1

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи 

Воробьев Денис Витальевич

«Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома

лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd»

Специальность 03.00.24 – микология 03.00.12 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – Диссертационная работа выполнена на кафедре физиологии растений и кафедре молекулярной биологии Московского Государственного Университета имени М.

В.Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Е. С. Лобакова доктор биологических наук ведущий научный сотрудник Н. Р. Мейчик Официальные оппоненты доктор биологических наук профессор Е. П. Феофилова кандидат биологических наук старший научный сотрудник И. Д. Инсарова Ведущая организация: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН.

Защита состоится «30» октября 2009 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском Государственном Университете им. М. В.

Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

Факс – (095) 939-43- С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» сентября 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н. М. А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время не возникает сомнений, что клеточная стенка – одна из важнейших динамичных структур клеток микроорганизмов и высших растений (Горшкова, 2007). В талломах симбиотических организмов – лишайников, сформированных гифами гриба, клетками микроводорослей и/или цианобактерий, клеточные стенки компонентов выполняют разнообразные функции: селективного узнавания и специфического контактного взаимодействия партнеров, формирования уникальной морфофизиологической структуры таллома, определяют устойчивость лишайников к неблагоприятным абиотическим факторам, участвуя в осуществлении комплекса взаимодействий между компонентами симбиотической системы с окружающей средой (Nieboer, 1978; Loppi, Nelli, 1997; Wsten, Wessels, 1997; Бязров, 2005; Sacristn, Vivas, 2007; Феоктистов, Киташов, 2009).

Ввиду того, что лишайники представляют целостную систему из нескольких компонентов, которые трудно разделимы, изолированная из такой сложной системы «клеточная стенка», представлена суммой клеточных стенок отдельных ее компонентов.

Однако следует учитывать, что в составе препарата «клеточной стенки» таллома лишайника преобладает клеточная стенка микобионта, т.к. грибной компонент составляет основную долю биомассы таллома (90-98%) (Palmqvist, 2000; Бязров, 2005).

Одним из лимитирующих факторов формирования и роста лишайников in vivo является влажность среды обитания. Известно, что границы влажности, в которых организм физиологически активен, обуславливают ареал его распространения в наземных экосистемах (Palmqvist, 2000). Можно предположить, что, не имея специализированных структур для поглощения и транспорта ионов, ионообменные группы клеточных стенок компонентов лишайников играют ключевую роль в процессах поступления в талломы минеральных веществ и воды из атмосферных осадков. Однако механизмы толерантности лишайников к высушиванию, а также процессы поглощения и транспорта ионов талломами лишайников, изучены недостаточно. Можно предположить, что в этом процессе определенную роль играют белки, относящиеся к классу гидрофобинов, и ионообменные группы клеточных стенок.

Хитин-глюкановый комплекс является основным структурным компонентом клеточных стенок грибов, участвующих в формировании лишайникового симбиоза, а его состав (соотношение компонентов) свидетельствует о важнейших структурных изменениях в составе клеточных стенок гриба в зависимости от возраста таллома. Необходимо отметить, что хитин-глюкановый комплекс у грибов участвует в процессах поступления и накопления минеральных веществ из атмосферных осадков (Ugrozov, Artamonova, 2008).

Данные литературы о структурных изменениях в хитин-глюкановом комплексе в зависимости от возраста таллома лишайника отсутствуют.

Процесс формирования талломов лишайников in vivo связан с селективным узнаванием партнеров и их специфическим взаимодействием. Механизмы взаимодействия микобионта с циано- и фикобионтами различны. У цианолишайников ведущая роль в этом процессе отводится лектинам, белкам или гликопротеинам способным связывать олигосахаридные остатки с высокой специфичностью, а у фитолишайников – специфическим АВР-белкам (algal binding protein) микобионтов, являющихся компонентами их клеточных стенок (Sacristn and Vivas, 2007). Данных о специфических АВР-белках микобионтов в составе таллома лишайников в литературе мало. Известно, что они, взаимодействуя с рецепторами клеточных стенок водорослей, приводят к структурной перестройке как клеточных стенок фикобионта, так и цитоплазмы, вызывая деградацию хлоропластов (Sacristn and Vivas, 2007). Можно предположить, что у трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa в состав клеточных стенок молодых частей таллома (апикальная и медиальная зоны) входят как специфические АВР-белки, участвующие в связывании фикобионта таллома – зеленой водоросли рода Coccomyxa, так и лектины, осуществляющие селективное узнавание цианобактерий рода Nostoc, формирующих поверхностные цефалодии. Специфические белки клеточных стенок лишайников до настоящего времени изучены недостаточно.

Цель работы. Комплексное изучение состава и функциональной роли ионообменных групп и специфических белков клеточных стенок лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd в связи с особенностями структурной организации его таллома.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) изучить морфоструктурные особенности строения таллома лишайника P. aphthosa;

2) охарактеризовать состав ионообменных групп клеточных стенок таллома лишайника P.

aphthosa;

3) определить роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника P. aphthosa;

4) изучить участие в ионообменном процессе хитин-глюканового комплекса микобионта;

5) выявить специфические нековалентно закрепленные и закрепленные при помощи дисульфидных связей белки, входящие в состав клеточных стенок таллома P. aphthosa;

6) установить функциональную роль ионообменных групп и специфических белков клеточных стенок таллома лишайника.

Научная новизна. В работе предложен новый подход к изучению таллома лишайника P.

aphthosa (L.) Willd, основанный на выделении структурно-функциональных зон, которые различаются анатомо-морфологическим строением и биохимическим составом. Впервые установлено, что в составе клеточных стенок лишайника P. aphthosa присутствуют четыре типа функциональных групп, из них три являются катионообменными (два типа карбоксильных групп и фенольные ОН-группы), и одна – анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, характеризующие количественный и качественный состав ионогенных групп клеточных стенок P. aphthosa, а также интервалы pH, в которых эти группы ионизированы и способны вступать в ионообменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Определены параметры, количественно характеризующие способность к набуханию клеточных стенок P. aphthosa.

На основании значений коэффициентов набухания клеточных стенок и таллома лишайника установлена важная роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника. Впервые выделен и проанализирован хитин-глюкановый комплекс из клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa. Показано, что его состав изменяется в зависимости от возраста таллома.

Впервые проведено комплексное исследование нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков, входящих в состав клеточных стенок лишайника P. aphthosa. Показано, что качественный и количественный состав белков клеточных стенок изменяется в зависимости от зоны таллома. Установлено, что у P.

aphthosa среди нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности обнаружены белки со свойствами амилоидов.

Практическое значение. Предложен метод для выделения и анализа хитин-глюканового комплекса P. aphthosa, который может быть применен для анализа хитин-глюканового комплекса других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. Разработан новый подход для определения белков клеточных стенок P. aphthosa, который может быть использован в микологических исследованиях.

Полученные в работе результаты о присутствии в составе клеточных стенок лишайника P. aphthosa среди нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков со свойствами амилоидов необходимо учитывать при биотехнологическом использовании биомассы лишайников.

Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по «Общей симбиологии» для студентов биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедр физиологии микроорганизмов и микологии и альгологии биологического факультета МГУ; семинаре кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ; Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург, 2005; Международной научной конференции, посвященной 200летию Казанской ботанической школы, Казань, 2006; Междисциплинарном микологическом форуме с международным участием, Москва, 2009; конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» с международным участием, Москва, 2009.

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на _ стр. машинописного текста, состоит из введения, _ глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего _ наименования (из них _ на иностранных языках). Работа содержит _ таблиц и иллюстрирована _ рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

Обзор посвящен обсуждению роли клеточных стенок лихенизированных грибов в обеспечении их жизнедеятельности. Представлены имеющиеся данные по химическому составу и строению клеточных стенок симбионтов лишайников. Обсуждаются вопросы участия клеточных стенок лишайников в накоплении различных веществ их слоевищами.

Приведены данные о функциональной роли белков клеточных стенок. Рассмотрен вклад белков, относящихся к классу гидрофобинов, в процесс жизнедеятельности грибов и лишайников.

Глава 2. Материалы и методы.

Объектом исследования служил трехкомпонентный листоватый лишайник Peltigera aphthosa (L.) Willd. Выбор этого вида обусловлен тем, что по данным литературы можно предположить наличие у него белков, участвующих в формировании фито- и цианолишайников. Кроме того, для P. aphthosa характерны поверхностные цефалодии, которые возможно отделить от поверхности таллома лишайника, что позволяет получить из трехкомпонентной системы двухкомпонентную.

Для характеристики апикальной, медиальной и базальной зон лишайникового таллома, а также для оценки качества выделенного из них полимерного матрикса клеточных стенок использовали методы световой и электронной сканирующей микроскопии.

Для определения качественного и количественного состава ионообменных групп клеточных стенок проводили потенциометрическое титрование, которое осуществляли методом отдельных навесок (Мейчик и др., 1999). Анализируя полученные кривые зависимости сорбционной способности от pH, определяли число типов ионообменных групп, их количество и константы ионизации. Количество свободных аминогрупп определяли также методом неводного титрования.

Определение содержания воды в интактных слоевищах лишайника и весового коэффициента набухания клеточных стенок лишайника в воде. Набухшие в воде фрагменты интактных слоевищ лишайников или стандартизованные клеточные стенки обсушивали фильтровальной бумагой и определяли их сырую массу (GF и GFcw, соответственно). Затем образцы высушивали при 60°С до постоянного веса и определяли их сухую массу (GD и GDcw, соответственно). Весовой коэффициент набухания стандартизованных клеточных стенок (Kcw) и содержание воды в интактных слоевищах (Q) определяли по соответствующим формулам (Гельферих, 1962).

Эндогенное содержание ионов определяли титрометрическим методом и потенциометрическим методом с использованием ионселективных электродов.

Содержание общего белка определяли по методу Лоури с использованием спектрофотометрического метода. Присутствие амилоидоподобных белков определяли с помощью метода флуоресцентной спектрофотомерии.

Определение элементного состава слоевищ лишайника и выделенных из них клеточных стенок. Процентное содержание азота, углерода и водорода в слоевищах лишайника и выделенных из них клеточных стенках определяли в Институте общей и неорганической химии им. Курнакова с помощью полуавтоматического CHN(S)-анализатора фирмы Carbo Erba Instruments (Италия).

Определение нековалентно закрепленных и закрепленных с помощью дисульфидных связей белков клеточных стенок проводили с помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием белков непосредственно в геле при помощи кумасси и с помощью метода вестерн-блот анализа с последующей визуализацией белков на нитроцеллюлозной мембране.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием Excel 7,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Изучение анатомо-морфологической и биохимической структуры таллома лишайника.

На первом этапе исследования с помощью световой и электронной сканирующей микроскопии у P. aphthosa были выявлены три зоны (апикальная, медиальная и базальная), которые существенно различаются своей структурной организацией (рис. 1).

Апикальная зона таллома P. aphthosa составляет в среднем 1 см. Диагностирующим признаком апикальной зоны можно считать наличие на ее поверхности ищущих гиф, длина которых варьирует и по мере приближения к медиальной зоне уменьшается, так же как и их количество. На поверхности апикальной зоны происходит закладка цефалодиев, специализированных структур, сформированных азотфиксирующими цианобактериями.

Цефалодии легко отделяются от поверхности таллома, так как прикреплены к ней только кончиками ищущих гиф. Под цефалодиями сохраняется верхняя кора таллома лишайника.

Медиальная зона расположена от конца апикальной зоны до основания лопасти таллома. Ее размеры в среднем составляли 2-4 см. На поверхности медиальной зоны отсутствуют ищущие гифы. Многочисленные мелкие цефалодии в виде извитых палочек или мелких дисков погружены в поверхность таллома, а при отделении их от нее на поверхности таллома остаются бесцветные пятна. Изучение под световым микроскопом срезов таллома в таких местах показало отсутствие пигментов в слое верхней коры и зоны фотобионта под ней.

Базальная зона составляет основную часть таллома лишайника P. aphthosa. Цефалодии на поверхности этой зоны выявляются в виде крупных, до 3 мм в диаметре, дисков, погруженных в таллом лишайника. При отделении их от таллома наблюдается повреждение поверхности таллома. Под цефалодиями отсутствуют слой верхней коры и зона фотобионта.

Рисунок 1. Морфологическая дифференциация таллома лишайника P. aphthosa: а - внешний вид трехкомпонентного листоватого лишайника; б - схема разделения таллома лишайника P. aphthosa на апикальную, медиальную и базальную зоны.

Для характеристики биохимического состава исследуемого таллома определено содержание общего белка и основных биогенных элементов в различных зонах P.

aphthosa. Установлено, что наибольшим содержанием и белка и азота характеризуется апикальная зона, а наименьшим – базальная. Следует отметить, что и в клеточных стенках разновозрастных частей таллома сохраняется аналогичная закономерность по содержанию общего азота (рис. 2, табл. 1).

Известно, что ионы калия, натрия, кальция, нитрат- и хлорид-ионы являются одними из основных в растительных организмах. Они принимают участие во многих биологически важных процессах. Данные об их содержании в талломе лишайников могут свидетельствовать о физиологических особенностях вида.

Наши результаты показывают, что разные по возрасту зоны таллома лишайника не отличаются по содержанию ионов натрия, калия и хлорида. Однако распределение по разным зонам таллома ионов кальция и нитрата неравномерно. По содержанию ионов кальция выделяется апикальная зона. В ней – почти в 2 раза больше этих ионов, чем в медиальной зоне и в 1,5 раза больше, чем в базальной. Известно, что у лишайников ионы кальция играют роль в водном обмене и в образовании кристаллов оксалата кальция или Таблица 1. Общее содержание (N, %), в образцах таллома и препаратах клеточных стенок.

Приведены средние значения и их стандартные отклонения (пять биологических повторностей).

Рисунок 2. Общее содержание белка (мг/г сухой массы) в разных зонах таллома лишайника.

Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

Рисунок 3. Эндогенное содержание Ca2+ (мкмоль/ г сухой массы) в талломе лишайника P. aphthosa.

Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

Рисунок 4. Эндогенное содержание NO3- (мкмоль/г сухой массы) в талломе лишайника P. aphthosa.

Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

комплексов с лишайниковыми кислотами. Более того, в литературе есть данные об участии ионов кальция в процессе узнавания компонентов при формировании целостной симбиотической ассоциации (Sacristn and Vivas, 2007). Таким образом, полученные данные о высоком содержании кальция в апикальной зоне могут свидетельствовать о том, что для роста клеткам таллома необходима большая концентрация этого элемента (рис. 3).

Содержание нитрат-ионов в талломе лишайника плавно возрастает от апикальной к медиальной и далее к базальной зоне. В старых частях их почти в 2 раза больше, чем в молодых (рис. 4). Вероятно, у P. aphthosa в базальной зоне цианобактерии функционально более активны, чем в апикальной, так как в последней цефалодии закреплены на поверхности таллома только кончиками гиф (рис. 3.3, 3.4, 3.6 дисс.).

Глава 4. Исследование ионообменных свойств клеточных стенок, изолированных из таллома лишайника P. aphthosa, в зависимости от возраста.

4.1 Оценка качества выделения клеточных стенок.

Выделение клеточных стенок из таллома лишайника P. aphthosa проводили по известной методике (Мейчик и др., 1999). На конечной стадии препараты промывали ацетоном, чтобы удалить оставшиеся, возможно, лишайниковые вещества, а затем высушивали в термостате при 55-60°C. Под термином «клеточные стенки» мы подразумеваем в основном клеточные стенки микобионта, т.к. основную массу таллома лишайника (до 98%) составляет микобионт.

Для оценки качества выделения клеточных стенок проводили микроскопическое исследование препаратов таллома и изолированных из него клеточных стенок, окрашенных флуоресцентным красителем DAPI (4`,6-diamidino-2-phenilindole).

Исследование показало отсутствие в образцах изолированных клеточных стенок внутриклеточных структур, при этом в препаратах сохранялась целостность структуры, тогда как в гифах таллома лишайника отчетливо видно присутствие ДНК.

Для доказательства отсутствия в препаратах клеточных стенок внутриклеточных белков нами проведен сравнительный анализ данных электрофореза в полиакриламидном геле выделенных из таллома лишайника клеточных стенок и измельченных частей таллома. На полученных электрофореграммах четко видно отсутствие белковых полос в экстрактах клеточных стенок (рис. 4.1.3 дисс.), в то время как в экстрактах из таллома обнаружены белки с различной молекулярной массой (рис. 4.1.4 дисс.).

Еще одним доказательством качества полученных препаратов клеточной стенки могут служить результаты сравнительного анализа данных элементного анализа выделенных клеточных стенок и образцов измельченного таллома после выделения общего белка. Как свидетельствуют данные, препараты таллома и клеточной стенки мало отличаются по содержанию азота, углерода и водорода, что также указывает отсутствие внутриклеточных белков в полученных нами препаратах клеточных стенок.

4.2 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп клеточных стенок.

Известно, что одна из важных функций клеточных стенок – поглощение воды и минеральных веществ. Проходя через клеточные стенки, благодаря физико-химическим особенностям этого компартмента, питательные вещества включаются в создание внутренней физиологической среды организма. В работе нами определены ионообменные свойства клеточных стенок, изолированных из разных зон таллома и их возможный вклад в накопление ионов клетками. Определено, что в структуре полимерного матрикса клеточных стенок содержится 4 типа ионогенных групп, способных принимать участие в обменных реакциях с ионами внешней среды: это два типа карбоксильных групп, фенольные ОН-группы и аминогруппы. По качественному составу функциональных групп полимерный матрикс клеточных стенок таллома разных зон не отличается, о чем свидетельствуют значения констант диссоциации (pKaj, табл. 2). Как видно (табл. 3), во всех вариантах количество катионообменных групп значительно больше, чем анионообменных, т.е. можно заключить, что клеточные стенки лишайника являются природными ионообменниками и обладают, в основном, катионообменными свойствами.

Количество ионогенных групп в клеточных стенках значительно зависит от возраста таллома. В стенках базальной части количество карбоксильных групп уроновых кислот почти вдвое больше, чем в апикальной зоне. Наибольшее количество анионообменных групп находится в медиальной части таллома. Отличие состоит также в том, что клеточные стенки апикальной и медиальной частей таллома содержат в 1,4 раза больше карбоксильных групп фенольных кислот, чем стенки базальной зоны (табл. 3).

Таблица 2. Параметры кислотно-основного равновесия клеточных стенок, изолированных из разных участков таллома P. aphthosa.

j – тип группы; рКаj – константа ионизации группы j – того типа; nj – константа для группы j – того типа; rjcorr. – коэффициент корреляции для групп j – того типа; Sj – количество групп j – того типа;

k – число точек на прямой. 1 – аминогруппы, 2 – карбоксильные группы уроновых кислот, 3 – карбоксильные группы фенольных кислот; 4 – фенольные ОН-группы. Значения Sj выражены в мкмоль на 1 г сухой массы клеточных стенок.

Таблица 3. Количественный состав ионогенных групп клеточных стенок, выделенных из разных участков таллома лишайника P. aphthosa.

Зоны таллома Stcat и Stan – общая катионообменная и анионообменная способности клеточных стенок соответственно. j – тип группы; S – количество ионогенных групп j – типа. 1 – аминогруппы, 2 – карбоксильные группы уроновых кислот, 3 – карбоксильные группы фенольных кислот; 4 – Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

В разновозрастных частях слоевищ наблюдается разное соотношение карбоксильных и фенольных ОН-групп, которые принадлежат, по-видимому, лишайниковым веществам.

Эти результаты свидетельствует об изменении с возрастом количественного и качественного состава лишайниковых веществ в слоевищах или их соотношения.

4.3 Набухание клеточных стенок.

Одним из важных физико-химических показателей, которые количественно характеризуют свойства полимеров клеточных стенок, как ионообменника, является набухание. Причиной набухания ионообменных материалов в водном растворе является наличие гидрофильных групп, причиной нерастворимости – существование поперечных связей. Степень набухания ионообменного материала зависит от свойств ионита и состава Рисунок 5. Коэффициент набухания KCW клеточных стенок и оводненность таллома (Q) P. aphthosa (KCW и Q – г H2O на 1 г сухой массы клеточной стенки и таллома соответственно). Приведены средние значения, бары – стандартные отклонения (5-7 биологических повторностей).

внешнего раствора. Известно, что способность к набуханию возрастает с уменьшением степени поперечной связанности, с увеличением общего количества ионогенных групп, с увеличением степени их диссоциации, с уменьшением концентрации раствора и зависит от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент. Результаты настоящего исследования показывают, что клетки P. aphthosa имеют достаточно развитую клеточную стенку, так как в зависимости от возраста доля массы клеточных стенок от общей сухой массы слоевища от 45 до 55%. Величина коэффициента набухания варьирует от 3,3 до 3,8 г Н2О/г сухой массы клеточных стенок (рис. 5). Этот параметр в пределах стандартного отклонения не зависит от возраста, что, вероятно, обусловлено приблизительно равным общим содержанием ионогенных групп в клеточных стенках разных по возрасту частей таллома (Stcat, табл.3). Следует отметить, что содержание воды в клеточных стенках значительно больше, чем в талломе, что указывает на важную роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника (рис. 5).

4.4 Анализ хитин-глюканового комплекса.

Известно, что важным структурным компонентом клеточной стенки лишайников является хитин, который у этих организмов входит в состав хитин-глюканового комплекса (ХГК). Данных о том, сколько хитина содержится в клеточной стенке лишайника, как изменяется его содержание в зависимости от возраста таллома, до начала настоящее работы получено не было. В соответствии с известной методикой (пат. 2121505РФ СО8В37/02; C12N 1/14), из клеточных стенок, изолированных из таллома P aphthosa, выделен и проанализирован ХТК. Согласно полученным нами данным, наибольшей массовой долей хитина характеризуется в ХГК апикальной зоны, в которой этот показатель достигает 70% (рис. 6). В базальной зоне содержание хитина в ХКГ уменьшается почти в 2 раза, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет ~ 20%. Таким образом, с возрастом в хитин-глюкановом комплексе клеточной стенки P aphthosa увеличивается массовая доля глюканов.

Рисунок 6. Содержание хитина (%) и глюкана (%) в составе хитин-глюканового комплекса в зависимости от возраста таллома лишайника P. aphthosa. Приведены средние значения, бары – стандартные отклонения (3 биологические повторности).

4.5 Нековалентно закрепленные и закрепленные дисульфидными связями белки клеточных стенок.

В клеточных стенках лишайников присутствуют как структурные, так и слабосвязанные белки, причем к последним, как правило, относят белки, обладающие ферментативной активностью и участвующие в процессе узнавания микобионта, фотобионта и цианобионта и формировании целостной симбиотической ассоциации.

Обнаружение поверхностных белков проводили в экстрактах, которые получали, используя или буфер Леммли, или диметилсульфоксид (ДМСО). Буфер Леммли позволяет экстрагировать нековалентно закрепленные белки и белки, закрепленные при помощи дисульфидных связей. ДМСО позволяет экстрагировать только нековалентно закрепленные белки.

Для идентификации нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков использовали производное биотина (сульфосукцинимидил-6биотинамидо)-гексонат). Это соединение не проникает через цитоплазматическую мембрану и взаимодействует только с белками клеточной стенки, что ранее было показано для дрожжей (Casanova, Lopez-Ribot, 1992; Mrsa, Seidl, 1997). Следует отметить, что для исследования белков клеточных стенок лишайников этот метод нами применен впервые.

Контролем отсутствия цитоплазматического содержимого в экстрактах при биотинилировании клеточных стенок микобионта и фотобионта был водный экстракт, полученный из измельченного таллома лишайника, предварительно обработанного модифицированным биотином. После визуализации в полученном контроле была идентифицирована одна белковая полоса с молекулярной массой 200 kDa (рис. 7).

Метод биотинилирования клеточных стенок микобионта и фотобионта позволил обнаружить в апикальной зоне – 6, в медиальной зоне – 6 и в базальной зоне – 4 белковых полос с молекулярными массами от 18 до более чем 300 kDa (рис. 8). Белковая полоса, которая идентифицируется в контроле, выявляется и при вестерн-блот анализе. Ответить на вопрос, принадлежит этот белок к белкам клеточных стенок или относится к белкам цитоплазматического содержимого, не представляется возможным. Вероятно, это экстрагированный водой из измельченного таллома цитоплазматический биотинилированный белок. Эти результаты позволяют заключить, что также как в клетках дрожжей модифицированный биотин не проникает через цитоплазматическую мембрану, т.к. в противном случае на вестерн-блот анализе детектировалось бы большее число белковых полос.

Метод биотинилирования позволил выявить белковые полосы, характерные только для апикальной и медиальной зон. Причиной различий в интенсивностях окраски некоторых общих полос в разных зонах, по-видимому, является различная доступность биотина к белковым молекулам, различное содержание лизиновых остатков в молекулах белков или различия в концентрации этих белков в клеточных стенках. Мы не исключаем вероятность того, что в идентифицированные нами фракции входят несколько различных белков с близкими молекулярными массами. Вероятно также, что некоторые из детектируемых нами белковых полос являются субъединицами одного белка.

Применение метода электрофореза для идентификации поверхностных белков в экстрактах, полученных из целых частей таллома лишайника с применением буфера Леммли, показало, что в апикальной зоне выявляются 12, в медиальной зоне – 11, а в базальной зоне – 10 белковых полос (рис. 8).

Рисунок 7. Анализ белков цитоплазматического содержимого (А – электрофорез в полиакриламидном геле, Б – вестерн-блот анализ; 1 – апикальная зона, 2 – медиальная зона, 3 – базальная зона).

Рисунок 8. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (А) и вестерн-блот анализ (Б) экстракта белков, полученного в буфере Леммли (1 – апикальная зона, 2 – медиальная зона, 3 – базальная зона).

Сравнительный анализ двух методов идентификации поверхностных белков показал, что на электрофореграмме и при вестерн-блот анализе экстракта белков из целых частей таллома детектируются как общие, так и специфичные белковые полосы. Большее количество белковых полос, выявленных на электрофореграмме, вероятнее всего связано с тем, что на ней детектируются не только белки клеточной поверхности, но и, возможно, цитоплазматические белки. На основании этих результатов можно предположить, что некоторые из обнаруженных нами белков на электрофореграмме принадлежат белкам клеточных стенок, а лизиновые остатки, (сайты связывания биотина), или недоступны для модифицированного биотина, или отсутствуют. Поэтому количество белков в клеточных стенках лишайника P. aphthosa может быть больше, чем обнаружено методом биотинилирования.

4.6 Амилоидоподобные белки клеточной поверхности.

Для обнаружения поверхностных белков нами был применен также другой способ их экстракции с использованием диметилсульфоксида. Этот способ экстракции позволяет выделить белки, которые обладают свойствами амилоидов. Под термином амилоиды обычно подразумеваются белковые агрегаты, характеризующиеся филаментной морфологией, высоким содержанием -слоев (с -тяжами расположенными перпендикуРисунок 9. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (а) и вестерн-блот анализ (б) белков, полученных экстракцией таллома P. aphthosa диметилсульфоксидом.

Рисунок 10. Интенсивность флуоресценции (условные единицы) белков, полученных экстракцией таллома диметилсульфоксидом, с Тиофлавином Т (1 – контроль, 2 – экстракт белков).

лярно оси фибриллы – кросс--структура), относительной устойчивостью к действию протеаз. Амилоидоподобные белки обнаружены у грибов и лишайников и, согласно данным литературы, принимают участие в защите от неблагоприятных факторов внешней среды (например, при переходе из одной среды в другую).

Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях показал наличие в ДМСО экстракте двух белковых полос (рис. 9). Следует подчеркнуть, что при вестерн-блот анализе в присутствии модифицированного биотина при экстракции и ДМСО, и буфером Леммли эти белковые полосы не обнаруживались. При этом на вестерн-блот анализе ДМСО экстракта белков детектируется белковая полоса, которая выявляется также на вестерн-блот анализе экстракта белков, полученного при помощи буфера Леммли.

Наличие амилоидных фибрилл в ДМСО экстракте белков из таллома лишайника P.

aphthosa было показано нами также методом флуоресцентной спектрофотомерии с использованием тиофлавина Т (рис. 10). Определено, что при длине волны 490 нм наблюдается максимум флуоресценции (рис. 10). Эти результаты также свидетельствуют в пользу того, что поверхностные белки исследуемого лишайника включают амилоидоподобные белки, которые, вероятно, являются гидрофобинами. Присутствие последних доказано также методом световой микроскопии в поляризованном свете после окрашивания Конго красным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свойства экстраклеточного матрикса лишайников имеют большое значение для жизнедеятельности этих организмов. Физико-химические свойства клеточных стенок влияют на процессы поступления воды и растворенных веществ в слоевище, а также на процессы транспорта веществ между симбионтами. В работе нами был сделан акцент на исследование клеточных стенок микобионта, т.к. именно микобионт составляет основную массу слоевища таллома (до 98%).

На основании данных анатомо-морфологического строения и биохимического состава были выделены и охарактеризованы в зависимости от возраста три зоны таллома лишайника P. aphthosa: апикальная, медиальная и базальная. Показано, что зоны таллома различаются не только взаимным расположением компонентов, но и количеством белка, а также эндогенным содержанием ионов кальция и нитрат-ионов. Показано, что максимальная концентрация ионов кальция находится в апикальной зоне, в которой происходит контактное взаимодействие компонентов и формирование целостной симбиотической системы. Вероятно, ионы кальция в этом процессе играют существенную роль.

Исследование ионообменных свойств клеточных стенок проводили в соответствии с выявленными особенностями строения таллома, в зависимости от возраста его частей. В работе предложены способы оценки чистоты выделенных препаратов клеточных стенок.

Установлено, что в клеточных стенках P. aphthosa содержится четыре типа ионогенных групп, способных принимать участие в обменных реакциях с ионами внешней среды: это два типа карбоксильных групп, фенольные ОН-группы и аминогруппы. Показано, что по качественному составу функциональных групп полимерный матрикс клеточных стенок таллома разных зон не отличается, о чем свидетельствовали значения констант диссоциации. Во всех вариантах количество катионообменных групп значительно больше, чем анионообменных. Эти результаты дают основание заключить, что клеточные стенки лишайника P. aphthosa являются природными ионообменниками и обладают, в основном, катионообменными свойствами.

Показано, что количество ионогенных групп в клеточных стенках значительно зависит от возраста таллома. В стенках базальной части количество карбоксильных групп уроновых кислот почти вдвое больше, чем в апикальной зоне. Наибольшее количество анионообменных групп находится в медиальной части таллома. Отличие состоит также в том, что клеточные стенки апикальной и медиальной частей таллома содержат в 1,4 раза больше карбоксильных групп фенольных кислот, чем стенки базальной зоны. В разновозрастных частях слоевищ наблюдается разное соотношение карбоксильных и фенольных ОН-групп, которые принадлежат, по-видимому, лишайниковым веществам.

Эти результаты свидетельствует об изменении с возрастом количественного и качественного состава лишайниковых веществ в слоевищах или их соотношения.

Результаты настоящего исследования показывают, что клетки P. aphthosa имеют достаточно развитую клеточную стенку, так как в зависимости от возраста доля массы клеточных стенок от общей сухой массы слоевища составляет от 45 до 55%. Величина коэффициента набухания варьирует от 3,3 до 3,8 г Н2О/г сухой массы клеточных стенок.

Этот параметр в пределах стандартного отклонения не зависит от возраста, что, вероятно, обусловлено приблизительно равным содержанием ионогенных групп и приблизительно одинаковой степенью поперечной связанности полимеров в клеточных стенках разных по возрасту частей таллома. Показано, что содержание воды в клеточных стенках значительно больше, чем в талломе, что указывает на важную роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника.

Нами был выделен и охарактеризован хитин-глюкановый комплекс (ХГК) из клеточных стенок лишайника P. aphthosa. Согласно полученным данным, наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, в которой этот показатель достигает 70%. В базальной зоне содержание хитина в ХКГ уменьшается почти в 2 раза, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет 20%. Таким образом, с возрастом в ХГК клеточной стенки P. aphthosa увеличивается массовая доля глюканов.

Примененный метод выделения и анализа ХГК может быть использован при определении аналогичных свойств других лихенизированных грибов. Уменьшение доли хитина и увеличение доли глюкана от апикальной к базальной зонам приводит к формированию в базальной зоне более массивной клеточной стенки. Возможно, это связано с меньшим количеством поперечных сшивок молекул полисахаридов с помощью белка в клеточных стенках базальной зоны, чем в клеточных стенках апикальной зоны.

Впервые для определения нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков таллома лишайника был применен метод биотинилирования клеточных стенок. Нами показано, что качественный состав белков клеточных стенок таллома изменяется в зависимости от его зон, т.е. от возраста. Метод биотинилирования клеточных стенок микобионта и фотобионта позволил обнаружить в апикальной зоне – 6, в медиальной зоне – 6 и в базальной зоне – 4 белковых полос с молекулярными массами от 18 до более чем 300 kDa. Наличие в клеточных стенках апикальной и медиальной зон двух белков, отсутствующих в базальной зоне, вероятно, связано с тем, что эти белки участвуют в специфическом взаимодействии микобионта с фотобионтом и цианобионтом.

Разработанный подход для определения нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков может быть применен для определения аналогичных белков у других видов лихенизированных грибов. Полученные данные могут указывать на участие белков клеточных стенок в процессах формирования лишайникового таллома.

Примененные методические подходы позволили впервые выявить в составе клеточной поверхности таллома лишайника P. aphthosa амилоидоподобные белки. Предполагается, что эти белки участвуют в обеспечении механизма толерантности таллома лишайника к высушиванию, образуя белковые агрегаты, характеризуемые филаментной морфологией с высоким содержанием -слоев.

ВЫВОДЫ

1. В талломе лишайника P. aphthosa выделены три функциональные зоны (апикальная, медиальная и базальная), которые различаются анатомо-морфологической структурой и биохимическим составом. Установлено, что наибольшим содержанием белка, азота и ионов кальция характеризуется апикальная зона, а наименьшим – базальная зона.

2. Ионообменные свойства полимерного матрикса экстраклеточного пространства таллома лишайника P. aphthosa определяются наличием в составе клеточных стенок четырех типов функциональных групп, которые способны принимать участие в обменных реакциях с ионами окружающей среды при соответствующих условиях.

Впервые показано, что катионообменные свойства клеточной стенки определяются присутствием в ней двух типов карбоксильных и фенольных ОН-групп, а анионообменные – аминогруппами.

3. Объем полимерного матрикса клеточных стенок таллома лишайника является относительно постоянной величиной и мало зависит от ионных условий в окружающей среде.

4. В полимерной структуре клеточной стенки лишайника P. aphthosa присутствуют азотсодержащие полимеры, представленные как белками, так и хитинглюкановым комплексом (ХГК), содержание которых зависит от возраста таллома. Наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, а наименьшей – ХГК базальной зоны, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет 20%. Показано, что с возрастом в хитин-глюкановом комплексе клеточной стенки P. aphthosa увеличивается массовая доля глюканов.

5. Клеточные стенки апикальной, медиальной и базальной зон таллома лишайника различаются по набору белков, закрепленных нековалентно и с помощью дисульфидных связей.

6. Впервые показано, что среди нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности лишайника P. aphthosa присутствуют белки со свойствами амилоидов.

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук 1. Воробьев Д. В., Мейчик Н. Р. Состав ионообменных групп в клеточных стенках микобионта и фотобионта в составе трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. №1. С.18-19.

2. Воробьев Д. В., Безсонов Е. Е., Калебина Т. С., Лобакова Е. С. Характеристика белков «клеточной стенки» лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Бюллетень московского общества испытателей природы. Отдел биологический. 2009. Т. 14. Вып. 2.

Приложение 1. С. 29-31.

3. Воробьев Д. В., Мейчик Н. Р., Лобакова Е. С., Ермаков И. П., Матвеева Н. П.

Ионообменные свойства клеточных стенок, изолированных из таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Микробиология. 2009. Т. 78. №5. С.702-708.

Прочие публикации 4. Нургазиева Д. К., Воробьев Д. В., Кожушный А. П. Диализное культивирование как новый метод получения культур фико- и цианобионтов из лишайников Peltigera aphthosa и Stereocaulon alpinum // Труды международной конференции грибы в природных и антропогенных экосистемах. Спб, 2005. Т. 2. С. 54 – 57.

5. Киташов А. В., Нургазиева Д. К., Воробьев Д. В., Лобакова Е. С. Особенности выделения фототрофных микросимбионтов трехкомпонентных лишайников // Материалы международной научной конференции вопросы общей ботаники: традиции и перспективы.

Казань, 2006. Ч. 1. С. 208 – 210.