На правах рукописи

Маняхин Артем Юрьевич

Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) на юге

Приморского края (интродукция, состав флавоноидов,

биологическая активность)

03.02.14 – биологические ресурсы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Горнотаежной станции им.

В.Л. Комарова Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Зориков Петр Семенович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН Васьковский Виктор Евгеньевич кандидат биологических наук Ухваткина Ольга Николаевна

Ведущая организация: Федеральное Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Дальневосточный государственный аграрный университет, г. Благовещенск

Защита диссертации состоится "12" мая 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.02 в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН по адресу: 690022, г.

Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН.

Тел.: 8(4232)31-14- Факс: 8(4232)31-40- E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (библиотеке Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН г.

Владивосток, пр-т. 100 лет Владивостоку, 159). Текст автореферата размещен на сайте совета http://www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент Н.А. Командрова 1.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Известно, что из произрастающих на Земле высших растений лишь около 10-15 % исследовано на наличие биологически активных веществ. Такие исследования требуют серьезного вложения материальных средств. Поэтому первостепенное значение приобретают анализ информации уже накопленной в академической и народной медицине о растениях; разработка системного подхода к изучению лекарственного растительного сырья, рациональное использование дикорастущих и культивируемых растений. Требуется реализация новых подходов в создании фитопрепаратов, внедрение современных физико-химических методов их стандартизации [Завражнов, 1993].

В современной фармацевтической науке существует ряд критериев для оценки лекарственного растительного сырья. С одной стороны, научные исследования химического состава растений показывают широкие возможности получения веществ или лекарственных препаратов с различной фармакологической активностью. С другой стороны, используемая технология переработки растительного сырья, как правило, ориентирована на получение только одного целевого продукта. Сложившаяся на сегодняшний день практика промышленной переработки сырья очень часто не отражает степень его изученности. Преодоление этого противоречия, возможно путем внедрения новых подходов к оценке качества сырья и использования комплексных ресурсосберегающих технологий. Предпосылкой для внедрения таких технологий является изучение химического состава лекарственных растений, условий их произрастания, основных физико-химических свойств биологически активных соединений, разработка наиболее подходящих методик экстракции этих веществ.

Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi, сем. Lamiaceae) является одним из примеров нерационального использования сырья. Истощение запасов природного сырья, массовое исчезновение популяций дикорастущего растения под антропогенным прессом, постоянный рост спроса промышленности и населения на сырье этого растения вызывает необходимость введения сырья в культуру и более полного и комплексного его использования. [Бухашеева, Асеева, 2002].

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение биологических особенностей S. baicalensis в условиях культивирования и природной популяции с оценкой перспективы его выращивания в условиях юга Приморского края как источника растительных полифенолов, а также разработка методов определения качественного и количественного содержания биологически активных веществ и максимального извлечения суммы флавоноидов из сырья.

Для достижения поставленной цели исследования были определены следующие задачи:

1) изучить биоморфологические особенности и ритм сезонного развития S. baicalensis в условиях культивирования на юге Приморского края;

2) сравнить биоморфологические показатели, семенную продуктивность и биопродуктивность растений из природных популяций и выращенных в условиях интродукции;

3) изучить особенности накопления байкалина и других полифенольных соединений в подземных и надземных органах растения при выращивании в условиях юга Приморского края и природных популяциях;

4) определить оптимальные условия экстракции флавоноидов из корней (способ экстракции, тип растворителя, соотношение сырье - экстрагент, температура и продолжительность экстракции);

5) определить качественный и количественный состав флавоноидов в экстрактах;

6) исследовать биологическую активность флавоноидов культивируемого S. baicalensis на экспериментальных животных.

Научная новизна работы.

Впервые проведено изучение состояния агропопуляции S. baicalensis на юге Приморского края (Хасанский район, окрестности пос. Краскино) и показано, что растение характеризуется высоким содержанием байкалина и других полифенольных соединений. Изучены биологические и морфологические особенности развития интродуцента (семенная продуктивность и урожайность). Изучена динамика накопления и распределения по органам растения полифенолов в условиях юга Приморского края и научно обоснованы оптимальные сроки заготовки сырья. Впервые исследована возрастная структура природной популяции (Октябрьский район, окрестности с. Чернятино)..

Исследована биологическая активность полифенолов культивируемого сырья.

Практическая ценность. Разработаны методы интродукции S. baicalensis на юге Приморского края. Даны рекомендации по выращиванию и использованию интродуцента.

Разработана схема экстракции без использования токсичных растворителей.

Материалы диссертации используются в технологической схеме культивирования S.

baicalensis, образовательном процессе при решении вопросов экологического воспитания и образования школьников и студентов края, а также для организации просветительной работы с населением. На основании проведенных исследований, решением Государственной комиссии РФ по испытанию и охране селекционных достижений, S.

baicalensis включен в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию как «Шлемник байкальский Муссон».

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийской научной конференции «Состояние лесов Дальнего Востока и актуальные проблемы лесоуправления» [Хабаровск, 2009]; 10-й международной очно-заочной научнопрактической конференции студентов, аспирантов и молодых исследователей «Интеллектуальный потенциал вузов - на развитие Дальневосточного региона и стран АТР» [Владивосток, 2008], 2-ой международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» [Казахстан, 2007]; всероссийской.

конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» [Улан-Удэ, 2007], 11-ой всероссийской конференции «Экосистемы, организмы, инновации» [Москва, 2009].

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК.

Структура и объем Работа изложена на 134 страницах, содержит 22 рисунка, 18 таблиц и 6 приложений.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка используемой литературы ( источников, в том числе 162 на русском языке и 97 на иностранных).

Глава 2. Материалы и методы Полевые исследования по интродукции популяции S. baicalensis проводились на базе открытого акционерного общества «Юбиком» (Приморский край, Хасанский район).

Природная популяция изучалась в окрестностях с. Чернятино Октябрьского района Приморского края общепринятыми методами [Зайцев, 1972; Кузнецова, 1974; Миркин и др., 2000; Морозова и др., 1997; Муравьева, 1991; Пименова и др., 1998].

Изучение семенной продуктивности и урожайности проводили как описано в литературе [Методические..., 1980; Положий и др., 1988].

Экстракты готовили с использованием воды и различных концентраций этилового спирта (0-96 %), варьировали параметры времени, температуры, соотношения сырье :

экстрагент, степени измельчения сырья. По окончанию экстрагирования экстракт оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Для проведения ультразвуковой экстракции нами использовалась УЗ ванна «Сапфир» с термостатом. Время воздействия ультразвука - 15 мин первичного озвучивания для активного проникновения экстрагента в сырье и непосредственное время ультразвуковой экстракции в течение 20; 30; 40 минут, при комнатной температуре. Вакуум-фильтрацию проводили на установке ПВФ 47/ (Россия). Полученные экстракты высушивали с помощью сублимационной сушки Martin Christ Alpha 1-2 (Германия).

Количественное определение байкалина и других полифенольных соединений в сухом экстракте проводили методом обращено-фазовой высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Shimadzu LC-10VP (Япония). Идентификацию пиков байкалина проводили, сравнивая время удержания стандарта с хроматограммами испытуемых растворов образца. Концентрацию байкалина определяли по стандартной программе для хроматографа с учетом влажности стандарта и образцов.

Методы исследования биологической активности экстрактов S. baicalensis на экспериментальных животных. В работе использовали 80 белых беспородных половозрелых мышей-самцов массой 20-25 г, 63 беспородных крыс-самцов с исходной массой тела 140-160 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария на стандартном пищевом рационе, при свободном доступе к воде и естественном световом режиме с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [European…, 1986] и разрешения комиссии по биомедицинской этике при Горнотаежной станции ДВО РАН. При разделении животных на группы проводили ранжирование по массе тела и возрасту.

Влияние техногенного загрязнения моделировали на мышах. Для этого добавляли в их пищу в течение 20 дней по 1 г на особь в день измельченных листьев липы (Tilia amurensis Rupr.) из двух районов г. Владивостока с различным уровнем техногенного загрязнения (ТЗ). Уровень загрязнения в районе с минимальной техногенной нагрузкой (Ботанический сад) составлял по значению индекса загрязнения атмосферы (ИЗА) величину 2,58, тогда как в районе с максимальной техногенной нагрузкой (Луговая, г.

Владивосток) ИЗА составлял 6,3 [Ежегодный…,2008]. Животные были разделены на группы по 10 особей в каждой. В 1-ой (фоновое техногенное загрязнение) группе животным в пищу добавляли листья липы из района с минимальным техногенным загрязнением; во 2-й (максимальное техногенное загрязнение) группе – в пищу добавляли листья липы из района с максимальным техногенным загрязнением; в 3-й опытной группе – в пищу добавляли листья липы из района с максимальным техногенным загрязнением + сухой экстракт шлемника (10 мг/кг); 4-й опытной группе в пищу добавляли листья липы из района с максимальным техногенным загрязнением + препарат сравнения - 1 мл/кг ранее изученного в нашей лаборатории экстракта патринии скабиозолистной (ЭПС) (Patrinia scabiosifolia Fisch. ex Link) [Зорикова, Хасина, 2005].

Алкогольный гепатит вызывали у крыс контрольной и опытной групп введением в желудок 40% этилового спирта по 0,7 мл на 100 г массы крыс 1 раз в сутки в течение дня [Мансурова, Олимова, 1985]. Животным опытной группы вводили в желудок сухой экстракт шлемника байкальского (СЭШБ) в дозе 10 мг/кг в водном растворе объема 1мл, 1 раз в день на протяжении 21 дня. Интервал между введениями СЭШБ и этанола соответствовал 5-6 часам. Животные интактной группы получали в соответствующем объеме дистиллированную воду.

О степени антиоксидантной эффективности СЭШБ судили по следующим показателям: активность перекисное окисление липидов (ПОЛ) контролировали посредством определения содержания малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и гомогенате печени по методу И. Д. Стальной и Г. Г. Гаришвили [1977], каталазную активность сыворотки крови определяли методом Г. А. Бабенко, М. Н.

Гайнацкого [1976] на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием критерия Стьюдента.

Физиологические методы исследования СЭШБ в дозе 10 мг/кг в водном растворе объема 1мл, вводили животным (группа 3) в желудок через зонд. Контрольные группы мышей получали соответствующий объем дистиллированной воды (группа 1 и 2) или препарат сравнения (группа 4) – жидкий экстракт патринии скабиозолистной (ЭПС) в дозе 1 мл/кг по аналогичной схеме.

Для исследования ориентировочно-двигательной активности (ОДА) применяли тест «открытое поле» (ОП) Время наблюдения за поведением мыши - 5 минут. В поведении животного выделяли следующие визуально идентифицируемые поведенческие акты:

пересечение диаметров (пробеги), пересечение окружностей (переходы), число актов груминга и замирания, число стоек с опорой на стенки и без опоры. После 5 минут исследования животное возвращали в клетку и тщательно протирали пол после каждого теста.

Метод исследования поведения в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) основан на безусловно-рефлекторном страхе падения с высоты и открытых пространств у грызунов [Dawson, Tricklebank, 1995]. Время, проведенное в открытых рукавах ПКЛ, обратно пропорционально уровню тревожности. Таким образом, чем выше показатель предпочтения открытых рукавов лабиринта закрытым, тем ниже уровень тревоги у животных и наоборот. В ходе эксперимента животное помещали на центральную площадку лабиринта и в течение 5 минут визуально регистрировали его поведенческие акты. Рассчитывали индексы тревожного поведения. Эти показатели являются стандартными в методике оценки тревожности лабораторных животных. Чем ниже показатели, тем выше тревожность и наоборот [Воронина, Островская, 1998].

Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Условия интродукции.

Интродукционные площадки располагались в Хасанском районе Приморского края, окрестности пос. Краскино (42° 44 с.ш., 130° 46 в.д.). Для агрохимической характеристики смешанных образцов почвы были выполнены следующие анализы:

содержание гумуса, актуальная кислотность, обменная кислотность, гидролитическая кислотность, содержание подвижных форм фосфора и калия.

Все определения выполнены для трех проб почвы. В табл. 1 представлены средние значения агрохимических характеристик. Пробы 1, 2, 3 соответствуют интродукционным участкам: 1 – уклон 3, высокий уровень грунтовых вод; 2 – уклон до 6, высокая минерализация почвы; 3 – отсутствие уклона, средний уровень грунтовых вод.

3.2. Биологические и морфологические особенности развития интродуцента При подзимнем сроке посева проростки появляются в середине апреля, при весеннем – в третьей декаде апреля, на 14-16 день после посева.

Опадание семядолей означает переход особей шлемника в ювенильное стояние.

Для ювенильных особей характерно наличие одного осевого побега, несущего 5-6 пар настоящих листьев, не отличающихся по морфологическим особенностям от листьев проростков и взрослых растений, но увеличивающихся по размерам в акропетальной последовательности. В ювенильном состоянии побег достигает 10-12 см высоты.

Стержневой корень проникает в почву на глубину 3-5 см. Главный побег продолжает моноподиальное нарастание, достигает 25-40 см высоты и несет до 18-20 пар листьев.

Число боковых побегов 1-го порядка увеличивается до 6-8 пар. На боковых побегах 1-го порядка, образовавшихся из почек, находившихся 4-5-й пары листьев, формируются побеги 2-го порядка. В течение первого года жизни 100% особей переходят из прегенеративного состояния в генеративное. Однолетние особи зацветают в конце лета (в августе), образуют полноценные семена. Осенью, к концу сентября, на корневой шейке закладываются почки возобновления, из которых в следующем году развиваются новые побеги.

Двулетние особи несут вегетативные и генеративные почки, которые трогаются в рост рано весной. Массовое отрастание отмечено в третьей декаде апреля. Из почек развиваются однолетние побеги, несущие одну весенне-летне-осеннюю генерацию листьев. В конце апреля молодые побеги достигали длины 5-7 см с 4-6 парами листьев, длиной 4,0-1,2 см, ширины 0,15-1,3 см. В последующем наблюдается интенсивный рост побегов и формирование растения. Через месяц растения достигали 30-40 см высоты, а диаметр - 50-60 см, количество побегов было в пределах 40-60 шт. Цветение начиналось 15-20 июля, т.е. в среднем через 70 дней после массового отрастания. Массовое цветение отмечено в конце июля (27.07.), в эту фазу особи достигли максимальной высоты до см. Распускание цветков происходило в акропетальном направлении с центрального побега, вслед за которым распускались цветки из с соцветий на боковых побегах порядка, а затем и 2 порядка. Продолжительность цветения S. baicalensis составляла 60- дней. Период созревания семян отмечен в конце августа. Фаза созревания семян не зависит от возраста генеративных растений. Возраст генеративных растений не влияет на сроки наступления и прохождения фенологических фаз, в то время как метеорологические условия вегетационного периода могут сдвинуть сроки прохождения отдельных фаз развития. Вслед за распусканием цветков на центральном побеге распускаются цветки соцветий на боковых побегах 1-го порядка, затем 2-го порядка. Длительность цветения одного цветка 2-5 дней, фаза цветения около 60-70 дней.

Период образования семян и их созревания примерно равен периоду цветения (55дней). Длительность фазы созревания семян не зависит от возраста генеративных растений и сроков посева (подзимнего и весеннего). Форма и положение чашечки цветка в период созревания семян не меняются по сравнению с фазой цветения, окраска же ее становится темно-фиолетовой. Из четырех эрем, находящихся в ценобиях, созревают от до 4. К концу октября, с наступлением заморозков, побеги вместе с листьями отмирают.

В таком состоянии растения зимуют. Вегетационный период длится 225-300 дней.

3.3. Семенная продуктивность и урожайность S. baicalensis в культуре и природной популяции В вегетационный сезон 2008 г. было проведено обследование агро- и природной популяций S. baicalensis. У культивируемых растений зафиксированы следующие показатели: среднее число семян в коробочке 2,7 ± 0,005, среднее число генеративных побегов на 1 растение 6,73 ± 0,03. Потенциальная семенная продуктивность на генеративный побег составляет 251,25 ± 14,6 шт., реальная – 168,99 ± 11,9 шт. Наличие полноценных семян – один из основных показателей соответствия условий произрастания биологическим потребностям вида. Это положение подтверждается высоким коэффициентом семенной продуктивности интродуцента, который равен 67%, что свидетельствует о хорошей адаптации вида к условиям культивирования.

В природной популяции S. baicalensis в вегетационный период 2008 г среднее число семян в коробочке было равно 2,2 ± 0,005, число генеративных побегов на растение - 4,32 ±0,03. Потенциальная семенная продуктивность растения составляет 123,76±10,3 шт., реальная – 64,8±15,7 шт. Коэффициент семенной продуктивности в природной популяции несколько ниже, чем в культуре и составляет 52,4%.

Качество семян определяется размерами, массой 1000 штук и проверкой на всхожесть. В результате исследования природной популяции оказалось: величина семян составляет 1,8±0,01 мм; масса 1000 семян 1,27±0,05 г. Для культивируемых растений аналогичные показатели равны, соответственно: 2,35±0,01 мм и 1,83±0,03 г. Установлено, что в результате интродукции линейные размеры семян возросли на 30,6 %, вес – 44,1 %.

Для установления ценности полученных при культивировании семян как посевного материала проведены опыты по определению лабораторной всхожести семян. При температуре 25° С прорастание семян начиналось на 3 сутки после закладки. Энергия прорастания семян на 5 день в группе без периода покоя составила 37%, у семян годовой выдержки - 32%, лабораторная всхожесть на 10-е сутки равнялась, соответственно 52 и 41%. Анализ значений энергии прорастания и всхожести семян S. baicalensis показал, что при хранении указанные показатели несколько снижаются, приближаясь к показателям природных популяций.

Нами была определена урожайность надземных и подземных частей S. baicalensis на трех интродукционных площадках и в дикой популяции (табл. 2). Наибольшая плотность генеративных особей отмечена на площадке 3, но при этом эксплуатационный запас корней на данном участке является самым низким. Максимальная урожайность корней приходится на площадку 2 при минимальной плотности посадки.

Сырьевые ресурсы S. baicalensis в условиях интродукции и природной популяции Модельная Плотность роста, Эксплуатационный Эксплуатационный площадка площадка площадка популяция 3.4. Накопление флавоноидов в условиях культивирования и в природной популяции хроматографическим методом показали, что в течение сезона качественный состав фенольных соединений остается постоянным, хотя количественно их характеристики изменяются. Количественная ВЭЖХ показала изменение содержания основного флавоноида – байкалина по фенологическими фазами. Максимальное содержание его (14,9 % от абс. сух. сырья) приходилось на весенний период. В фазу цветения (июльавгуст) содержание байкалина в корнях значительно снижалось – до 5,5 %. В начальный осенний период, в фазе формирования семян, количество байкалина несколько увеличивалось (8,3%), и по мере созревания семян продолжало возрастать, хотя и не достигло максимума. В конце октября, к завершению вегетационного цикла, содержание флавоноида в корнях еще более увеличивалось, и приближалось к максимальным значениям (12,5 %).