На правах рукописи

ЛЫСЕНКОВА Антонина Сергеевна

ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТОГЕМАТИЧЕСКОГО

БАРЬЕРА ЛЕГКИХ У СОБАК

ПРИ ДИРОФИЛЯРИОЗЕ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь – 2013

Работа выполнена в Государственном научном учреждении СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Новочеркасск)

Научный руководитель: Ермаков Алексей Михайлович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Квочко Андрей Николаевич доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», заведующий кафедрой физиологии, хирургии и акушерства Дерезина Татьяна Николаевна доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», заведующая кафедрой внутренних незаразных болезней, патофизиологии, клинической диагностики, фармакологии и токсикологии

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится «05» апреля 2013 года в 1330 часов на заседании диссертационного совета Д.220.062.02 при ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по адресу: г. Ставрополь, пер.

Зоотехнический, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по адресу: г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12.

Автореферат разослан «_» 2013 года и размещен на сайтах: ВАК Минобразования и науки РФ http://vak.ed.gov.ru «_» _ 2013 г., ФГБОУ ВПО «Ставропольский ГАУ»:

http://www.stgau/ru «_»_ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Дьяченко Юлия Васильевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные данные по эпидемиологии дирофиляриоза позволяют говорить о широком распространении этого заболевания в различных странах мира, включая Россию. Ареал распространенности занимает по климатогеографической зоне широты от 41 до 58 град. северной широты (М.В. Сухова, 2002; В.Б. Ястреб, 2009). В России дирофиляриоз обнаружен в 39 субъектах (М.В. Сухова, 2002; А.Ю.

Медведев, 2007; А.Ю. Аракельян, 2008; Ю.Г. Бескровная, 2009; А.С. Журавлев, 2009; В.Б. Ястреб, 2009; Т.Н. Сивкова, 2010; Н.В. Ярошенко, 2010). Распространению заболевания способствуют усиливающиеся миграционные процессы человека и животных, высокая приспособляемость зоонозов к новым условиям обитания, отсутствие должных санитарноэпидемиологических мероприятий и др. По данным Суховой М.В. (2002), в Волгоградской области ежегодный прирост заболеваемости дирофиляриозом среди животных составляет 16%. Эта ситуация создает риск распространения заболевания как среди животных, так и среди людей. Так, в период с 1999 по 2003 год дирофиляриоз у человека выявлен в 150 случаях (Е.В. Михайлова, 2008; Ю.Г. Бескровная, 2009). Случаи дирофиляриоза зафиксированы у жителей в Московской, Тульской областей, Алтайского края, Тюмени, Нижнего Поволжья, Краснодарского края и других регионов (Т.И. Авдюхина, В.Г. Супряга, В.Ф. Постнова, 1997; Н.А. Азарова, В.П. Прейдер, 1999; Л.И. Карпук и др., 2000; В.В. Гуськов и др..

2001; А.В. Ушаков, Т.Ф. Степанова, А.С. Стругова, 2002; А.М. Бронштейн, В.Г. Супряга и др., 2003; М.В. Григорьев, Е.В. Дворовенко, 2003).

К 2004 году в России отмечено уже 300 случаев дирофиляриозной инвазии у человека (В.Г. Супряга и др., 2004; С.А. Нагорный, В.В. Карташов, А.А. Артамонова, Ю.Г. Бескровная, 2005).

Авторы указанных исследований утверждают, что эти данные не отражают настоящей ситуации, так как много случаев остается неучтенными. Вполне очевидно, что при сохранившихся тенденциях заболеваемость дирофиляриозом будет увеличиваться. В научной литературе продолжают появляться сообщения об обнаружении дирофиляриоза у человека (Р.С. Арекельян с соавт., 2011; Н.Е. Белова, 2012; М.Г. Тухбатуллин, Р.Ф. Гайнутдинова, 2012).

Экономическая сторона данной проблемы заключается в том, что заболевание имеет выраженную тенденцию к распространению среди специальных групп собак (питомники силовых структур), на подготовку которых затрачиваются значительные средства (Н.В. Серебрякова, А.М.

Ермаков, И.В. Колодий, 2008).

Локализация паразита Dirofilaria immitis в малом круге может проявляться в виде пневмонии либо сопровождаться клиникой тромбоэмболии малого круга кровообращения (П.В. Колесников, 2009; И.В. Колодий, 2009). Проявления могут быть выраженными, а могут протекать бессимптомно. Так, по данным Ястреба В.Б. (2009), тяжелое течение отмечено в 37,7 % случаев, средней степени тяжести – в 29,8%, а бессимтомное – в 32,5 % случаев.

Изучение малого круга кровообращения и легких ранее проводилось отдельными отечественными учеными (П.В. Колесников, 2009).

Была описана клиническая картина острой эозинофильной пневмонии, тромбоэмболии легких при дирофиляриозе. Однако, при всей очевидности патогенеза этих поражений, остается много нерешенных вопросов.

В частности, не изучены более глубокие механизмы поражения легочной ткани, эндотевлия и сурфактантной системы. Интерес к этим проблемам обусловлен несколькими причинами. В последнее время стало известно, что один из компонентов сурфактантной системы, в частности, белок-D (SP-D) играет существенную роль в местной иммунной защите легких от различного рода инфекций (А.Е. Абатуров, 2011; 2012;

Clark, Reid, 2002; 2003; Whitsett, 2002; Wu, Kuzmenko, Wanetal., 2003).

Была выявлена способность данного белка определять выраженности иммунного ответа и степень активации воспалительного процесса легочной ткани (Crouch, Wright, 2001; Kishoreetal., 2005; Hartl, Griese, 2005). Изучение данного компонента сурфактантной системы легких в условиях заражения дирофиляриозом представляет научный и практический интерес.

В последние годы в генезе многих заболеваний, включая и неинфекционные, большое значение придается поражению или дисфункции эндотелия (О.А. Гомазков, 2001; Т.Ю. Калюта, О.Е. Царева, А.Д. Трубецков и др. 2005; А.И. Ковалев, Г.И. Марцинкевич, Т.Е. Суслова, А.А.

Соколов, 2004; Р.Г. Оганов, Г.В. Погосова, 2007; О.В. Костенко, 2008;

Coats, 2004). С учетом того, что эндотелий представляет собой важнейший компонент аэрогематического барьера легких является актуальной задачей исследование его функций при дирофиляриозе у собак.

Современное состояние данного вопроса и вышеназванные предпосылки определили выбор темы нашего исследования.

Объект исследования: породные и беспородные собаки обоих полов в возрасте от 1 до 12 лет, инвазированные D.immitis собаки, кровь, легкие павших животных.

Предмет исследования – механизмы и маркеры повреждения гистогематического барьера легких собак с дирофиляриозом.

Научная гипотеза. Размножение и развитие дирофилярий в сосудах малого круга кровообращения сопровождается продукцией ими биологически активных соединений, запускающих каскад реакций, характеризующихся повреждением структуры и функции гистогематического барьера легких. Используя современные маркеры, можно показать и предположить роль отдельных факторов в механизме повреждения легких при дирофиляриозе у собак.

Цель исследования: изучить функциональное и морфологическое состояние гистогематического барьера легких и его отдельных компонентов у собак при дирофиляриозе.

Задачи исследования:

1. Изучить функциональное состояние гистогематического барьера легких у здоровых и больных дирофиляриозом собак по отношению к белку-D сурфактанта легких (SP-D) в зависимости от возраста, пола и породы собак.

2. Оценить функциональное состояние эндотелия у здоровых и больных дирофиляриозом собак в зависимости от возраста, пола и породы собак.

3. Сопоставить особенности морфологических изменений с функциональным состоянием гистогематического барьера легких у собак с дирофиляриозом.

4. Дать комплексную функционально-морфологическую оценку аэрогематического барьера легких у больных дирофиляриозом собак.

Научная новизна. Впервые получена функциональная и морфологическая характеристика аэрогематического барьера легких у здоровых и инвазированных дирофиляриозом собак. Получены данные о дисфункции эндотелия, характеризующиеся в уменьшении синтезирующей функции по отношению к фактору Виллебранда при хроническом течении заболевания. Впервые получены данные о резистентности аэрогематического барьера по отношению к белку-D (SP-D) сурфактанта легких. Выявлены возрастные и половые особенности резистентности аэрогематического барьера легких по отношению к белку-D сурфактанта легких у здоровых и больных дирофиляриозом собак. Установлено, что при остром и хроническом течении воспаления в легких резистентность барьера по отношению к белку-D закономерно изменяется. В патоморфозе определены фазы течения воспалительного процесса в легких при дирофиляриозе. Впервые проведены сопоставления морфологической картины легких и их метаболических функций по отношению к белку-D сурфактанта легких.

Теоретическая значимость. Заключается в обосновании использования маркера белка-D сурфактанта для оценки состояния гистогематического барьера легких и степени его повреждения. Полученные данные о динамике изменений концентрации белка-D и фактора Виллебранда являются новыми элементами патогенеза органных повреждений, в частности, легких при дирофиляриозе.

Практическая значимость. Полученные данные по концентрации белка-D и фактора Виллебранда у здоровых и больных собак разного пола и возраста могут служить в качестве нормативных и критериальных показателей в лабораторной диагностике поражения легких.

Имеющиеся доказательства наличия дисфункции эндотелия и ослабления местной иммунной защиты легких диктуют необходимость разработки и применения коррекции указанных нарушений. Дополнительные сведения о патогенезе поражения легких и развитии гипоксии при дирофиляриозе у собак могут быть использованы в научно-педагогической практике ветеринарных и биологических факультетов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Течение дирофиляриоза у собак сопровождается изменениями функциональных и морфологических характеристик гистогематического барьера легких, нарушением обмена белка-D в легких, эндотелиальной дисфункцией, уменьшением дыхательной поверхности легких и последующим развитием гипоксии.

2. Резистентность гистогематического барьера легких по отношению к белку-D сурфактанта легких с возрастом, как у здоровых, так и больных дирофиляриозом собак, независимо от их породы, изменяется фазно и зависит от пола животного.

3. Проницаемость гистогематического барьера легких по отношению к белку-D и активность фактора Виллебранда зависят от характера и выраженности воспалительной реакции в легких и половой принадлежности животного.

Материалы исследования были обсуждены: на Международной конференции « Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, г.); Международной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, 2012 г.); Всероссийской конференции «Инновационные пути развития агропромышленного комплекса: задачи и перспективы» (Зерноград, 2012 г.); ХХ Всероссийской научно-практической конференции «Образование-наука-технологии» (Майкоп, 2012 г.); на межлабораторном совещании в Государственном научном учреждении «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук» (Новочеркасск, 2012); на Всероссийской научнопрактической конференции «Научное обеспечение устойчивого развития отрасли животноводства Российской Федерации» (Новочеркасск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных статей, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении морфологической части работы консультативную помощь оказывал кандидат медицинских наук, доцент Г.В. Левин.

Реализация результатов исследований. Полученные показатели концентрации белка-D и фактора Виллебранда у собак внедрены в диагностических лабораториях Научно-исследовательского института Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону), ГБУ «Бузулукское районное управление ветеринарии», «Медицинский центр профилактической медицины» (г. Астана, Казахстан); в учебный процесс и иммуногенетическую лабораторию ГБОУ ВПО Адыгейского государственного университета, в преподавание дисциплины «Паразитология и инвазивные болезни животных» аграрного факультета Российского университета дружбы народов. Полученные данные по механизмам повреждения легких при дирофиляриозе у собак могут использоваться в учебном процессе по специальностям «Биология», «Ветеринария» и «Зоотехния».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка. Материал изложен на 120 страницах, иллюстрирован 25 рисунками и микрофотографиями, 24 таблицами. Библиографический список включает в себя 228 наименований, из них 75 отечественных и 153 зарубежных автора.

Материал и методы исследования.

Всего обследовано 113 собак из специализированных питомников силовых структур г. Ростова-на-Дону, Краснодара и службы по отлову животных г. Бузулука (табл. 1). Из указанного количества прижизненно у 101 собаки (37 здоровых и 64 больных собак) исследовали концентрацию в крови белка-D сурфактанта легких и фактора Виллебранда. Возраст собак составил от 1 до 12 лет. Из этой группы 19 собак с дирофиляриозом были эвтаназированы по показаниям и на вскрытии у них обнаружены зрелые дирофилярии в сердце и легочных артериях; 12 здоровых собак, погибших от автотравмы, служили контролем при исследовании гистологической картины легких.

Для функциональной характеристики аэрогематического барьера был выбран белок-D (SP-D) сурфактанта легких. Выбор обусловлен тем, что этот белок обладает двойственными характеристиками. С одной стороны, обладая гидрофильностью, белок обеспечивает адекватную степень увлажнения сурфактанта и ряд других его физических характеристик. С другой стороны, белок-D обеспечивает защиту респираторного тракта от инфекционных агентов (А.Е. Абатуров, 2011; Jounblat et al., 2004; Hartl, Griese, 2006; Kishore et al., 2006).

Учитывая, что метаболизм сурфактанта происходит на уровне альвеолярного пространства (Clark, Reid, 2003), появление компонентов сурфактанта в крови может свидетельствовать о снижении резистентности аэрогематического барьера легких.

Определение концентрации SP-D осуществляли иммуноферментным методом (автоматический иммуноферментный анализатор "Alisei", Италия) с использованием тест-наборов для собак фирмы «Cusabio»

(КНР). Концентрация белка выражалась в нг/мл.

Другой маркер – фактор Виллебранда (WF) был выбран по следующим причинам. Данный фактор синтезируется мегакариоцитами и преимущественно эндотелием (А.И. Грицюк, Е.Н. Амосова, И.А. Грицюк, 1995;

В.В. Долгов, П.В. Свирин, 2005). С учетом этого интенсивность синтеза данного фактора в основном определяется функциональным состоянием мегакариоцитов и эндотелия (З.С. Баркаган, 2000; Ф.Дж. Шиффман, 2000).

Для определения фактора Виллебранда использовался иммуноферментный метод и тест-наборы для собак фирмы «Cusabio» (КНР).

Анализы выполнены в аккредитованной лаборатории НИИ биологии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону).

Клиническое обследование здоровых и больных животных проводили по общепринятой методике с последующим занесением результатов в соответствующие протоколы и истории болезни. У животных из подкожной вены предплечья, латеральной вены сафены утром натощак брали кровь, которую затем исследовали на наличие микрофилярий методом насыщенного (обогащенного) мазка по Knott и иммунохроматографическим методом (Canine SNAP 4Dx, IDEXX) для качественного выявления специфических антигенов Dirofilaria immitis.

Для гистоморфологического исследования кусочки легких фиксировали в нейтральном формалине и заливали в парафин (Б. Рамейс, 1954), после чего изготавливались микросрезы толщиной 5-6 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин и эозином (М.С. Роскин, 1955).

Для количественной оценки выраженности патологического процесса использовалась морфометрическая методика Г.Г. Автандилова (1990).

Для оценки дыхательной поверхности легких был введен индекс А/МАсоотношение площадей альвеол к площади альвеолярного пространства.

Таблица 1 - Экспериментально-клинический материал и методы исследования Изучение морфологической картины легких у здоровых собак, погибших от автотравмы Изучение морфологической картины легких у больных дирофиляриозом собак Исследование концентрации белка-D сурфактанта легких у здоровых собак разных пород Исследование фактора Виллебранда у здоровых собак разных пород Исследование концентрации белка-D сурфактанта легких у больных дирофиляриозом собак разных пород Исследование концентрации фактора Виллебранда у больных дирофиляриозом собак разных пород Идентификация дирофиляриоза методом обогащенной капли по Knott Идентификация дирофилярий иммунохромотаграфическим методом Статистическую обработку проводили с помощью методов вариационной статистики, корреляционного анализа по Спирмену, точного критерия Фишера и Хи-квадрат с использованием стандартной компьютерной программы «Biostat». Различия считались достоверными при р0,5).

Таблица 2 - Сравнительный анализ содержания белка-D (SP-D) сурфактанта в плазме крови (нг/мл) здоровых и больных