На правах рукописи

ДОАН ТХУ ТХУЙ

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ

РЕДКИХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (EUONYMUS NANA Bieb.,

DIOSCOREA NIPPONICA Makino., DIOSCOREA CAUCASIA Lipsky. и

ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS Kom.)

Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева»

доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Калашникова Елена Анатольевна

Официальные оппоненты: Аладина Ольга Николаевна доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева», профессор на кафедре плодоводства Васильева Ольга Григорьевна кандидат биологических наук, Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, лаборатория биотехнологии растений, младший научный сотрудник Всероссийский научно-исследовательский

Ведущая организация:

институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита диссертации состоится «13» марта 2013 года в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу:

127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс: (499) 976-24-92, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «12» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии, в частности широко применяемый метод клонального микроразмножения, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество растений при недостатке исходного материала, а также получать потомство, генетически идентичное исходному виду или форме. Стратегия сохранения биоразнообразия отражена в различных нормативных документах, таких как «Национальная стратегия по сохранению биоразнообразия России» (2001) и «Стратегия ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений» (2003). Задачами этих программ являются: формирование единого банка данных; инвентаризация редких видов и разработка системы критериев для их выявления и определения уровня их охраны; изучение биологических особенностей редких видов и механизмов действия на них лимитирующих факторов; разработка биологических принципов и способов сохранения редких видов; разработка единых методик работы с редкими и исчезающими видами растений при проведении популяционных исследований, интродукции и культивирования in vitro.

К редким растениям относятся, например, диоскорея ниппонская, диоскорея кавказская, бересклет карликовый, а также кирказон манчьжурский, которые занесены в Красную Книгу РФ. Кроме того, диоскорея является ценной лекарственной культурой, богатой биологически активными веществами, в частности, диосгенином, который накапливается в различных тканях и органах этих растений, и обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость растений к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды и др. Данные культурные растения являются богатством России, которое необходимо сохранять для будущих поколений. Поэтому разработка методологических подходов по сохранению изучаемых видов растений является актуальной проблемой.

Цели и задачи исследования. Целью работы - оптимизация условий культивирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Kom. и разработка технологии их клонального микроразмножения.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:

• отработать методику по получению хорошо растущей стерильной культуры изолированных эксплантов Euonymus nana и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis;

• оптимизировать состав питательной среды для культирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus nana и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis;

• изучить влияние нетрадиционных регуляторов роста Дропп и Цитодеф, а также препарата Мицефит на морфогенетическую активность изолированных эксплантов;

• изучить влияние условий культивирования на суммарное содержание растворимых фенольных соединений в разных типах пересадочной • изучить локализацию фенольных соединений в тканях растений in vivo и Научная новизна работы. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонскои и кирказона маньчжурского. Впервые установлены особенности размножения в условиях in vitro исследуемых видов, занесенных в Красную книгу РФ.

Показано, что для бересклета карликового и кирказона маньчжурского размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем, а для диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской – за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов и в пазухе листа.

Впервые изучено влияние нетрадиционных для культуры in vitro регуляторов роста Дропп, Цитодеф и Мицефит на морфогенетическую активность изолированных органов и пересадочной культуры изучаемых видов.

Установлено, что присутствие в составе питательной среды препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов или микроклубней, и увеличивало коэффициент размножения. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации 10 -6 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядка, а также активизировался процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.

Впервые на растениях диоскореи ниппонской и кавказской, бересклета карликового и кирказона маньчжурского изучено содержание растворимых фенольных соединений и их локализация в тканях интактных растений, микроклонах и каллусной культуре. Установлены особенности их накопления в зависимости от первичного экспланта и условий культивирования.

Практическая значимость работы. Усовершенствованные технологии клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской могут быть применены для сохранения и создания коллекции in vitro данных видов. Для ускорения процесса размножения in vitro редких, лекарственных и исчезающих растений рекомендуется применять препарат Мицефит в концентрации 10-6 мг/л.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Сельскохозяйственная биотехнология», «Основы биотехнологии», «Прикладная биотехнология» для студентов агрономических специальностей.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Особенности размножения в условиях in vitro Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Kom.

2. Эффективность применения препаратов Дропп, Цитодеф и Мицефит при клональном микроразмножении изучаемых видов 3. Закономерности в синтезе растворимых фенольных соединений и их локализация в тканях интактных растений, микроклонах и каллусной ткани.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: 11-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА (Москва. 2011); II Международной школе-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях»

(Звенигород, 2011); Международной научной конференции молодых ученых РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012); Юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси» (Минск, 2012);

Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012).

Личный вклад автора. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены лично автором на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Автор принимал непосредственное участие в разработке программы исследований, планировании и проведении экспериментов по изучению особенностей клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонской и кирказона маньчжурского in vitro. Результаты диссертационной работы обобщены совместно с научным руководителем, д.б.н. Е.А. Калашниковой.

Соискателем лично написан литературный обзор и оформлена диссертационная работа.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 2 в журналах из списка ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов и библиографического списка. Общий объем рукописи 135 стр., содержит 15 таблиц, 52 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 203 источника, в том числе 135 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в период с 2010 по 2013 г.

Материалом для работы служили растения бересклета карликового (Euonymus nana Bieb.), диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica Makino.), диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia Lipsky.) и кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.), пересаженные из природных условий на участок редких и исчезающих растений Главного ботанического сада РАН (Москва). В качестве эксплантов использовали боковые и верхушечные почки, листовые пластинки, многолетние клубни (диоскорея) и семена (диоскорея и кирказон).

Стерилизацию растительных эксплантов проводили по схеме: 1) обработка KMnO4 – 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы - 7 мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой.

Для индукции образования пазушных побегов, адвентивных почек и микроклубней первичные экспланты культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасиге и Скуга, а также различные вещества с цитокининовой и ауксиновой активностью. В качестве цитокининов изучали влияние БАП, 2iр, кинетина в концентрациях от 0,5 до 1, мг/л, а также препаратов Дропп (0,01-1,0 мг/л) и Цитодеф (0,01-1,0 мг/л), и препарата Мицефит (10-4 – 10-7 мг/л). Из веществ с ауксиновой активностью изучали влияние НУК (0,5-1,0 мг/л), ИМК (1-7 мг/л), ИУК (1-7 мг/л) и 2,4-Д.

Препарат Мицефит во всех экспериментах добавляли в питательную среду после ее автоклавирования. Стерильный раствор препарата Мицефит получали путем пропускания его через стерильный фильтр с диаметром пор 0,45мµ. В экспериментах испытание препарата Мицефит проводили отдельно, а также в сочетании с регуляторами роста БАП, 2ip и Дропп. Уровень рН питательной среды доводили до 5,7 – 6,0.

Экспланты культивировали при температуре 240С, 16-ти часовом фотопериоде, при освещении белыми люминесцентными лампами интенсивностью 3 тыс. лк.

Для укоренения микропобегов использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую нормы макросолей, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, а так же ИУК в концентрации 1 мг/л.

Адаптацию растений проводили в контейнерах, содержащих проавтоклавированный субстрат.

Биохимические и морфофизиологические исследования.

Определение суммы растворимых фенольных соединений в интактных растениях, микроклонах, микроклубнях и каллусных культурах проводили по методике М.Н. Запрометова (1971, 1993). Клетки растений или каллусную ткань экстрагировали 96%-ным этанолом в течение 1 часа. Для определения содержания суммы растворимых фенольных соединений к 0,5 мл этанольного экстракта в мерной пробирке добавляли 3 мл дистиллированной воды и перемешивали. После этого прибавляли 0,5 мл реактива Фолина-Дениса, перемешивали и через 3 мин приливали 1 мл насыщенного раствора соды, и доводили общий объем до 10 мл дистиллированной водой. Через 1 час определяли содержание суммы соединений при длине волны 725 нм на спектрофотометре.

Содержание флаванов определяли с 1%-ным раствором ванилина в 70% серной кислоте при 500 нм (Swain, Hillis, 1959; Запрометов, 1971).

Калибровочные кривые строили по (-)-эпикатехину.

Содержание флавонолов определяли по реакции с 1%-ным водным раствором AlCl3 c последующим спектрометрированием при 415 нм (Gage, Wendei,1950). Калибровочную кривую строили по рутину.

Для определения тканевой локализации фенольных соединений использовали 0,08% раствор реактива «Fast- Blue» в фосфатном буфере (рН = 6,5) и 0,01% ванилиновый реактив в хлороформе (Soukurova,2000; Приступа и др., 1970; Зайцева, 2007). Препараты анализировали при помощи светового микроскопа Carl Zesis (Германия) и фотодокументировали.

Статическая обработка данных. Математическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики (Доспехов,1985; Смиряев, Кильчевский, 2007).

Дисперсионный анализ проведен с использованием программы MS ECXEL.

Эксперименты проводили в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях. На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской и ниппонской и кирказона маньчжурского микроразмножения: 1) активация развития существующих в растении меристем; 2) индукция образования адвентивных почек из тканей первичного экспланта; 3) регенерация растений из каллусной ткани. Изучали влияние традиционных для культуры in vitro регуляторов роста (БАП, 2ip, ИУК, НУК) на изучаемые морфогенетические процессы на всех этапах клонального микроразмножения.

1. Бересклет карликовый (Euonymus nana Bieb.) На первом этапе микроразмножения необходимо было отработать методику по получению хорошо растущей стерильной культуры.

Экспериментально нами установлено, что оптимальным режимом стерилизации оказалась ступенчатая стерилизация: 1) обработка KMnO4 – 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой. При этом максимальное число жизнеспособных эксплантов составило 78%, минимальное число инфицированных - 12% и некротизированных эксплантов - 10%. В остальных вариантах число жизнеспособных эксплантов было незначительным и составило в среднем от 5 до 23%.

Известно, что коэффициент размножения, а также морфометрические показатели сформировавшихся побегов находятся под контролем гормонального состава питательной среды. Нами установлено, что присутствие в составе среды БАП в концентрации 1 мг/л в сочетании с НУК 0,5 мг/л приводило к формированию в среднем от 2 до 3 побегов на один эксплант, которые характеризовались активным ростом, в то время как в других вариантах эти учитываемые показатели не превышали 1,5-2,3 и 1,2 – 1,5 см, соответственно (Рис. 1).

Дальнейшее культивирование микропобегов бересклета на оптимальной среде приводило к стабильному формированию хорошо растущих побегов и среднему коэффициенту размножения.

Другой используемый прием клонального микроразмножения - индукция образования адвентивных почек из тканей первичного экспланта. В нашем опыте в качестве первичного экспланта была взята листовая пластинка, изолированная с растений in vitro. Экспериментально установлено, что сочетание кинетина (0,2 мг/л) с НУК (4 мг/л) приводило к прямой регенерации растений из тканей листа. Причем в этом варианте учитываемый показатель был максимальный и составил 45,6% (Табл.1).

Влияние гормонального состава питательной среды на регенераионный потенциал изолированных листьев бересклета карликового Сформировавшиеся побеги (после 6 пассажей) в дальнейшем укореняли и переносили для адаптации в условия нестерильной культуры. Приживаемость растений составляла в среднем 86-92%.

2. Диоскорея кавказская (Dioscorеa caucasica Lipsky) и диоскорея ниппонская (Dioscorea nipponica Makino) В работе в качестве исходного материала были взяты растения in vitro, с которых изолировали сегменты стебля с одной или двумя пазушными почками, листовые пластинки, а также в качестве эксплантов изучали семена и изолированные зародыши. Экспланты культивировали на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей различные концентрации 2,4–Д, кинетина, БАП, НУК, сахарозу и агар. Установлено, что у обоих изучаемых в работе видов диоскореи процесс клонального микроразмножения осуществляется за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов или в пазухе листа, которые в дальнейшем использовали для клонирования. Причем формирование микроклубней происходило более интенсивно у диоскореи ниппонской по сравнению с диоскореей кавказской (Рис. 2), для которой не характерно в условиях in vivo формирование воздушных корней. Наилучшей была среда, содержащая 2ip 1 мг/л в сочетании с НУК 1 мг/л.

В дальнейшем полученные микроклоны переносили на среды для укоренения с ИУК или ИМК. Установлено, что присутствие в составе питательной среды ИУК в концентрации 3-5 мг/л приводило к формированию в 95% случаях хорошо развитой корневой системы. Это позволило микрорастениям хорошо переносить адаптацию к нестерильным условиям выращивания.

Поскольку диоскорея относится к исчезающим видам и имеет ограниченный ареал распространения в природе, то большое практическое значение приобретает получение ей каллусных и суспензионных культур, как возможных источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Для инициации каллусных культур использовали изолированные зародыши, сегменты стебелей и листьев, а также фрагменты клубней, полученные с растений диоскореи кавказской и ниппонской in vitro и in vivo.

Установлено, что процесс каллусогенеза зависит от типа первичного экспланта и гормонального состава питательной среды. Так, каллусная ткань, полученная из изолированных зародышей, характеризовалась плотной консистенцией и имела белый или светло-желтый цвет. Причем на среде, содержащей 2,4-Д, этот процесс происходил с максимальной интенсивностью.

При последующих пассажах пролиферативная активность каллусных клеток не снижалась.

Иная картина наблюдалась при использовании в качестве первичного экспланта изолированных сегментов клубней. В этих вариантах формирование каллусной ткани происходило в местах поранения и, в частности, в периферийной зоне экспланта. Каллусная ткань была средней консистенции и состояла из глобулярных структур, которые имели светло-зеленую окраску.

Присутствие в составе питательной среде 2,4-Д и кинетина в концентрации мг/л и 0,1 мг/л, соответственно, приводило к более интенсивному формированию каллусной ткани по сравнению со средой, содержащей 2,4-Д.

Отмечено, что при использовании в качестве первичного экспланта сегментов, изолированных с клубней in vivo, формирование каллусной ткани происходило в 5 % случаев, в то время как при использовании сегментов, полученных из клубней in vitro, учитываемый показатель составил 72%. Возможно, это связано с накоплением в первичных эксплантах фенольных соединений.

При культивировании изолированных сегментов стеблей и листьев формирование каллусной ткани не было отмечено нами ни в одном из испытанных вариантов сред.

3. Кирказон маньчжурский (Aristolochia manshuriensis Kom.) Как и в предыдущих исследованиях с растениями диоскореи и бересклета для кирказона маньчжурского были изучены условия культивирования изолированных эксплантов на разных этапах клонального микроразмножения.

На первом этапе установлено, что оптимальным режимом стерилизации оказалась ступенчатая стерилизация: 1) обработка KMnO4 – 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой. При этом максимальное число жизнеспособных эксплантов составило 30%, минимальное числе инфицированных - 12% и некротизированных эксплантов - 58%. В остальных вариантах число жизнеспособных эксплантов было незначительным и составило 1 - 10%.

Нами установлено, что наиболее эффективным способом размножения кирказона маньчжурского в условиях in vitro оказался способ, основанный на активации развития существующих меристем (пазушных почек).

Экспериментально показано, что при культивировании микрочеренков на среде, содержащей 0,5 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК, наблюдалось наилучшее формирование микропобегов из пазушных почек. Такие микропобеги характеризовались быстрым ростом, правильной морфологией листа, а также были ярко-зеленого цвета. В базальной части микрочеренков наблюдали формирование рыхлой каллусной ткани желтого цвета, которая, вероятно, ингибировала развитие корневой системы. Кроме того, во всех вариантах отмечалось побурение среды, вероятно, из-за выделения фенольных соединений, несмотря на присутствие в ее составе активированного угля.

Поэтому через 2-3 пассажа сформировавшиеся микропобеги погибали. Все это свидетельствовало о том, что в отличие от растений бересклета и диоскореи, для растений кирказона необходимо проводить более детальные исследования.

В другой серии экспериментов с кирказоном маньчжурским был изучен морфогенетический потенциал изолированных зародышей, так как известно, что изолированные ткани и органы растений, находящиеся в ювенильной стадии развития, обладают большей морфогенетической активностью.

Исследования показали, что не более 10% изолированных зародышей обладали жизнеспособностью, которая проявлялась лишь в раскрытии семядольных листьев. Развития гипокотиля и корневой системы не наблюдали. При дальнейшем культивировании таких зародышей формирование проростка не происходило из-за его последующей гибели.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами были подобраны условия культивирования изолированных эксплантов, обеспечивающие клонирование бересклета карликового, диоскореи кавказской и ниппонской, а также кирказона маньчжурского. Однако полученные результаты свидетельствуют о невысоком коэффициенте размножения требуют проведения дополнительных исследований.

Изучение влияния нетрадиционных регуляторов роста на морфогенетическую активность изолированных эксплантов и пересадочной культуры бересклета, диоскореи и кирказона.

Существующие для травянистых растений традиционные методы клонального микроразмножения нельзя применять без серьезных корректировок для древесных пород. При размножении древесных растений in vitro встречается множество трудностей на всех этапах микроразмножения, начиная с получения стерильной культуры эксплантов, дальнейшего размножения и кончая этапом укоренения. Для кустарниковых пород, в частности, для бересклета карликового (Euonymus nana Bieb.) и многолетних лиан - диоскореи кавказской (Dioscorеa caucasica Lipsky), диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica Makino) и кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.) указанные трудности значительно усиливаются.

Формообразовательные процессы в условиях in vitro происходят при наличии в составе питательной среды биологически активных веществ, таких как регуляторы роста, аминокислоты, растительные экстракты и др. Однако применение традиционных, широко используемых в культуре веществ не всегда приводит к получению положительного результата. Поэтому поиск или создание новых отечественных высокоэффективных нетоксичных регуляторов роста остается актуальной проблемой в целом для сельского хозяйства, и для биотехнологии растений, в частности.

К таким веществам относится препарат Мицефит, а также вещества с цитокининовой активностью Дропп и Цитодеф.

Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на клональное микроразмножение бересклета, диоскореи и кирказона.

2. Бересклет карликовый (Euonymus nana Bieb.) Экспериментально установлено, что оптимальной средой на первом этапе клонального микроразмножения бересклета карликового была среда, содержащая препарат Цитодеф в изучаемых концентрациях (Табл. 2). В этих условиях наблюдали формирование на одном экспланте от 3 до 5 шт. побегов, которые развивались из существующих меристем первого и второго порядка, средняя высота которых составляла 2,3-2,5 см. (Рис. 3 а, б).

В вариантах, в состав которых входил 2iр развитие побегов второго порядка нами не было отмечено. Как правило, побеги формировались из существующих меристем первичного экспланта, и средняя высота этих побегов не превышала 2 см. (Рис. 3 в). В основании побега было отмечено формирование каллусной ткани средней интенсивности.

Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов бересклета карликового на этапе введения в культуру in vitro Варианты Количество побе- Высота побегов, см Формирование Примечание: «+» сильное образование каллусной ткани; «±» среднее образование каллусной ткани; «- » отсутствие образования каллусной ткани.

Особо следует отметить вариант питательной среды, в состав которой входил препарат Дропп. Уже на 14 сутки с начала культивирования было отмечено сильное формирование каллусной ткани не только в основании экспланта, но и по всей поверхности сегментов стебля, клетки которого из дифференцированного состояния переходили в дедифференцированное.

Следует отметить, что сформировавшаяся каллусная ткань отличалась позеленением на свету и имела плотную консистентность. Кроме того, в хорошо пролиферирующей каллусной ткани под действием препарата Дропп наблюдали массовое образование адвентивных почек, среднее число которых составило от 12 до 19 шт. на один эксплант (Рис. 3 г, д). Развитие адвентивных почек происходило медленно, и лишь через 4 недели было отмечено формирование укороченных побегов, размер которых не превышал 3 мм.

Таким образом, проведенные исследования позволили заключить, что на первом этапе клонального микроразмножения с целью формирования хорошо растущих побегов целесообразно включать в состав питательной среды препарат Цитодеф в концентрациях 0,5 – 1,0 мг/л, а для увеличения коэффициента размножения – Дропп 0,5 – 1,0 мг/л. Однако, данные концентрации приводили к незначительному росту побегов, что, вероятно, связано с применением данных препаратов в очень высоких концентрациях.

Исходя из литературных данных, исследуемые препараты применяются в более низких концентрациях, таких как 0,0001-0,01 мг/л. Поэтому в своей дальнейшей работе – на этапе микроразмножения - мы исследовали влияние препаратов Дропп и Цитодеф в концентрациях 0,01 мг/л.

Экспериментально установлено, что именно в низких концентрациях исследуемые препараты оказывали существенное влияние на индукцию образования адвентивных почек, их дальнейший рост и формирование хорошо развитых побегов (Рис. 4) по сравнению с контрольным вариантом. Кроме того, в этих вариантах наблюдали высокий коэффициент размножения, который составлял 12-26 растений с одного экспланта, в то время как в контрольном варианте этот учитываемый показатель составил 9.

Таким образом, установлено, что присутствие в составе питательной среды нетрадиционных для культуры in vitro препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов и увеличивало коэффициент размножения.

Экспериментально нами было показано, что сформировавшиеся побеги не были способны образовывать корни в процессе микроразмножения. Поэтому в следующей серии экспериментов нами было изучено влияние веществ ауксинового типа действия (ИУК и ИМК) на процесс ризогенеза. Причем, действие данных гормонов было изучено на фоне постоянного присутствия в питательной среде препарата Дропп в концентрации 0,01 мг/л. Установлено, что рекомендуемые в литературе для корнеобразования ауксины в наших экспериментах не оказали положительного действия, поэтому поиск новых методологических подходов и стимуляторов корнеобразования остается актуальной проблемой для бересклета.

2. Диоскорея кавказская (Dioscorеa caucasica Lipsky) и диоскорея ниппонская (Dioscorea nipponica Makino) Исследования показали, что гормональный состав питательной среды приводил к изменению морфофизиологических процессов, которые проявлялись: 1) в формировании каллусной ткани в основании первичного экспланта с одновременной регенерацией растений; 2) в индукции развития существующих в растении меристем; 3) в формировании микроклубней de novo.

Экспериментально установлено, что для диоскореи ниппонской и диоскореи кавказской из всех изучаемых цитокининов наибольшей стимулирующей активностью индуцировать образование клубней и побегов обладал препарат Дропп. В этих вариантах учитываемый показатель находился в пределах 3-4 шт., в то время как в вариантах с присутствием в питательной среде 2iр (контрольный вариант) или препарата Цитодеф частота образования клубней в среднем составила 1-2 шт. на один эксплант. Показано, что с увеличением концентрации препаратов в питательной среде (с 0,5 до 1,0 мг/л во всех вариантах) коэффициент размножения увеличивался, однако при этом наблюдали формирование мелких клубней и небольших по размеру побегов.

Наши исследования подтверждают данные, полученные ранее другими авторами (Чулафич, 1991; Грубишич и др., 1993; Орешников и др., 1994), что именно гормональный состав питательной среды оказывает существенное влияние на процесс формирования микроклубней, который зависит от исследуемого генотипа. Так, для диоскореи ниппонской было характерно формирование микроклубней двух типов: 1) у основания стебля, 2) воздушные клубни в пазухе листьев, в то время как у диоскореи кавказской формирование микроклубней, как правило, происходило у основания побега.

В исследованиях с диоскореей кавказской и диоскореей ниппонской были установлены некоторые закономерности: 1) из двух изучаемых видов наибольшей морфогенетической активностью обладала диоскорея кавказская, для которой было характерно во всех изучаемых вариантах образование от 2 до 4 шт. клубней, от 7 до 9 шт. корней, высота растений составила в среднем 5, см; 2) формирование клубней происходило в 97,3% случаев в основании побега; 3) коэффициент размножения зависел от исследуемого генотипа и гормонального состава питательной среды (Рис. 5).

Ср. количество микроклубней, шт Ср. количество побегов, шт Ср. количество корней, шт Рис. 5 Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на морфометрические показатели растений диоскореи кавказской (а) и диоскореи ниппонской (б) in vitro Однако исследования, проведенные на протяжении 5 месяцев культивирования, показали, что в процессе выращивания в условиях in vitro скорость формирования хорошо развитых побегов существенно уменьшалась, что проявлялось не только на высоте растений, но и на размерах индуцированных микроклубней, которые не превышали 1-2 мм по диаметру (Рис. 6). Поэтому в последующих экспериментах данные препараты были изучены в концентрации 0,01 мг/л.

Нами экспериментально и статистически доказано, что уменьшение концентрации препаратов Цитодеф и Дропп до концентрации 0,01 мг/л в питательной среде оказывает существенное положительное влияние на рост побегов и формирование микроклубней на протяжении длительного культивирования in vitro, причем концентрация 0,01 мг/л препарат Дропп была оптимальной для учитываемых показателей (Рис. 6), так как в этом Рис. 3 Формирование пазушных и адвентивных почек на среде МС, содержащей различные цитокинины: а – Цитодеф 0,5 мг/л, б – Цитодеф 1,0 мг/л, в – 2iр 1,0 мг/л (контроль), г – Дропп 0,5 мг/л, д - Дропп 1,0 мг/л Рис. 6 Формирование микроклубней на среде, содержащей препарат Цитодеф 1, мг/л (а) и 0,01 мг/л (б) и препарат Дропп 1,0 мг/л (в) и 0,01 мг/л (г) после 6 месяцев культивирования варианте формировались более крупные клубни, и они имели правильную морфологию.

Таким образом, для получения стабильного коэффициента размножения и формирования растений с правильной морфологией целесообразно в питательную среду в качестве цитокинина добавлять препарат Дропп в концентрации 0,01 мг/л.

Известно, что формирование клубней находится под контролем ауксинов.

Поэтому представляло интерес изучить влияние этих гормонов на индукцию образования микроклубней de novo в условиях in vitro. В работе испытывали ИУК и ИМК в различных концентрациях (3 – 7 мг/л) в сочетании с препаратом Дропп 0,01 мг/л. Полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие в составе питательной среды ауксинов ИУК или ИМК повышало процесс ризогенеза и клубнеобразования. Однако, ИУК оказывала больший стимулирующий эффект на учитываемые процессы по сравнению с ИМК. Были выявлены некоторые закономерности: 1) с увеличением концентрации изучаемых ауксинов в питательной среде до 7 мг/л повышалась способность эксплантов формировать микроклубни; 2) при концентрации ауксинов 1 мг/л наблюдали минимальное формирование микроклубней как в основании побега, так и в пазухе листа; 3) присутствие в питательной среде ИУК и ИМК не оказывало влияние на частоту формирования воздушных микроклубней в пазухе листьев и у основания стебля.

Таким образом, на последнем этапе клонального микроразмножения диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской целесообразно включать в состав питательной среды ИУК или ИМК в концентрациях 1 – 5 мг/л с целью увеличения коэффициента размножения и укоренения микропобегов.

3. Кирказон маньчжурский (Aristolochia manshuriensis Kom.) Исследования показали, что препараты Дропп и Цитодеф в изучаемых концентрациях не оказывали существенного влияния на активацию развития пазушных почек. В тестируемых вариантах наилучшее формирование побегов было отмечено лишь в варианте с Дропп 0,01 мг/л. Несмотря на это, в контрольном варианте (БАП 0,5 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л) наблюдали интенсивный рост пазушных меристем и формирование хорошо развитых побегов (Рис. 7).

Таким образом, в отличие от бересклета и диоскореи, для которых наилучшей средой была среда, содержащая препарат Дропп (0,01 мг/л), для кирказона маньчжурского оптимальным цитокинином был БАП 0,5 мг/л.

Влияние препарата Мицефит на клональное микроразмножение бересклета карликового, диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской Препарат Мицефит получен в ОАО "Биохиммаш" и разработан на основе микоризных грибов, выделенных из корней багульника, штамм Phialocephala fortinii F-833.

1. Бересклет карликовый (Euonymus nana Bieb.) Экспериментально установлено, что присутствие в составе питательной среды препарата Мицефит в разных концентрациях в сочетании с различными цитокининами оказывает неодинаковое влияние на процессы морфогенеза, в частности на образование микропобегов, их рост и формирование корневой системы.

Установлено, что сочетание цитокининов с препаратом Мицефит в различных концентрациях не оказывает существенного влияния на процессы формирования побегов de novo. Учитываемый показатель во всех вариантах находился на уровне контроля. Исключение составили лишь варианты, с Мицефитом в концентрации 10-7 мг/л, в которых количество побегов на один эксплант было ниже, чем в контроле.

Визуальные наблюдения и биометрические измерения показали, что скорость формирования адвентивных побегов зависела от применяемых цитокининов (Табл. 3).

Влияние препарата Мицефит на морфогенетическую реакцию микропобегов Так, в вариантах с сочетанием БАП и препаратам Мицефит высота побегов была ниже контроля, в варианте с 2ip и Мицефитом – на уровне контроля, а в варианте с Дропп и Мицефитом – выше контрольного варианта.

Что касается укореняемости микропобегов, то данная ответная реакция не была нами отмечена в вариантах с БАП и 2ip. Эффект применения Мицефита усиливался лишь при его совместном применении с препаратом Дропп.

Проявление ауксинового эффекта объясняется тем, что в состав препарата Мицефит входят ауксины, в частности ИУК, примерно 0,00005%, а также янтарная кислота 3,158% (Синчурина, 2011), которая применяется при зеленом черенковании растений.

Дальнейшее культивирование микропобегов в течении 4 месяцев на средах, содержащих препарат Мицефит в различных концентрациях, особенно в сочетании с препаратом Дропп, оказывало стимулирующее действие на формирование хорошо развитой корневой системы.

Таким образом, препарат Мицефит оказался эффективным препаратом при клональном микроразмножении бересклета карликового.

2. Диоскорея кавказская (Dioscorеa caucasica Lipsky.) и диоскорея ниппонская (Dioscorea nipponica Makino) В результате проведенных исследований было сделано заключение, что присутствие в составе питательной среды препарата Мицефит в различных концентрациях приводило к повышению морфогенетической активности культивируемых эксплантов: усиливается рост растений в высоту и стимулируется укореняемость побегов по сравнению с контрольным вариантом.

Более того, наблюдали формирование воздушных микроклубней и микроклубней в основании побегов. Следует отметить, что скорость формирования микроклубней находилась в прямой зависимости от наличия Мицефита в питательной среде. Так, в этих вариантах формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом, а именно, в варианте с Мицефитом через 2 месяца, а в контрольном варианте – через 4-5 месяцев в зависимости от исследуемого вида. Можно предположить, что такое стимулирующее действие препарат Мицефит проявляет благодаря высокому содержанию в его составе углеводов (75,1%), из которых на долю сахарозы приходится 17,8%, глюкозы - 37,6% (Синчурина, 2011). Хорошо известно, что именно сочетание высоких концентраций углеводов с ауксинами приводит к индукции образования микроклубней и их дальнейшему росту.

Вместе с тем следует отметить, что результативность действия препарата Мицефит связана именно с наличием в его составе комплекса веществ, обладающих стимулирующим действием, например, гормонов роста (ауксины, цитокинины, гибберелловая кислота), аминокислот (глютаминовая кислота, глицин, цистеин, валин, лейцин), а также присутствием таких кислот, как янтарная, фумаровая, фосфорная, гликолевая и др.

Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в интактных растениях и в микроклонах. Одной из задач диссертационной работы было выяснение особенностей накопления соединений фенольной природы (суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флавонолов) в различных органах интактных растений бересклета, кирказона и диоскореи.

Экспериментально установлено, что исследуемые в работе виды растений обладают разной способностью к синтезу фенольных соединений. Так, в растениях диоскореи кавказской образование полифенолов было в 1,5-2 раза выше, чем в растениях диоскореи ниппонской, а для растений бересклета карликового отмечалось существенное снижение количественного содержания соединений фенольной природы (в 2 – 3,5 раза) по отношению к другим исследуемым видам. Что касается кирказона маньчжурского, то для данной культуры количественный показатель растворимых фенольных соединений занимал промежуточное положение (Рис. 8). Аналогичные закономерности были отмечены и при определении флаванов и флавонолов (флавоноидов), которые в зеленых тканях растений являются наиболее распространенными полифенолами (Запрометов, 1993, Chattopadhyay, 1999, 2000). При анализе корневищ диоскореи кавказской было установлено, что максимальное количество полифенолов накапливается в многолетних корневищах (Рис. 9), в то время как для растений бересклета и кирказона их уровень был самым высоким в надземных частях растений (особенно в листьях). Полученные нами существенные отличия в накоплении фенольных соединений у различных видов растений и в разных органах согласуются с данными других исследователей (Запрометов, 1964; Ishikura, 1976; Juntheikki, 2000,Wagner, 2003).

Рис. 8 Содержание растворимых фенольных Рис. 9 Содержание растворимых соединений в интактных растениях фенольных соединений в корневищах диоскореи, бересклета и кирказона интакных растений диоскореи В следующей серии эксперимента был изучен количественный состав растворимых фенольных соединений в микроклонах диоскореи, кирказона и бересклета. Экспериментально установлено, что клеточные культуры сохраняют способность к синтезу фенольных соединений, характерную для интактных растений. Однако данный учитываемый показатель был значительно ниже по сравнению с исходными тканями интактных растений. Вероятно, это связано с тем, что в процессе культивирования микропобегов в условиях in vitro уменьшается выделение фенолов в питательную среду, что снижает их ингибирующее действие на ткани культивируемых эксплантов. Кроме того, ранее многими авторами было показано, что присутствие в составе питательной среды различных регуляторов роста оказывает определенное влияние на способность культур in vitro к синтезу полифенолов (Загоскина, 2009). В наших экспериментах было установлено, что существенное увеличение биосинтеза полифенолов наблюдается в микроклонах, полученных на питательных средах, содержащих препарат Дропп в концентрации 0,01 мг/л (Рис. 10, 11), а также сочетание его с препаратом Мицефит (10-6 мг/л) (Рис. 12 ).

Рис. 10 Содержание растворимых Рис. 11 Содержание растворимых фенольных соединений в фенольных соединений в корнях микроклубнях диоскореи in vitro диоскореи in vitro Рис. 12 Содержание растворимых фенольных соединений в микроклонах Именно в этих вариантах микроклоны характеризовались интенсивным ростом и формированием мощной надземной биомассы, в последнем случае адвентивных корней. Для микроклонов бересклета максимальное накопление фенольных соединений было отмечено в листьях, в то время как у диоскореии их было больше в микроклубнях, также как и у интактного растения. Это согласуется с данными других исследователей, показавших, что клеточные культуры сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, характерных для интактных тканей, однако учитываемый показатель в микроклонах ниже, чем у исходных тканей (Носов, 1991, Bhaising, 1998).

Локализация растворимых фенольных соединений в интактных растениях, микроклонах и каллусных культурах (диоскореи, бересклета и кирказона). Растениям родов Dioscorea L., Euonymus L., Aristolochia L.

присуще образование разнообразных низкомолекулярных соединений. Для определения внутритканевой локализации фенольных соединений в работе использовали корневищные клубни, молодые побеги и листья, микроклоны и каллусные культуры данных растений (Рис. 13).

Рис. 13 Локализация фенольных соединений: А - в железистом волоске листа бересклета; Б – в корневищных клубнях диоскореи; В - в побеге кирказона; Г - в каллусных культурах бересклета; Д - в каллусных культурах кирказона; Е – в железистых волосках листа бересклета с экскретом, выделенным под кутикулу (А, Б, В, Е - реакция на флавоны (с ванилиновым реактивом), Г, Д - реакция на сумму растворимых фенольных соединений (с реактивом Fast Blue) Специфические гистохимические реакции позволили обнаружить эти вещества в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях как интактных растений, так и микроклонов (Рис. 13). Полифенолы в них локализуются в клеточных стенках, межклетниках и в специализированных фенолзапасающих эпибластах, дающих положительную реакцию на сумму растворимых фенольных соединений (с реактивом Fast Blue) и на флаваны (с ванилиновым реактивом). Кроме того, фенольные соединения выявлены в клетках покровных и запасающих тканей.

В каллусных культурах полифенолы были также обнаружены в цитоплазме, вакуолях, реже - в межклетниках.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонской и кирказона маньчжурского. Показано, что для бересклета карликового и кирказона маньчжурского размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем, а для диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской – за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов и в пазухе листа.

2. Впервые изучено влияние нетрадиционных для культуры in vitro регуляторов роста Дропп, Цитодеф и Мицефит на морфогенетическую активность изолированных органов и пересадочной культуры изучаемых видов.

Присутствие в составе питательной среды препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов или микроклубней, и увеличивало коэффициент размножения.

3. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации 10-6 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядков, а также активизировало процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.

4. Впервые изучено содержание растворимых фенольных соединений, а также флавоноидов у представителей диоскореи, кирказона и бересклета и показано, что растения диоскореи характеризуются более высокой способностью к синтезу фенольных соединений, чем растения бересклета и кирказона. Это проявляется как на уровне суммарного накопления фенольных соединений, так и на процентном соотношении различных классов растворимых фенольных соединений (флаваны и флавонолы). Наибольшее содержание фенольных соединений, в том числе флавонолов и флаванов отмечено в листьях растений, а наименьшее – в корнях, за исключением корневищ диоскореи.

5. Установлено, что фенольные соединения (ФС) в интактных растениях и микроклонах локализуются в эпидермальных и паренхимных тканях, а также в клетках сосудисто-проводящих пучков и замыкающих клетках устьиц, клеточных стенках в межклетниках. Однако в микропобегах локализация ФС происходит менее интенсивно, что связано с их меньшим содержанием в тканях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Доан, Тху Тхуи. Клональное микроразмножение бересклета карликового (Euonymus nana Bieb) / Е.А. Калашникова, Доан Тху Тхуи, О.И.

Молканова // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ /ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. - Москва, 2011. – Т. XXVI. - С. 244- 2. Доан, Тху Тхуи. Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений / Е.А. Калашникова, Доан Тху Тхуи, О.И. Молканова // Известия ТСХА. 2012. – № 5, – С. 48- 3. Доан, Тху Тхуи. Влияние ауксинов на образование микроклубней диоскореи ниппоской и диоскореи кавказской in vitro / Доан Тху Тхуи, Е.А.

Калашникова // Тезисы докладов II Международной школы-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». – Звенигород: Цифровичок, 2011. – С. 4. Доан, Тху Тхуи. Сохранение биоразнообразия диоскореи японской (Dioscorea nipponica) и диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia) in vitro // Материалы 11-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - Москва, 2011. - С. 5. Доан, Тху Тхуи. Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на клональное микпроразмножение редких исчезающих видов растений / Доан Тху Тхуи, А.И.

Ефимова // Сборник статей Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА. – Москва, 2012. – Т.1. – С. 21- 6. Доан, Тху Тхуи. Клональное микроразмножение кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.) / Доан Тху Тхуи, Е.А.

Калашникова // Тезисы докладов юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси». - Минск, 2012. - С. 472- 7. Доан, Тху Тхуи. Получение каллусной ткани из изолированных частей диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia) и диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica)» / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов». - Киев, 2012. – С. 251-252.