На правах рукописи

Верхоглазова Елена Викторовна

ДИАГНОСТИКА ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЕТОДАМИ

ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Специальность: 03.01.01 - радиобиология

Москва - 2012 2

Работа выполнена на кафедре физики ускорителей и радиационной медицины физического факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Пирогов Юрий Андреевич

Официальные оппоненты: Рууге Энно Кустович, доктор физико-математических наук, профессор, ФГБУ "Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс" МЗСР России, руководитель лаборатории Козлова Елена Карловна, доктор физико-математических наук, профессор, Первый МГМУ им. И.М.

Сеченова, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН

Защита состоится «_» _ 2012 года в _ на заседании диссертационного совета Д.501.001.65 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, ауд..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» _ 20_ года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Опухоли глиального ряда (астроцитарные, олигодендроглиальные) трудно поддаются лечению. Это связано с их быстрым прогрессированием и высокой вероятностью продолженного роста после хирургического удаления.

Применяемые в настоящее время методы лечения - химио- и радиотерапия, не всегда оказываются эффективными из-за быстрого инвазивного роста, при котором опухолевые клетки глубоко инфильтрируют окружающую интактную ткань. Отсутствие чётких границ при обычных нейровизуализационных исследованиях не позволяет точно определить объем предстоящей операции.

Заболеваемость опухолями головного мозга в России составляет от 7,42 до 13,9 на 100 000 населения в год. При этом злокачественные глиомы встречаются в 5-8 случаях на 100000 и составляют 60-80% всех злокачественных новообразований центральной нервной системы (ЦНС) [Смолин А.В., 2007]. За последние годы наметилась тенденция к увеличению заболеваемости злокачественными глиомами в разных возрастных группах на 1,2% в год.

Среди первичных опухолей головного мозга у взрослых до 50,3% составляют злокачественные глиомы - мультиформная глиобластома и анапластическая астроцитома, которые являются наиболее частой причиной смерти при опухолях ЦНС [Осинов И.К., 2010].

В настоящее время применяются различные методы исследования указанных опухолей – визуализация с использованием компьютерной рентгеновской томографии, позитронно-эмиссионной томографии, магнитнорезонансная томография (МРТ). Значительный интерес представляют также флуоресцентные методы. Особо следует отметить методы исследования, основанные на явлении ядерного магнитного резонанса (ЯМР) - ЯМРспектроскопия и МРТ. Они обладают высокой информативностью, постоянно совершенствуются и становятся все более доступными.

Значительный прогресс в изучении глиальных опухолей достигается за счет их моделирования на малых лабораторных животных, поскольку снимаются риски, связанные с безопасностью исследования для человека. В последнее время весьма активно такое моделирование осуществляется путем инвазии искусственно культивируемых штаммов опухолей, например, глиомы C6, в мозг мышей или крыс. Практикуется также пересадка опухоли от ее носителя к здоровой особи, например, в случае глиобластомы 101/8. На модельных объектах отслеживается динамика роста опухоли, совершенствуются методы ее визуализации, производится апробация новых контрастных веществ и лекарственных препаратов. Изучаются другие возможности диагностики и лечения – термометрия, орган-селективная доставка лекарственных препаратов, гипертермия и др.

Весьма актуальным является разработка методов неинвазивной диагностики зоны поражения, особенно на ранней стадии, визуализация и исследование ее динамики.

экспериментальные возможности методов, основанных на явлении ЯМР, и получить дополнительную информацию о специфике исследования глиальных опухолей, включая моделирование глиомы C6 и 101/8 на малых лабораторных животных.

Цель работы: развитие методов диагностики глиальных опухолей, основанных на использовании явления ядерного магнитного резонанса - ЯМР спектроскопии высокого разрешения и магнитно-резонансной томографии.

Это подразумевает оптимизацию: аппаратурных конфигураций оборудования, параметров импульсных последовательностей, алгоритмов обработки данных и методов их визуализации.

Указанные направления развития диагностических методов нацелены на повышение их информативности с учетом специфики объектов исследования – человека и малых животных.

Исследования проводились в рамках решения конкретных задач, выдвигаемых практикой научного поиска. В том числе, в сотрудничестве с рядом научных организаций. Они включали в себя:

1. Изучение и сопоставление динамики развития глиомы человека и малого животного по данным МРТ и гистопатологического анализа;

2. Анализ метаболитов при глиоме C6 с помощью локальной ЯМР спектроскопии;

3. Определение динамики потребления головным мозгом животного биологически активных веществ (глюкозы) и их метаболизма при норме и поражении глиомой методами локальной ЯМР-спектроскопии;

4. Апробация контрастных МРТ-агентов, включая железосодержащие наночастицы, при исследовании головного мозга малого животного, пораженного глиомами C6 и 101/8.

Научная новизна работы 1. Получены и проанализированы данные МРТ, позволяющие отобразить длительную (более 11 лет) эволюцию глиальной опухоли у человека, включая 7-летний этап ее естественного развития.

2. Предложен алгоритм автоматической сегментации зоны поражения по данным МРТ, полученным при сканировании с одновременным подавлением сигналов воды и жира, для оценки объема этой зоны.

3. На малых животных поставлены эксперименты по локальной ЯМР спектроскопии, в том числе на ядрах, отличных от протонов, благодаря чему получены данные о метаболитах при развитии опухоли.

4. Для оценки динамики потребления органом биологически активных веществ методом ЯМР спектроскопии предложено использовать сигнал жировой ткани в качестве эталона, по которому производится сопоставление сигнала от исследуемого вещества.

5. При исследовании динамики развития глиомы C6 и глиобластомы 101/ получены данные о локализации введенного в организм животного контрастного вещества, содержащего наночастицы декстран-магнетита, в зоне абсцесса.

Теоретическая и практическая значимость Теоретическая значимость работы состоит в том, что в ней получены дополнительные данные, указывающие на обоснованность экспериментов по ЯМР и МРТ с малыми животными в контексте построения адекватной модели, отображающей процессы, происходящие в головном мозге при его поражении глиальной опухолью.

Практическая значимость работы состоит в том, что в ней даны рекомендации по постановке и проведению измерений, основанных на методе ЯМР, позволяющих неинвазивным способом получить полезную информацию о состоянии вещества головного мозга.

В работе даны рекомендации по практическим аспектам проведения измерений локальных спектров и получения МР-изображений. Приведены оптимальные параметры импульсных последовательностей, обеспечивающих достаточное качество МРТ-изображений и спектров ЯМР за приемлемое время сканирования.

Представляют практический интерес данные, касающиеся дозировок препаратов, вводимых животным – анестетиков, биологически активных и контрастных веществ.

Следует отметить, что из-за отсутствия до недавнего времени оборудования для МРТ-исследований малых животных описываемые эксперименты в России ранее не проводились. Поэтому при планировании подобных работ большое значение имеет учет наработанного опыта по их проведению, адаптации технических и программных средств, учета дозировок веществ, вводимых животным. В этом контексте имеются основания полагать, что результаты работы и рекомендации, содержащиеся в ней, могут быть востребованы в организациях, в которых имеется аналогичное МРТ-оборудование – ТИБОХ ДВО РАН (Владивосток), МНТЦ РАН (Новосибирск), РНИМУ им. Н.И. Пирогова (Москва).

Основные положения, выносимые на защиту Эффективным методом исследования глиальных опухолей человека является их моделирование на лабораторных животных.

Магнитно-резонансная томография и ЯМР спектроскопия позволяют получить наиболее детальную информацию о процессах, сопровождающих рост глиальных опухолей.

использовании режимов сканирования с подавлением сигналов от нормальных тканей, основанном на селекции по временам релаксации, и применении нанокапсулированных декстран-ферритовых контрастных агентов.

Локальная in-vivo ЯМР-спектроскопия, в том числе с применением изотопного обогащения, предоставляет данные о структурном составе зоны поражения и метаболизме.

Материалы диссертации были доложены:

на научных семинарах факультетов и других подразделений МГУ имени М.В. Ломоносова: физический факультет (2008, 2009, 2012); на Евразийских конференциях: Москва (2010); 4th Int. Summer School “Nuсlear Physics Methods and Accelerators in Biology and Medicine”, Prague (Czech Republic), 2007, Всеросс. научн. конф. ВНКСФ-14, Уфа, 2008, 5th Int. Summer School “Nuсlear Physics Methods and Accelerators in Biology and Medicine”, Bratislava (Slovakia), 2009, 8th Intl Conf. on the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, Rostock (Germany), 2010, на семинаре Университета штата Вашингтон (Сиэтл, США), 2008.

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 4 - в изданиях, входящих в перечень ВАК. Кроме статей опубликовано 11 тезисов докладов.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения. Она содержит 125 страниц, 35 рисунков, 2 таблицы и список литературы из ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение глиальных опухолей методом МРТ 1.1 Анализ эволюции опухолей По данным МРТ, полученным в ЦМТС МГУ, проанализирована эволюция глиальных опухолей человека (фибриллярной астроцитомы и анапластической олигодендроглиомы) и лабораторной крысы (глиома C6).

Выявлялись закономерности роста зоны поражения для обоснования адекватности моделирования глиальных опухолей человека с помощью глиомы C6 крысы и оценки эффективности такого моделирования.

Особенностью исследования является то, что динамика опухолей человека отслеживалась в течение длительного, более 7 лет, периода роста опухоли. А астроцитома – при ее естественном развитии (без хирургического и другого медицинского вмешательств). Ранее оценки динамики проводились по косвенным данным и охватывали сравнительно короткие периоды наблюдения (1-2 года). В результате получены данные, позволяющие оценить среднюю скорость роста зоны поражения при астроцитоме - рис.1а.

Рис.1. а) эволюция астроцитомы у человека (верхний график – общий объем зоны поражения- кистозная и глиозная трансформации, нижний – объем зоны глиозной трансформации); б) динамика роста глиомы C6 у крыс Wistar.

Для оценки общего объема зоны поражения использованы T2взвешенные изображения, для расчета объема глиозной трансформации – изображения от режимов МРТ-сканирования с одновременным подавлением сигналов воды и жира. График показывает, что средняя скорость роста зоны поражения у человека составляет - 30 см3 в год. Излом графика и последующий спад – результат проведенного лечения (радиотерапия).

Аппроксимируя линейную зависимость для начального периода развития опухоли можно определить дату заболевания (1999 г.) и сопоставить с ее с датой, когда пациент впервые начал ощущать головные боли (1998 г.). Незначительное расхождение в датах объясняется тем, что на начальном этапе опухоль развивается менее быстрыми темпами, что наиболее наглядно выявляется при исследованиях глиальных опухолей у малых животных.

В рамках модельных исследований глиальных опухолей была проанализирована динамика развития глиомы С6 у крысы Wistar-Furth.

Глиома была спровоцирована введением клеточных штаммов в головной мозг животного. Специфика моделирования данного процесса на малых животных в том, что за короткое время можно проследить развитие опухоли до весьма значительных размеров - даже больше объема головного мозга. На рис.1б приведены несколько графиков, показывающих динамику развития глиомы C6. Можно отметить значительную вариабельность роста опухоли, возможно, связанную с индивидуальными особенностями объектов исследований.

Из графиков следует, что средние скорости роста зоны поражения у человека и крысы оказываются соизмеримыми – соответственно, 0.08 и 0.05см3/сутки.

Можно сопоставить скорости роста объема глиальной опухоли G=dV/dt для разных типов биологических объектов, введя для них естественные объемные и временные эталоны - V0 и T0. То есть, оценивать динамику по коэффициенту K, входящему в выражение для G, если его представить в виде G=d(V/V0)/d(t/T0)(V0/T0)=K(V0/T0). Эталоны не должны быть слишком вариабельными для конкретного животного или человека.

Поэтому в качестве временного эталона (T 0) нельзя, например, использовать продолжительность жизни, но можно задать длительность вынашивания плода. В качестве объемного эталона (V0) можно использовать объем мозга.

Применительно к человеку и крысе получаются: К=0.017 и K=0.6соответственно. По величине K можно судить об эффективности моделирования, имея в виду способность за короткое время измерений отследить значительный прирост опухоли.

Близкие значения абсолютного прироста опухоли человека и глиомы C6 крысы указывают на адекватность моделирования, а существенная разница в относительном приросте опухоли у крысы по сравнению с человеком – ее эффективность.

Как уже отмечалось выше, для расчета объема зоны поражения, отбирались МР-изображения, получаемые от обычных режимов сканирования, а также от режимов с подавлением сигналов нормальной ткани. Благодаря такому подходу удалось внутри зоны поражения выявить отдельно зоны кистозной и глиозной трансформации, провести их сегментацию и вычислить соответствующие объемы.

Расчеты проводились с использованием известного программного пакета ImageJ. Для автоматизации процесса сегментации был задействован алгоритм Multi Otsu Thershold, поставляемый в виде приложения (plugin’а) к пакету ImageJ. При работе этого алгоритма для МР-изображения строится гистограмма и происходит сортировка пикселов на 4 градации по яркости. По сути дела, по исходному изображению строятся разные яркостные изображения. Из них отбирается изображение с наибольшей яркостью. После этого производится его бинаризация – присвоение каждому пикселу либо черного, либо белого цвета в зависимости от того, больше или меньше его яркость по отношению к пороговому значению. Это пороговое значение определяется по алгоритму isodata, встроенному в базовый комплект ImageJ.

Чтобы в сегментируемую зону не попадали ткани, не представляющие интереса – нормальные ткани, были использованы изображения от режимов сканирования с одновременным подавлением сигналов воды и жира.

Расчет объема зоны, отсегментированной по яркостному критерию, производился путем построения гистограммы по бинаризованному изображению. После этого количество подсчитанных пикселов умножалось на площадь каждого из них и на толщину сканируемого среза. Обычно площадь пиксела составляла 1x1 мм, а толщина среза – 6 мм.

1.2 Применение контрастных агентов для визуализации глиальных изображениях (T2ВИ), благодаря разнице во временах поперечной релаксации 2 у опухоли по сравнению с белым веществом мозга. Различия в протонной плотности (PD) и времени продольной релаксации 1 для глиомы и нормальных тканей менее выражены. Это отчетливо видно на релаксационных картах, построенных по изображениям, полученных методом спинового эха при варьировании параметров R и TE а пределах 0.95-5.0 сек и 13-170 мс, соответственно.

Рис. 2. Карта протонной плотности и релаксационные 1 и 2- карты.

При введении в организм животного контрастного вещества на основе Gd-содержащих парамагнетиков, хорошая визуализация глиомы получается и на T1ВИ – рис. 3.

Рис. 3. Т1ВИ до и после введения Gd-агента при исследовании модельных глиальных опухолей у крыс: глиома С6 – слева, глиобластома 101/8 – справа.

Эффект возникает из-за того, что в зоне опухоли у клеток мозга ослаблен гематоэнцефалический барьер. Это способствует проникновению в нее парамагнетика, из-за чего у тканей в этой зоне сокращается время T1.

В последнее время проводятся интенсивные исследования контрастных веществ, содержащих железо или марганец. Подобные исследования проводились и в рамках данной работы.

При МРТ-исследовании глиомы C6 применялись Магневист (пр-во фирмы Шеринг) в качестве Gd-агента и декстран-магнетит (ДМ). Последний позиционируется как негативно контрастный МРТ-агент, снижающий сигнал от нормальных тканей, что позволяет лучше выявить зону опухоли и сосуды, ее питающие. При накоплении железосодержащего препарата по периферии опухоли создаются условия для их удержания в этой зоне с помощью градиентных магнитных полей и лечения опухоли методом гипертермии, которую можно обеспечить за счет РЧ нагрева.

Декстран является продуктом жизнедеятельности особых бактерий, используется как основной компонент кровезаменителя, производится разными компаниями промышленным способом. ДМ представляет собой смесь наночастиц размерами 120-240 нм. Каждая из них содержит ядро – кристалл Fe3O4, окруженное молекулами декстрана – полисахаридами с молекулярной массой ~70 кДа. В настоящей работе использован ДМ, предоставленный сотрудниками онкоцентра (РОНЦ им. Н.Н.Блохина), которые в своих публикациях для ДМ применяют недостаточно обоснованный термин «декстран-феррит». Особенностью применения ДМ как контрастного вещества является значительное время внедрения в организм – (circulation half time) - более 24 часов и медленное выведение из организма за счет метаболизма - несколько месяцев.

Апробация ДМ проводилась при исследовании подкожных опухолей меланомы и карциномы. Отмечалось накопление ДМ по периферии опухолей. Это давало основания полагать, что подобные свойства могут проявиться и при исследовании глиальных опухолей. На это же указывали данные зарубежных исследователей, проводивших подобные исследования.

В настоящей работе проводилось исследование головного мозга крысы c глиомой C6 (7 дней) и крысы с глиобластомой 101/8 (8 дней).

Применение Gd-агента позволило уточнить локализацию глиомы на T1ВИ и выявить зону, по периферии которой отмечалось слабо выраженное снижение МР-сигнала до введения контраста – рис. 4.

Введение Gd-агента сразу приводило к повышению сигнала по периферии зоны. При этом продолжительность эффекта не превышает 1 часа, поскольку Gd-агент после этого выводится из организма. Введение ДМ ( мл) позволило уже четко (и надолго) выявить эту зону по существенному снижению МР-сигнала на всех режимах сканирования. Описываемый эффект проявился лишь на следующий день после введения ДМ в организм животного, что соответствует известным данным о времени его внедрения в организм и метаболизации.

Рис. 4. Визуализация капсулы абсцесса -A и глиомы - G на T1ВИ изображениях при введении контрастных веществ: (а) и (б) – до и после введения декстран-феррита; (в) и (г) - до и после введения Gd-агента.

Проблемная зона для глиомы C6 исследовалась методом локальной ЯМР-спектроскопии. Отмечался рост пика лактата и липидов со временем.

При введении ДМ зарегистрировано уширение спектральных линий до 24- Гц через 1-2 суток после введения ДМ с последующим восстановлением ширины линии до 12-13 Гц через 5 дней. Это согласуется с данными о динамике циркуляции ДМ в организме животного, а потому давало веские основания считать, что снижение сигнала по периферии проблемной зоны связано с накоплением частиц железа.

На это же указывали данные магнитометрических измерений, проведенные сотрудниками ИОФАН. Они выявили наличие в голове крысы ~20 мкг ДМ. В то же время их измерения для всей головы, проведенные для нормальной крысы и крысы с глиомой, не выявили существенной разницы в количестве обнаруженных частиц ДМ. Это указывает на особую избирательность их локализации в зоне поражения.

Особое внимание проблемной зоне было уделено в связи с тем, что она первоначально интерпретировалась как продукт распада глиомы. Однако более детальный анализ, включая сопоставление с данными, полученными сотрудниками РНИМУ им. Н.И. Пирогова, давал основания считать, что данное образование является абсцессом, капсула которой и стала зоной концентрации железосодержащих частиц. Гистопатологический анализ, проведенный на биофаке МГУ, подтвердил данную гипотезу.

Надежных данных о проникновении ДМ в глиому C6 и глиобластому 101/8 не выявлено, что возможно, связано со слишком большим разбросом в размерах наночастиц, представленных в данном конкретном препарате.

Однако получены данные о специфике накопления ДМ в зоне абсцесса. Эта информация полезна для диагностики и раннего выявления абсцесса, т.е.

анализа побочных последствий, связанных с реализацией модели глиомы.

2. Гистопатологический анализ Гистопатологический анализ применялся для сопоставления данных МРТ с реальными тканевыми структурами. В частности, дифференциации различных зон поражения – опухоли, отека, некрозных зон и т.п.

Экспериментальных крыс глубоко наркотизировали, перфузировали трансаортально 4% параформальдегидом и приготавливали на замораживающем микротоме (Reichert) серийные срезы толщиной 40 мкм.

Окрашивание препаратов проводили 0,1% крезилвиолет на 0,1 М ацетатном буфере рН 3,3.

Рис. 5. Общий вид имплантированой глиомы С6 в каудопутамене крысы на 7-е (А) и 21-е (Б) сутки после имплантации. Окрашивание 0,1% толуидином с ванадиевокислым фуксином.

Гистологический анализ выявил наличие опухоли у всех животных.

Объем опухоли возрастал в соответствии со сроком, прошедшим после введения (рис. 5) Клетки глиомы характеризовались различными формой и размером, а также выраженным полиморфизмом ядер, что соответствовало гистологической картине мультиформной глиобластомы человека.

Вследствие повышенного содержания рибонуклеопротеидов глиомные клетки обладают большей хромофильностью и окрашиваются крезилвиолетом и толуидином более интенсивно, чем нормальная нервная ткань. Это позволило хорошо дифференцировать основной очаг опухоли и крупные очаги инвазии при световой микроскопии - рис. 6.

Рис. 6. Гистологическая картина глиомы С6 на препаратах мозга, окрашенных крезиловым фиолетовым и толуидиновым синим. А -общий вид глиомы. Б - полиморфизм ядер глиомных клеток. Масляная иммерсия. В, Г перивазальная и периневральная инвазия глиомы (показано стрелками).

Таким образом, с помощью гистологического анализа уточнялась информация, которая на МР изображениях трактовалась неоднозначно.

3. Локальная ЯМР спектроскопия для исследования глиомы C В спектре протонов 1H (300 МГц) надежно регистрировались следующие метаболиты:

- N-ацетиласпартат (NAA), холин (Cho), креатин (Cr), лактат (Lac), сигнал от липидов (Lip). При сопоставлении спектров нормального участка мозга и зоны поражения при глиоме C6 отмечается существенное повышение пика лактата и липидов. Отмечается рост этих пиков со временем – рис. 7. Заметно снижение пика N-ацетиласпартата и креатина, снижение соотношений NAA/Cr, NAA/Cho, Cr/Cho. Аналогичные закономерности отмечались при исследовании глиобластомы человека. Это указывает на адекватность моделирования данной опухоли с помощью глиомы C6, имплантируемой малым животным.

Рис. 7. Спектры 1H от двух участков мозга крысы размерами 2.5x2.5x2.5 мм:

(а) - норма, (б) и (в) - глиома после ее инвазии через интервалы, соответственно, 7 и 14 дней.

Помимо интенсивностей пиков измерялась ширина линий спектра для оценки времени поперечной релаксации T2* в зоне поражения при исследовании головного мозга животного, пораженного глиомой C6. Такие измерения оказались полезны при проведении экспериментов с введением в организм животного контрастного агента – ДМ. По уширению линий спектра выявилось накопление железосодержащих частиц в зоне абсцесса, представленной на МРТ-изображении изоинтенсивными фрагментами.

В спектре фосфора 31P (121 МГц) надежно регистрировались основные метаболиты: фосфомоноэстер (PME), неорганический фосфат (Pi), фосфодиэстер (PDE), фосфокреатин (PCr), аденозин трифосфат (ATP -,,).

ATP ATP ATP

PME PME PME

PDE PDE PDE

Рис. 8. Спектры 31P спустя разное время после инвазии глиомы: 0, 7, 14 дней.

Сравнивая спектры 31P для нормального мозга и мозга, пораженного глиомой C6, можно отметить подавление пика PDE и возрастание пика Pi – рис. 8. Аналогичный эффект известен из данных по исследованию мозга человека при сопоставлении спектров, полученных от нормального мозга и мозга, пораженного глиобластомой.

Таким образом, несмотря на сравнительно грубую локализацию спектра 31P, он оказывается достаточно информативным для оценки состояния головного мозга, поскольку отражает основные закономерности, характерные для его поражения глиальной опухолью.

поверхностной приемо-передающей катушки, размещенной вблизи головы мыши, в основном регистрируются сигналы от жировой ткани – рис. 8(а).

Самый интенсивный пик дает фрагмент (CH 2)n. Тем не менее, спектроскопия C применяется для отслеживания сигналов биологически активных препаратов, например, дельта-аминолевулиновой кислоты (-ALA) или глюкозы, специально вводимых в исследуемый живой объект.

Глюкоза обычно используется в качестве маркера биологических процессов – по интенсивности ее потребления отдельными органами можно получить информацию об изменениях в функционировании, а значит, поражении того или иного органа. Именно поэтому очень важно получить эту информацию неинвазивным образом. В настоящее время для этого используются методы позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и МРТ.

ПЭТ весьма сложен как в подготовке специального препарата глюкозы, так и в реализации исследования.

Метод МРТ более распространен, но его чувствительность пока не позволяет получать изображения, отображающие картину распределения углерода даже при изотопном обогащении. Однако полезную информацию все-таки можно получить с помощью локальной ЯМР-спектроскопии, обеспечивающей достаточную чувствительность. Проблема в том, что выделить протонный спектр указанных препаратов на фоне метаболитов организма очень сложно. Переход к ядрам, отличным от протонов, например, C, позволяет упростить эту задачу. Но поскольку естественное содержание изотопа 13C мало (~1%), то для повышения чувствительности метода применяются вещества, обогащенные по данному изотопу.

Сопоставляя интенсивность сигнала от этих веществ с «жировым»

пиком, можно проследить динамику метаболических процессов и выявить корреляцию интенсивности сигналов с размерами опухоли. Именно эти направления исследований предполагалось развить в рамках данной работы.

Были отлажены режимы сканирования, позволяющие получить спектры ЯМР 13C приемлемого качества. Апробация методов проводилась по регистрации спектров от головы мыши, ее печени, а также зон локализации ее нормальных органов и органов, пораженных раковыми заболеваниями.

На рис. 9а представлен спектр 13C от головы мыши после внутривенного введения -аминолевулиновой кислоты, обогащенной по двум позициям. Была выявлена корреляция между интенсивностью сигналов и степенью поражения органов. Практика показала, что в качестве эталона для калибровки интенсивности линий спектра удобно использовать «жировой»

пик (CH2)n.

Рис. 9. Спектры 13C от головы крысы: после инъекции -ALA (а); после инъекции глюкозы при поражении мозга глиомой C6 (б) и норме (в).

Этот мощный сигнал присутствует в спектре ткани вне зависимости от того, вводилась ли глюкоза или другое вещество. При этом его вариабельность не может быть сколько-нибудь значительной, поскольку структура жировой ткани слабо зависит от состояния организма.

Практика показала, что вариабельность сигнала ЯМР 13C от внутривенно введенного вещества слишком велика для того, чтобы делать вывод о взаимосвязи вводимого количества вещества и размером зоны поражения. Это может быть связано с индивидуальными особенностями восприятия организмом вводимого вещества. На рис. 9 приведены спектры ЯМР 13C, полученные с применением поверхностной катушки, размещенной вблизи головы мыши, после введения глюкозы, полностью обогащенной по C. Спектр (б) получен на 7-ой день после имплантации клеток экспериментальной глиомы, спектр (в) – от нормальной мыши. В случае (б) при сканировании применялась гетероядерная развязка от протонов, которая способствует повышению сигнал/шум за счет трансформации мультиплетов в синглеты. Несмотря на это, сигнал от глюкозы оказался ниже по сравнению с «жировым» пиком, чем в случае (в), когда повышение отношения сигнал шум достигалось лишь за счет эффекта Оверхаузера – РЧ насыщение протонных переходов перед считыванием сигналов 13C.

Можно констатировать, что спектроскопия 13C с введением изотопно обогащенной глюкозы полезна не для оценки корреляции интенсивности сигналов с размерами опухоли, а для прослеживания динамики метаболических процессов.

Метаболизм отслеживался по изменению соотношений пиков глютамата (~55 мд) и фрагментов (C6) глюкозы (~75 мд). Регистрировался сигнал 13C ЯМР непосредственно после введения глюкозы и спустя 2 часа.

Накопление сигнала производилось в течение 20 мин. Полученые соотношения пиков следующие: 5:1 и 2:1. Этот результат коррелирует с известными данными о временных масштабах метаболизма глюкозы. Кроме пика глютамата регистрировался также пик лактата (~20 мд), однако в рамках проведенных исследований его изменения нельзя признать убедительными.

Отметим дополнительные факторы, способные повысить эффективность метода. Первое - при проведении работ в распоряжении была глюкоза, изотопно обогащенная по всем позициям. Однако для наивысшей эффективности описываемых измерений необходима глюкоза, обогащенная лишь по позиции C1. Если глюкоза обогащена не только в позиции C1, но и в позиции C2, то линии углерода C1 превращаются в дублеты из-за спинспинового взаимодействия с углеродами C2 с соответствующим перераспределением высот пиков. Второе - повысить чувствительность метода в 4 раза (1H/13C) можно за счет применения импульсной последовательности, обеспечивающей перенос пполяризации от протонов к ядрам 13C. Обычно применяют пространственно селективный аналог известной последовательности DEPT (Destortionless Enhancement Polarization Transfer).

Полезный результат проведенных измерений состоит в том, что экспериментально доказана возможность in vivo регистрации спектров 13C от внутривенно введенных биологических веществ, включая прослеживание их метаболизма. Регистрировать спектры можно с помощью поверхностной катушки, обеспечивающей их пространственную локализацию. Возможно сканирование со спиновой развязкой от протонов без перегрева животного.

Поскольку зона локализации может быть позиционирована в области головы малого животного, то возможно изучение глиомы C6 методом 13С ЯМР.

Основные технические аспекты исследований МРТ-измерения, описанные в данной работе, проведены на МРтомографах Tomikon S50 (0.5 Тл) и BioSpec 70/30 (7 Тл) (фирмы «Брукер»), размещенных в Центре магнитной томографии и спектроскопии МГУ имени М.В.Ломоносова.

Во время исследования животные размещались на платформе, подогреваемой до 600C за счет циркуляции воды, протекающей через термостат. Анестезия производилась путем внутрибрюшинной инъекции хлоральгидрата - Cl3CCH(OH)2 из расчета 300 мг на кг веса животного ( мг для крысы). Животные были предоставлены сотрудниками Института судебной психиатрии (ГНЦССП) им. В.П.Сербского и НПЦ Наносистемы.

Доза глюкозы, вводимой в организм мыши через хвостовую вену, составляла 0.08-0.1 г. Дозировка контрастных веществ составляла 0.2 мл - как для ДМ, так и Gd-агента, вводимых внутривенно. Практиковалось также внутрибрюшинное введение ДМ.

МР-изображения и протонные спектры (300 МГц) регистрировались в конфигурации cross-coil - для возбуждения спинов использовался резонатор диаметром 20 см, а регистрация сигнала производилась поверхностной катушкой, оптимизированной для съемки головы животного. Локализация зоны интереса при съемке спектров обеспечивалась импульсной последовательностью PRESS (Point Resolved Spectroscopy), дающей эффективное уменьшение объема образца и выбор зоны интереса за счет применения градиентных полей. При этом производилось частотноселективное подавление сигналов воды по методике VAPOR.

Съемка спектров 13C и 31P производилась в конфигурации single-coil с помощью приемо-передающей поверхностной катушки диаметром 2 см.

Локализация зоны интереса обеспечивалась за счет позиционирования катушки относительно этой зоны.

Для получения МР изображений использованы следующие импульсные последовательности 2-TSE (TR/TE=6000/55 мс, TL=8), T1SE (TR/TE=430/24 мс), T1GE (TR/TE=146-300/6 мс, FA=900), Для получения ЯМР-спектров 31P (121 МГц) и 13С (75 МГц) шириной порядка 10-20 кГц применялась одноимпульсная последовательность, в которой использовались прямоугольные РЧ импульсы длительностью 50 мкс от 1кВт передатчика после ослабления на 18 дБ.

Параметры импульсной последовательности PRESS – (900-TE1-1800TE2-1800-TE-FID) следующие: TR/TE1/TE2/TE=2500/9.7/10.3/20 мс. При считывании МР-сигнала оцифровывалось 4096 точек. Ширина спектра – Гц. Пауза между запусками РЧ импульсов, отводимая для релаксации спинов, ~ 2 сек. Количество накоплений сигналов – 128-256. Для подавления шума в спектре перед Фурье-обработкой FID’а проводилось умножение его на затухающую со временем ~ 0.1 сек экспоненту (LB~10 Hz). После коррекции фазы производилась коррекция базовой линии спектра.

Обработка спектральных данных производилась с помощью программ XWINNMR v..3.0, TopSpin v.2.0, MestreC v.1.0. МР-изображения обрабатывались с помощью программ ParaVision v.5.0 и ImageJ v.1.46.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате настоящей работы, нацеленной на комплексное исследование глиальных опухолей методами ядерного магнитного резонанса, было сделано следующее:

Получены и обработаны экспериментальные данные о динамике развития глиальных опухолей человека, включая случай, когда лечение длительное время не проводилось. Для расчета объема зоны поражения при глиальной опухоли разработан алгоритм автоматической сегментации фрагментов МР-изображения. Показано, что алгоритм работает наиболее эффективно, если используются изображения, полученные при сканировании с подавлением сигналов нормальных тканей.

Проведены исследования на лабораторных животных с инвазией двух типов модельных глиальных опухолей – глиомы C6 и глиобластомы 101/8. Измерена динамика глиомы C6 для малого животного методом МРТ, гистопатологические измерения, а также проведено сопоставление динамики развития глиальной опухоли человека с динамикой развития глиомы C методом МРТ. Предложен критерий оценки эффективности моделирования на основе естественных биологических эталонов.

Получены данные о влиянии Gd- и Fe– содержащих контрастных агентов на контраст МР-изображения при исследованиях глиомы C6 и глиобластомы 101/8. Показана возможность улучшения визуализации зоны абсцесса при использовании указанных контрастных агентов.

Проведены исследования мозга животных методами локальной ЯМРспектроскопии, включая измерения на ядрах, отличных от протонов.

Получены данные о метаболитах мозга нормального и пораженного глиомой C6. По измерениям ширины линий локальных спектров 1H отслежена динамика Fe-содержащего контрастного агента в зоне абсцесса. Получены предварительные результаты в исследованиях по изучению метаболизма биологически активных веществ методом 13C ЯМР спектроскопии, намечены подходы по совершениствованию метода.

накопления сигналов ЯМР разработаны оптимальные протоколы, обеспечивающие получение наиболее информативных данных от исследований. Разработаны рекомендации по дозировке контрастирующих препаратов и препаратов для анестезии малых животных.

ВЫВОДЫ

Динамика роста глиальной опухоли у малого животного и человека определяется схожими факторами абсолютного прироста зоны поражения. Это указывает на наличие сходных механизмов, определяющих развитие глиальных опухолей и возможность их моделирования на малых животных. Способность за короткое время измерений отследить значительный прирост опухоли указывает на эффективность такого моделирования.

При МРТ исследовании целесообразно применять режимы сканирования с подавлением сигналов нормальных тканей, в частности, воды и жира. В этом случае обеспечивается наиболее отчетливая визуализация зоны поражения, создаются наиболее благоприятные условия для ее автоматической сегментации, построения объемных образов, волюметрии.

Локальная ЯМР спектроскопия по ядрам 1H и анализа глиальной опухоли. ЯМР-спектроскопия C полезна для исследования динамики метаболизма введенных в организм животного биологически активных изотопно обогащенных веществ. Полученные из ЯМР-спектроскопии данные о метаболитах для глиомы C6 коррелируют с данными для глиобластомы человека, что указывает на адекватность моделирования указанной опухоли на животных.

Введение декстран-магнетита как негативного контрастного вещества улучшает визуализацию абсцесса как возможного побочного продукта, вызываемого инъекцией модельной глиальной опухоли в головной мозг лабораторного животного.

Гистопатологический анализ мозга дает дополнительную информацию о структурных особенностях зоны поражения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Куприянов Д.А., Верхоглазова Е.В., Волков А.А., Пирогов Ю.А. // Высокопольная магнитно-резонансная томография экспериментальной С6 глиомы у крыс // Медицинская физика, 2010, №1 (45), с 65-69.

Верхоглазова Е.В., Абаншина И.В., Пирогов Ю.А. Математические операции с МРТ изображениями // Медицинская визуализация, 2010, №1, c. 117-123.

Анисимов Н.В. Гуляев М.В., Корецкая С.С., Верхоглазова Е.В., Герус М.А., Пирогов Ю.А., Магнитно-резонансная томография всего тела – техническая реализация и диагностические применения // Альманах клинической медицины, т.17 (1), 2008, с. 143-146.

Анисимов Н.В., Корецкая С.С., Гуляев М.В., Верхоглазова Е.В., Пирогов Ю.А. МРТ-диагностика с использованием алгебраических операций с изображениями // Технологии живых систем, 2010, №2, с.3-9.

Другие публикации автора по теме диссертации 5. Verkhoglazova E.V., Kupriyanov D.A. Spectroscopy in Magnetic Resonance Tomography // Proc. AIP, Bratislava (Slovakia), 2007, v. 958, pp. 284-285.

Верхоглазова Е.В., Куприянов Д.А., Абаншина И.В., Волков А.А.

Морфометрия головного мозга // Всеросс. научн. конф. ВНКСФ-14, Уфа, 2008. Инф. бюлл., с. 396-397.

Анисимов Н.В., Гуляев М.В., Верхоглазова Е.В., Герус М.А., Пирогов Ю.А., Диагностические применения магнитно-резонансной томографии всего тела // Ломоносовские чтения-2008. Секц. физики, Сб. тез. докл.М.: Физич. фак-т МГУ, 2008, с. 129-131.

8. Anisimov N.V., Ubaydullaev A.S., Gulyaev M.V., Verkhoglazova E.V., Bakhmutova A.V., Gerus M.A., Pirogov Yu.A. Whole body MRI: Diagnostic applications // Proc. EUROMAR-2008, S.- Petersburg (Russia), 2008, p. 254.

Верхоглазова Е.В., Куприянов Д.А., Пирогов Ю.А. Магнитнорезонансная томография в моделировании С6 глиомы у крыс // Тезисы II Научн.-практ. конф. «Перспективы развития инноваций в биологии», 2008.- М.: Изд-во МГУ, с. 39-40.

10. Верхоглазова Е.В., Куприянов Д.А., Пирогов Ю.А. Магнитнорезонансная томография в моделировании С6 глиомы у крыс // Материалы XVI Межд. конф. «Ломоносов-2009».- М.: Изд. МГУ, 2009, 11. Pirogov Y.A., Anisimov N.V., Gubskiy L.V., Gulyaev M.V., Koretskaya S.S., Verkhoglazova E.V., Abanshina I.V. Additional diagnostic possibilities at use of algebraic operations with MR-images // Proc. ESMRMB-2009, Antalya (Turkey), 2009, 508, p. 375-376.

12. Anisimov N.V., Gulyaev M.V., Koretskaya S.S., Verkhoglazova E.V., Abanshina I.V., Pirogov, Yu.A. Expansion of diagnostic opportunity by means of algebraic operations with MR-images // Proceedings of NMRCMSaint Petersburg (Russia), 2009, p. 11.

13. Verkhoglazova E.V., Kupriyanov D.A., Yusubalieva G.M., Baklaushev V.P.

MRI morphometry of C6 Glioma in Rats // Proc. 5th Int. Summer School “Nuсlear Physics Methods and Accelerators in Biology and Medicine”, Bratislava (Slovakia), AIP Conference Proc., 2009, V. 1204.

14. Brusentsov N.A., Pirogov Y.A., Anisimov N.V., Polianski V.A., Lichinicer M.R., Golubeva I. S., Gulyaev M.V., Nikitin M.P., Brusentsova T.N., Nikitin P.I., Verkhoglazova E.V. Combined MRI-adaptive Magneto-thermopolychemotherapy for Improved Cancer Treatment // American Institute of Physics: Conference Proceedings, 2010, v.1311, pp. 447-451.

15. Верхоглазова Е.В. Эволюция глиальных опухолей по данным МРТ // Материалы XVI Межд. конф. «Ломоносов-2012». Электронное издание.- М.: Изд. МГУ, 2012.