На правах рукописи

БОЛДЫРЕВА

МАРГАРИТА НИКОЛАЕВНА

HLA (КЛАСС II) И ЕСТЕСТВЕННЫЙ ОТБОР. «ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ» ГЕНОТИП,

ГИПОТЕЗА ПРЕИМУЩЕСТВА «ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ» ГЕТЕРОЗИГОТНОСТИ.

14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва, 2007 г.

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, Алексеев Л.П.;

Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Г.Т.;

доктор медицинских наук, профессор Ярилин А.А.;

доктор медицинских наук, профессор Певницкий Л.А.

Ведущая организация: Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава

Защита состоится “_26_” декабря 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп. 2. Факс: (499) 617-10-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России».

Автореферат разослан “_” 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Л.С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования полиморфизма главного комплекса тканевой совместимости человека (HLA) проводятся с середины 60-х годов, когда методами серологического типирования было выявлено, что в разных популяциях определяется разное частотное распределение вариантов HLA антигенов. Первое Международное Рабочее Совещание по изучению HLA (IHWS) состоялось в 1964 году в США. С этого момента в рамках Совещания десятки лабораторий из разных стран мира стали заниматься изучением полиморфизма системы HLA. Эти исследования сопровождались интенсивным международным обменом типирующими сыворотками, что привело к быстрому накоплению сведений о широчайшем полиморфизме этой системы. В 1972 году пятое Рабочее Совещание уже полностью было посвящено этому направлению.

В 1967 году Amiel J.C. на третьем Рабочем Совещании впервые сообщил об обнаруженной им связи антигенов HLA с развитием болезни Ходжкина. Это сообщение послужило началом развития направления «HLA и болезни».

Особенно актуальными эти исследования стали после открытия Цинкернагелем и Догерти [Zinkernagel R.M. and Doherty P.C., 1974] иммунного распознавания вирусных антигенов Т-лимфоцитами «в контексте» белков главного комплекса тканевой совместимости хозяина, в результате которого стало ясно, что гены, кодирующие HLA белки, являются, по сути, генами иммунного ответа, определяя направление процессов, происходящих в иммунной системе. В последующем целый ряд исследователей получили многочисленные доказательства роли HLA в развитии заболеваний, связанных с иммунной системой: инфекционных, аутоиммунных и онкологических [Thorsby E., 1997].

В 80-х годах исследователи обратили внимание на связь антигенов HLA и репродуктивные проблемы. Целый ряд работ был посвящен изучению совпадений по HLA антигенам среди пар с необъяснимым бесплодием [Алексеев Л.П. и соавт.1980; Collins J.A. et al, 1983; Coulam C.B. et al., 1987; Wilcox A.J. et al., 1988;

Creus M. et al., 1998]. В 90-х годах группа датских исследователей во главе с Christiansen O.B. нашла взаимосвязь антигенов HLA класса II и репродуктивными потерями [Christiansen O.B. et al, 1992] у женщин. С тех пор продолжается накопление фактов о роли HLA в процессах репродукции.

Прогрессу в области исследований популяционного полиморфизма системы способствовало открытие K. Mullis в 1983 г полимеразной цепной реакции (ПЦР) и разработка затем на ее основе новых методов и технологий HLA генотипирования, которые стали широко использоваться зарубежными исследователями системы HLA.

Однако в России до начала 90-х годов практически все исследования полиморфизма системы HLA выполнялись только серологическими методами и касались, главным образом, изучения распределения антигенов I класса, что было связано с отсутствием в России доступных для исследователей качественных типирующих сывороток к антигенам II класса. Именно поэтому подавляющее большинство отечественных публикаций было посвящено изучению распределения антигенов HLA класса I. Популяционные исследования антигенов HLA были проведены среди народов Сибири и Дальнего Востока [Рычков Ю.Г. и Удина И.Г.,1985; Fevelova V.V.,1990; Дегтярева Е.А. и Пузырев В.П.,1993;

Коненков В.И. и соавт.,1993; Сартакова М..Л. и соавт.,1998;. Яздовский В.В. и соавт.,1998]. Ряд публикаций касался изучения некоторых финно-угорских народов, проживающих на территории России [Удина И.Г.и Раутян Г.С., 1994;

Гусева И.А. и соавт.1998]. В то же время было очевидно, что популяционное разнообразие населения России, занимающей огромную евразийскую территорию и генетически очень разнообразную, было изучено недостаточно. Кроме того, к моменту начала исследований уже было установлено, что II класс HLA определяет значительную часть генетической предрасположенности к развитию ряда заболеваний, связанных с иммунной системой [Skarvsag S. et al., 1992; Ploski R., et al.,1995; Dessoukey M.W., 1996; Minton E.J., 1997].

В начале 90-х годов сотрудники отдела иммуногенетики (рук. профессор Л.П.Алексеев) ГНЦ Института иммунологии ФМБА России в рамках 11 IHWS выполнили популяционное исследование HLA класса II генотипирующими реагентами, предоставленными организаторами Международного Совещания [Alexeev L.P. et al. 1992].

В 1996г. Трофимов Д.Ю. разработал метод мультипраймерной ПЦР и реагенты для типирования полиморфных генов HLA класса II. Разработка метода и создание генотипирующих реагентов позволили коллективу сотрудников отдела иммуногенетики Института реализовать проведение настоящего исследования.

Цель исследования. Изучить популяционное разнообразие и генетическое родство ряда этнических групп России и стран СНГ на основе типирования генов HLA класса II (DRB1,DQA1,DQB1). Оценить значение генов HLA (класс II) для развития аутоиммунных заболеваний. Предложить и обосновать гипотезу об участии генов HLA (класс II) в естественном отборе.

Задачи исследования.

1. Определить частоты вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA-DQB в 20 популяционных группах России и стран, граничащих с Россией, определить степень их генетического родства между собой и по отношению к другим народам мира.

2. Определить частоты гена DRB1 в 11 популяционных группах больных сахарным диабетом 1 типа, определить HLA DRB1 маркеры чувствительности и устойчивости к развитию заболевания.

3. Оценить значение генов HLA DRB1 при идиопатическом невынашивании беременности.

4. На основании собственных данных и данных литературы предложить и обосновать гипотезу об участии генов HLA II в естественном отборе на индивидуальном и популяционном уровне.

Научная новизна. Впервые получены данные о частотном распределении вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 в 20 популяционных группах (русские из Архангельской, Костромской, Смоленской, Вологодской областей;

белорусы из Витебской, Брестской, Гомельской областей; украинцы из Львовской и Хмельницкой областей, марийцы, удмурты, татары, гагаузы, армяне, ненцы, саамы, казахи, калмыки, тувинцы, буряты), на основании частот вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 определены генетические расстояния между исследованными популяциями, на основании частот вариантов гена DRB определены генетические расстояния между исследованными популяциями и популяциями из разных стран мира.

Впервые получены данные о частотном распределении гена DRB1 среди больных сахарным диабетом 1 типа в 11 популяционных группах (русские из Москвы, Архангельской, Вологодской областей и Удмуртии; татары, мари, удмурты, узбеки, тувинцы, калмыки и буряты), определены генетические маркеры предрасположенности и устойчивости к заболеванию по каждой популяции, а также общие маркерные генотипы, ассоциированные с чувствительностью и устойчивостью к развитию сахарного диабета 1 типа.

Впервые получены данные об отрицательном значении гомозиготности по генам DRB1 для репродуктивного успеха у мужчин.

На основании данных полученных в результате проведенных исследований и данных литературы предложена новая концепция «функционального» генотипа, в котором «функционально» гомозиготный генотип может состоять из разных вариантов гена DRB1, ассоциированных с функционально сходным проявлением и гипотеза преимущества «функциональной» гетерозиготности.

Научно-практическая значимость. Данные о частотном распределении вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 в 20 популяционных группах России и стран, граничащих с Россией, имеют самостоятельное популяционногенетическое значение. Они могут быть использованы также как база данных для региональных, федеральных и международных популяционных генетических исследований, а также в качестве контрольных для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих регионах.

Полученные данные о частотном распределении вариантов гена DRB среди жителей г.Москвы и Удмуртии, принадлежащих к русскому этносу, могут быть использованы в качестве контрольных для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих регионах.

Данные о степени генетического родства между популяциями, можно использовать для оптимизации банка неродственных доноров-добровольцев гемопоэтических стволовых клеток по количественному и популяционному составу, а также для оптимизации подбора пар донор-реципиент при органных трансплантациях.

аутоиммунным заболеваниям на основании оценки DRB1 генотипа можно использовать для дифференциальной диагностики заболеваний, ассоциированных с иммунной системой и генетического прогнозирования в семьях больных аутоиммунными заболеваниями.

Сформулированная концепция «функционального» генотипа и гипотеза «функциональной» гетерозиготности могут служить вкладом в теорию иммуногенетики и иммунологии.

Публикации по теме диссертации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 73 печатных работы, в том числе 22 статьи в центральных российских журналах, 40 публикаций в иностранных журналах.

Результаты исследования были представлены на 7 Европейских конференциях по гистосовместимости (Будапешт 1997; Страсбург 1998; Крит 1999; Монпелье 2000, Гранада 2001, Страсбург 2002, Баден-Баден 2003) и 3 конгрессах РААКИ в 2001, 2002, 2007 гг.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов и глав результатов собственных исследований с анализом литературных данных и выводов. Работа содержит 29 таблиц и 11 рисунков. Библиография состоит из отечественных и 485 зарубежных источников.

Материалы и методы исследования В ходе работы были обследованы 2525 здоровых (не имеющих тяжелых хронических заболеваний и жалоб на момент обследования) взрослых, не связанных кровным родством представители двадцати этнических групп, проживающих в различных регионах России, Украины, Белоруссии и Казахстана.

Исследования проводились сотрудниками отдела иммуногенетики в период 1994 год.

Образцы крови, которые использовались для выполнения исследования, были получены из разных источников: биоматериал от русских из Смоленской области (n=156), белорусов из Витебской (n=70), Брестской (n=105), Гомельской (n=100) областей, украинцев из Хмельницкой (n=138) и Львовской (102) областей, марийцев (202) из республики Марий Эл, гагаузов (n=225) из республики Молдова, полученный в результате этнографических и медико-генетических экспедиций, предоставила д.б.н. Балановская Е.В. (Медико-генетический научный центр РАМН); биоматериал, от большеземельских ненцев (n=92 - Ненецкий Автономный Округ), кольских саамов (n=107, п.Ловозеро, Мурманская область), русских из Архангельской области (n=81), полученный в ходе медико-генетических экспедиций, предоставлен д.м.н. Евсеевой И.В. (Северный госмедуниверситет, г.Архангельск), биоматериал от удмуртов (n=202), собранный в различных районах республики Удмуртия предоставили к.м.н. Поздеева О.С. и Ганичева Л.Л.

(Ижевская государственная медакадемия); биоматериал от русских из Костромской области (n=126) предоставлен Целинской И.Н. (Костромская областная больница); биоматериал от русских из Вологодской области (n=121) предоставлен Кашининым М.Н. (Вологодская областная б-ца); биоматериал от татар (потомков переселенных в годы отечественной войны из Казани, n=87) был собран в Кировской области и предоставлен проф.Зайцевой Г.А. (Кировский НИИ гематологии и переливания крови); биоматериал от тувинцев (n=164) из разных районов республика Тыва был предоставлен д.м.н. Осокиной И.В. (Институт медицинских проблем Севера СО РАМН).

биоматериал от казахов (Актюбинская область республики Казахстан, n=141), бурят (Гусино-Озерского района Бурятии, n=87), калмыков (из разных районов республики Калмыкия, n=136) и армян (республика Армения, n=83).

В рамках исследований по направлению «HLA и репродукция» были обследованы 240 супружеских пар с повторными прерываниями беременности и неудачными ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение), проходившими обследование в Центре иммунологии репродукции (98 пар) и лаборатории клинической цитогенетики Медико-генетического научного центра РАМН ( пары). Контролем служили 74 пары, имеющие детей, обратившиеся в Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН по поводу установления отцовства, которое было подтверждено, и 300 здоровых доноров крови ( женщин и 203 мужчин) из г. Москвы.

Совместно с сотрудниками Эндокринологического научного центра РАМН были обследованы 6 популяционных групп больных сахарным диабетом 1 типа и соответствующие им контрольные группы, представлявшие собой случайным образом отобранных, здоровых на момент исследования, лиц различной этнической принадлежности: русские из г.Москвы (79 больных СД1/ 300 контроль), татары (96/87), мари (28/202), калмыки (13/136), буряты (25/87), узбеки (69/109).

Биоматериал от больных сахарным диабетом 1 типа русских из Архангельской области (48/81) предоставлен д.м.н. Евсеевой И.В. (Северный госмедуниверситет, г.Архангельск); русских из Вологодской области (69/121) предоставлен Кашининым М.Н. (Вологодская областная б-ца); русских из Удмуртии (54/159) и удмуртов (52/101) - Ижевской государственной медакадемией (Ганичева Л.Л.), тувинцев (15/164) - Институтом медицинских проблем Севера СО РАМН (Осокина И.В.).

Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом высаливания по стандартной процедуре [Miller S.A. et al., 1988]. HLA генотипирование образцов ДНК проводили методом мультипраймерной ПЦР [Трофимов Д.Ю., 1996]. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали наборы HLAДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-Технология», Россия). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" («НПФ ДНК-Технология", Москва).

Статистическая обработка данных включала: определение частот гена DRB1 и гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 методом максимального правдоподобия (maximum-likelihood). Для расчетов использовали компьютерную программу «Арлекин»[Schneider S. et al., 1966], версия 2.1 (URL:http://anthro.unige.ch/arlequin).

Расчет генетических расстояний [Nei M., 1972] на основании генных частот проводили при помощи компьютерной программы «DJgenetic», версия 0. (Серегин Ю.А., Балановская Е.В.). Графически результаты кластерного анализа представлены в виде дендрограмм и графиков многомерного шкалирования по двум осям [Дерябин В.Е., 1971], построение которых проводили с помощью компьютерной программы «Статистика» (версия 6.0). Тестирование на нейтральность отбора по Ewens-Watterson для локуса DRB1 было проведено при помощи компьютерной программы «Арлекин».

Относительный риск (ОР) развития/устойчивости к сахарному диабету типа вычисляли по формуле B.Woolf [Певницкий Л.А., 1998]. Этот показатель означает, во сколько раз чаще встречается заболевание при наличии в генотипе индивидуумов какого-либо варианта HLA генов по сравнению с частотой заболевания у индивидуумов без этого HLA варианта. Значения ОР большие, чем 1, свидетельствуют о том, что конкретный вариант DRB1 гена ассоциирован с развитием заболевания, причем, чем больше величина относительного риска, тем ассоциация более выражена. Значения ОР, меньшие, чем 1, свидетельствуют об ассоциации вариантов HLA генов с устойчивостью к развитию заболевания, причем, чем меньше величина относительного риска, тем ассоциация того или иного варианта гена DRB1 с устойчивостью к развитию заболевания более выражена. Значения ОР, близкие к 1, свидетельствует об отсутствии ассоциаций.

Статистическую достоверность значений ОР определяли по точному двустороннему критерию Фишера без корректировки на количество аллелей [Певницкий Л.А., 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Полиморфизм HLA II и популяционные исследования Исследование генетического родства 20 популяций России и стран СНГ на основании полиморфизма гена HLA II DRB1 и гаплотипов DRB1DQA1-DQB1. Вычисленные частоты вариантов гена DRB1 и трехлокусных гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 были использованы для расчета генетических расстояний между популяциями [Болдырева М.Н. и соавт., 2005, 2006(1), 2006(2)].

Результаты кластерного анализа представлены на рисунках 1, 2, 3, в виде дендрограмм и двухмерного графика многомерного шкалирования: на рис.1 – дендрограмма, построенная на основе частот вариантов только гена DRB1, на рис.2 - на основании частот вариантов гаплотипов трех генов - DRB1, DQA1 и DQB1.

На обеих дендрограммах (рис.1,2) все исследованные популяционные группы образовали три крупных кластера. Один кластер образовали 8 популяций, проживающие на территориях, относящихся к центральной и южной частям Восточной Европы: три группы белорусов (из Гомельской, Брестской и Витебской областей), две группы украинцев (из Львовской и Хмельницкой областей), русские из Смоленской области, гагаузы и армяне.

Рис.1. Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот гена DRB1- для 20 популяций России и стран СНГ. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.

Хмельницкой и Львовской областей и русских из Смоленской области было сходным. Белорусы из южных областей республики (Гомельская и Брестская) оказались генетически близкими друг другу. Генетически близкими между собой оказались также и украинцы из центральной (Хмельницкая область) и западной частей (Львовская область) страны. Положение русских из Смоленской области на обеих дендрограммах также оказалось более близким к исследованным украинским популяционным группам, чем к белорусским.

В то же время положение белорусов с севера республики (Витебская область) на двух дендрограммах различается. На дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 (Рис.1) эта группа белорусов не вошла в один кластер с белорусами из южных областей (Брестская и Гомельская) страны, в то время как на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB (рис.2), все три группы белорусов образовали единый «белорусский» кластер.

Рис.2 Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов для 20 популяций России и стран СНГ. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.

Разное положение занимают на двух дендрограммах гагаузы и армяне, генетически сильно отличающиеся как между собой, так и от славянских популяций. Если на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB (рис.1) эти две популяционные группы образуют отдельный кластер, то на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB (рис.2), гагаузы и армяне последовательно «примыкают» к кластеру «славянских»

популяций.

Следующий кластер образовали популяции, проживающие в северном и северо-западном регионах европейской части России. Однако оказалось, что дендрограммы, построенные на основе частот вариантов гена DRB1 (рис.1) и DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов (рис.2) несколько различаются. Русские из Костромской и Вологодской областей по обеим дендрограммам являются наиболее близкими друг другу популяционными группами. Наиболее близкими этим двум группам русских по дендрограмме гена DRB1 (рис.1) являются русские из Архангельской области, а затем уже марийцы. По дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 (рис.2), генетически более близкими русским из Костромской и Вологодской областей являются марийцы, а затем уже русские из Архангельской области.

Еще одно отличие двух дендрограмм касается удмуртов и татар, образовавших отдельный кластер. Если на дендрограмме гена DRB1 (рис 1.) этот кластер примыкает к популяциям, северо-западных областей России, то на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 (рис 2) этот кластер уже примыкает к популяциям с азиатским генофондом (казахи, калмыки, тувинцы и буряты). Однако в обоих случаях кластер удмуртов и татар довольно сильно отличается от большинства популяций, входящих с ними в более крупный кластер. Это позволяет предположить, что удмурты и татары занимают промежуточное положение между европейским и азиатским генофондом. Следует подчеркнуть, что удмурты и татары между собой также заметно различаются (рис.1,2).

Большеземельские ненцы и кольские саамы, на основе частот гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 (рис 2) вошли в один кластер с европеоидным популяциям севера и северо-запада восточной Европы, в то же время сильно от них отличаясь. На дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 (рис 1), ненцы и саамы оказались уже в одном кластере с популяциями с выраженным азиатским генофондом (казахи, калмыки, тувинцы, буряты), также сильно от них отличаясь (особенно саамы). Полученный результат позволяет предположить наличие в генофонде ненцев и саамов генов как северо-европейского, так и азиатского происхождения.

Взаиморасположение популяций азиатского происхождения, составляющих основу третьего кластера на обеих дендрограммах (рис.1,2) практически не различается. Казахи и калмыки, а также буряты и тувинцы оказались попарно генетически близкими друг другу популяциями. Но величина генетических различий между перечисленными группами на дендрограмме гаплотипов DRB1DQA1-DQB1 (рис.2) была более выражена по сравнению с дендрограммой на основе частот гена DRB1 (рис.1).

Взаиморасположение исследованных 20 популяций, на двухмерных графиках многомерного шкалирования, построенных на основании частот гена DRB1 и DRB1-DQA1-DQB1 принципиально не отличалось от их положения на соответствующих дендрограммах.

Исследование генетического родства 20 исследованных популяций и популяций из разных стран мира на основании полиморфизма гена HLA II DRB1. Для сравнения с исследованными популяционными группами из доступных литературных источников были выбраны литературные данные по частотам гена DRB1 в популяциях, представляющих, насколько это возможно, коренное население различных стран Европы, Азии, Австралии, Новой Зеландии и Америки. Европейское население представлено жителями Норвегии [Капустин С.И.,1998], Оркнейских островов, Уэльса, Северной Ирландии, Англии, Дании, Финляндии, северной Германии, Швеции, Бельгии, Австрии, юго-восточной Франции, Швейцарии, Чехии, Венгрии, Хорватии, Болгарии, Италии, о.Сардиния, Греции [Terasaki P.I.., Gjertson D.W., 1997]. Кроме того, были использованы данные по частотам вариантов гена DRB1 у евреев из Израиля, жителей Японии, Кореи, Южного Китая, Тайваня, Таиланда, а также аборигенов Австралии, маори, коренных жителей Новой Зеландии, индейцев из Аргентины, Бразилии, Мексики, эскимосов Гренландии [Terasaki P.I.., Gjertson D.W., 1997]. Результаты этого анализа в виде графика многомерного шкалирования представлены на рисунке 3.

[Болдырева М.Н. и соавт. 2006(2)]. Плотное «ядро», состоящее из большинства взятых в анализ европейских популяций, вытянуто с юга на север. К этому «европейскому ядру» с одной стороны примыкают удмурты, татары и мари – европеоиды с примесью уралоидного компонента, причем у марийцев в большей мере, чем у удмуртов и татар, проявляется и присутствие «угро-финского»

компонента.

Как следует из данных, представленных на рис.3, из исследованных азиатских популяций России и стран СНГ ближе всего к европейцам оказались казахи и калмыки. Основу генофонда тувинцев и, особенно, бурят составляют гены центрально-азиатского происхождения.

Направление Рис 3. Расположение 20 исследованных популяций России, стран СНГ и ряда стран Евразии, Австралии, Новой Зеландии, Америки в рамках многомерного шкалирования на основе генетических расстояний по частотам гена DRB1. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты, Сар – жители о.Сардиния, Гре – греки, Бол – болгары, Ита – итальянцы, Гаг – гагаузы, Евр – евреи, Нор – норвежцы, Орк – оркнейцы, Уэл – уэльсцы, СИр – североирландцы, Анг – англичане, Фин – финны, Нем – немцы, Дат – датчане, Чех – чехи, Блг – бельгийцы, Авс – австрийцы, Фра – французы, Шве – шведы, Швц – швейцарцы, Вен – венгры, Хор – хорваты, Таил – таиландцы, Тайв – китайцы из Тайваня, ЮКит – китайцы из южного Китая, Кор – корейцы, Япо – японцы, ИнА – индейцы из Аргентины, ИнМ – индейцы из Мексики, ИнБ – индейцы из Бразилии, Эск – эскимосы Гренландии, Авл – аборигены Австралии, Мао – маори из Новой Зеландии.

Особенно удивительно, что саамы, живущие на Кольском полуострове, оказались наиболее близки к индейцам из Аргентины и бурятам. Положение ненцев на графике многомерного шкалирования с одной стороны может свидетельствовать о своеобразии указанной популяционной группы, сочетающей происхождения, а с другой - о недостаточности сведений об HLA генетическом профиле различных популяционных групп, в том числе и нашей страны. Эти пробелы могут искажать взаиморасположение популяций и не позволяют более определенно судить об их происхождении и генетическом родстве.

Таким образом, взаимоположение 20 изученных популяций относительно друг друга и относительно разных популяций мира на графиках многомерного шкалирования и дендрограммах, построенных на основании расчета генетических расстояний по частотам вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1, адекватно отражают их этногенез и географическое взаиморасположение. Это подтверждает возможность использования и отдельных генов HLA класса II, в частности наиболее полиморфного гена DRB1, и гаплотипов, включающих несколько генов, в частности DRB1-DQA1-DQB1, для изучения генетической истории формирования различных народов. Основные генетические различия между исследованными популяциями улавливаются уже при использовании только гена DRB1, хотя исследование DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов, позволяет выявить более тонкие особенности популяционных групп, что предпочтительнее для генетического анализа. Такой вывод совпадает с мнением Begovich A.B. et al.

[2001], который считает, что гаплотипы генов HLA являются «подразделением»

аллелей, увеличивающим полиморфизм HLA., что совпадает с современными представлениями о том, что беспрецедентный полиморфизм генов HLA, в частности генов II класса, предоставляет уникальные возможности для исследователей в области популяционной геномики [Erlich H.A. et al.,.2006].

Есть ли селекция гена DRB1 в обследованных группах?

Данные теста на нейтральность отбора [Ewens W.J., 1972; Watterson G.A., 1978 ] свидетельствуют о том, что в подавляющем большинстве исследованных популяций наблюдаемая гомозиготность по специфичностям гена DRB1 была существенно ниже, чем ожидаемая, что свидетельствует о наличии балансирующей селекции по отношению к гену DRB1 и совпадает с выводами авторов исследований, выполненных на разных популяциях [Klitz W; et al.,1986;

Salamon H, et al., 1999; Tiercy J.M. et al., 1992; Mack S.J. et al., 2000 Tsai Y. et al.,2006 Luo M. et al.,2006]. Исключение составляют только саамы и татары, у которых значения ожидаемой и наблюдаемой гомозиготности достоверно не различались, что говорит скорее о нейтральности отбора в отношении указанных групп. Подобные результаты также получены исследователями относительно разных популяций [Tsai Y. et al.,2006 Luo M. et al,2006].

Заключение. На основании проведенного анализа данных типирования исследованных популяционных групп по вариантам генов HLA класса II можно заключить, что ген DRB1, и, особенно, трехлокусные гаплотипы DRB1-DQA1-DQB адекватно отражают этногеографическое взаиморасположение исследованных популяционных групп. Большая часть исследованных популяций находится под влиянием балансирующей селекции, которая приводит к снижению количества гомозигот, в частности по гену DRB1 и, соответственно по всем сцепленным с ним генам II класса HLA.

Селекция может осуществляться через функцию генов HLA, как генов иммунного ответа. Проверка этой гипотезы предстоит в последующих разделах.

2. Естественный отбор и HLA II использования полиморфных генов HLA класса II для исследования генетического родства популяций. С другой стороны известно, гены HLA класса II – это гены иммунного ответа, непосредственно участвующие в его развитии, прежде всего на инфекционные агенты [Хаитов Р.М., 2005]. Установлено также, что гены HLA класса II имеют выраженную ассоциацию с развитием аутоиммунных заболеваний [Thorsby E., 1997; Дедов И.И. и соавт., 2002] и имеют отношение к развитию ряда патологий, приводящих к нарушению репродукции [Алексеев Л.П. и соавт. 1986;

Christiansen O.B., et al, 1992]. Эти факты говорят о том, что гены HLA II класса должны непосредственно подвергаться действию естественного отбора Инфекции. Открытие Цинкернагелем и Догерти [Zinkernagel R.M. and Doherty P.C., 1974] иммунного распознавания вирусных антигенов Т-лимфоцитами «в контексте» белков главного комплекса тканевой совместимости хозяина, за которое им была присуждена Нобелевская премия, позволило редположить, что генетические различия индивидуумов в локусе, кодирующем MHC белки, могут влиять на интенсивность и эффективность ответа хозяина на инфекцию [Lipsitch M. et al, 2003], определяя тем самым, результат этого взаимодействия. Таким образом, гены HLA II класса, являясь генами иммунного ответа, продукты которых представляют чужеродные пептиды клеткам иммунной системы должны находиться под давлением естественного отбора.

Усилия многих лабораторий были направлены на изучение возможных точек приложения естественного отбора, касающегося действия инфекционного окружения. В ряде исследований содержатся результаты об ассоциациях разных вариантов генов HLA с исходом инфекций противоречащие друг другу [Lockett S.F., et al., 2001; Ng M.N. et al., 2004; Roe D.L. et al., 2000; Thursz M. et al., 1999].

недостаточности наших знаний о процессах, которые могут происходить в результате действия инфекционных агентов.

В таблице 1 приведены данные о вариантах гена DRB1, ассоциированных с развитием и устойчивостью (или самостоятельным очищением от патогена) к некоторым инфекциям.

Таблица 1. DR маркеры чувствительности и устойчивости к разным инфекционным заболеваниям.

Заболевание Чувствительность очищение от Подобные данные имеются в литературе и в отношении ассоциаций вариантов гена DRB1 с эффективным или неэффективным ответом на вакцинацию [Hayney M.S. et al, 1996; Caillat-Zucman S.et al, 1998; Hopkins W.J. et al, 1999; Nardin E.H. et al, 2000; Vidan-Jeras B. et al, 2000; Poland G.A. et al, 2001; Qian Y. et al, 2002; Thio C.L. et al, 2003; Wang C. et al, 2004].

Репродукция. Сексуальное предпочтение. Значение генов главного комплекса тканевой совместимости (MHC) в выборе сексуального партнера у млекопитающих было обнаружено в 70-х годах [Yamazaki K., et al,1975]. И в последующем, основная масса работ, посвященных поиску доказательств неслучайности выбора полового партнера, была выполнена на животных. Так, в работе Hedrick P.W. было установлено, что самки мышей, при наличии возможности выбора, предпочитают самцов, отличающихся от них по MHC, что фактически приводит к уменьшению пропорции гомозигот среди потомства, усиливая тем самым его генетический полиморфизм [Hedrick P.W., 1992].

Установлено, что у животных уникальность индивидуального запаха, с которой связывают индивидуальное распознавание, выбор партнера, «гнездовое»

поведение и селективный блок беременности связана с генами MHC [Jacob S., et al, 2002]. Сексуальный выбор, связанный с генами MHC, приводит к рождению потомства, преимущественно гетерозиготного по генам MHC. Это может не только усиливать резистентность к инфекциям, но и препятствовать инбридингу в целом.

Именно предотвращение инбридинга может быть наиболее важной функцией MHC-ассоциированного выбора полового партнера и основным селективным механизмом, сохраняющим разнообразие MHC генов у видов с подобными возможностями. [Potts W.K. et al, 1994].

У людей влияние социально-культурной среды на процесс выбора полового партнера имеет существенное значение, поэтому исследование биологической роли системы HLA в вопросах, связанных с сексуальным предпочтением, затруднено. Тем не менее, существует ряд исследований, посвященных этой теме. Так, в работе Jacob S. et al. (2002) было показано, что женщины могут различать запахи мужчин (нравится/не нравится), отличающихся друг от друга уже по одному аллелю HLA. Доказательства направленности в выборе сексуального партнера были получены и в серии работ, выполненных в религиозной секте хатеритов (европеоиды). Направленность в выборе сексуального партнера проявлялась в том, что только количество гомозиготных по генам HLA индивидуумов было ниже математически ожидаемого (в соответствии с менделевским распределением). В отношении трех других полиморфных генов, расположенных на других хромосомах, подобного эффекта отмечено не было [Kostyu D.D., et al, 1993; Robertson A., et al, 1999]. Было установлено также, что беременность у женщин из секты хатеритов, совпадавших с партнером по вариантам гена DRB1, что могло привести к увеличению гомозиготности потомства, наступала через более длительные интервалы времени по сравнению с парами, не совпадавшими по гену DRB1 [Ober C., et al, 1992]. Это могло служить причиной меньшего количества детей в таких семьях [Ober C., et al, 1988].

Подобные результаты, подтверждающие неслучайный выбор сексуального партнера были получены на племенах южноамериканских индейцев [Hedrick P.W., Black F.L., 1997].

Невынашивание беременности и бесплодие неясного генеза.

Исследования, свидетельствующие о том, что HLA антигены могут влиять на развитие плода и последующий исход беременности, были начаты в 60-х годах. В течение 60-70х годов были получены данные о том, что зародыши с отцовскими HLA антигенами, отличающимися от материнских HLA антигенов (гистонесовместимая беременность) могут иметь селективное преимущество в выживании по сравнению с зародышами, унаследовавшими отцовские HLA антигены, не отличающиеся от материнских антигенов (гистосовместимая беременность) [Billington W.D., 1964; Clarke B., Kirby D.R.S., 1966; Kirby D.R., 1970;

Beer A.E. and Billingham R.E., 1976; Алексеев Л.П. и соавт., 1980; Алексеев Л.П. и соавт.,1986]. Предполагалось, что гистосовместимая беременность не распознается материнской иммунной системой или материнский иммунный ответ не соответствует физиологическому, что может приводить к потере плода. Таким образом, было сделано предположение, что гистонесовместимая беременность является необходимым условием для успешной имплантации и роста плода, а повторные аборты могут быть связаны с «избыточным» сходством партнеров по антигенам HLA [Christiansen O.B., 1996]. Однако, в большинстве более поздних работ, в которых были использованы методы ДНК типирования, увеличения совпадений по генам HLA класса II среди пар с повторными выкидышами уже обнаружено не было [Christiansen O.B. et al., 1989; Ito K. et al., 1992; Takakuwa K.

et al., 1992; Laitinen T. et al. 1993; Wagenknecht D.R. et al., 1997]. Только Ober C. et al. (1993) сообщали о значительном увеличении совпадений по HLA-DQ локусу среди пар с повторными выкидышами по сравнению с контролем.

Другие исследования были посвящены HLA совпадению среди пар с необъяснимым бесплодием [Ober C. and van der Ven, 1997], которое, по мнению авторов исследований, может быть результатом пери-имплантационных потерь плода [Collins J.A. et al, 1983; Wilcox A.J. et al., 1988], в результате сходства по HLA между партнерами [Coulam C.B. et al., 1987; Creus M. et al., 1998]. В то же время ряд исследователей не обнаружили значительных различий в HLA совпадениях партнеров между парами с необъяснимым бесплодием и фертильными парами [Nordlander C. et al., 1983; Persitz E. et al., 1985].

240 супружеских пар с повторными прерываниями беременности неясного генеза и неудачными ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение) были проанализированы нами с точки зрения совпадения супругов по специфичностям гена HLA-DRB1 по сравнению с 74 контрольными семьями, имеющими детей.

Полученные данные свидетельствуют о том, что среди пар с невынашиванием беременности неясного генеза не было отмечено достоверного увеличения количества совпадающих по специфичностям гена HLA-DRB1 пар по сравнению с контрольными парами, имеющими детей [Болдырева М.Н. с соавт. 2004]. Среди этих же супружеских пар было проанализировано значение HLA гомозиготности для репродуктивного результата. Полученные результаты позволили сделать вывод о разном значении гомозиготности по HLA генам класса II у мужчин и женщин для успешного развития беременности. У женщин с невынашиванием беременности неясного генеза ни общее количество гомозигот, ни количество гомозигот разной DRB1 специфичности не отличалось от таковых в обеих контрольных группах (женщины из пар, имеющих детей и здоровые донорыженщины). У мужчин из пар, имеющих детей, общее количество гомозигот было в три раза меньше, чем у мужчин из пар с невынашиванием беременности неясного генеза и контрольной группы, что свидетельствует о том, что гомозиготность по гену HLA DRB1 является неблагоприятным фактором для репродуктивного успеха, хотя и не единственным. Так, например, из 74 пар, имеющих детей, мужчина был гомозиготен по DRB1*02 и трое – по DRB1*07, то есть гомозиготность по генам HLA II у мужчин не является абсолютным препятствием для репродукции, и, скорее всего, контролируется не только генами MHC [Болдырева М.Н. с соавт. 2004]..

Репродукция, аутоиммунные заболевания и HLA. К настоящему моменту накопилось много фактов о роли аутоиммунных процессов, имеющих непосредственную связь с генами MHC, в нарушении репродуктивной функции.

Анализ работ, выполненных в 1965-96 гг позволил Geva E. et al. заключить, что аутоиммунные процессы могут лежать в основе многих болезней человека и могут быть ассоциированы с нарушениями репродукции. В то же время, нарушение репродуктивной функции может быть первым признаком аутоиммунных расстройств.[Geva E., et al, 1997]. Существенный дефицит фертильности был обнаружен у больных системной красной волчанкой [Gleicher N.б 1999; Hardy C.T. et al, 1999], ревматоидным артритом [Nelson J.L., et al, 1993], склеродермии [Silman A.J., Black C., 1998]. Снижение фертильности было отмечено и при других аутоиммунных заболеваниях, таких как тиреоидные болезни, сахарный диабет 1 типа, эндометриоз [Gleicher N., et al, 1993, Poppe K., et al, 2002]. Косвенным доказательством того, что патологическая аутоиммунная функция влияет на репродуктивную способность являются сведения о том, что супрессия патологической аутоиммунной функции кортикостероидами может улучшать фертильность [Dmowski W.P., et al, 1995; El-Roeiy A., et al, 1998].

У женщин с нарушенной репродуктивной функцией значительно чаще, чем у фертильных, обнаруживали различные ауто-антитела, прежде всего направленные против мишеневых антигенов репродуктивной и эндокринной систем. Анти-овариальные антитела значительно чаще, чем остальные, встречались при ранней менопаузе и необъяснимом бесплодии [Fenichel P., et al, 1997; Luborsky J., et al, 1999]. Мишенями аутоантител могут быть стероидогенные ферменты, гонадотропины и их рецепторы, желтое тело, зона пеллюцида и ооцит.[Forges T, et al, 2004]. Аутоиммунный ответ на стероидные гормоны и клетки яичника могут служить причиной нарушения его функции [Kauffman R.P., et al, 2003].

Впервые связь между аутоантителами и прерыванием беременности была обнаружена в начале 80-х годов. [Cowchock S., et al, 1984]. У женщин с повышенной частотой повторных выкидышей было обнаружено увеличение уровня многих аутоантител. [Christiansen O.B., et al, 1997]. Установлено, что из 60% известных причин спонтанных абортов на долю аутоиммунного фактора приходится 20%. [Stephenson M.D., 1996]. Аутоиммунные болезни (артриты, тиреоидиты, сахарный диабет 1 типа) более часто встречались в семьях женщин с необъяснимыми спонтанными абортами. [Shelton A.J. et al., 1994]. За последние десятилетия клиницистами было установлено, что при аутоиммунных заболеваниях, таких как системная красная волчанка, наблюдается значительно более высокий уровень невынашивания, чем в общей популяции – около 50% у больных с активной болезнью. [Ramsey-Goldman R, et al, 1992].

В течение 80-х годов исследователи установили связь между потерей зародыша у женщин с антифосфолипидными антителами, был охарактеризован антифосфолипидный синдром. [Hill J.A., Choi B.C., 2000]. Потом появилась серия кардиолипиновых антител [Trabace S., et al, 1991; Mueller-Eckhardt G., et al, 1994].

В 90-х годах группа датских исследователей во главе с Christiansen O.B.

исследовала взаимосвязь вариантов антигенов HLA класса II и репродуктивными потерями. Так, в 1992 году они сообщили о том, что DRw17,DQw2 ассоциирован с чувствительностью к повторным потерям плода [Christiansen O.B., et al, 1992], затем в 1993 году – что частота антигенов DR1, DR3 и DR10 была увеличена у пациентов с 4 и более выкидышами [Christiansen O.B., et al, 1993,1995]. Далее было обнаружено, что среди пациентов с анти-кардиолипиновыми антителами и повторными прерываниями беременности было значительно больше женщин с фенотипом DR3 и меньше – с фенотипом DR2 [Christiansen O.B., et al, 1998].

Sasaki T. С et al. (1997) также обнаружил значительное увеличение частоты антигена DR4 у женщин с тремя и более повторными выкидышами.

Значение роли различных вариантов гена DRB1 в развитии репродуктивных необъяснимыми повторными прерываниями беременности и неудачными ЭКО по сравнению с контрольными парами, имеющими детей [Болдырева М.Н. с соавт.

2004]. Полученные данные свидетельствуют о том, что для мужчин и женщин из «проблемных» пар разные генотипы DRB1 имеют разное значение. Так, у женщин из «проблемных» пар было отмечено существенное увеличение числа генотипов, в которые входила специфичность DRB1*04, ассоциированная с развитием таких аутоиммунных заболеваний, как сахарный диабет 1 типа [Schipper R.F., et al.

2001], ревматоидный артрит [Zanelli E., et al. 2000] и аутоиммунный тиреоидит [Petrone A., et al. 2001] и устойчивостью к таким инфекционным заболеваниям, как гепатит С [Cramp M.E. et all, 1998]. В то же время у мужчин из «проблемных» пар специфичность DRB1*01, ассоциированная с устойчивостью к гепатиту С [Barrett S. et al., 1999, 2001; Fanning L.J. et al., 2000] и HIV [MacDonald K.S. et al., 2000;

Motta P. et al., 2002], но и чувствительностью к развитию таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит [Rowley MJ, et al., 1997; Ebringer A, Wilson C. 2000], анкилозирующий спондилит [Brown MA, et al., 1998],,болезнь Крона естественный отбор среди представителей разных полов ведется по разным признакам, вероятно, имеет определенный смысл с точки зрения дополнительной устойчивости вида в целом.

HLA II и нарушение репродукции в результате инфекций. Хотя в различных популяциях факторы, приводящие к бесплодию, различаются, воспалительными заболеваниями тазовых органов, в результате чего может нарушаться нормальный транспорт и оплодотворение ооцита [Templeton A., et al., передающиеся половым путем, так что воспалительные заболевания тазовых органов представляют связь между инфекциями, передающимися половым путем, и бесплодием. Незначительное число работ посвящено изучению ассоциаций генов HLA и бесплодием, вызванным инфекциями. Так, ряд авторов исследовали связь генетических факторов хозяина и трубный фактор бесплодия, связанный с C.trachomatis. Оказалось, что DQA1*0102 и DQB1*0602 вместе с IL-10 -1082AA генотипом были значительно более частыми у пациентов с трубным бесплодием