На правах рукописи

Фадина Оксана Алексеевна

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ BRASSICA

Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2014

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН в 2010-2014 гг.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Эмиль Ефимович Хавкин.

Официальные оппоненты:

в.н.с. лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции ФБГУН ИФР РАН доктор биологических наук Галина Викторовна Новикова, зав. кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Соловьев.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита диссертации состоится 30 июня 2014 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42; тел. (499) 977факс (499) 977-09-47; e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии и на Интернет-сайте www.vniisb.ru.

Автореферат разослан « »_ 2014 г., размещен на Интернетсайте www.vniisb.ru «21» апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Вобликова В. Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Переход к цветению – важнейшее событие в жизни растений. Ген FRIGIDA участвует в регуляции перехода растений семейства Brassicaceae к цветению под влиянием пониженных температур (путь вернализации, рис. 1). На примере арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) показано, что белок FRIGIDA служит структурной основой (scaffold) комплекса белков, который усиливает экспрессию гена FLOWERING LOCUS C, репрессора перехода к цветению (Choi et al., 2011;

Ding et al., 2013; Geraldo et al, 2009).

Рис. 1. Место гена FRIGIDA в генетической сети, контролирующей переход растений A. thaliana к цветению (по Caicedo et. al., 2004). AP1 – APETALA1,

FLC – FLOWERING LOCUUS C, FRI – FRIGIDA, VIN3 – VERNALISATION

INSENSITIVE 3, SOC1 - SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1, LFY

– LEAFY, FT - FLOWERING LOCUUS T.

В опытах с арабидопсисом взаимодействие сильных и слабых аллелей генов FLOWERING LOCUS C и FRIGIDA во многих случаях объясняет различия по времени зацветания (Johanson et al., 2000; Shindo et al., 2005;

Strange et al., 2011), Строение и функции гена FRIGIDA у систематически близких растений рода Brassica L. исследованы совершенно недостаточно.

Культурные виды Brassica L. включают яровые и озимые однолетние и двулетние жизненные формы, происходящие из субтропиков и умеренных широт и представленные диплоидными и тетраплоидными видами с геномами A, B и C: Brassica rapa L. (геном A), Brassica nigra (L.) W.

D.J.Koch (геном B), Brassica oleracea L. (геном C), Brassica juncea (L.) Czern.

(геном AB), B. napus L. (геном AC) и Brassica carinata A.Braun (геном BC).

Хорошо изученная эволюция геномов этих растений (Cheng et al., 2013;

Cheung et al., 2009; Couvreur et al., 2010; Lysak et al., 2005) создает благоприятные предпосылки для исследования дивергенции гена FRIGIDA в роде Brassica. Исследования полиморфизма этого гена в связи с агроэкологическими особенностями возделывания культурных форм Brassica может способствовать селекции этих культур на такие хозяйственно ценные признаки, как время перехода к цветению и раннеспелость.

Цель и задачи исследования. Клонировать и провести сравнительный структурный анализ гена FRIGIDA в геномах A, B и C культурных видов Brassica. Создать на этой основе специфичные SCAR маркеры, пригодные для использования в селекции.

Научная новизна исследования. Обоснована двухлокусная модель гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Получены новые данные о строении локусов FRI.a и FRI.b в геномах A, B и C и дивергенции гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Создана система SCAR маркеров для изучения разнообразия локусов FRI.a и FRI.b в геномах и субгеномах Brassica; эти маркеры могут быть использованы для картирования и функционального анализа гена FRIGIDA.

Практическая значимость работы. Созданы локус- и геномспецифичные маркеры гена FRIGIDA, которые могут оказаться полезными для уточнения связи этого гена с QTL времени перехода к цветению. Эти маркеры могут также быть использованы и интрогрессивной селекции культурных форм Brassica, в том числе на время зацветания и скороспелость.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Заключение», выводов, списка литературы, включающего 144 названия, и одного приложения. Работа изложена на 147 машинописных страницах, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы четыре статьи в рецензируемых изданиях.

Результаты исследования были представлены на VII съезде общества физиологов России (Нижний Новгород, 2011), на Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012), на Третьей Вавиловской Международной конференции «Идеи Н. И. Вавилова в современном мире»

(Санкт – Петербург, 2012), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), на Всероссийской научной конференции c международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013).

Работа была поддержана грантом РФФИ (проект 09-04-00606a).

Автор благодарит Центр коллективного пользования “ВНИИСБ” за секвенирование нуклеотидных последовательностей гена FRIGIDA.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. Семена растений Brassica были получены из коллекций Centre for Genetic Resources Resources (CGN), Вагенинген, Нидерланды, Warwick Horticulture Research International, Уеллесборн, Великобритания (GK) и ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР), С.

Петербург. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге два дня и затем высаживали в почву. Растения выращивали при комнатной температуре при постоянном освещении под лампами OSRAM Circolux EL (24W).

Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев с помощью набора AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences, США). Концентрацию выделенной ДНК измеряли при 260 нм на NanoPhotometer P 300 (IMPLEN, Германия).

Амплификация геномной ДНК. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе DNA Engine PTC 200 (Bio-Rad, США) по универсальной программе: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 62°C, мин 30 с при 72°C; один цикл 15 мин при 72°C. Для амплификации

FRIGIDA

программу: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 58°C, 2 мин при 72°C;

один цикл 15 мин при 72°C. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле при напряжении электрического поля 67 В/см. Гели фотографировали в ультрафиолете (длина волны 312 нм) с помощью цифровой системы Biotest (“Биоком”, Россия) и Gel Logic Imagyng System (Eastman Kodak, США).

Праймеры, использованные в работе. Праймеры для ПЦР (табл. 1) подбирали вручную на основании множественного выравнивания последовательностей FRIGIDA и оптимизировали с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/ biotools) по следующим параметрам: температура отжига, GC состав, возможное образование шпилек и димеров. Оптимизированные праймеры были проверены на возможность неспецифичного отжига с помощью программы BLAST. Все праймеры синтезированы компанией «Синтол», Москва (www.syntol.ru).

клонировали с помощью наборов PCR Cloning Kit InsTAcloneTM с нарабатывали в штамме E. coli JM109 с использованием набора TransformAid (Fermentas). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Axygen Biosciences), согласно протоколу фирмыпроизводителя. Нуклеотидную последовательность вставки определяли при помощи автоматического анализатора ABI 3130 (Applied Biosystems, США).

Хроматограммы нуклеотидных последовательностей были отредактированы (www.technelysium.com.au/chromas_lite.html) и депонировали в Генбанке NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

последовательностей приведены в табл. 2.

осуществляли в базах данных CoreNucleotide, EST, GSS и SRA NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), BRAD (http://brassicadb.org/brad; B.

rapa BGI scaffolds v. 1.0) и INRA Brassica.FR (http://www.brassica.fr; 454-reads database) с использованием программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Для подбора и оптимизации ПЦР праймеров были использованы следующие программы: NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Lasergene 7. (http://www.dnastar.com) Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools).

Для филогенетического анализа использовали алгоритм Maximum Likelihood в пакете MEGA5 (Tamura et al., 2011).

Для определения экзон-интронной структуры использовали алгоритм FGENSH (http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=fgen). Аминокислотные последовательности были получены с использованием программы Expasy Translate tool (http://web.expasy.org/translate). Для распознавания характерных доменов белка FRIGIDA использовали базу данных Pfam. version 24. (http://pfam.janelia.org/search/sequence) поиска, а для предсказания биспиральных структур - программу COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html).

полиморфизма последовательностей ДНК использовали DnaSP 5.10.1 (Rozas et al., 2010).

Номенклатура локусов и маркеров FRIGIDA, полученных в данной работе. В соответствии с номенклатурой, принятой для геномов Brassica (Ostergaard., King, 2008), локус обозначается сокращением типа BolC.FRI.a, где Bol – B. oleracea, C – геном С, FRI –ген FRIGIDA, a –локус a.; Маркер обозначается сокращением типа BrX.Fri.Y, где Br – вид B. rapa, X – геномная специфичность маркера (геном A, B или С); Y – локусная специфичность маркера. Так, например, маркер BrA.FRI.a специфичен для локуса FRIa из генома A B. rapa.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск и первичный анализ гомологов гена FRIGIDA с помощью последовательностей FRIGIDA в геномах Brassica мы использовали метод генов-кандидатов. В качестве гена-прототипа мы выбрали функциональный ген FRIGIDA из A. thaliana поздноцветущего экотипа H51 (AF228499). Поиск структурных гомологов этого гена проведен в базах данных NCBI Genbank, (http://www.brassica.fr). С помощью алгоритма BLAST мы обнаружили анонимные фрагменты гомологов FRIGIDA у B. rapa, B. oleracea и B. napus.

Таким же образом в фосмидном клоне B. rapa Chifu найдена полноразмерная последовательность гена FRIGIDA. В базе данных BRAD (подраздел Scaffolds v. 1.0) (http://brassicadb.org/brad/blastPage.php), содержащей полный геном дигаплоидной формы B. rapa ssp. pekinensis Chifu, были обнаружены два скаффолда (BGIScaffold000064 и BGIScaffold000108), содержащие гомологи гена FRIGIDA, условно названные FRI.a и FRI.b, с открытой рамкой считывания длиной 2178 и 2062 п.н., соответственно. В базе данных French Brassica rapa мы нашли большое число фрагментов генома B. rapa Chifu (454 последовательности), которые были собраны в контиги, гомологичные на 100% выделенным из скаффолдов локусам FRI.a и FRI.b.

Геномные контиги, содержащие гомологи FRI.a и FRI.b, картированы на разных группах сцепления генома А - соответственно, A3 и A4, что позволило определить FRI.a и FRI.b как два генетических локуса, в отличие от A. thaliana, в геноме которого этот ген представлен одним локусом. Таким образом, мы впервые обнаружили, что ген FRIGIDA представлен в геноме диплоидного вида двумя паралогичными локусами. В пользу двухлокусной модели свидетельствует и анализ FRIGIDA у B. napus (Wang et al., 2011). В случае B. oleracea локусы BolC.FRI.a и BolC.FRI.b картированы на хромосомах C3 и C9 (Irwin et al., 2012).

Определенные доказательства связи этого гена с переходом растений Brassica к цветению получены только для локуса FRI.a: Присутствие последовательностей B. rapa и B. oleracea, гомологичных локусам FRI.a и FRI.b, в базах данных EST в Генбанке NCBI указывает на то, что оба локуса транскрибируются. В случае B. napus показана связь FRI.a с QTL для времени перехода к цветению (Wang et al., 2011), а в случае B. oleracea ген FRI.a комплементировал неактивный ген fri у мутантов A. thaliana (Irwin et al., 2012). Функция локуса FRI.b пока неизвестна.

Клонирование и сравнительный анализ последовательностей локусов FRIGIDA из геномов и субгеномов Brassica А, С и В. На основании всех извлеченных из баз данных последовательностей FRIGIDA видов Brassica мы сконструировали и оптимизировали систему локус-специфичных праймеров для клонирования последовательностей FRI.a и FRI.b из геномов Brassica (рис. 2, табл. 1). Для изучения гена FRIGIDA у B. nigra (геном В) мы разработали систему праймеров, специфичных для этого генома. Из-за отсутствия в базах данных последовательностей FRIGIDA из B. nigra мы не смогли подобрать праймеры для амплификации полноразмерной последовательности этого гена.

Таблица 1. Праймеры, использованные для ПЦР амплификации фрагментов и полноразмерных последовательностей гена FRIGIDA.

BrAC.FRIaF ATCCCCAATGGCCGTCCG

BrA.FRIaR AAGCTTTCTGCTTGTTAAGCCC

BrAC.FRIaF ATCCCCAATGGCCGTCCG

BrC.FRIaR GATCCTAAGCTTTGTGTTTATTAAATAA

BrA.FRIbF CCCATGGCCTTTCGTAATGG

BrAC.FRIbR CCTTTGTTACAWWTTTTACATTCCTC

BrC.FRIbF CCCATGGCCTTCCGTAATG

BrAC.FRIbR CCTTTGTTACAWWTTTTACATTCCTC

А, В, BrFRIF GGCTGCTGTTGCGTGGAAGAA

С BrFRIR TGAGCAGTGTTGACTAAAAGGG

BrB.FRIaF TCCTGTGATTGGACAAAGCCAAGT

BrFRIR TGAGCAGTGTTGACTAAAAGGG

BrAB.FRIbF TTTTTAGCTGCGTTGTTATCAGTG

BrB.FRIbR TCCATGAACTAGAGTGTGCCC

BrAC.FRIaFRIbR TCTTCTTCCACGCAACAGCAG

Примечание. * WW соответствует AT/AA, ** Frigida фрагмент гена FRI, который включает почти весь домен Frigida и бльшую часть C-концевой области.

С помощью созданной системы праймеров мы клонировали FRI.a и FRI.b из шести видов Brassica (табл. 2) и проанализировали их последовательности в сравнении с геном FRIGIDA из A. thaliana.

Таблица 2. Последовательности гена FRIGIDA, клонированные из растений Brassica в данном исследовании.

B. oleracea var. alboglabra * Регистрация этих последовательностей не завершена.

Определение экзон-интронной структуры локусов FRIGIDA Brassica, а, следовательно, предсказание первичной структуры процессированных транскриптов и последовательностей белков, проводили тремя in silico методами: (1) выравнивание экзонов FRIGIDA.арабидопсиса с локусами FRIGIDA Brassica; (2) сравнение геномных последовательностей FRIGIDA Brassica с EST (mRNA) последовательностями Brassica; (3) предсказание структуры транскрипта с помощью алгоритма FGENSH.

Рис. 2. Строение локусов FRIGIDA в геномах Brassica А, В и С. A – локус FRI.a в геномах А и С, Б – фрагмент гена FRIGIDA из генома В, В – локус FRI.b из геномов А и С. 1 – положение старт-кодона, 2178 и 2069 – положение стопкодонов. Интроны обозначены сплошной черной линией. Черными прямоугольниками и римскими цифрами обозначены экзоны. Арабскими цифрами и стрелками показано расположение и направление праймеров. Горизонтальной скобкой обозначено положение центрального консервативного домена Frigida. Шкала соответствует гену FRIGIDA JN015481.

Оказалось, что локусы FRI.a и FRI.b Brassica и FRIGIDA арабидопсиса не различаются по экзон-интронной структуре: в них три экзона и два интрона (рис. 2). Таким образом, гены FRIGIDA у видов Brassica и у Arabidopsis обнаруживают значительное сходство. На рис. 2 сопоставлено строение локусов FRI.a и FRI.b в геномах Brassica А, В и С. Анализ последовательностей этих локусов показал, что наиболее вариабельной областью гена является первый экзон. Область второго экзона наиболее консервативна и содержит однонуклеотидные замены, отличающие последовательности FRIGIDA из генома В от геномов A и С Brassica. Второй интрон имеет множество однонуклеотидных замен и делеций, отличающих FRIGIDA из генома B от FRIGIDA геномов A и С. Начало первого и конец третьего экзона содержат множество геном-специфичных полиморфизмов.

Сравнение последовательностей FRI.a и FRI.b из Brassica c другими последовательности FRIGIDA из B. nigra сильно отличаются от FRIGIDA из геномов A и C Brassica и скорее напоминают FRIGIDA у Raphanus sativus L.

Сравнительный анализ нуклеотидного разнообразия экзонов и интронов последовательностей FRI.a и FRI.b геномов и субгеномов Brassica свидетельствует о том, что в локусе FRI.a наиболее вариабельной является область первого интрона (79%). В локусе FRI.b наиболее консервативной областью является второй экзон (99%), остальные интроны и экзоны вариабельны в равной степени (97%).

Изучение полиморфизмов экзонов FRI.a и FRI.b диплоидных и тетраплоидных видов Brassica показало, что несинонимичные замены присутствуют в основном в области первого экзона. Во втором и третьем экзоне несинонимичных замен существенно меньше (рис. 3). Таким образом, как и у Arabidopsis, кодирующая область гена FRIGIDA состоит из двух эволюционирующих с разной скоростью областей: первая включает первый экзон, а вторая состоит из второго и третьего экзонов. В первом экзоне гена FRIGIDA Brassica мы наблюдаем высокое соотношение несинонимичного и Рис. 3 Внутривидовой полиморфизм кодирующей области локусов FRIGIDA Brassica.(А) – геном и субгеномы А, (Б) – геном и субгеномы С; a – разнообразие несинонимичных полиморфизмов, s – разнообразие синонимичных полиморфизмов; a/s – соотношение несинонимичных замен к синонимичным заменам; п.н. – пар нуклеотидов. (Sliding-window анализ, длина окна: 100, шаг: 25 п.н.). И так же переставьте в дисс.

синонимичного разнообразия (a/s). Для второго и третьего экзонов

FRIGIDA

несинонимичное (a). Это предполагает, что на первую часть гена действовал положительный отбор, а на вторую - отрицательный отбор.

Таким образом, для последовательностей локусов FRI.а и FRI.b всех геномов и субгеномов Brassica наиболее консервативной является область второго экзона, а наиболее вариабельными – области, соответствующие C- и N-концевым несинонимичных и синонимичных замен вдоль кодирующей части гена FRIGIDA выявил заметные различия между локусами FRI.a и FRI.b и между различными участками гена. Возможно, мы обнаружили «горячие точки» в функциональные изменения после дупликации (Doebley and Lukens, 1998;

Rensing, 2014).

Далее, мы сопоставили полученные нуклеотидные и аминокислотные последовательности FRIGIDA в субгеномах А и С аллотетраплоидов с соответствующими последовательностями у их предполагаемых диплоидных предков. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b показал, что они на 9599% сходны с ортологами из соответствующих геномов B. rapa и B. oleracea. Аминокислотные последовательности FRIGIDA.a и FRIGIDA.b в субгеномах А и С также были на 9699% сходны с последовательностями из соответствующих геномов B. rapa и B. oleracea (табл. 3). Почти полное соответствие (99% сходства) белков FRIGIDA.a и FRIGIDA.b у диплоидов и тетраплоидов B. carinata и B. juncea показано также для генома B. Таким образом, последовательности гена FRIGIDA из геномов А, С и B у диплоидов B. rapa, B. oleracea и B. nigra сохраняются в субгеномах А, С и B трех аллотетраплоидных видов, B. carinata, B. juncea и B. napus.

Белок FRIGIDA в геномах и субгеномах Brassica А, С и В. Производные аминокислотные последовательности FRIGIDA.a и FRIGIDA.b оказались немного короче (555-596 а.о.), чем у прототипа из A. thaliana (609 а.о.). Все полученные последовательности содержат консервативный

FRIGIDA

участок, который соответствует центральному домену Frigida (286-308 а.о.), характерному для суперсемейства белков FRIGIDA и FRIGIDA-LIKE 1 (Risk et al., 2010), и С- и N- концевые области, важные для функциональной активности белка (рис. 4 и 5). Присутствие специфичной 37-аминокислотной последовательности в N-концевой части продуктов трансляции генов FRI.a и FRI.b Brassica позволяет отнести эти белки к классу I FRIGIDA, а не к FRIGIDA-LIKE. N-концевая область белков FRIGIDA является наиболее вариабельной. Для этой области FRIGIDA.а из субгенома А В. napus известны шесть однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных со временем зацветания (Wang et al., 2011). Центральные консервативные Таблица 3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей FRIGIDA.у видов Brassica Белок FRIGIDA.a диплоидных видах Chifu (AEJ81950) BraA. FRIGIDA.a PakChoi (AFC68976) A12DH (AFB73908) A12DH (AFC90010) Frosty (AFC68978) Chifu (AEJ81951) PakChoi (AFC68977) Frosty (AFC68979) A12DH (AFB73907) домены Frigida белков FRIGIDA.a и FRIGIDA.b Brassica различаются небольшим числом геном- и локус-специфичных полиморфизмов.

Белок FRIGIDA A. thaliana содержит coiled-coil домены в двух положениях, в N- и C-концевых областях (рис. 4 и 5). Известно, что Сконцевой регион важен для функциональной активности белка FRIGIDA из A. thaliana, и биспиральная структура в этом регионе необходима для образования комплекса, способствующего транскрипции гена FLOWERING LOCUS C (Сhoi et. al., 2011). В случае Brassica, образование coiled-coil домена на C-концевом участке белка у всех проанализированных последовательностей FRIGIDA.a и FRIGIDA.b предсказано с высокой вероятностью (0.91.0). Что касается N-концевой области, то в этом случае coiled-coil домен предсказан с малой вероятностью (менее 0,05) как у раноцветущих, так и у поздноцветущих форм Brassica. Однако у FRIGIDA арабидопсиса, в белке FRIGIDA.a у B. oleracea (геном C) и B. carinata (субгеноме C), а также у B. juncea (субгеном A) образование этого домена предсказано с вероятностью 0,8. Оказалось, что для области, в которой coiled-coil домен предсказан с вероятностью 0,8, характерно наличие остатка глутаминовой кислоты (E-). Замена этой аминокислоты в локусе FRIGIDA.a на глицин (G0), приводит к уменьшению вероятности образования coiled-coil домена, так как разница в зарядах нарушает стабильность домена. Наличие глутаминовой аминокислоты (E-) также характерно для этой области coiledcoil домена у гомологов FRIGIDA в других видах Brassicaceae.

При сравнительном анализе белков мы обнаружили характерные аминокислотные повторы в С-концевой области белка FRIGIDA. Эти повторы различаются числом, инсерциями и одиночными заменами. У FRIGIDA.a из генома и субгеномов A три повтора MEEARSIS, у FRIGIDA.a из генома и субгеномов С - два таких же повтора, для генома B характерен один повтор MEEEARAIS; у FRIGIDA.b из генома и субгеномов A и B - по одному повтору MEGEARSIS; для генома и субгеномов С характерен один Рис. 4. Предсказание coiled-coil структуры в белках FRIGIDA у A. thaliana и видов Brassica. А) Функциональный белок FRIGIDA у A. thaliana (AAG23414), (Б) Нефункциональный белок FRIGIDA у A. thaliana (NC_003075), (В) FRIGIDA.a из B. oleracea (AFC90010, AFC68978) и (Г) белки FRIGIDA.a из B. rapa (AEJ81950, AFC68976), B. carinata (AHJ09876) и B. juncea (AHM25020), и FRIGIDA.b у B. rapa (AEJ81951, AFC68977) и B.

oleracea (AFC68979), (Д) фрагмент белка FRIGIDA.а у B. nigra (AHJ09878), Рис. 5. Cтроение белка FRIGIDA. A - Белок FRIGIDA у A. thaliana, Б - Белок FRIGIDA.a у Brassica, В - Белок FRIGIDA.b у Brassica, MEEKARSLS, MEEARSIS, MEEEARAIS, MEGEARSIS и MEQGEARSIS – аминокислотные повторы (в скобках число повторов), A - C – геномы и субгеномы Brassica, (*** - 37-а.о. область, содержащая девять а.о. (*), характерных для класса I FRIGIDA.

повтор MEQGEARSIS. Эти повторы перекрываются с доменом Frigida и coiled-coil доменом в C-концевом участке белка.

Приведенная на рис. 6 дендрограмма нуклеотидных последовательностей наглядно иллюстрирует наши представления о двух локусах FRIGIDA и аллельном разнообразии этих локусов у видов Brassica. Отчетливо разделяются линии Brassicaceae I и II, трибы внутри каждой линии и локусы FRI.a и FRI.b в пределах рода Brassica, а однолетний диплоид A. thaliana с его редуцированным геномом отделен от многолетнего тетраплоида A. lyrata.

Вопрос о том, можно ли интерпретировать выявленный нами диморфизм FRIGIDA.у B. nigra в пользу двухлокусной модели, важен для возникновению двух локусов. Irwin и соавторы (Irwin et al., 2012) предложили модель возникновения двух локусов FRIGIDA у B. oleracea (С и С9), по которой сначала в результате трипликации генома предка Brassica, локусы FRIGIDA разместились на хромосомах С2, С3 и С9, а затем в ходе эволюции третий локус FRIGIDA с хромосомы С2 был утерян. Далее виды Brassica сохранили два локуса FRIGIDA, а виды Arabidopsis – только один, причем у A. thaliana этот локус расположен на хромосоме 4, а у A. lyrata на хромосоме 8. Примечательно, что все нуклеотидные последовательности последовательности FRI.a – на FRIGIDA у A. thaliana. Можно предположить, что у общего предка Brassicaceae ген FRIGIDA был дуплицирован и сохранился у линий Arabidopsis и Brassica. В процессе отделения от A. lyrata в геноме A. thaliana сохранился только один из дуплицированных генов, соответствующий FRI.a Brassica, а у A. lyrata со временем этот локус был утерян, и остался дупликат, соответствующий локусу FRI.b Brassica (см. Hu et al., 2011).

Если локус FRI.b не только экспрессируется, но и, действительно, участвует в регуляции перехода к цветению, то можно предположить, что он сохранился в линии Brassica A/C в связи с особенностями фракционирования и неофункционализации дуплицированных генов у B. rapa и B oleracea, эволюция которых происходила в более прохладных климатических условиях, а в последние 10 тыс. лет и под сильным давлением искусственного отбора. В пользу такого предположения говорит Рис. 6. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей гомологов гена FRIGIDA у видов семейства Brassicaceae. I и II линии (lineages) семейства Brassicaceae. Алгоритм Maximum Likelihood; величины бутстрепа рассчитаны для 1000 повторений. Дерево укоренено относительно нуклеотидной последовательности FRIGIDA из A. thaliana H51 (AF228499).

избирательное сохранение у B. rapa множественных копий FLOWERING LOCUS C как ключевого гена перехода к цветению, столь критичного для адаптации к условиям внешней среды (Xiao et al., 2013).

SCAR маркеры для изучения аллельного разнообразия гена FRI.a и FRI.b геномов А, В и С. Обнаруженные нами последовательности FRIGIDA в геномах Brassica были использованы для создания специфичных маркеров. С этой целью мы провели множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей гена FRIGIDA из геномов А и С. Присутствие специфичных полиморфизмов в этих последовательностях позволило нам сконструировать геном-специфичные праймеры и создать четыре пары SCAR маркеров, которые соответствуют полноразмерным последовательностям локусов FRI.a и FRI.b (2500 и 2100 п.н., соответственно) и различают эти локусы в геномах А и С (рис. 2, табл. 4). Для верификации локусспецифичных маркеров геномов и субгеномов А и С был проведен скрининг образцов B. rapa (геном A), B. oleracea (геном C), B. carinata (геном BC), B.

juncea (геном AB) и B. napus (геном AC). Все исследованные образцы Brassica одновременно содержали оба локуса FRI.a и FRI.b.

Множественное выравнивание полноразмерных нуклеотидных последовательностей локусов FRI.a и FRI.b из B. rapa, B. oleracea, B. juncea, B. carinata и B. napus и FRIGIDA у других видов Brassicaceae позволило выявить наиболее консервативные участки, которые могли сохраниться у B.

nigra в ходе эволюции. На основании таких участков, присутствующих во всех последовательностях FRIGIDA, изолированных из Brassicaceae, была разработана и оптимизирована система праймеров (BrFRIF и BrFRIR), которые фланкируют фрагмент гена FRIGIDA длиной около 1300 п.н. Эти праймеры являются только ген-специифичными и не позволяют различать геном- и локус- специфичные формы гена (рис. 2, табл. 4). Для верификации локус-специфичных маркеров генома и субгеномов В был проведен скрининг образцов B. nigra (геном B), B. carinata (геном BC) и B. juncea (геном AB).

Для массового скрининга локусов FRI.a и FRI.b у культурных видов Brassica мы создали систему локус-специфичных маркеров, дающих единичный сигнал амплификации. В геномах А и С в области первого интрона FRIGIDA найден участок, общий для обоих локусов FRI.a и FRI.b.

На основании этого участка был создан ген-специфичный праймер BrAC.FRIaFRIb (см. рис. 2, табл. 4).

Таблица 4. Маркеры локусов FRIGIDA из геномов А, В и С Brassica.

Локус- и геном-специфичные SCAR маркеры для изучения аллельного разнообразия локусов FRIGIDA геномов и субгеномов А и С Brassica Ген-специфичные SCAR маркеры для изучения аллельного разнообразия Br.FRI.b BrFRIR Локус- и геном-специфичные маркеры для массового скрининга локусов *Последовательности праймеров указаны в табл. 1.Центровка Для амплификации локуса FRI.a из генома и субгеномов А и генома С и субгеномов С Brassica использовали пару праймеров BrAC.FRIaF и BrAC.FRIaFRIbR. Для амплификации локуса FRI.b из генома и субгеномов А Brassica использовали пару праймеров BrA.FRIbF и BrAC.FRIaFRIbR, а для амплификации локуса FRI.b из генома и субгеномов С Brassica - пару праймеров BrС.FRIbF и BrAC.FRIaFRIbR. Размер созданных таким образом локус-специфичных маркеров составляет около 720 п.н. Множественное выравнивание полноразмерных нуклеотидных последовательностей локусов FRI.a и FRI.b из B. rapa, B. oleracea, B. juncea, B. carinata, B. napus и полученных нами последовательностей фрагментов FRI.a и FRI.b из генома и субгеномов B позволило выявить локус-специфичные участки, характерные только для генома B. На основании этих участков, была разработана и оптимизирована система геном-специфичных праймеров, которые различают локусы FRI.a и FRI.b в геноме и субгеномах B. Для амплификации локуса FRI.a использовали пару праймеров BrB.FRIaF и BrFRIR (ампликон размером около 900 п.н.), а для локуса FRI.b использовали праймеры BrAB.FRIbF и BrB.FRIbR (ампликон размером около 500 п.н.) (рис.2, табл. 4) Наличие специфичного локуса в исследуемом образце определяется по появлению сигнала амплификации. Для верификации созданных маркеров был проведен скрининг образцов культурных видов Brassica: B. rapa (геном A), B. nigra (геном В), B. oleracea (геном С), B. carinata (геном ВС), B. juncea (геном АВ), и B. napus (геном АС). Присутствие сигналов амплификации целевых фрагментов выявлено во всех исследованных образцах Brassica.

Пара праймеров BrAC.FRIaF и BrAC.FRIaFRIbR является специфичной для локуса FRI.a из геномов и субгеномов А и С Brassica, но не является геномспецифичной.

Последовательности FRIGIDA у фенотипически контрастных форм Brassica. Cозданные нами SCAR маркеры позволили нам провести сравнительный анализ растений B. rapa, которые резко различаются по времени зацветания в отсутствие холодового воздействия. Существенных различий в строении последовательностей FRIGIDA.a обнаружено не было.

Это обстоятельство можно интерпретировать двояко: (1) критический для данного признака участок гена находится за пределами исследованной последовательности, возможно, в регуляторных элементах гена; (2) проявление уникальных для этих форм признаков, связанных с регуляцией перехода к цветению, контролируется генами, отличными от FRIGIDA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве гена-кандидата для изучения гена FRIGIDA у культурных видов Brassica был выбран ген A. thaliana. На основании множественного выравнивания найденных in silico последовательностей гена FRIGIDA из культурных видов Brassica созданы локус-специфичные праймеры. С помощью этих праймеров из геномов Brassica были клонированы локусы последовательностей.

Присутствие двух локусов FRIGIDA отличает культурные виды Brassica от A. thaliana с одним локусом FRIGIDA. Оба локуса FRIGIDA представлены у видов Brassica аллельными формами, специфичными для геномов A, B и C. Как и у A. thaliana, все последовательности локусов FRI.a и FRI.b последовательности белка FRIGIDA.а и FRIGIDA.b содержат центральный консервативный домен Frigida и специфичные N- и C-концевые области, важные для функциональной активности белка. В C- концевой области FRIGIDA.а и FRIGIDA.b в геномах и субгеномах Brassica сохраняется coiledдомен, необходимый для белок-белкового взаимодействия с coil участниками комплекса FRI-C. Для N-концевой области образование такой структуры было предсказано только для FRIGIDA.a генома и субгенома C у B. oleracea, B. carinata и субгенома A у B. juncea. Исходя из этого, можно предположить, что наличие или отсутствие coiled-coil домена в этой области не является критичным для функциональной активности белков FRIGIDA.

Двухлокусная модель FRIGIDA доказана для геномов А и С растений Brassica. В случае B. rapa, скаффолды, в состав которых входят FRI.a и FRI.b локализованы на хромосомах A3 и A4. Для B. oleracea локусы FRI.a и FRI.b картированы на хромосомах C3 и C9 (Irwin et. al., 2012). Для B. nigra (геном В) аналогичных данных нет. Однако отчетливый диморфизм этого гена позволяет предполагать, что ген FRIGIDA в геноме B также представлен двумя локусами на разных хромосомах или двумя локусами на одной хромосоме, возникшими в результате тандемной дупликации, как это показано для двух локусов FLC у A. lyrata (Nah and Chen, 2010, Kemi et. al., 2013).

Сравнительный анализ показал, что последовательности локусов гена FRIGIDA и продуктов их трансляции, характерные для геномов А, B и С диплоидов B. rapa, B. nigra и B. oleracea, сохраняются с высокой степенью консервативности (95-99 %) в субгеномах А, B и С трех аллотетраплоидных видов, B. carinata, B. juncea и B. napus.

На основании локус-специфичных полиморфизмов, характерных для геномов А, С и B Brassica, созданы локус- и геном-специфичные маркеры FRIGIDA. Эти маркеры могут быть использованы для изучения структурного и функционального полиморфизма гена FRIGIDA, для картирования гена FRIGIDA и уточнения связи этого гена с локусом признака «время перехода к цветению», а также применены в селекции культурных видов Brassica на скороспелость.

ВЫВОДЫ

Впервые выявлены сравнительные особенности строения белка FRIGIDA у шести видов Brassica: аминокислотные последовательности FRIGIDA отличаются от прототипа у A. thaliana отсутствием coiled-coil домена в N-концевой области; геном-специфичные варианты FRIGIDA у видов Brassica различаются строением и числом характерных повторов в Сконцевой области.

У трех геномов Brassica ген FRIGIDA представлен двумя локусами.

Сравнительный анализ локусов FRIGIDA у диплоидов Brassica (AA, CC, BB) и производных тетраплоидов (AABB, AACC и BBCC) обнаружил высокую консервативность этого гена.

Созданы и верифицированы локус- и геном-специфичные маркеры FRIGIDA, пригодные для картирования и функционального анализа этого гена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Fadina O. A., Pankin A. A., Khavkin E. E. Molecular characterization of the flowering time gene FRIGIDA in Brassica genomes A and C // Физиол. растений, 2013, Т. 60, С. 277-287.

Фадина О.А. Эволюция гена вернализации FRIGIDA у Brassica // Труды по прикл. бот., ген. и сел. СПб, ВИР. 2013. Т. 173. С. 39-48.

Фадина О.А., Хавкин Э.Е. Ген вернализации FRIGIDA у культурных видов Brassica // Физиол. растений, 2014, Т. 61, С. 334-342.

Фадина О.А., Хавкин Э.Е. ДНК маркеры гена вернализации FRIGIDA у культурных видов Brassica. Докл. РАСХН, 2014, №2, С. 3-6.