гидроперекись -линоленовой кислоты, 13-ГПОТ) получали окислением линолевой и -линоленовой кислот, соответственно, при участии соевой липоксигеназы (Sigma-Aldrich, США). (9S,10E,12Z)-9гидроперокси-(10,12)-октадекадиеновую кислоту (9-гидроперекись линолевой кислоты, 9ГПОД) и (9S,10E,12Z,15Z)-гидроперокси-(10,12,15)-октадекатриеновую кислоту получали в результате инкубации линолевой и -линоленовой кислот, соответственно, с липоксигеназой томата. Гидроперекиси очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на колонке Separon SIX (5 мкм, 3,2150 мм, Tessek, Чехия).

Реакцию липоксигеназного окисления проводили в насыщенном кислородом 0,1 M Na-фосфатном буфере (pH 7,0 или 9,0), содержавшем 0,3 мM субстрата. Активность ферментов CYP74 определяли по снижению характерного для гидроперекисей жирных кислот оптического поглощения при 234 нм. Анализ проводили в 0,05 M Na-ацетатном (pH 5,0), Na-фосфатном (pH 6,0-8,0), трис-HCl (pH 7,5-8,5) и глицин-NaOH (pH 9,0) буферах.

Для расчета скорости реакций использовали начальные линейные участки кинетических кривых. Кинетические параметры рассчитывали по установке наборов данных для насыщающей модели с одним сайтом связывания простого лиганда с помощью программного обеспечения SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., США).

Продукты реакций экстрагировали смесью этилацетата и гексана (1:1), высушивали, перерастворяли в метаноле и наносили на колонку Nucleosil 5 ODS (2504,6 мм) (Macherey-Nagel, Германия) с обращенной фазой. Растворитель нужных фракций высушивали. Остаток перерастворяли в ацетоне и наносили на две соединенные колонки Separon SIX с нормальной фазой. Для протонирования жирных кислот в систему растворителей добавляли ледяную уксусную кислоту (1:1000). Фракции ВЭЖХ на нормальной фазе, соответствующие отдельным пикам продуктов, метилировали диазометаном. Метиловые эфиры анализировали хирально-фазовой ВЭЖХ на колонке Chiralcel OD-H (Daicel Chemical Industries, Япония) в смеси растворителей гексан/изопропанол (97:3 по объему).

Образцы для ГХ-МС готовили по протоколу, разработанному ранее [Grechkin et al., 2007]. Реакционную смесь экстрагировали смесью гексана с этилацетатом (1:1). Продукты высушивали, растворяли в метаноле и восстанавливали в присутствии NaВН4. Восстановленные продукты метилировали диазометаном, диазометан выпаривали, продукты растворяли в метаноле и гидрировали водородом над PtO2. Продукты силилировали смесью пиридин/гексаметилдисилазан/триметилхлорсилан (2:1:2). После упаривания силилирующей смеси продукты экстрагировали гексаном. Очистку продуктов проводили с помощью ВЭЖХ, после чего проводили их анализ методом газовой хромато-массспектрометрии (ГХ-МС) путем полного спектрального сканирования ионов в диапазоне отношений массы к заряду от 50 до 650 с помощью масс-спектрометра QP5050A, соединенного с газовым хроматографом GC-17A (Shimadzu, Япония).

Для определения пространственной структуры оксигенированных жирных кислот и подтверждения данных по геометрической изомерии применяли метод спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса. 1Н-ЯМР спектры исследуемых веществ, растворенных в CDCl3, и 2D-COSY регистрировали с помощью спектрометра Avance (Bruker, Германия) при рабочей частоте 600 МГц. Эксперименты по гомоядерному 1Н двойному резонансу проводили с помощью того же инструмента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Биохимическая характеристика рекомбинантной липоксигеназы ZmLOX кукурузы обыкновенной (Zea mays). Наработку рекомбинантного фермента ZmLOX проводили в клетках штамма E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS B. Оптимизация условий экспрессии гена ZmLOX3 позволила достичь высокой каталитической активности фермента. Его очистку проводили комбинацией методов ионообменной и гидрофобной хроматографии. В табл. 1 представлены результаты типичного эксперимента.

Табл. 1. Каталитическая активность препаратов рекомбинантной ZmLOX3.

Согласно теории обратной ориентации, предложенной Гарднером [Gardner, 1989], появление 9-гидропероксипроизводных жирных кислот связано с тем, что в кислых условиях карбоксильная концевая группа жирной кислоты находится в неионизированном состоянии и способна погружаться в субстрат-связывающий карман. При защелачивании реакционной среды ионизация карбоксильной группировки заставляет жирную кислоту переориентироваться; происходит погружение в активный центр метильной концевой группы, что ведет к образованию 13-гидропероксипроизводных жирных кислот.

Скорости и продукты окисления линолевой и -линоленовой кислот при участии ZmLOX3 исследовали при разных значениях pH. Было установлено, что вне зависимости от рН среды преобладающим продуктами реакции являлись (9S)-гидроперекиси жирных кислот (табл. 2). В отличие от опубликованных данных для (9S)-липоксигеназ, регио- и стереоспецифичность ZmLOX3 не зависели от условий реакции.

Скорость окисления -линоленовой кислоты была меньше, чем линолевой. Согласно модели, предложенной для ЛОГ млекопитающих [Kuhn et al., 1990], субстрат должен позиционироваться так, чтобы пентадиеновая группировка связалась с определенным ключевым аминокислотным остатком; взаимодействие акцептора с водородом прохирального центра субстрата должно быть энергетически выгодным. Вероятно, взаимодействие пентадиеновой группировки, центром которой является 11-ый атом углерода, с соответствующим аминокислотным остатком активного центра ZmLOX3 происходит как в случае -линоленовой, и линолевой кислот. Это обеспечивает специфичность реакции. Однако для -линоленовой кислоты энергетически выгодным является удаление атома водорода от прохирального центра другой пентадиеновой группировки (9-го атома); увеличение расстояния от акцептора водорода до пентадиеновой группировки с прохиральным центром на 11-ом атоме углерода снижает скорость реакции.

2.2. Направленная модификация первичной структуры ZmLOX3. Для выяснения особенностей первичной структуры и филогенетического положения ZmLOX3 проводили множественное выравнивание аминокислотных последовательностей липоксигеназ растений, для которых получены данные о специфичности действия. Кроме того, с помощью методов компьютерного моделирования нами была построена трехмерная модель ZmLOX3. Полученные данные свидетельствуют о том, что разделение липоксигеназ на группы по специфичности не обнаруживает строгого соответствия степени схожести первичных структур. В то же время, согласно сравнительному анализу первичной структуры липоксигеназ Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последователь- GmLOX1 и 9-специфичного ностей липоксигеназ сои GmLOX1, VLXD, GmLOX3, фермента ZmLOX3 в этом сайте VLXB и кукурузы ZmLOX3. а – Ala560, б – Ala562 в обнаруживается последовательпоследовательности ZmLOX3. ность INALAR.

В полипептидной цепи рекомбинантного фермента ZmLOX3 были проведены замены аминокислотных остатков A560G и A562G. Было обнаружено, что преобладающим продуктом окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 A560G была (9S)гидроперекись. Количество минорных продуктов (9R)-, (13S)-, (13R)-гидроперекисей линолевой кислоты составляло не более 3 %, что соответствовало профилю продуктов окисления субстрата при участии ZmLOX3 дикого типа (табл. 2). Полученный результат согласуется с компьютерной моделью, согласно которой боковая группировка Ala560 не участвует в формировании субстрат-связывающего кармана. Продуктами окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 A562G являлись 9- и 13-гидроперекиси в соотношении 68,5:31,5. С помощью хирально-фазовой ВЭЖХ показано, что среди 9гидроперекисей линолевой кислоты преобладали (S)-энантиомеры (97 %), тогда как среди 13-гидроперекисей преобладали (R)-энантиомеры (96 %). Для ZmLOX3 дикого типа константа Михаэлиса для линолевой кислоты составила 20,2 мкМ, тогда как для ZmLOX A562G – 3,2 мкМ. Таким образом, в результате мутации A562G липоксигеназы ZmLOX кукурузы была изменена региоспецифичность каталитического действия фермента.

Табл. 2. Процентное соотношение продуктов окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 дикого типа и ее мутантных форм A560G и A562G.

Согласно гипотезе Коффа [Coffa, Brash, 2004] для каталитической активности (13S)специфичных липоксигеназ оптимальными являются щелочные условия, когда карбоксильная концевая группа жирной кислоты ионизирована и субстрат входит в активный центр фермента метильной концевой группой. Для образования (9S)-гидроперекиси субстрат должен проникнуть в активный центр неионизированной карбоксильной группой при кислых pH. Альтернативная гипотеза заключается в том, что ориентация субстрата всегда соответствует его погружению в активный центр метильной концевой группой.

Ключевую роль играет боковая группа аминокислотного остатка Ala542 GmLOX (Ala562 ZmLOX3), расположенного у входа в субстрат-связывающий карман. У (13S)специфичных липоксигеназ она закрывает от молекулы кислорода 9-ый атом углеродной цепи субстрата. У (9S)-специфичных липоксигеназ боковая группа остатка аланина блокирует 13-ый атом. При замене остатка аланина на менее объемный остаток глицина углерод в 13-ом положении открывается для присоединения кислорода. Поэтому мутантная форма ZmLOX3 A562G катализирует образование не только (9S)-, но и (13R)гидроперекиси линолевой кислоты.

Ранее высказано предположение, что у некоторых липоксигеназ, в частности, (8R)ЛОГ коралла Plexaura homomalla субстрат-связывающий центр представляет собой не карман, а U-образный канал [Neau et al., 2009]. В этом случае специфичность действия липоксигеназы может зависеть от ориентации субстрата в канале. До настоящего времени мы не располагаем данными о трехмерной структуре (9S)-специфичных липоксигеназ.

Однако использование методов биоинформатики позволило построить пространственную модель фермента на основании сходства аминокислотных последовательностей с липоксигеназами, для которых данные рентгеноструктурного анализа получены.

2.3. Моделирование механизма ферментативного действия ZmLOX3. Согласно филогенетическим данным специфичность действия липоксигеназ определяется не протяженными последовательностями, а компактными доменами. При этом для липоксигеназ характерны разные спектры специфично окисляемых субстратов. Так, (13S)липоксигеназа GmLOX3 сои, в отличие от ZmLOX3, специфично окисляет полиненасыщенные жирные кислоты длиной 20 и 22 углеродных атома, хотя и с меньшей эффективностью, чем линолевую и -линоленовую кислоты. При этом как GmLOX3, так и ZmLOX3 способны использовать в качестве субстрата сложные липиды [Чечеткин и соавт., 2009]. Данные о пространственной структуре 13-ЛОГ GmLOX1 и GmLOX3, а также комплекса GmLOX3 с аналогом субстрата были получены методом рентгеноструктурного анализа [Dainese et al., 2005]. Эти данные были использованы нами при конструировании пространственной модели ZmLOX3 (рис. 2).

Полученная модель ZmLOX3 обладает значительным сходством с пространственной структурой соевых липоксигеназ. N-концевой PLAT-домен ZmLOX3 длиной 160 аминокислотных остатков участвует во взаимодействии с мембранами и свободными жирными кислотами. В состав PLAT-домена входят аминокислотные остатки Asp31 и Glu120, необходимые для связывания Ca2+, и Lys114. Благодаря Lys114 обеспечивается ассоциация белка с мембраной, либо липопротеин-связанным субстратом. В состав С-концевого домена входит третий Ca2+-связывающий аминокислотный остаток Glu194.

Для (8R)-липоксигеназы коралла, GmLOX1 и ZmLOX3 провели моделирование взаимодействия субстрата и активного центра (рис. 3) и определили следующее. Активный центр GmLOX1 формируется тремя полостями, соединяющимися у атома железа.

Жирная кислота в активном центре может располагаться одним из двух способов (рис. 4).

В первом случае карбоксильная концевая группа субстрата фиксируется водородными связями с Thr257 (GmLOX1) в полости I (рис. 4В). Углерод, от которого отрывается водород, располагается в непосредственной близости (3 ) от атома железа. Алифатическая часть субстрата располагается в полости II. Во втором случае часть субстрата находится в полости I в непосредственной близости от аминокислотных остатков Leu255, Glu256, Thr259, Ile538, Ile753, Leu754 и Ile839; остальная часть субстрата располагается в полости III (рис. 4Г). Таким образом, специфичность действия GmLOX1 при использовании в качестве субстратов жирных кислот с разной длиной углеродной цепи объясняется возможностью их разного позиционирования в активном центре.

Рис. 3. Положения субстратов в активных центрах ZmLOX3 (а, б, в) и GmLOX1 (г, д, е), рассчитанные с помощью программы Autodock 4.2. Субстраты: а, г – (7Z,10Z,13Z)гексадекатриеновая, б, д – -линоленовая, в, е – (13Z,16Z)-докозадиеновая кислоты.

Рис. 4. Модели позиционирования субстрата Trp498 – вместо Leu в соответств активном центре липоксигеназ. А – «U»- вующих положениях. В случае кообразная модель (8R)-ЛОГ коралла, Б – ZmLOX3, раллового фермента карбоксильная В – GmLOX1 при взаимодействии с субстратами группа субстрата фиксируется на