На правах рукописи

АРНАУТОВ МАКСИМ ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА ИЗ

МЯСА МИДИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ СОЗДАНИЯ

ОБОГАЩЕННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.04 – технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва, 2013

Работа выполнена во ФГБОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП»)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Абрамова Любовь Сергеевна советник директора ФГУП «ВНИРО»

Копыленко Лилия Рафаэльевна Официальные доктор технических наук, оппоненты:

главный научный сотрудник лаборатории ВНИРО-ТЕСТ ФГУП «ВНИРО»

Дыдыкин Андрей Сергеевич кандидат технических наук, доцент, заведующий лабораторией технологии детских, лечебно- профилактических и специализированных продуктов ГНУ «Всероссийский научно- исследовательский институт мясной промышленности» им.

В.М.Горбатова Россельхозакадемии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет» (ФГБОУ ВПО «КГТУ»)

Защита состоится «17» декабря 2013 г. в 14:00 ч. на заседании диссертационного совета Д 307.004.03 при ФГУП «Всероссийский научноисследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО») по адресу: 107140,г. Москва, ул. В. Красносельская, 17.

Факс: (499) 264-91-87, e-mail: [email protected] C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО») Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Татарников Вячеслав Александрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Актуальность обусловлена решением задач, поставленных в «Основах государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 года». В настоящее время в питании населения наблюдается недостаточность пищевого белка и целого ряда микро- и макронутриентов. Дефицит белка, полноценного по аминокислотному составу, сопровождается неспособностью соответствующих защитных систем организма адекватно отвечать на неблагоприятные воздействия окружающей среды, что резко повышает риск развития ряда заболеваний [Суханов Б.П., Тутельян В.А., Онищенко Г.Г., 2009; Позняковский В.М., Суханов Б.П., 2009; Тутельян В.А. и др., 2010]. Известно также, что для питания населения в отдельных регионах характерна недостаточность некоторых эссенциальных микроэлементов (ЭМ), в частности селена, железа, цинка, хрома. Согласно общим положениям теории адекватного питания, сформулированной академиком Уголевым А.М., имеются определенные основания отдавать предпочтение органически связанным формам ЭМ, поскольку именно они в наибольшей степени соответствуют особенностям ферментативных систем организма, сложившимся в ходе эволюции.

Водные биологические ресурсы, особенно моллюски, имеют большое значение в решении задач снабжения населения продуктами с высокой пищевой ценностью, заданными свойствами, биологически активными добавками к пище, предназначенными для восполнения микроэлементной недостаточности и профилактики заболеваний. Одним из направлений их переработки в легкодоступные для усвоения организмом человека белки и аминокислоты является получение гидролизатов на их основе.

Исследованиями в области разработки технологии гидролизатов рыбных и нерыбных объектов занимались такие ученые, как Кизеветтер И.В., Лагунов Л.Л., Рехина Н.И., Ордуханян Н.И., Новикова М.В., Чимиров Ю.И., Беседина Т.В., Черногорцев А.П., Konrad G, Jaswal A.S. и ряд других. Общепризнана эффективность применения кислотных гидролизатов из мяса мидий в лечебном и профилактическом питании [Лагунов Л.Л. и др., 1997; Рехина Н.И. и др., 1997, Новикова М.В. и др., 2004; Новикова М.В., 2004]. Однако, недостаточно удовлетворительные органолептические показатели, а также значительное снижение биологической ценности из-за полного или частичного разрушения некоторых незаменимых аминокислот (в первую очередь триптофана) в процессе кислотного гидролиза препятствуют расширению ассортимента специализированных пищевых продуктов на основе кислотных мидийных гидролизатов. Вследствие очень высокого содержания солей в кислотных гидролизатах мидий отсутствует возможность эффективного обогащения их эссенциальными микроэлементами d-ряда в органической форме. В соответствии с предположением об определяющей роли короткоцепочечных пептидов в проявлении радиорезистентной активности мидийных гидролизатов в работе была поставлена задача получения ферментативного гидролизата мяса мидий с высоким содержанием низкомолекулярных пептидных фракций, обеспечивающих высокую биологическую ценность, радиорезистентные свойства, хорошую растворимость и повышенную эффективность связывания эссенциальных микроэлементов. Это обстоятельство определяет актуальность разработки биотехнологического подхода, основанного на использовании ферментативного гидролиза для получения ферментолизатов мяса мидий с задаваемыми физикохимическими показателями и высокой биологической ценностью.

Цель работы - научное обоснование технологии ферментативных гидролизатов из мяса мидий с задаваемой пищевой и биологической ценностью, предназначенных для создания пищевых продуктов, в том числе обогащенных эссенциальными микро- и макроэлементами.

Основные задачи исследования:

Обосновать использование ферментолизата мяса мидий в качестве сырья для получения обогащенных пищевых продуктов и разработать нутриентнотехнологические рекомендации к созданию ферментолизата мяса мидий и комплекса ферментолизата мяса мидий с цинком с задаваемыми показателями.

Разработать и оптимизировать в лабораторных условиях технологию ферментолизата мяса мидий, получить его комплекс с цинком, экспериментально определить их химический состав и важнейшие физико-химические показатели:

молекулярно-массовое распределение пептидных фракций и содержание цинка в составе комплекса.

В полупромышленных условиях апробировать разработанную технологию, получить опытные партии ферментолизата мяса мидий, его комплекса с цинком и охарактеризовать их по химическому составу, физико-химическим показателям и показателям безопасности.

В опытах in vitro с помощью аминокислотного анализа и in vivo в опытах на лабораторных животных (крысах линии Вистар) с использованием ростового и балансового методов исследования охарактеризовать пищевую и биологическую ценность ферментолизата мяса мидий.

охарактеризовать радиорезистентные свойства ферментолизата мяса мидий и его комплекса с цинком.

Разработать рецептурные композиции мидийных соусов, включающих в качестве пищевого ингредиента ферментолизат мяса мидий, и исследовать их химический состав, показатели качества и безопасности.

Разработать техническую документацию на ферментолизат мяса мидий, его комплекс с цинком, мидийный соус и мидийный соус, обогащенный цинком.

Оценить экономическую эффективность от внедрения разработанной технологии.

Научная новизна. Установлено, что радиозащитная и гемостимулирующая активность гидролизатов мяса мидий возрастают с увеличением содержания в их составе низкомолекулярных пептидных фракций. Показано, что ферментативный гидролизат мяса мидий с суммарным содержанием более 45% короткоцепочечных и среднецепочечных пептидов обладает такими же радиорезистентными свойствами (радиозащитной и гемостимулирующей активностью), что и кислотный гидролизат «МИГИ-К ЛП».

Установлена зависимость степени гидролиза мяса мидий от содержания ферментного препарата «Протозим» и мяса мидий в смеси, продолжительности процесса ферментолиза, что позволило определить рациональные параметры задаваемыми физико-химическими показателями.

В опытах in vivo установлено, что потребление растущими крысами эффективности белка для ферментолизата мяса мидий и гомогенизированного мяса мидий составили соответственно 2,8 и 1,7 г прироста массы тела на грамм потребленного белка.

Научные положения, выносимые на защиту:

- обоснование использования мяса мидий в качестве сырья для получения микроэлементами с задаваемыми свойствами;

- оптимизация технологии ферментолизата мяса мидий, его комплекса с цинком для получения продуктов с задаваемыми физико-химическими показателями: молекулярно-массовым распределением пептидных фракций и содержанием цинка в составе комплекса;

- оценка радиорезистентных свойств ферментолизата мяса мидий и его комплекса с цинком, обосновывающая их биологическую эффективность при создании обогащенных пищевых продуктов;

- моделирование рецептурных композиций мидийного соуса, включающего в качестве пищевого ингредиента ферментолизат мяса мидий, и мидийного соуса, обогащенного органической формой цинка, и исследование их химического состава, показателей качества и безопасности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования явились основой для создания ферментолизата мяса мидий с задаваемыми свойствами, как самостоятельного продукта, так и компонента для пищевых продуктов, в том числе обогащенных эссенциальными микро- и макроэлементами.

Новизна технических решений подтверждена патентом РФ на изобретение № 2468593 от 10.12.12 «Способ получения белкового ферментолизата из мяса мидий».

Изготовлена опытная партия ферментолизата мяса мидий и комплекса ферментолизата мяса мидий, обогащенного цинком на экспериментальном производстве ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия», г. Углич. Результаты подтверждены актом о выпуске партии.

Разработана и утверждена техническая документация: ТУ 9283 – 113 – 00472124-2013 «Ферментолизат мяса мидий» и ТИ, ТУ 9283 – 116 – 00472124Комплекс ферментолизата мяса мидий с цинком» и ТИ, ТУ 9283-144Гидролизат мяса мидий пищевой МИГИ-К» и ТИ, ТУ 9283-146Соус мидийный» и ТИ, ТУ 9283-147-00472124-2013 «Соус мидийный, обогащенный цинком» и ТИ.

На рассмотрении в Федеральном институте промышленной собственности (ФИПС) находятся две заявки на изобретение, касающиеся композиций пищевого № 2013122593/13(033296) от 17.05.2013.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается проработкой литературных источников по теме диссертации, постановкой целого ряда экспериментов, применением современных инструментальных методов анализа, математической обработкой результатов экспериментов, публикацией основных положений диссертации.

Основные положения диссертационной работы обсуждались на IV научнопрактической конференции «Пищевая и морская биотехнология – для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (г. Светлогорск, 2011), XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее», II научнопрактической конференции молодых ученых ФГУП «ВНИРО» (г. Москва, 2011), XXI Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Гурзуф, 2013).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано научных работ, в том числе 3 – в научных изданиях, рекомендованных ВАК, получен 1 патент РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 147 страницах основного текста, содержит таблиц, 24 рисунка, 2 приложения на 43 листах, список литературы включает наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность, научная новизна, практическая значимость работы и положения, выносимые на защиту.

В первой главе «Обзор литературы» проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы, дана общая характеристика мидий, основные направления использования мидий и гидролизатов мидий в профилактическом и лечебном питании, а также новые пищевые источники органических форм эссенциальных микроэлементов на основе ферментолизата мяса мидий. На основании проведенного анализа литературных данных сформулирована цель и определены основные задачи настоящего исследования.

Во второй главе «Объекты, методология и методы исследований». В результате анализа трудов, касающихся методологических и методических аспектов разработки технологии ферментативного гидролизата из мяса мидий, предназначенного для создания пищевых продуктов, в том числе обогащенных эссенциальными микро- и макроэлементами, была разработана программноцелевая модель исследований (рисунок 1).

Объектами исследований являлись варено-мороженое мясо мидий Mitylus Chilensis, ферментные препараты «Флавоэнзим», «Протозим», «Панкреатин», образцы ферментолизатов мяса мидий (ФММ), комплекса ферментолизата мяса мидий с цинком, кислотные гидролизаты из мяса мидий, а также мидийный соус и мидийный соус, обогащенный цинком.

Анализ научно-технической и патентной литературы Разработка нутриентно-технологических рекомендаций к созданию ферментолизата мяса мидий и комплекса ферментолизата мяса мидий с цинком Разработка и оптимизация процесса ферментативного гидролиза мяса мидий партии ферментолизата рекомендаций к созданию мидийного соуса и мяса мидий и комплекса мидийного соуса, обогащенного цинком, на основе ферментолизата мяса ферментолизата мяса мидий и комплекса с цинком полупромышленных Разработка и утверждение технической документации Рисунок 1 – Программно-целевая модель исследований В работе использовали стандартные и модифицированные в процессе исследования химические, физико-химические, органолептические, микробиологические и биологические методы.

Массовую долю сухих и минеральных веществ (золы), аминного азота, поваренной соли определяли в соответствии с ГОСТ 7636. Значение pH определяли на pH-метре Мультитест ИПЛ-101-1 фирмы НПП «СЕМИКО», а вязкость соусов – на вискозиметре фирмы Brookfield DV-II Pro Viscometer.

анализаторе «Kjeltec» модель 2300 (фирма Tecator, Швеция) по методу Кьельдаля, липидов - с помощью автоматического экстрактора Сокслет фирмы VELPSER 148/6 c использованием диэтилового эфира.

Определение аминокислотного состава белка сырья, ферментолизатов и мидийных соусов проводили совместно с сотрудниками МГУ им.

М.В.Ломоносова на анализаторе ААА-835 фирмы «Hitachi» с последующей компьютерной обработкой данных по программе Мультихром для Windows;

триптофана - по методу Фюрта совместно с сотрудником ФГБУ «НИИ питания»

РАМН Ю.С. Сидоровой. Содержание микро- и макроэлементов определяли в АНО «Центр биотической медицины» на квадрупольном масс-спекрометре Elan 9000 (Perkin, США), согласно МУК 4.1.1482.

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе тестируемых образцов оценивали совместно со старшим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН С.Н. Зориным, методом эксклюзионной хроматографии среднего давления на колонке Superose 12 (1,6х50 см), («Pharmacia», Швеция), используя в качестве элюента 0,2М раствор NaCL+азид натрия, с детектированием фракций при длине волны 280 нм на проточном УФдетекторе UV-1. Хроматограммы интегрировали весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Оценку радиозащитной и гемостимулирующей активности ферментолизата и комплекса с цинком проводили в ФГБУ «МРНЦ» (г. Обнинск) в опытах на мышах-гибридах по утвержденным в 1975 г «Методическим рекомендациям по вопросам определения численности кроветворных колониеобразующих единиц (КОЭ) с помощью тестов экзогенных и эндогенных селезеночных колоний».

Показатели биологической ценности мяса мидий и ферментолизата мяса мидий определяли в опытах in vivo совместно с сотрудниками лаборатории физиологии и биохимии пищеварения ФГБУ «НИИ питания РАМН». Биологическую ценность определяли по методу оценки коэффициента эффективности белка (КЭБ) и методу истинной усвояемости пищевых белков.

Комплекс с цинком получали путем инкубации водного раствора хлорида цинка с аминокислотами и пептидами ферментолизата мяса мидий в соотношении масса хлорида цинка к массе азота в составе ферментолизата, умноженного на коэффициент 6,25 («азот*6,25»)=1:10 при рН=7,0, и последующей нанофильтрацией.

Полученные результаты исследований обрабатывали с использованием методов математической статистики. Повторность опытов и анализов – трехкратная. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с использованием компьютерных программ при доверительной вероятности 95%.

В третьей главе «Разработка технологии ферментолизата мяса мидий и комплекса ферментолизата мяса мидий с цинком» приведены нутриентнотехнологические рекомендации к созданию ферментолизата мяса мидий и комплекса ферментолизата мяса мидий, обогащенного органической формой цинка, обоснование выбора сырья, ферментного препарата, а также рациональных режимов ферментативного гидролиза мяса мидий, отработка технологии ферментативного гидролиза мяса мидий и комплекса с цинком в полупромышленных условиях и характеристика биологической ценности ферментолизата мяса мидий в опытах in vivo.

радиорезистентными свойствами могут обладать пептиды, образующиеся при гидролизе мяса мидий [Абрамова Л.С. и др., 2011]. Для проверки этого предположения, то есть для сравнительной оценки радиорезистентных свойств пептидов различной молекулярной массы (мол. масса) нами проведен модельный эксперимент: коммерческий препарат «МИГИ-К ЛП» с помощью мембранной фильтрации разделен на высокомолекулярную пептидную фракцию (мол. масса больше 3,6кДа) и суммарную фракцию короткоцепочечных и среднецепочечных пептидов (мол. масса меньше 3,6кДа), далее называемой низкомолекулярной. Как видно из таблицы 1, низкомолекулярная фракция состояла на 95% из пептидов с молекулярной массой менее 3,6кДа, и обладала высокой радиозащитной и гемостимулирующей активностью, в то время как в исходном образце «МИГИ-К ЛП» суммарное содержание пептидов с массой менее 3,6кДа было практически в два раза меньше, что привело к снижению активности.

Таблица 1 – Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций «МИГИ-К ЛП» и оценка их радиорезистентных свойств Наименование показателя Диапазон молекулярных Средняя масса селезенки Среднее количество эндоколоний, (М+t) Примечание: * р < 0,05 значимое различие с образцами 2 и 3.

Таким образом, высокие значения радиозащитной и гемостимулирующей активности для фракции низкомолекулярных пептидов определили основной показатель нутриентно-технологических рекомендаций при создании ферментолизата мяса мидий и его комплекса с цинком: содержание пептидных фракций с молекулярной массой менее 3,6кДа в ферментолизате должно составлять не менее 45%.

Обоснование выбора сырья. Для получения ферментолизата мяса мидий и его комплекса с цинком использовали варено-мороженое мясо мидий Mitylus Chilensis, выращенных в условиях марикультуры.

Изучение пищевой и биологической ценности мяса мидий Mitylus Chilensis показало, что анализируемое сырье содержало 15% белка, полный набор незаменимых и заменимых аминокислот, 2% липидов с высоким уровнем эссенциальных жирных кислот, 3% углеводов и практически не отличалось по исследуемым показателям от мяса мидий M. galloprovincialis и Mytilus edulis, выращенных в естественных условиях. Это позволило сделать заключение о целесообразности использования мяса мидий Mitylus Chilensis, в качестве сырья, для получения ферментолизата мяса мидий, его комплекса с цинком и обогащенных пищевых продуктов на их основе.

ферментолизата мяса мидий с высоким содержанием низкомолекулярных фракций использовали ферментные препараты: «Флавоэнзим» (Novozymes, Дания), «Панкреатин» (Pancreatin, Германия), «Протозим» (ЕНЗИМ, Украина).

Ферментолиз проводили по одностадийной и двухстадийной схеме, основные параметры процесса ферментолиза представлены в таблице 2.

Таблица 2– Основные параметры процесса ферментолиза Наименование Оптимум Протеолитическая Продолжительфермента, % «Флавоэнзим»

«Панкреатин»

«Панкреатин»

«Флавоэнзим»

Примечание - ферментолиз проводили при температуре 50C и концентрации мяса мидий в смеси 5% по сухим веществам.

Полученные ферментолизаты мяса мидий характеризовали по выходу ферментолизата мяса мидий относительно массы исходного сырья, по содержанию общего азота в их составе (таблица 3), а также по молекулярномассовому распределению пептидных фракций (таблица 4).

Таблица 3 – Выход ферментолизатов мяса мидий и содержание в них азота Таблица 4 – Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций ферментолизата мяса мидий молекулярных масс,