На правах рукописи

Шерин Пётр Сергеевич

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ТРИПТОФАНА

И ЕГО ПРИРОДНОГО МЕТАБОЛИТА КИНУРЕНИНА

01.04.17 – химическая физика,

в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Новосибирск – 2009

Работа выполнена в Институте «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель доктор химических наук, Центалович Юрий Павлович

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор Соколова Ирина Владимировна кандидат физико-математических наук, Глебов Евгений Михайлович

Ведущая организация Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится “ 3 ” июня 2009 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 при Институте Химической Кинетики и Горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.

Автореферат разослан “ 24 ” апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук Онищук А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Исследование первичных фотореакций с участием аминокислот – структурных единиц белков – является важной задачей для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живой природе. Аминокислота триптофан, присутствующая в составе многих белков, обладает наибольшим поглощением в диапазоне длин волн 260–310 нм среди всех аминокислот. Фотоионизация триптофана считается одним из важнейших каналов фотоиндуцированного окисления белковых молекул и может являться начальной стадией развития многих заболеваний. Фотохимия триптофана широко изучалась на протяжении нескольких последних десятилетий, однако до сих пор остаются открытыми несколько фундаментальных вопросов, касающихся фотоионизации триптофана.

Прежде всего, остаются невыясненными механизм однофотонной ионизации, а также природа возбужденного состояния, являющегося предшественником этой фотореакции.

Таким образом, детальное исследование механизма фотоионизации триптофана представляется важной и актуальной задачей.

Кинуренин и его производные, обнаруженные в хрусталике глаза, являются природными метаболитами аминокислоты триптофан. Фотохимические реакции этих соединений мало изучены. Было показано, что эти соединения обладают поглощением в диапазоне 300–400 нм и являются очень слабыми фотосенсибилизаторами. На этом основании был сделан вывод, что кинуренины являются молекулярными УФ фильтрами, предохраняющими хрусталик и сетчатку глаза от фотоповреждений. Механизм эффективной УФ защиты в настоящее время остается невыясненным. Недавно было сообщено, что кинуренин может выступать в роли фотовосстановителя и фотоокислителя ряда биологически значимых соединений, однако механизмы этих реакций остаются неизвестными. Исследования термических реакций кинуренинов показали, что эти соединения являются нестабильными при физиологических условиях; спонтанное дезаминирование приводит к образованию реакционных соединений, которые могут ковалентно связываться с белками хрусталика. Белки, модифицированные молекулами УФ фильтров, демонстрируют заметную фотохимическую активность и способны образовывать реакционные формы кислорода при аэробном фотолизе. Эти сообщения показывают, что кинуренины могут участвовать в реакциях фотоповреждения белков хрусталика, что, в свою очередь, может давать существенный вклад в развитие катаракты. Таким образом, исследование механизмов фотореакций кинуренинов является актуальной задачей для фотохимии, биологии и медицины.

Настоящая работа посвящена исследованию динамики и механизмов фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекулах триптофана и кинуренина, изучению спектральных и фотохимических свойств короткоживущих промежуточных частиц, образующихся в результате фотолиза этих соединений, и исследованию возможных реакций этих частиц с молекулами, содержащимися в хрусталике глаза.

Целями данной работы являются:

растворитель) на механизм однофотонной ионизации триптофана.

(2) Исследование механизма ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний кинуренина, а также механизма фотоионизации. Определение влияния внешних условий (растворитель, изотопное замещение, pH среды, температура) на исследуемую фотофизику кинуренина.

(3) Изучение реакционной активности триплетного состояния кинуренина, образующегося под действием УФ излучения, по отношению к ряду соединений, содержащихся в хрусталике глаза.

(4) Исследование фотохимической активности ковалентно связанных аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в Научная новизна работы. Впервые разделены вклады в однофотонную ионизацию триптофана от нерелаксированного предфлуоресцентного *S и релаксированного нижнего S1 синглетных возбужденных состояний. Показано, что квантовый выход фотоионизации из состояния *S увеличивается с уменьшением температуры, что обусловлено конкуренцией между фотоионизацией из состояния *S и колебательной релаксации *S S1. Релаксация является термически активируемым процессом, при этом энергия активации не зависит от свойств используемых растворителей.

';

Установлено, что ультрабыстрый безизлучательный переход S1 S0 в молекуле кинуренина обусловлен межмолекулярными взаимодействиями посредством водородных связей между фотовозбужденным кинуренином и молекулами растворителя. Впервые зарегистрировано триплетное состояние кинуренина, изучены фотохимические свойства этого интермедиата. Показано, что фотоионизация кинуренина протекает по двухфотонному механизму; триплетное состояние является предшественником этой фотореакции. Установлены механизмы и измерены константы скорости реакций тушения триплетного состояния кинуренина рядом аминокислот и антиоксидантов, присутствующих в хрусталике глаза. Показано, что кинуренин, ковалентно связанный с аминокислотами, проявляет большую фотохимическую активность, чем в свободном состоянии.

Практическая ценность работы. Полученные результаты будут использованы для дальнейших фундаментальных исследований фотохимических систем с участием триптофана и кинуренина. В работе установлен механизм эффективной УФ защиты молекулами кинуренина, что может быть использовано при разработке новых материалов с высокой степенью защиты от УФ излучения. Данные о фотохимической активности кинуренина могут быть востребованы при разработке лекарственных препаратов для терапевтического лечения и/или замедления развития ранних стадий катаракты.

Личный вклад соискателя. Автор участвовал в разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций по теме диссертационной работы. Весь объём экспериментальных исследований выполнен лично автором или при его непосредственном участии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на российских и международных конференциях и симпозиумах: XVI–XVIII, XX симпозиумах “Современная Химическая Физика” (Туапсе, Россия, 2004–2006, 2008 г.), 9th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Оксфорд, Великобритания, 11–17 сентября 2005 г.), 5th Research Workshop on Diffusion Assisted Reactions (Новосибирск, Россия, 13–19 августа 2006 г.), Porquerolles International Conference on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (остров Поркероль, Франция, 2– 9 сентября 2006 г.), An International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry (Коттаям, Керала, Индия, 8–11 февраля 2007 г.), Современные Подходы к Проблемам Физикохимии и Катализа (Новосибирск, Россия, 16–19 мая 2007 г.), VII Voevodsky Conference “Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes” (Черноголовка, Россия, 25–28 июня 2007 г.), 6th Aegean Summer School in Visual Optics (Ираклион, Греция, июня – 1 июля 2007 г.), International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (Аскона, Швейцария, 19–24 августа 2007 г.), I Международная Конференция «Физико-Химические Методы Исследования Нанообъектов в Химии, Биологии и Медицине» (Туапсе, Россия, 3–9 октября 2007 г.), Central European Conference on Photochemistry (Бад Хофгаштайн, Австрия, 10–14 февраля 2008 г.), XXIX European Congress on the Molecular Spectroscopy (Опатия, Хорватия, 31 августа – 5 сентября 2008 г.).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 статьях, а также в тезисах международных и российских симпозиумов и конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 185 наименований. Работа изложена на 133 страницах, содержит 51 рисунок, 12 таблиц и 1 схему.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.

Глава I представляет собой обзор литературы, посвященной фотохимическим реакциям триптофана и кинуренина. В первом разделе рассматриваются фотофизика и фотохимия индола, триптофана и родственных им соединений. Рассмотрены основные фотохимические реакции, а также свойства триплетных состояний и радикалов, образующихся при фотолизе этих молекул. Особое внимание уделено фотоионизации триптофана. Приведено обсуждение возможных механизмов фотоионизации (одно- или двухфотонный процессы) и природы фотовозбужденных состояний, предшествующих этой реакции. Во втором разделе представлен обзор термических и фотохимических реакций кинуренина и его производных, которые могут иметь место в хрусталике глаза.

Рассмотрены известные на сегодняшний день фотохимические свойства кинуренинов;

показано, что кинуренины являются эффективными молекулярными УФ фильтрами.

Отдельное внимание уделено обзору различных механизмов, ответственных за быструю дезактивацию возбужденных состояний в органических молекулах. Рассмотрена термическая нестабильность кинуренинов и последующие реакции с участием продуктов распада, которые могут приводить к образованию новых УФ фильтров или ковалентному присоединению кинуренинов к белкам хрусталика. Обсуждается связь между термическими превращениями кинуренинов и их фотохимической активностью, а также возможная роль этих процессов в катарактогенезе.

В главе II подробно описаны используемые в работе методы исследования (стационарная и времяразрешенная оптическая спектроскопия) и методики проведения экспериментов. Исследование динамики промежуточного поглощения с наносекундным временным разрешением было проведено с помощью установки лазерного импульсного фотолиза, созданной в МТЦ СО РАН (возбуждение: 266, 308, 355 нм; регистрация: 240– нм; временное разрешение 10 нс), которая оборудована температурной приставкой, позволяющей проводить эксперименты в диапазоне температур 200–360 К. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения с фемтосекундным временным разрешением было осуществлено с помощью соответствующих установок, расположенных в университете г. Женева, Швейцария (возбуждение: 400 нм; регистрация флуоресценции 420–620 нм; регистрация промежуточного поглощения 360–750 нм; временное разрешение 200 фс).

Глава III настоящей диссертации посвящена исследованию влияния параметров среды (температура, pH, растворитель) на механизм однофотонной ионизации водных растворов триптофана.

Зависимость квантового выхода фотоионизации триптофана от энергии импульса лазера показала, что в наших экспериментальных условиях при энергии импульса лазера меньше 20 мДж вклад от двухфотонной ионизации становится пренебрежимо мал. В этих условиях были получены зависимости квантовых выходов фотоионизации от температуры для N-ацетил-L-триптофана (NATrpH) и L-триптофана (L-TrpH). Эксперименты были нерелаксированного предфлуоресцентного *S и релаксированного S1 синглетных возбужденных состояний в общий процесс ионизации. В кислых условиях фотоионизация из нижнего синглетного состояния S1 подавлена процессом протонирования индольного кольца через растворитель, в то время как в нейтральной среде однофотонная ионизация происходит из обоих состояний *S и S1.

Квантовый выход Рис. 3.1.а. Зависимости квантового выхода фотоионизации от температуры для IH и L-TrpH в кислых растворах (pH 0.1). : IH в смеси этанол/вода 10/1, : L-TrpH в смеси метанол/вода 10/1, : L-TrpH в смеси этанол/вода 10/1. б. Зависимость ln(1/*ион – 1) от 1/T для L-TrpH в смеси этанол/вода 10/1.

В кислых растворах с увеличением температуры наблюдается небольшое уменьшение квантового выхода ионизации из состояния *S для L-TrpH и NATrpH. Этот эффект может быть отнесен к конкуренции двух ультрабыстрых процессов – ионизации из состояния *S и релаксации *S S1. Для подробного исследования этого эффекта были получены зависимости квантового выхода ионизации для индола (IH) и L-триптофана (L-TrpH) в различных растворителях в широком диапазоне температур (Рис. 3.1.а). Квантовый выход ионизации из состояния *S ( * ) может быть записан следующим образом:

Предполагая, что константа скорости ионизации из состояния *S ( kион ) является независимой от температуры, а константа скорости релаксации (kp) зависит от температуры согласно закону Аррениуса, было получено следующее выражение:

На Рис. 3.1.б представлена зависимость выхода ионизации L-TrpH в смеси этанол/вода 10/ в координатах Аррениуса. Полученные результаты хорошо описываются линейной зависимостью, что позволяет получить значения энергии активации Ep и ln(Ap/ kион ), представленные в Табл. 3.1. Можно видеть, что для всех исследованных систем значение Ep составляет величину около 4.5 кДж/моль и почти не зависит от свойств используемых растворителей (Табл. 3.1). Предположительно, релаксация *S S1 включает в себя образование короткоживущего комплекса, состоящего из фотовозбужденной молекулы триптофана и молекул растворителя, в котором перенос колебательной энергии происходит в результате столкновения молекул растворителя с индольным кольцом.

Табл. 3.1. Значения энергии активации Eр и ln(Aр/k*ион) для константы скорости релаксации *S S1 для молекул IH и L-TrpH в различных растворителях.

В главе IV представлены результаты исследования фотопроцессов, протекающих в молекуле кинуренина (KN).

возбужденных состояний кинуренинов на пикосекундном масштабе времени в различных растворителях. На Рис. 4.1.а приведены временные профили флуоресценции на синем крае, в центре и на красном крае полосы эмиссии, наблюдаемые при фотолизе водного раствора кинуренина. Быстрый спад сигнала в синей области и соответствующий рост сигнала в красной области спектра являются следствием сольватационной релаксации, которая приводит к сдвигу спектра в красную область, так называемому динамическому сдвигу Стокса. Этот сдвиг можно явно видеть по эволюции спектра флуоресценции во времени, временные константы 1 = 0.9 пс, 2 = 4. возбужденном состоянии и 3 – времени исследованная на этом же масштабе эволюцией флуоресценции: начальный сдвиг спектра в синюю область вследствие сольватационной релаксации сопровождается монотонной гибелью сигнала (Рис. 4.1.в).

Аналогичные измерения были проведены для KN в смеси MeOH/H2O 10/1 (по объему) и в ДМСО. Наблюдаемая эволюция спектров флуоресценции и промежуточного поглощения качественно совпадает с результатами, представленными на Рис. 4.1. При переходе от воды к ДМСО время жизни состояния S1 возрастает почти на два порядка, что можно видеть по данным, представленным в Табл. 4.1 и на Рис. 4.2. Эксперименты в дейтерированной воде показали увеличение времени жизни состояния S1 в 1.6 раза по сравнению с водой (Табл. 4.1).

Полученные значения времени жизни и квантового выхода флуоресценции были использованы для оценки констант скорости излучательной (kфл) и безизлучательной гибели (kБГ) состояния S1:

Как можно видеть из Табл. 4.1, значение водородной связи, что может быть описано эмпирическим сольватохромным параметром сильная зависимость от свойств растворителя ультрабыстрой дезактивации состояния S1. б. Временные профили промежуточного Природа этих эффективных взаимодействий заключается в наличии неподеленной пары электронов на атоме азота анилиновой группы кинуренина. В возбужденном состоянии происходит перераспределение электронной плотности в молекуле кинуренина, что увеличивает кислотность аминогруппы и основность карбонильной группы и приводит к образованию комплекса из молекул растворителя и KN, связанного межмолекулярными водородными связями.

Табл. 4.1. Фотофизические свойства KN в различных растворителях при комнатной температуре: сольватохромный параметр Камлета и Тафта; 3 – время жизни состояния S1; фл – квантовый выход флуоресценции; kфл и kБГ – константы скорости флуоресценции и безизлучательной гибели состояния S1, соответственно. Погрешность измерений: 10 %.

Схема. 4.1. Механизм ультрабыстрой дезактивации S1 состояния кинуренина.

В предельном случае возможен межмолекулярный перенос протона, как это отражено на Схеме 4.1. Отсутствие сигнала от протонированного состояния S1 в спектрах промежуточного поглощения не позволяет полностью отказаться от данного механизма, т.к.

этот интермедиат может быстро гибнуть в процессе обратного переноса протона с образованием основного состояния KN.

Второй раздел главы IV посвящен исследованию фотохимических свойств триплетного состояния кинуренина. При фотолизе, сенсибилизированном ацетоном, были зарегистрированы спектры промежуточного поглощения, отнесенные к суперпозиции спектра поглощения триплетного кинуренина TKN (в кислой среде T KNH 2 ) и спектра выгорания исходного соединения KN (Рис. 4.3.а). Расчет наблюдаемых временных профилей промежуточного поглощения позволил установить значения коэффициентов экстинкции T(430) триплетных состояний кинуренина: 3700 M–1см–1 для нейтрального и 3500 M–1см–1 для протонированного состояния. Зависимость отношения промежуточного поглощения на 480 нм к поглощению на 430 нм от значения pH среды (Рис. 4.3.б) была Рис. 4.3. Фотолиз KN, сенсибилизированный ацетоном (110 М KN в смеси вода/ацетон 10/1). а. Спектры промежуточного поглощения при pH 7.0 ( ) и pH 0.1 ( ), наблюдаемые через 3 мкс после импульса лазера. б. рН зависимость отношения поглощения TKN на нм к поглощению на 430 нм, измеренным через 2 мкс после импульса лазера.

использована для определения значения константы кислотно-основного равновесия pKaТ = 4.7, которая была отнесена к анилиновой группе кинуренина.

Прямой фотолиз водных растворов кинуренина показал, что квантовый выход триплетных состояний KN в нейтральной среде составляет величину Т = 0.018±0.004, в то время как в кислой среде выход близок к единице. Столь значительная разница была отнесена к протонированию анилиновой группы кинуренина, что делает невозможным частичный перенос заряда с атома азота на ароматическую систему и, как следствие, межмолекулярных водородных связей. При переходе от протонных растворителей к апротонным значение Т увеличивается (в ДМСО Т = 0.33±0.06), что связано с отсутствием межмолекулярных водородных связей в апротонных растворителях.

Третий раздел главы IV посвящен изучению механизма фотоионизации водного раствора кинуренина. В ходе проведенных исследований были получены индивидуальные спектры поглощения короткоживущих частиц кинуренина: триплетного состояния, катион радикала и аддукта сольватированного электрона с кинуренином (Рис. 4.4.а). Аналогично были получены спектры интермедиатов 3-гидроксикинуренина (3OHKN).

Линейная зависимость квантового выхода фотоионизации KN и 3OHKN от энергии импульса лазера (Рис. 4.4.б) указывает на двухфотонный механизм ионизации. Поскольку синглетные возбужденные состояния KN и 3OHKN обладают временем жизни много меньшим (27.1 и 9.6 пс, соответственно), чем длительность импульса лазера (8 нс), то триплетное состояние.

, 103 М-1см- Рис. 4.4. а. Спектры поглощения интермедиатов, наблюдаемые при фотолизе водных растворов KN, pH 7.0. : аддукт электрона KNH•; : триплетное состояние TKN; : катион радикал KN•+. б. Зависимость квантового выхода фотоионизации от энергии импульса лазера. : KN, фотолиз на 266 нм; : 3OHKN, фотолиз на 266 нм; : KN, фотолиз на нм; : 3OHKN, фотолиз на 266 нм.

Опираясь на полученные результаты, общая схема реакций, имеющих место при фотолизе KN и 3OHKN, может быть представлена в следующем виде:

Глава V диссертации посвящена исследованию реакций тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза. В качестве тушителей были использованы антиоксиданты аскорбат и глутатион, аминокислоты триптофан, тирозин, гистидин, метионин и цистеин, а также молекулярный кислород.

Было показано, что основными тушителями триплетного состояния кинуренина являются аскорбат, триптофан и тирозин; полученные значения констант скорости тушения представлены в Табл. 5.1.

Механизм тушения триплетного Табл. 5.1. Константы скорости тушения (kT) состояния кинуренина был определен из поглощения и динамики промежуточного поглощения, наблюдаемой в буферных и небуферных водных растворах. В результате было установлено, во всех исследуемых переносе электрона с молекулы тушителя на молекулу кинуренина, с последующим быстрым депротонированием катион радикала тушителя. Единственным исключением является реакция с кислородом, в которой происходит перенос триплетной энергии на молекулу кислорода.

кинуренина и его аддуктов с аминокислотами гистидином (His-KN), лизином (Lys-KN), цистеином (Cys-KN) и антиоксидантом глутатионом (GSH-KN); химические структуры которых приведены на Рис. 6.1.

Динамика гибели фотовозбужденных состояний аддуктов в различных растворителях, наблюдаемая методами оптической спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением, демонстрирует качественное согласие с эволюцией возбужденных состояний кинуренина (см. Рис. 4.1). Единственным отличием является увеличение времени жизни

COOH COOH

COOH COOH

Рис. 6.1. Химические структуры аддуктов KN с аминокислотами лизин (Lys-KN), цистеин (Cys-KN) и гистидин (His-KN), а также с антиоксидантом глутатионом (GSH-KN).

состояния S1 при переходе от Lys-KN к GSH-KN, что отражено в Табл. 6.1. Спектры поглощения триплетных состояний и радикалов аддуктов качественно совпадают со спектрами интермедиатов кинуренина, представленных на Рис. 4.4.а. Как и квантовый выход флуоресценции, квантовый выход триплетных состояний демонстрирует увеличение при переходе от Lys-KN к GSH-KN (Табл. 6.1). Механизм этих изменений заключается в ослаблении и/или блокировании части межмолекулярных водородных связей между молекулами растворителя и хромофорной частью аддуктов, что приводит к уменьшению скорости безизлучательного перехода S1 S0.

Табл. 6.1. Время жизни состояния S1 (3), квантовые выходы флуоресценции (фл) и триплетных состояний (T), анаэробного ( Ar ) и аэробного ( O2 ) фоторазложения водных растворов УФ фильтров. Погрешность измерений: 10 %.