УДК 577.1(035)(075.8)

ББК 28.072я2я73

Б63

С о с т а в и т е л и:

Т. А. Кукулянская, Н. М. Орел

Рекомендовано ученым советом

биологического факультета

29 сентября 2009 г., протокол № 2

Р е ц е н з е н т ы:

кандидат биологических наук, доцент С. Б. Бокуть;

кандидат биологических наук, доцент Е. А. Храмцова Биохимия : справочник студента : учеб.-метод. пособие для студенБ63 тов биол. фак., обучающихся по специальности 1-31 01 01 «Биология»

специализации 1-31 01 01-02 05 «Биохимия» / сост. : Т. А. Кукулянская, Н. М. Орел. – Минск : БГУ, 2011. – 83 с.

ISBN 978-985-518-396-0.

В справочнике по биохимии приводятся данные об основных свойствах химических веществ, правилах приготовления растворов и реактивов. Кратко изложены методические указания для проведения количественного и качественного исследования биополимеров, основные правила техники безопасности при работе в биохимической лаборатории.

Предназначено для студентов биологического факультета. Будет полезно для магистрантов, аспирантов, специализирующихся по биохимии и смежным дисциплинам молекулярно-биологического направления.

УДК 577.1(035)(075.8) ББК 28.072я2я ISBN 978-985-518-396-0 © БГУ,

ПРЕДИСЛОВИЕ

Экспериментальные приемы, используемые в биохимии, очень разнообразны. При проведении исследований в рамках лабораторных практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ, магистерских диссертаций широко используются методы количественной регистрации показателей, описываемые в соответствующих пособиях и руководствах. Как привило, для постановки эксперимента недостаточно записи конкретной методики, и на практике приходится привлекать большое количество дополнительной справочной литературы. Для облегчения подготовки и проведения эксперимента предлагается настоящее пособие.

Справочник по биохимии представляет собой информационное учебно-практическое издание, предназначенное для широкого круга студентов, магистрантов, аспирантов, специализирующихся по биохимии и смежным дисциплинам молекулярно-биологического профиля. Он содержит основные общепринятые биохимические сокращения, единицы Международной системы единиц (СИ), правила приготовления растворов, прописи буферных смесей, плотности и концентрации кислот. В нем приведена информация о физико-химических свойствах аминов, аминокислот, пептидов, углеводов, наиболее распространенных жирных кислот, витаминов и их активных форм, нуклеотидов и др. Охарактеризованы некоторые реагенты, применяемые в биохимических экспериментах. В справочник включены основные биохимические показатели нормы у человека и у крысы, наиболее часто используемые методы количественного определения, высаливания, осаждения и очистки белков, электрофоретические методы анализа белков и нуклеиновых кислот, классификация ферментов и единицы ферментативной активности, другая полезная информация. Особое внимание обращается на соблюдение требований безопасного выполнения работ, для этого приводится инструкция по охране труда при работе с химическими веществами в лабораториях биологического факультета.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ,

ПРИНЯТЫХ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛИТЕРАТУРЕ

абс. – абсолютный комн. т. – комнатная температура аморф. – аморфный конк. – конкурентный атм. – атмосфера (ед. измерения) конц. – концентрированный ац. – ацетон крист. – кристаллы, кристаллический, безвод. – безводный кристаллизация бел. – белый лед. – ледяной бесцв. – бесцветный медл. – медленно в-во – вещество м/м – масса на массу водн. – водный м/об – масса на объем возд. – воздух м. р. – малорастворимый восплам. – воспламеняющийся минер. – минеральный вязк. – вязкий max – максимум газ. – газовый min – минимум гигр. – гигроскопичный нейтр. – нейтральный гидрол. – гидролиз неорг. – неорганический гор. – горячий неуст. – неустойчивый давл. – давление н. р. – нерастворимый ДМСО – диметилсульфоксид о. – очень ДМФА – диметилформамид о. п. р. – очень плохо растворимый ДСН – додецилсульфат натрия об. – объем ед. – единица об/об – объем на объем жидк. – жидкость окисл. – окислять(ся), окисление ИК – инфракрасный опр. – определение инерт. – инертный опт. – оптимум исп. – испарять(ся), испарение орг. – органический кисл. – кислый, кислота ос. – осадок кол-во – количество отн. – относительно перекр. – перекристаллизовывать ТХУ – трихлоруксусная кислота петр. эф. – петролейный эфир укс. – уксусная пир. – пиридин ум. – уменьшать(ся) плотн. – плотность усл. – условия погл. – поглощение уст. – устойчивый р. – растворимый УФ – ультрафиолет разб. – разбавленный ФАД – флавинадениндинуклеотид разл. – разлагаться, с разложением флуор. – флуоресценция (А – максимум (после tпл или tкип) возбуждения, F – максимум раств. – раствор, растворимый флуоресценции) раств-ль – растворитель ФМН – флавинмононуклеотид раст-сть – растворимость хол. – холодный, на холоде ТСХ – тонкослойная хроматография – неограниченно смешивающийся

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ,

ПРИНЯТЫХ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛИТЕРАТУРЕ

КоQ10 – коэнзим Q10 (убихинон) emax – коэффициент молярной экстинкции в максимуме поглощения emin – коэффициент молярной экстинкции в минимуме поглощения el – коэффициент молярной экстинкции при длине волны l C – молярная концентрация Ео – стандартный окислительно-восстановительный потенциал, В Еа – энергия активации, ккал/моль DF – изменение свободной энергии, ккал/моль DG – изменение свободной энергии при температуре 25 °С и рН 7, ккал/моль I – ингибитор, ингибирование Мr – относительная молекулярная масса S – константа седиментации в воде при температуре 20 °С Тпл – температура плавления, К Ткип – температура кипения, К Тразл – температура разложения, К tзам – температура замерзания, °С tкип – температура кипения, °С tпл – температура плавления, °С tразл – температура разложения, °С Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции (в условиях насыщения фермента субстратом)

ОСНОВНЫЕ ЕДИНИЦЫ ИЗМЕРЕНИЯ,

ПРОИЗВОДНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ И КОНСТАНТЫ

Энергия, рабокалория = тепла Количество электричества Молекулярная масса Молярная масса Относительная масса Скорость ремоль/с моль/с акции кая активность Коэффициент седиментации ность

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ И РЕАКТИВОВ

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ

Растворы – это однородные (гомогенные) системы, состоящие из двух и более компонентов (составных частей) и продуктов их взаимодействия.

По точности выражения содержания вещества растворы делят на неточные (приблизительные) и точные.

Неточные растворы. Численным выражением состава приблизительных растворов в соответствии с Международной системой единиц (СИ) является массовая доля растворенного вещества – безразмерная физическая величина, равная отношению массы растворенного вещества к общей массе раствора. На практике также применяют численное выражение состава раствора в виде массово-объемных отношений его компонентов.

Для получения более полного представления о приготовлении приблизительных растворов обратимся к рассмотрению наиболее часто используемых их аналогов, объединяемых термином «процентное содержание».

Под процентным содержанием принято понимать определенную массу или объем вещества (г или мл соответственно), содержащихся в 100 г или в 100 мл раствора. Это общее определение понятия процентного содержания включает несколько разновидностей. В зависимости от единиц (объема или массы), используемых для обозначения, различают массовое (весовое), массо-объемное (весо-объемное), объемное, объемно-массовое (объемновесовое) процентные содержания.

Массовое (весовое) процентное содержание (%) показывает сколько граммов вещества содержится в 100 г раствора и вычисляется по формуле:

где а – массовая доля растворенного вещества; б – количество растворителя в граммах (в сумме составляют 100 г).

Например, 20%-ным раствором NaCl называют такой раствор, в 100 г которого содержится 20 г NaCl и 80 г воды. Для получения раствора этого вида процентного содержания навеску вещества вносят в химический стакан, в который затем вливают 80 мл воды (при комнатной температуре масса 1 мл воды составляет примерно 1 г).

Массо-объемное (весо-объемное) процентное содержание (г%) представляет собой отношение массовой доли растворенного вещества в граммах к 100 мл раствора. Размерность этого вида процентного содержания – г/мл (м/об). Например, 20 г%-ный раствор NaCl содержит 20 г соли в 100 мл раствора. Для его получения навеску соли (20 г) вносят в мерный цилиндр или мензурку и доливают водой до метки. В случае водных растворов численно одинаковые массовые и массо-объемные процентные растворы по массовой доле вещества в единице объема различаются не очень сильно, ими можно пренебречь. Однако при использовании неводных растворов различия по массовой доле вещества в единице объема могут быть весьма значительными. Так, в 10 г%-ном растворе жира в тетрахлорметане (жидкости плотностью 1,6 кг/л) на 10 г жира приходится около 90 мл растворителя, тогда как в 10%-ном растворе значительно меньше – 56 мл.

Объемное процентное содержание (об%, или ° – градус) есть отношение объемной доли (мл) вещества к 100 мл раствора. Размерность объемного процентного содержания – мл/мл (об/об). Например, 20 об%-ный (20°) раствор этилового спирта содержит 20 мл абсолютного (безводного) спирта и 80 мл воды. Следует иметь в виду, что при смешивании разных жидкостей, бесконечно растворяющихся друг в друге (как, например, в случае спирта и воды), в силу явления контракции (т. е. взаимного проникновения молекул одного вещества через промежутки между молекулами другого) конечный объем раствора может составлять менее 100 мл.

Объемно-массовое (объемно-весовое) процентное содержание отражает объемную долю (мл) вещества, содержащуюся в 100 г раствора. В лабораторной практике используется редко.

Приготовление процентных растворов из кристаллогидратов:

1-й с п о с о б (точный). Предварительно рассчитывают массовое (весовое) количество кристаллогидрата, в котором содержится заданное количество вещества. Пусть, например, требуется приготовить 5%-ный раствор CuSO4 из кристаллогидрата (CuSO4 5H2O) этого вещества. Для расчета необходимой его навески исходят из того, что на одну молекулу CuSO приходится пять молекул воды – относительная молекулярная масса (Mr) H2O = 18, а Mr CuSO4 5H2O составляет 245 (155 приходится на чистую соль и 90 (18 5) – на воду). Путем решения пропорции:

находят требуемую навеску кристаллогидрата (х):

На этикетке бутыли, в которой хранится такой раствор, должно быть написано: «5%-ный (или 5 г%-ный) раствор CuSO4». Это значит, что в 100 г (или 100 мл) раствора содержится 5 г CuSO4, а не его кристаллогидрата.

2-й с п о с о б (условный). Часто, готовя процентные растворы, ведут расчет исходя из массы кристаллогидрата. Например, для приготовления 5%-ного раствора отвешивают 5 г CuSO4 5H2O и приливают к этому количеству воду до объема 100 мл. По существу, такой раствор не является 5%-ным. На этикетке сосуда, в котором он хранится, должна быть надпись:

5%-ный (или 5 г%) раствор CuSO4 5H2O.

Следует иметь в виду, что неправильное хранение кристаллогидратов (в частности, из-за плохой герметичности посуды) может приводить к постепенному выходу кристаллизационной воды из кристаллической решетки (выветривание). При этом часть вещества, особенно на поверхности кристаллов, переходит в аморфное состояние. Такой реактив не пригоден для приготовления растворов ни первым, ни вторым способом. В данном случае требуется предварительно перекристаллизовать его (т. е. восстановить кристаллическую структуру реагента) или, если это позволяют химические свойства вещества, прокалить, переведя его таким образом в аморфное состояние.

Поскольку в соответствии с требованиями СИ в качестве единицы массы и объема раствора используют «кг» и «л», то для приготовления таких растворов сразу производят расчет массовой или объемной доли растворенного вещества на кг или л раствора (размерность таких растворов будет г(кг)/кг, г(кг)/л или мл(л)/л соответственно) или значения отдельных видов процентного содержания умножают на 10, при этом массовое (весовое) и объемное процентное содержание преобразуются в массовое и объемное отношение с размерностью г(кг)/кг и мл(л)/л соответственно, а массо-объемное (весо-объемное) процентное содержание – в массовое содержание с размерностью г(кг)/л.

Для приготовления неточных растворов используются аптекарские, технические (техно-химические) весы и мерная посуда (цилиндры, мензурки).

В случае если возникает потребность в получении приблизительных растворов путем разбавления более концентрированных, можно воспользоваться простым и быстрым способом, определяемым правилом «креста».

Пусть необходимо разбавить 20%-ный (200 г/л) раствор NaCl до 5%-ного (50 г/л). Составляют первую запись:

где 20 – показатель массовой доли вещества во взятом растворе; 5 – показатель требуемого содержания массовой доли; 0 – вода.

Из 20 вычитают 5 и полученное значение записывают в правом нижнем углу. Из 5 вычитают 0 и записывают цифру в правом верхнем углу. После этого схема принимает вид:

Это означает, что для получения 5%-ного раствора нужно 5 объемов 20%-ного раствора смешать с 15 объемами воды.

Если смешивать два исходных раствора одного и того же вещества для получения раствора промежуточной концентрации, то из схемы устраняется 0. Пусть смешиванием 35%-ного и 15%-ного растворов требуется приготовить 25%-ный. В этом случае схема примет вид:

Следовательно, для приготовления 25%-ного раствора нужно взять по 10 объемов обоих исходных растворов. Приведенными схемами можно пользоваться только тогда, когда не требуется достижения особой точности приготовления растворов.

Точные растворы. Численным выражением состава точных растворов в соответствии с СИ является молярная концентрация (с – моль/л). Молярная концентрация, или молярность, – это величина, равная отношению количества растворенного вещества к объему раствора. Раствор, в 1 л которого содержится 1 моль растворенного вещества, называется молярным.

Например, 1 моль/л раствор NaОН содержит в 1 л 1 моль 40 (относительная молекулярная масса) = 40 г NaОН; 0,01 моль/л раствор NaОН содержит в 1 л 0,01 моль 40 = 0,4 г NaОН и т. д. Чтобы приготовить, например, децимолярный раствор NaОН, надо отвесить его 4 г, внести в литровую мерную колбу, на горлышке которой отмечен объем, точно равный 1 л, добавить дистиллированной воды до полного растворения вещества и затем раствор довести до метки (нижняя часть мениска должна касаться метки).

Пользоваться молярной концентрацией удобно, так как известно количество вещества, содержащееся в определенном объеме раствора. Например, для нейтрализации 1 л 1 моль/л раствора NaОН необходимы в соответствии с уравнениями реакций следующие объемы растворов кислот: 1 л 1 моль/л раствора НС1 или 0,5 л 1 моль/л раствора Н2SO4. Очевидно, на нейтрализацию 0,5 л 2 моль/л раствора NaОН потребуется 0,5 л 2 моль/л раствора НС1, или 0,5 л 1 моль/л раствора Н2SO4, или 0,25 л 2 моль/л раствора Н2SO4 и т. д.

Для получения растворов точной концентрации применяют исходные вещества (т. е. реактивы квалификации «х. ч.», строго отвечающие своей химической формуле), фиксаналы, точную мерную посуду и весы для очень точного взвешивания (аналитические, полумикрохимические, микрохимические). Поскольку не всегда удается получить точный раствор нужной концентрации путем растворения приготовленной навески вещества или содержимого некоторых фиксаналов, его приходится проверять путем титрования, находить коэффициент поправки и при необходимости исправлять.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ

1. Ацетилхолина, 2%-ный нейтральный раствор. Готовят 2%-ный раствор ацетилхолинхлорида или бромида и нейтрализуют его 0,005 н раствором NaOH до рН 8,1.

2. Бензидин, 0,1%-ный раствор. 50 мг солянокислого бензидина растворяют в мерной колбе емкостью 50 мл примерно в 35–40 мл ацетатного буфера при нагревании до 70–80 °С в водяной бане.

После растворения охлаждают до комнатной температуры и доводят объем до метки ацетатным буфером. Раствор фильтруют в темную склянку и хранят не более 7 дней, не охлаждая его ниже 16 °С, так как бензидин может выпасть в виде кристаллов. Если раствор желтеет, то он непригоден.

3. Гипосульфит, 0,005 н раствор. Для приготовления 0,005 н раствора йодноватокислого калия отвешивают 0,3567 г KIO3 и растворяют в мерной колбе на 2 л бидистиллированной водой, которую приливают до метки. Каждый раствор проверяют по титрованному раствору KIO3. Проверку титра раствора гипосульфита калия производят, отмеривая в колбочку 2 мл раствора йодноватокислого калия, прибавляя 2 мл 3%-ного раствора тройного хлорцинкйодистого калия, 2 капли раствора крахмала и титруя выделившийся йод раствором гипосульфита из микробюретки.

4. Глюкоза, 1 мг/мл стандартный раствор. 50 г глюкозы разводят в мерной колбе до 50 мл 0,25%-ным раствором бензойной кислоты.

5. 2,4-Динитрофенилгидразин, 0,1%-ный раствор. 20 мл концентрированной соляной кислоты доводят дистиллированной водой до 100 мл (приблизительно 2 н HCl). В колбу Эрленмейера отвешивают 100 мг 2,4-динитрофенилгидразина и добавляют постепенно 100 мл приготовленного 2 н раствора соляной кислоты до полного растворения 2,4-фенилгидразина.

Раствор фильтруют и хранят в холодильнике.

6. Диазореактив. Готовят в день проведения работы из основного раствора сульфаниловой кислоты. 0,9 г сульфаниловой кислоты растворяют в 9 мл концентрированной соляной кислоты и доводят водой до 100 мл. Сохраняют в темной склянке. Этот основной раствор сульфаниловой кислоты может сохраняться в течение 2 недель. 1,5 мл основного раствора сульфаниловой кислоты наливают в стоящую во льду мерную колбу на 50 мл, добавляют 1,5 мл 5%-ного раствора азотистокислого натрия. Через 5 мин добавляют при помешивании еще 5 мл 5%-ного раствора азотистокислого натрия. Через 1 мин постепенно добавляют воду (при охлаждении) до метки. Перемешивают и оставляют раствор во льду на 15 мин. Раствор диазореактива может сохраняться во льду в течение суток.

7. KOH, 1 н спиртовой раствор. 1 объем 11 н раствора KOH смешивают с 10 объемами 90%-ного этилового спирта. Готовят в день анализа.

8. Железосинеродистый калий (красная кровяная соль [K3Fe(CN6)]).

Растворяют 1 г феррицианида калия и 1 г NaOH в 50 мл воды.

9. Индигокармина раствор. 1 г индигокармина растирают в фарфоровой ступке, растворяют в 50 мл концентрированной серной кислоты, осторожно доводят водой до 1 л, фильтруют и хранят в темной склянке.

10. Йода 0,1 н основной раствор. 1,27 мл йода и 3,23 мл йодистого калия растворяют в 100 мл воды. Сохраняется в темной склянке в холодильнике в течение 6 месяцев.

11. Йода 0,025 н рабочий раствор. Отмеривают 25 мл основного 0,1 н раствора йода, добавляют 17 мл концентрированной соляной кислоты и доводят водой до метки 100 мл. Можно хранить в течение 3 месяцев в холодильнике.

12. Насыщенный раствор NaCl. 30 г хлористого натрия растворяют в 100 мл воды и осаждают 10%-ным раствором NaOH.

13. Пировиноградная кислота, раствор. 50 мг пировиноградной кислоты или 62,5 мг натриевой соли пировиноградной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор содержит 0,5 мг пировиноградной кислоты в 1 мл.

14. Реактив Фоля. К 5–10%-ному раствору уксуснокислого свинца прибавляют 10%-ный раствор NaOH до растворения образовавшегося осадка.

15. Реактив Феллинга. Готовят отдельно два раствора:

а) 200 г K,Na-виннокислого и 150 г NaOH разводят в мерной колбе на 1 л;

б) 40 г медного купороса разводят в мерной колбе на 1 л.

Перед применением смешивают равные объемы этих растворов.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МОюЩИХ СМЕСЕЙ

Смесь Комаровского. К 100 мл 6 н раствора HCl добавляют 100 мл 5–6%-ного раствора Н2О2.

Хромовая смесь:

1-й с п о с о б: 200 г K2Cr2O7 растворяют в 1 л HNO3 конц. (избегать попадания в хромовую смесь этанола и метанола, окисляющих Cr2O72--ион до Cr3+ (раствор окрашивается в зеленый цвет и непригоден для применения)).

2-й с п о с о б: 6 г Na2Cr2O7 растворяют в 100 мл H2O + 100 мл H2SO (1,84). Хромовую смесь, приготовленную на H2SO4, не применяют, если посуда загрязнена солями Ba.

Марганцовокислый К на серной кислоте. К 100 мл 4%-ного раствора КMnO4 непосредственно перед употреблением для мытья добавить (для разогревания и усиления окислительных свойств) 3–5 мл H2SO4 конц. (HCl брать нельзя, так как образуется Cl2 ). Смесь используют однократно!

Если после мытья образуется бурый налет на посуде, то его удаляют раствором щавелевой кислоты, 5%-ным раствором NaHSO3 или FeSO4.

ОТНОСИТЕЛьНАЯ ПЛОТНОСТь

И КОНЦЕНТРАЦИЯ МИНЕРАЛьНЫХ КИСЛОТ

Относительная плотность и концентрация Относительная Молярность Содержание (г) Относительная Молярность Содержание (г) Относительная плотность и концентрация Относительная Молярность Содержание (г) Относительная Молярность Содержание (г) Относительная плотность и концентрация растворов аммиака Относительная Молярность Содержание (г) Относительная Молярность Содержание (г) Уксусная кислота

БУФЕРНЫЕ СМЕСИ

Объем довести дистиллированной водой до 200 мл.

Na-ацетат – лимонная кислота буфер (0,2 моль/л); рН 3,6–5, Цитратный буфер (0,1 моль/л); рН 3,0–6, (лимонная кислота Н2О, Mr = 210,14; Na3-цитрат 2Н2О, Mr = 294,12) Na2HPO4–NaH2PO4 (Na-фосфатный буфер) (0,1 моль/л); рН 5,8–8, (Na2HPO4 2Н2О, Mr = 178,05; Na2HPO4 12Н2О, Mr = 358,22;

NaH2PO4 Н2О, Mr = 138,0; NaH2PO4 2Н2О, Mr = 156,03) Объем довести дистиллированной водой до 200 мл.

K-фосфатный буфер (0,05 моль/л); рН 5,8–8, Объем довести дистиллированной водой до 20 мл.

Объем довести дистиллированной водой до 100 мл.

(Na2B4O7 10Н2О(бура), Mr = 381,43; борная кислота, Mr = 61,84) Боратный буфер (0,05 моль/л); рН 9,3–10, Объем довести дистиллированной водой до 200 мл.

Глициновый буфер (0,05 моль/л); рН 8,6–10, Объем довести дистиллированной водой до 200 мл.

ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

НЕКОТОРЫХ РЕАГЕНТОВ

1 Ацетальдегид (этаналь) Бесцв. восплам. жидк.

3 Бензойная кислота (бензолкарбоновая кислота) 4 Бычий сывороточный альбумин (БСА) 5 Виннокислый K,Na (сегнетова соль) 6 8-Гидроксихинолин (8-хинолинол;

п/п 7 Глиоксиловая кислота (оксоэтановая кислота)

OHCCOOH

9 Глицерин (1,2,3-тригидроксипропан) 11 Додецилсульфат натрия (ДСН; лаурилсульфат [CH3(СН2)10.СН2ОSO3]Na 12 Лимонная кислота

HOC COOH

14 Метанол (метиловый спирт; древесный спирт, 15 2-меркаплтоэтенол (монотиоэтиленгликоль) 16 Молочная кислота (2-гидроксипропионовая Гигр. крист. или сироп;

17 Муравьиная кислота (метановая кислота) 18 Натрия борогидрид 19 Пероксид водорода 20 Пировиноградная кислота (2-оксопропионовая п/п ксиполи(окси-1,2-этандиол)) H(OCH2CH2)nOH, где n 22 Полиоксиэтиленовые эфиры на основе Неионные ПАВ;

твин 20 (ПЭГ (n = 20), сорбитанмонолаурат); мицеллообразования:

твин 40 (ПЭГ (n = 20), сорбитанмонопальмитат); твин 20–60 мг/л;

твин 60 (ПЭГ (n = 20), сорбитанмоностеарат); твин 40–29 мг/л;

твин 80 (ПЭГ (n = 20), сорбитанмоноолеат) твин 60–27 мг/л;

23 Тиомочевина (тиокарбамид) 24 Тритон Х- (ПЭГ (n = 9, 10), n-(трет-октил)фенол) 25 Уксусная кислота (этановая кислота) 26 Уксусный ангидрид (этановый ангидрид) 27 Фенилизотиоцианат (ФИТЦ) 28 Фенилуксусная кислота (a-толуиловая кислота) 29 Фенол (карболовая кислота) 31 Этанол 32 Этилендиаминтетрауксусная кислота (этилендиаминтетраацетат; ЭДТА)

ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

АМИНОВ, АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ

п/п 1 L-Аланин (a-аминопропионовая кислота) 2 b-Аланин (b-аминопропионовая кислота) 3 L-Аргинин (a-амино-d-гуанидинвалериановая 4 L-Аспарагиновая кислота (a-аминоянтарная кисН2О; pI COOHCH2HNH2COOH 5 L-Аспарагин 6 Ацетилхолин OH(CH3)3N CH2CH2OOCCH 7 Барбитуровая кислота (лактам) 8 L-Валин (a-аминоизовалериановая кислота)

CHNHCOOH

9 Гистамин (b-аминоэтилглиоксамин) 10 L-Гистидин (a-амино-b-имидазолпропионовая кислота) 4,1625 Н2О; о. с. р.

11 Глицилглицин 12 Глицин (аминоуксусная кислота) 13 L-Глутаминовая кислота (a-аминоглутаровая кислота) COOHCH2CH2NH2COOH 14 L-Глутамин п/п 15 L-Глутатион (L-g-глутамил-L-цистеинилглицин) 16 L-Изолейцин (a-амино-b-метилвалериановая CH3CH2CH(CH3)CHNH2COOH 17 Имидазол 18 Индол (2,3-бензопиррол) кислота, гетероауксинбензопиррол) 20 Кадаверин (1,5-пентадиамин, пентаметилендиамин) 21 Креатин (b-метилгуанидоуксусная кислота, метилгликоциамин) 22 Креатинин (1-метилгликоциамидин) 23 L-Лейцин (a-аминоизокапроновая кислота) 24 L-Лизин (a,e-диаминокапроновая кислота) п/п 25 L-Метионин (a-амино-g-метилмеркаптомасляная CH3SCH2CH2CHNH2COOH 26 D,L-Оксипролин (g-окси-пирролидинкарбоновая 27 L-Орнитин (a, d-диаминовалериановая кислота) 28 D,L-Пролин (2-пирролидинкарбоновая кислота) 29 L-Серин (a-амино-b-оксипропионовая кислота) 30 Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) NH2CH2CH2SO3H 31 L-Тирозин (b-(п-оксифенилаланин)) 32 Тирамин 33 L-Треонин (a-амино-b-окси-н-масляная кислота) CH3CHOHCHNH2COOH 34 Триптамин (3-(b-аминоэтилиндол)) 35 L-Триптофан (a-амино-3-индолпропионовая кисН2О;

п/п 36 L-Фенилаланин (a-амино-b-фенилпропионовая 37 Холин (b-гидроксиэтило. р. Н2О, этаноле;

триметиламмониумгидроксид) HOCH2CH2N+(CH3)3OH– Цистеамин (b-меркаптоэтиламин) HSCH2CH2NH 39 L-Цистеин (b-меркаптоаланин) HSCH2CHNH2COOH 40 L-Цистин (a-амино-b-окси-н-масляная кислота) SCH2CHNH2COOH SCH2CHNH2COOH 41 L-Цитруллин (a-амино-d-уреидовалериановая 42 Этаноламин (b-оксиэтиламин) NH2CH2CH2OH

ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

МОНО-, ОЛИГО- И ПОЛИСАХАРИДОВ

п/п 1 Амилоза (a-1,4-глюкан) (a-1,4-глюкан, разветвления через a-1,6 связи) 4 N-Ацетил-D-глюкозамин п/п 5 D-Галактоза 6 Гиалуроновая кислота (a-1,4-глюкан, разветвления через a-1,6 связи) 8 D-Глюкоза п/п 9 D-глюконовая кислота 10 D-глюкуроновая кислота 11 Инулин (b-D-фруктофуранозил-(1,2)-b-D-фруктос. р. хол. Н2О; р.

12 Крахмал. (смесь амилозы (22–26 %) и амилопектина Раст-сть: н. р. Н2О п/п 13 Лактоза (b-галактопиранозил-(1,4)-глюкопираноза) 14 Лактулоза (b-галактофуранозил-(1,4)-D-фруктоза) 15 Ликобиоза (b-глюкопиранозил-(1,4)с. р. Н2О a-галактопираноза) п/п 16 Мальтоза (a-глюкопиранозил-(1,4)-a-глюкопираноза) 17 D-Манноза 18 Раффиноза (a-галактопиранозил-(1,6)-сахароза) 19 D-Рибоза п/п 20 D-Рибулоза 21 Сахароза (a-глюкопиранозил-(1,2)-b-фруктофураноН2О; с. р.

22 D-Седогептулоза п/п 23 Трегалоза (1-О-a-D-глюкопиранозилр. 10820 Н2О; о. с. р.

a-D-глюкопиранозид) 24 D-Фруктоза 25 Хитин 26 Целлобиоза (b-D-глюкопиранозил-(1,4)-D-глюр. Н2О; н. р. этаноле, копираноза) п/п 27 Целлюлоза (b-1,4-глюкан) 28 D-Эритроза

НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ

жИРНЫЕ КИСЛОТЫ

Жирная кислота

ЕДИНИЦЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

Скорость ферментативной реакции, как и любой химической реакции, определяется количеством веществ, прореагировавших за единицу времени при заданных условиях. Скорость ферментативной реакции зависит от активности фермента, которая может быть выражена в различных единицах:

1 катал (кат) – количество фермента, которое катализирует превращение 1 моль субстрата за 1 с при 25 °С (при оптимальных условиях для данного фермента (pH, [S]));

1 международная единица (МЕ) – количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25 °С (при оптимальных условиях для данного фермента (pH, [S])).

Удельная активность фермента – число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка.

Если известна молекулярная масса фермента, то можно рассчитать молекулярную активность (число оборотов), она характеризуется числом молей субстрата, которое подвергается превращению ферментом в количестве 1 моль за 1 мин. В том случае когда у фермента несколько активных центров, то определяют количество субстрата (в моль), подвергающегося превращению 1 моль каталитических центров (молярная концентрация фермента, умноженная на число активных центров в молекуле фермента) – активность каталитического центра.

Оксидоредуктазы Окислительно-восстановительные реакции всех Трансферазы Перенос отдельных атомов и групп атомов Гидролазы Гидролитическое расщепление химических связей Изомеразы Взаимопревращение различных изомеров

ОСНОВНЫЕ ВИТАМИНЫ

И ИХ АКТИВНАЯ ФОРМА

обозначение витамина D Кальциферол 1,25-Дигидроксихолекальциферол В5 (РР) Никотинамид Никотинамиддинуклеотид (НАД) В9 Фолиевая кислота Тетрагидрофолиевая кислота В12 Цианокобаламин Метилкобаламин, дезоксиаденозилкобаламин

СпЕКТРАльНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

НАДН НАДФН НАД НАДФ ФАД (в фосфатном буфере, 0,1 моль/л) ФАДН Гуанозин-5-трифосфат (ГТФ)

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

Спектрофотометрические методы анализа основаны на оценке поглощения световой энергии анализируемыми веществами. Между поглощением (А), пропусканием (Т) и интенсивностью (I) падающего света существует следующая зависимость:

где I0 – интенсивность падающего света; I – интенсивность пропущенного света.

Спектральные свойства веществ определяются их структурными особенностями, а интенсивность светопоглощения – концентрацией вещества в растворе:

где e – коэффициент молярного поглощения (молярной экстинкции);

l (см) – длина оптического пути (толщина слоя); c (моль/л) – концентрация вещества в растворе.

Коэффициент молярной экстинкции e численно равен поглощению раствора с концентрацией 1 моль/л при длине оптического пути 1 см. Он имеет размерность (моль/л)–1 см–1. Для соединений, обладающих высоким уровнем светопоглощения в видимой или УФ области спектра, например, пуринов, пиримидинов, флавиновых и пиридиновых коферментов, гемопротеинов и других e ~ 103–105.

ИНТЕРВАЛЫ ДЛИН ВОЛН

ПОГЛОЩАЕМОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ НОРМЫ

Наименование показателя, Показатель нормы Показатель нормы Аланинаминотрансфераза 0,10–0,68 0,46–0,21 (сыворотка) (АлАТ), ммоль/(ч л) Аспартатаминотрансфераза 0,1–0,45 0,9–0,74 (сыворотка) (АсАТ), ммоль/(ч л) Альфа-амилаза, г/(ч л) ммоль Рi/(ч л) Наименование показателя, Показатель нормы Показатель нормы Молочная кислота, ммоль/л 0,56–1,67 1,77–3,25 (кровь) Пировиноградная кислота, 45,6–114 114,0–353,4 (кровь) мкмоль/л Триглицерины, ммоль/л 0,44–1,82 0,35–0,70 (сыворотка) ммоль/л Фосфор неорг., ммоль/л 0,65–1,29 1,45–9,37 (печень) Холестерин, ммоль/л 3,64–6,76 1,09–2,36 (сыворотка)

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Растворимые белки экстрагируют из тканей, осаждают и после растворения осадка в щелочи определяют различными методами.

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди.

Позволяет определить от 2 до 10 мг белка в пробе.

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 10 мг в 1 мл.

2. Биуретовый реактив: 0,15 г CuSO4 5Н2O и 0,6 г NaКС4Н4O6 4Н2O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н2O, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ного раствора NaOH (свободного от Na2СО3), добавляют 0,1 г КI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке.

Ход определения:

К 1 мл раствора, содержащего от 2 до 10 мг белка, добавляют 4 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм.

Содержание белка в исследуемых пробах рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору белка. Определению мешает присутствие солей аммония.

Мешающие соединения. Пептиды, трис, сахароза и желчные пигменты дают окраску в биуретовой реакции; соли аммония, трис, сахароза и глицерин оказывают влияние на окраску, даваемую белками. Липиды и детергенты могут вызывать помутнение.

МИКРОМЕТОД С РЕАКТИВОМ БЕНЕДИКТА

Позволяет определить от 0,1 до 2 мг белка в пробе.

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 1 мг в 1 мл.

2. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта):

17,3 г цитрата натрия и 10 г Na2СО3 растворяют при подогревании в небольшом количестве воды. В раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.

3. NaОН – 6%-ный раствор.

Ход определения:

К 2 мл раствора, содержащего 0,1–2 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка.

МЕТОД ЛОУРИ

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10–100 мкг белка в пробе). На развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации 0,2 ммоль, глицилглицин), восстановители (цистеин, дитиотреитол в концентрации 0,01–0,4 ммоль, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА в концентрации 0,5 ммоль), детергенты (тритон Х-100 в концентрации 0,1– 0,2 % вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации 0,15 %, сахароза в концентрации 10 % и др.

В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по Лоури в растворитель для приготовления стандартного раствора белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. В некоторых случаях целесообразно проводить предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой (ТХУ), с последующим растворением их в щелочных растворах, или очистка белковых растворов от низкомолекулярных компонентов путем диализа или гель-фильтрации на сефадексе G-25.

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, содержащий 0,25 мг в 1 мл.

2. Na2СО3 – 2%-ный раствор в 0,1 н растворе NaОН.

3. CuSO4 5Н2O – 0,5%-ный раствор в 1%-ном растворе цитрата натрия.

4. Рабочий раствор: 1 мл реактива 3 смешивают с 50 мл реактива 2.

Рабочий раствор готовится в день определения.

5. Реактив Фолина – Чокальтеу: 10 г Na2WO4 2Н2O (перекристаллизованный) и 2,5 г Na2MoO4 2Н2O помещают в круглодонную колбу на 200– 250 мл, приливают 70 мл воды и хорошо перемешивают. К полученному раствору добавляют 5 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной НСl (х. ч.). Колбу присоединяют к обратному холодильнику (на шлифе), ставят на сетку и кипятят в течение 10 ч. Затем в раствор добавляют 15 г Li2SO4, 5 мл Н2O и одну каплю брома. Раствор перемешивают и нагревают для удаления брома. После охлаждения доводят Н2O до 100 мл, фильтруют и разводят Н2O с таким расчетом, чтобы получился 1 н раствор кислоты (т. е. приблизительно вдвое). Кислотность определяют титрованием разведенного в 10 раз реактива 0,1 н раствором NaОН в присутствии фенолфталеина. Реактив может храниться в темной склянке длительное время.

6. ССl3СООН (ТХУ) – 10%-ный раствор.

7. NaОН – 1 н раствор.

Ход определения:

К 0,4 мл исследуемого раствора, содержащего 10–100 мкг белка, приливают 2,0 мл рабочего раствора (4), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина – Чокальтеу, содержимое пробирки тщательно перемешивают и через 30 мин колориметрируют при 750 нм. Содержание белка рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору.

В случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют ССl3СООН (ТХУ) из такого расчета, чтобы конечная концентрация ее была равна 3–4 %. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на 10–20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием и промывают 2%-ным раствором ССl3СООН. К осадку добавляют 1–2 мл 1 н раствора NaОН и осторожно подогревают до растворения осадка белка. Раствор белка количественно переносят в мерную колбу на 25–50 мл, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

Мешающие соединения. Многие широко используемые биохимические реагенты мешают количественному определению белка, усиливая фон или нивелируя окраску с белком. К их числу относятся: тирозин, триптофан и фенольные соединения; буферы (например, трис, хепес, глицин, гистидин, цитрат); сахара (например, сахароза, глюкоза, глицерин); вещества, применяемые для создания градиента (например, фиколл, метризамид, поливинилпирролидон); тиольные соединения; восстановители; ЭДТА; (NH4)2SO4; тритон Х-100.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА МЕТОДОМ ЛОУРИ

В ПРИСУТСТВИИ НЕИОННЫХ ДЕТЕРГЕНТОВ

Для солюбилизации мембранных белков часто используют неионные детергенты, например, тритон Х-100, твин-80 и др. Так как эти детергенты влияют на развитие окраски при определении белка с биуретовым реактивом и методом Лоури, от них нужно освобождаться. Практически полного удаления детергентов из пробы можно добиться экстракцией их изоамиловым спиртом.

Реактивы:

1–5. Как для определения белка методом Лоури.

6. Изоамиловый спирт.

7. Хлороформ.

Ход определения:

0,5 мл раствора белка (10–100 мкг), содержащего тритон Х-100, смешивают с 0,5 мл 1 н раствора NaОН и 3 мл рабочего раствора (4). После 10-минутного выдерживания при комнатной температуре к полученной смеси добавляют 3 мл изоамилового спирта и снова тщательно перемешивают. Смесь центрифугируют 10 мин при 2000 g. Верхний слой, содержащий изоамиловый спирт, осторожно удаляют с помощью шприца. Оставшуюся жидкость (4 мл) помещают в чистую пробирку, доливают 0,38 мл реактива Фолина – Чокальтеу и после тщательного перемешивания к смеси добавляют 2,0 мл хлороформа для удаления следов изоамилового спирта. Все тщательно перемешивают, центрифугируют 15 мин при 2000 g, затем хлороформ удаляют с помощью шприца. Окраска развивается в течение 30 мин, после чего раствор колориметрируют при 750 нм. При построении калибровочного графика в стандартные пробы добавляют те же компоненты, что и в опытные.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С КУМАССИ СИНИМ

Метод основан на связывании с белками кислого красителя кумасси синего, выпускаемого в двух модификациях: R-250 и G-250. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется. Интенсивности окраски имеют линейную зависимость в диапазоне 1–10 мкг белка/мл.

Многие из исследованных соединений (фосфат, цитрат, пирофосфат, ацетат, HEPES, MOPS, MES, BES, PIPES, трис, какодилат, формиат, дитиотреитол, ЭГТА, глицин, тирозин, а также аденозин, АТФ, тимидин, ДНК, РНК, полиадениловая кислота) не влияют на развитие окраски. Наличие в среде инкубации детергентов вызывает значительное увеличение оптической плотности.

Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определять.

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, содержащий 0,05 мг в 1 мл.

2. Раствор красителя. 10 мг красителя (Coomassie brilliant blue G) гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл 95%-ного спирта. Полученный раствор смешивают с 10 мл 95%-ной фосфорной кислоты, разводят водой до конечного объема 100 мл. Отфильтрованный раствор красителя хранится при комнатной температуре около двух недель.

Ход определения:

1,5 мл раствора, содержащего от 10 до 50 мкг белка, смешивают с 1,5 мл раствора красителя (2). Через 3–5 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм, используя в качестве контроля 1,5 мл красителя с 1,5 мл Н2O вместо раствора белка. В описанной модификации А595 линейно зависит от количества белка в интервале от 10 до 50 мкг.

Мешающие соединения. Сильнощелочные буферы и детергенты, такие как додецилсульфат и тритон Х-100, снижают интенсивность окраски.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и в меньшей степени фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при длине волны 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе.

Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при усредненном содержании белка в растворе 1 мг/мл величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине слоя жидкости в 1 см). Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов.

Ход определения:

Измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм. Содержание белка рассчитывают с помощью номограммы (рис. 1): экспериментально полученные величины оптической плотности при 260 и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией; точка пересечения этой прямой со шкалой, на которой приведена концентрация белка, определяет содержание белка в исследуемом растворе.

Содержание белка можно найти по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм по формуле:

содержание белка = 1,45 А280 –

РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

ОСАДИТЕЛИ БЕЛКОВ

Вольфрамовая кислота Р а с т в о р А. 10%-ный (м/об) раствор вольфрамата натрия (Na2WO4 2H2O) в воде.

Р а с т в о р Б. 0,335 моль/л раствор H2SO4.

Образец ткани гомогенизируют с водой до желаемого разбавления, затем добавляют раствор вольфрамата, после чего по каплям, тщательно перемешивая, доливают равный объем серной кислоты. В другом варианте равные объемы растворов А и Б можно смешать перед добавлением к образцу. Смешанный реагент неустойчив; его не следует хранить более двух недель, при появлении осадка готовить заново. Фильтрат, получаемый в результате осаждения вольфрамовой кислотой, имеет рН ~ 6,5.

Приблизительные количества растворов вольфрамата и серной кислоты, необходимые для полного осаждения белка (из тканей крысы) приведены ниже:

Сульфат цинка – щелочь 1-й спо соб:

Р а с т в о р А. 10%-ный раствор ZnSO4 7Н2О.

Р а с т в о р Б. 0,5 моль/л раствор NaOH.

Вместо ZnSO4 можно использовать сульфат кадмия, однако никаких особых преимуществ как осадитель белка он не дает.

При титровании по фенолфталеину на 10 мл раствора А, разбавленного 70 мл Н2О, расходуется ~ 11 мл раствора Б (в течение достаточно долгого времени должна сохраняться розовая окраска).

1 мл крови разбавляют до 8 мл, добавляют 1 мл раствора А, перемешивают, добавляют 1 мл раствора Б, вновь перемешивают и фильтруют.

В случае других тканей реагенты берут в тех же соотношениях, что и при использовании вольфрамовой кислоты.

2-й спо соб:

Р а с т в о р А. К 12,5 г ZnSO4 7Н2О добавляют 125 мл 0,125 моль/л H2SO4. Общий объем раствора доводят до 1 л водой.

При титровании по фенолфталеину на 50 мл раствора А расходуется ~ 6,7–6,8 мл раствора Б (в течение достаточно долгого времени должна сохраняться розовая окраска).

К 1 мл крови добавляют 8 мл раствора А и перемешивают, добавляют 1 мл раствора Б, перемешивают и фильтруют. В случае других тканей работают по этой же методике.

3-й спо соб:

Р а с т в о р А. 5%-ный раствор ZnSO4 7H2О.

Р а с т в о р Б. 0,15 моль/л Ba(OH)2.

При титровании по фенолфталеину на 10 мл раствора А, разбавленного 100 мл Н2О, расходуется 10 мл раствора Б (в течение достаточно долгого времени должна сохраняться розовая окраска).

1 мл крови разбавляют 5 мл Н2О, добавляют 2 мл раствора А, перемешивают и добавляют 2 мл раствора Б; раствор перемешивают и фильтруют.

В случае других тканей работают по этой же методике.

Трихлоруксусная кислота При исследовании крови смешивают 1 мл образца с 9 мл 10%-ного (м/об) раствора трихлоруксусной кислоты; раствор центрифугируют или фильтруют. В случае тканевых экстрактов, инкубационных смесей ферментов и других объектов для обеспечения полного осаждения белков обычно достаточно использовать трихлоруксусную кислоту с конечным ее содержанием в белоксодержащем объекте 3–5 % (м/об). Небелковый азот остается в супернатанте. После удаления осадка белка трихлоруксусную кислоту в значительной мере можно удалить из супернатанта путем многократной экстракции диэтиловым эфиром, насыщенным водой.

Хлорная кислота В случае тканевых экстрактов, инкубационных смесей ферментов и других объектов добавляют такое количество хлорной кислоты, чтобы ее конечное содержание в белоксодержащем объекте составило 3–5 % (0,3– 0,5 моль/л). После центрифугирования избыток хлорной кислоты можно осадить в виде калиевой соли, нейтрализуя супернатант раствором КОН.

К2СО3 или К3РО4 при охлаждении до 0 °С (осадок КClО4 удаляют путем центрифугирования). Не следует допускать нагревания реакционной смеси во время центрифугирования, так как растворимость КClО4 гораздо выше при комнатной температуре, чем при 0 °С.

Добавляют такое количество этанола, чтобы конечное содержание составило 75–80 % (об/об); смесь нагревают (лучше до кипения в течение 1–2 мин), охлаждают, центрифугируют и декантируют супернатант. Для удаления этанола и липидного материала добавляют 3 объема СНCl3; смесь тщательно перемешивают и центрифугируют. Этанол переходит в слой (нижний) СНCl3.

ИСПОЛьЗОВАНИЕ СУЛьФАТА АММОНИЯ

ДЛЯ ВЫСАЛИВАНИЯ БЕЛКА

Ниже указано количество твердого (NH4)2SO4, который необходимо добавить, чтобы из раствора с известной первоначальной степенью насыщения получить раствор с желаемой конечной степенью насыщения. Все данные отнесены к насыщенному раствору при 0 °С (706,8 г (NH4)2SO4 в 1 л Н2О, т. е. 5,35 моль/л). Количество Gx (в г) (NH4)2SO4, которое необходимо добавить к 1 л раствора с первоначальной степенью насыщения S1, чтобы получить раствор с конечной степенью насыщения S2, определяется по формуле:

где G – масса (NH4)2SO4 (в г), содержащегося в 1 л насыщенного раствора;

S1 и S2 – степени насыщения в долях, например S1 = 0,5 и S2 = 0,7; u – парциальный удельный объем (NH4)2SO4 в насыщенном растворе. В формуле не учитывается изменение парциального удельного объема в зависимости от концентрации (NH4)2SO4.

При добавлении насыщенных растворов (NH4)2SO4 изменения объемов в результате смешивания незначительны. Объем Vнас (в мл) насыщенного раствора (NH4)2SO4, который необходимо добавить, чтобы увеличить первоначальную степень насыщения S1 раствора объемом 1 л до конечной степени насыщения S2, определяется по следующей формуле:

Степень Количество (г) твердого (NH4)2SO4, которое необходимо добавить на каждые 100 мл исходного раствора насыщения раст-

ДИАЛИЗ

Диализ используют для очистки белков (других высокомолекулярных соединений) от низкомолекулярных примесей или для замены состава среды. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке, приготовленном из полупроницаемой мембраны (концентрация солей, величина pH и другое), будет тот же, что и в окружающем растворе.

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Метод основан на том, что молекулы, обладающие электрическим зарядом, величина и знак которого определяются pH, ионной силой окружающей среды, под влиянием внешнего электрического поля передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру и степени гидратации.

Метод электрофореза белков в полиакриламидном геле обладает большой разрешающей способностью в связи с тем, что разделение смесей идет не только по заряду, но и по размерам и форме частиц. Преимуществами метода являются: химическая стабильность и инертность геля, возможность получения гелей с заданной величиной пор, отсутствие адсорбции и электроосмоса, устойчивость к растворителям, изменениям температуры и рН.

Использование диск-электрофореза в полиакриламидном геле, т. е.

электрофореза в неоднородной разделяющей среде, добавляет к этому эффект концентрирования, что позволяет проводить разделение белков из разбавленных растворов без их предварительного концентрирования. Электрофоретическое разделение белков проводят как в трубочках, так и в тонком слое полиакриламидного геля (слэбе).

Общие реактивы:

1. ТЕМЕД – реактив стабилен при хранении в холодильнике в неразбавленном виде. К полимеризуемой смеси его добавляют непосредственно перед разливкой.

2. Персульфат аммония [(NH4)2S2O8] – 1%-ный раствор, свежеприготовленный.

3. Амидовый черный 10 Б – 0,5%-ный раствор, приготовленный на 7%-ном растворе СН3СООН. Раствор стабилен при комнатной температуре.

4. Кумасси R-250 – 0,1%-ный раствор, приготовленный на 7%-ном растворе СН3СООН.

5. СНзСООН – 7%-ный раствор.

6. Сахароза – 40%-ный раствор.