Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

Майкова Евгения Владимировна

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИЗМЕНЕНИЯ

АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ КРОВИ ПРИ

ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань – 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: кандидат биологических наук Кравцова Ольга Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чернов Владислав Моисеевич кандидат медицинских наук, доцент Хасанов Нияз Рустемович

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Казань

Защита состоится «16» февраля 2012 года в « 1300 » часов на заседании Диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке имени Н.И.

Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Автореферат разослан “_” января 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Ишемическая болезнь сердца (ИБС) – одно из наиболее распространенных заболеваний сердечно-сосудистой системы, обусловленное атеросклеротическим поражением сосудов, в патогенезе которого большую роль играет сложное взаимодействие наследственных и средовых факторов, что указывает на мультифакторную природу данного заболевания, а выявление наследственной природы и молекулярных механизмов его развития составляет основу современной медицины (Сироткина О.В. и др., 2003; Friedlander Y. et al., 2001; Карпов Ю.А, 2010;

Власова Н.В., Асташкина О.Г., 2010; Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я., 2007; Васюк Ю.А., 2007; Чазов Е.И., 2009).

В настоящее время показано, что одним из факторов риска развития ИБС является изменение в работе антиоксидантной системы (АОС), маркерами нарушения которого являются, в первую очередь, продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) и некоторые ферменты, генетический дефект которых ведет к изменению их активности и нарушению антиоксидантной защиты (Закирова А.Н., 2004; Шалаев С.В., 2008; Escola-Gil et al., 2006).

Инициация ПОЛ при ИБС обусловлена снижением активности естественных антиоксидантных ферментов и дефицитом антиоксидантов, а также наличием дислипидемии, при которой содержащиеся в высокой концентрации в крови атерогенные липиды служат легким субстратом для свободно-радикального окисления. Избыток первичных продуктов ПОЛ, к которым относятся гидроперекиси липидов (ГПЛ), запускает системную воспалительную реакцию: происходит усиление агрегации тромбоцитов и адгезии нейтрофилов к эндотелию, нарушение синтеза оксида азота и развитие вазоконстрикции, снижение содержания ненасыщенных жирных кислот, цитотоксическое повреждение эндотелиоцитов (Меньщикова Е.Б. и др., 2008; Голиков А.П. и др., 2003; Ланкин В.З. и др., 2000). По уровню конечных продуктов ПОЛ, в частности малонового диальдегида (МДА), можно судить о неблагоприятных последствиях свободно-радикальных процессов, а именно о степени эндогенной интоксикации в стенке эндотелия (Кишкун А.А., 2010).

Основную антиоксидантную функцию в плазме крови выполняет церулоплазмин, являющийся белком острой фазы воспаления в эндотелии сосудов и, благодаря высокой феррооксидазной активности, предотвращающий неферментативные реакции, дающие начало свободным радикалам и дальнейшему развитию липопероксидации (Ващенко В.И., 2006).

Сложный механизм формирования клинического фенотипа ИБС, в частности, острого инфаркта миокарда (ОИМ) и стабильной стенокардии напряжения (СН), обусловлен также большим количеством и высоким полиморфизмом генетических маркеров, вовлеченных в его патогенез. Последние десятилетия в мире активно ведутся исследования по выявлению генетических факторов риска развития ИБС на основе полиморфизма ядерных генов, перечень которых включает не менее наименований из различных групп: гены белков липидного обмена, белков, регулирующих сосудистые реакции, гены гемостатических факторов и т.д (Human genetics official database, 2010). Кроме того, последние несколько лет пристальное внимание исследователей обращено к полиморфизму митохондриального генома, поскольку недостаточность функции дыхательной цепи, вызванной индивидуальными особенностями митохондриальной ДНК, может сказываться на различных биохимических функциях организма, в том числе на состоянии системы окислительного фосфорилирования и генерации активных форм кислорода (Тодоров И.Н., 2007; Smeitink J. и др., 2001).

Тем не менее, патогенетические факторы и механизмы дисрегуляции работы АОС при ИБС с различным клиническим течением еще недостаточно исследованы, так как фенотипическое проявление генетического полиморфизма в значительной мере зависит от генофонда и условий жизни конкретной популяции, чем и объясняется противоречивость данных по ассоциации полиморфизма геновкандидатов с риском развития ИБС.

Таким образом, на сегодняшний день представляется актуальной комплексная оценка вклада биохимических и генетических маркеров в изменение активности антиоксидантной системы при определенных клинических проявлениях ишемической болезни сердца у населения Республики Татарстан (РТ).

В связи с вышесказанным, была поставлена цель – характеристика антиоксидантного статуса крови при ишемической болезни сердца и выявление генетических факторов риска развития данной патологии.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

Выяснить особенности антиоксидантного статуса сыворотки крови (показатели общей антиоксидантной активности, церулоплазмина, гидроперекисей липидов и малонового диальдегида) у больных ИБС с клиническим проявлением в форме стабильной стенокардии напряжения (СН) и острого инфаркта миокарда (ОИМ).

Изучить связь между показателями антиоксидантной системы сыворотки крови при различных клинических формах ИБС.

Провести анализ ассоциации полиморфных маркеров ядерного генома:

+9T/C гена SOD2, +186C/T гена SOD3, -262С/T гена CAT, +242C/T гена NADPH1, +593С/T гена GPX1, а также полиморфизма митохондриальной ДНК с риском развития ИБС у населения РТ.

Показать влияние исследуемых полиморфных маркеров ядреного и митохондриального генома на изменение показателей антиоксидантного статуса сыворотки крови при ИБС.

Научная новизна Дана сравнительная характеристика изменения общей антиоксидантной активности сыворотки крови, содержания церулоплазмина, первичных и конечных продуктов ПОЛ (гидроперекисей липидов и малонового диальдегида) при остром инфаркте миокарда (ОИМ) и стабильной стенокардии напряжения (СН) в зависимости от гендерной принадлежности и генетических особенностей пациентов.

Впервые охарактеризована вариабельность митохондриальной ДНК при ИБС у населения РТ. Показано, что одна из наиболее распространенных европеоидных гаплогрупп мтДНК маркирует повышенную предрасположенность к развитию стабильной стенокардии напряжения у населения РТ.

Исследован вклад 5 полиморфных локусов генов, кодирующих ферменты прои антиоксидантной системы, в формирование генетической предрасположенности к ОИМ и СН у населения РТ.

Впервые проведен комплексный анализ по выявлению биохимических и генетических маркеров изменения активности антиоксидантного статуса сыворотки крови при ОИМ и СН.

Научно-практическая значимость работы Данные полученные в результате исследования, могут служить основой для формирования групп повышенного риска развития ИБС и разработки дифференцированных программ профилактики заболевания у конкретного человека с учетом данных генотипирования.

Материалы исследования представляют интерес в области биохимии, генетики популяций, клинической диагностики и могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменение антиоксидантного статуса сыворотки крови при ишемической болезни сердца зависит от ее клинического проявления, гендерной принадлежности пациентов и полиморфизма генов антиоксидантной системы.

2. Полиморфные варианты генов SOD2 и GPX1 являются факторами риска развития острого инфаркта миокарда, полиморфизмы генов САТ, SOD3 и митохондриального генома маркируют повышенный риск развития стабильной стенокардии напряжения у населения РТ.

Апробация работы Основные результаты исследований докладывались на итоговой научно – образовательной конференции студентов Казанского государственного университета (Казань, 2006 г.); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.); 13 annual Symposium for Biology Students of Europe (Казань, 2009 г.); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (памяти В.Г. Винтера) (Казань, 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2010 г.); VI международной научно-практической конференции «Спецпроект: анализ научных достижений»

(Днепропетровск, 2011 г.).

Публикации По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, среди которых публикация в ведущем рецензируемом издании, рекомендованном в действующем перечне ВАК.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 146 страницах текста и включает рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 210 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служили образцы сывороток венозной крови и препараты ДНК, выделенные из лейкоцитов венозной крови стандартным фенол-хлороформным методом (Маниатис Т., 1984).

Определение антиоксидантного статуса сыворотки крови проведено у 128 пациентов с диагнозом ИБС в форме ОИМ и СН (110 и 18 человек соответственно).

Генотипирование полиморфных локусов ядерного и митохондриального генома проведено у 266 больных (141 мужчин, 125 женщин) и 165 условно здоровых доноров (81 мужчин, 84 женщины).

Все исследованные группы были сформированы на базе ГУ МКДЦ и БСМП №1 (г. Казань). Диагноз ишемической болезни сердца устанавливался на основании клинических, инструментальных и биохимических данных. Обращалось внимание на типичность клинических показателей, анамнестические данные (перенесенный инфаркт миокарда и наличие диагноза стабильной стенокардии напряжения в анамнезе), специфичность изменений электрокардиограммы. Больные с хронической сердечной недостаточностью III-IV функционального класса, сложными нарушениями ритма сердца, тяжелыми заболеваниями печени, почек, легких, крови, сахарным диабетом, требующими коррекции, в исследование не включались. В исследование не включались пациенты с активными воспалительными процессами, онкологическими и иммунопатологическими заболеваниями. Исследуемые группы сформированы с учетом пола, возраста, отягощенной наследственности по ИБС (наличие ИБС у кровных родственников). Как больные ИБС, так и лица, составившие группу контроля, представляли собой смешанную популяцию Республики Татарстан и не состояли друг с другом в кровном родстве. Все лица дали информированное согласие на участие в исследовании.

Популяционные исследования вариабельности мтДНК проведены у человек, представляющих дисперсную выборку современного населения РТ.

Материал для популяционных исследований собран в ходе экспедиционных выездов в 2004-2007 гг.

Определение антиоксидантного статуса сыворотки крови проводили по показателям суммарной антиоксидантной активности (АОА) и концентрации церулоплазмина (ЦП), а также активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню гидроперекисей липидов (ГПЛ) и малонового диальдегида (МДА) в осадке липопротеидов сыворотки крови на базе ЦНИЛ КГМУ (г.Казань) (заведующий к.м.н. С.Р. Абдулхаков). Регистрацию продуктов проводили спектрофотометрическим методом согласно общепринятым методикам (Азнабаева Ю.Г., 2001; Гаврилов, 1983, 1987; Тен Э.В., 1981).

Генотипирование полиморфных локусов митохондриального и ядерного геномов проводили методом ПЦР и ПДРФ-анализа с использованием праймеров, предложенных в работах (Mitrunen K., 2001; Ahn J., 2006; Tiwari A.K., 2009; Izagirre N., 1999; Kolman C., 2000; Quintans B., 2004) на амплификаторах «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», г. Москва) и «MyCycler» (Bio-Rad Laboratories, США).

Продукты амплификации и рестрикции анализировали электрофорезом в нативном полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей визуализацией бромистым этидием с использованием гель-документирующей системы ChemiDocтм XRS (BioRad Laboratories, США).

Статистический анализ. Для сравнения данных применяли дисперсионный анализ, используя критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса с поправкой Бонферрони (Акберова Н.И., 2004). Взаимосвязь между параметрами оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (Лакин Г.Ф., 1990). Статистическая обработка выполнена с помощью пакета программ «Excel Office 2003».

Статистическая обработка данных по генотипированию проводилась с помощью программы UNPHASED версии 3.1.5 (программа находится в режиме свободного доступа (http://homepages.lshtm.ac.uk/frankdudbridge/software/unphased/), разработана Frank Dudbridge, 2006, MRC Biostatistics Unit Robinson Way Cambridge CB2 0SR, UK).

Значимость различий между группами по частотам встречаемости аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов оценивали по критерию 2 при уровне значимости р=0,05. Для оценки связи полиморфных локусов в развитии ИБС рассчитывали отношение шансов (ОШ) и 95% доверительных интервалов для ОШ (ДИОШ). Из полученных данных по биохимическим показателям в группах больных и группе контроля для объективной оценки вычисляли среднее значение (M) и стандартную ошибку (SE).

Результаты собственных исследований и их обсуждение Характеристика антиоксидантного статуса при различных клинических В настоящее время показана взаимосвязь между нарушениями работы системы антиоксидантной защиты организма и генезом сердечно-сосудистых патологий. При этом наибольший интерес вызывают специфические показатели работы АОС, такие как продукты перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид и гидроперекиси липидов) и активность антиоксидантных агентов (показатель суммарной антиоксидантной активности, содержание церулоплазмина в сыворотке крови и ферменты АОС) (Дайбанырова Л.В., 2006; Неверов И.В., 2002).

В связи с этим, нами охарактеризован процесс изменения активности антиоксидантной системы сыворотки крови при различном клиническом течении ИБС (в форме острого ИМ и стабильной СН) на основании количественной оценки четырех специфических маркеров: гидроперекисей липидов (ГПЛ), малонового диальдегида (МДА), церулоплазмина (ЦП) и суммарной антиоксидантной активности (АОА).

В ходе оценки антиоксидантного статуса сыворотки крови больных ИБС выявлено резкое увеличение средних показателей ЦП (62,75 ± 0,81 мг%) и ГПЛ (9, ± 0,32 отн.ед) по сравнению с нормой (25 48 мг% и 2 2,3 отн.ед., соответственно), а также незначительное повышение показателя АОА (49,20 ± 2,08 %, норма 41, 44,5 %), при этом, содержание МДА было в пределах нормальных значений (3,09 ± 0,22 мкМ/л, норма 2,2 4,8 мкМ/л). Показатели АОС в норме приведены согласно (Кишкун А.А., 2010; Александровский А.А., 2000; Клебанов Г.И., 1999; Березин Т.Т., 1998).

Необходимо отметить, что значительное снижение показателя АОА по сравнению с нормой наблюдалось у 35% больных ИБС, тогда как достоверное увеличение данного показателя отмечено у 65% пациентов (рис. 1). Кроме того, практически у всех больных ИБС отмечалось увеличение показателей ЦП и ГПЛ (91% и 99%, соответственно). В тоже время, содержание МДА у 35% пациентов находилось в пределах нормальных значений, примерно половина больных характеризовалась снижением данного показателя (48%), у остальных пациентов наблюдалось значительное повышение МДА по сравнению с нормальными значениями.

Рис. 1. Распределение пациентов в зависимости от показателей АОС в общей группе больных ИБС.

При разделении исследуемой группы больных ИБС по форме клинического течения заболевания также отмечено преобладание пациентов с повышенными значениями ЦП и ГПЛ (более 90%) как у пациентов с ОИМ, так и со СН, при этом средние значения данных показателей значимо не отличались (табл. 1).

При разделении исследуемых групп по гендерному признаку, в группе больных со СН значительное увеличение показателей ЦП наблюдалось в 100% случаев у женщин, тогда как доля мужчин с повышенными показателями ЦП составила 80%, однако такое распределение не носит статистически достоверного характера (p>0,05).

Стоит отметить, что средние значения данного показатели у мужчин со СН достоверно превышали таковые по сравнению с женщинами из группы больных СН и