[ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития
Фармацевтический факультет
Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии
Учебно–методическое пособие для студентов 5 курса
фармацевтического факультета Нижний Новгород 2006 УДК 615.1 Введение в хроматографический анализ. Учебно-методическое пособие для студентов 5 курса фармацевтического факультета. – Нижний Новгород:
Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006.
Учебно-методическое пособие составлено для студентов 5 курса фармацевтического факультета в соответствии с программой по фармацевтической химии (Москва, 2002 г.). В предлагаемой работе в краткой форме изложены основы хроматографического анализа, классификация его методов и описаны наиболее популярные методы анализа (газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография). Приведены блок схемы современных газожидкостных и жидкостных хроматографов, дан алгоритм расчта основных параметров анализа.
Рекомендовано к изданию Центральным методическим советом Нижегородской государственной медицинской академии. Протокол № 3 от ноября 2005 года.
Составители: проф. Н.Б. Мельникова, В.В. Селехов, В.М. Пожидаев, Т.В. Саликова, О.Е. Зимнякова, М.С. Гусихина.
Рецензент: инженер-хроматографист ООО «Фармстандарт-Фитофарм НН»
Пожидаева К.А.
© Н.Б. Мельникова, В.В. Селехов, В.М. Пожидаев, Т.В. Саликова, О.Е. Зимнякова, М.С. Гусихина,
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение............................................. Газовая хроматография.Теоретические положения метода....................... Лабораторная работа.................................. Жидкостная хроматография.
Теоретические положения метода....................... Лабораторная работа.................................. Перечень практических навыков и умений............... Список литературы................................... Приложение 1....................................... Приложение 2....................................... Приложение 3....................................... Приложение 4....................................... Приложение 5. Тестовые вопросы......................
ВВЕДЕНИЕ
Хроматография [гр. Chrmatos – цвет + grapho – пишу] – один из наиболее перспективных в настоящее время методов разделения и анализа веществ, используемый в различных отраслях аналитической химии. Основы метода были заложены русским ботаником М.С. Цветом для разделения сложной смеси растительных пигментов из листьев зеленых растений. Бурное развитие методов хроматографического анализа началось во второй половине XX века. С 1961 года хроматография используется в медицине СССР для анализа лекарственных средств.Сущность метода заключается в различной скорости перемещения веществ некоторой анализируемой смеси вдоль слоя сорбента (неподвижной фазы – НФ) в потоке элюента (подвижной фазы – ПФ). Скорость перемещения веществ связана с различным распределением разделяемых веществ между двумя фазами из-за неодинакового взаимодействия с ними. В результате исходная смесь разделяется на слои, содержащие более или менее чистые вещества, которые могут быть проанализированы.
В зависимости от выполняемых задач хроматография бывает:
– аналитической, когда производится исследование физико-химических характеристик веществ при использовании хроматографической аппаратуры и на основании параметров хроматографических зон;
– препаративной, используемой для выделения небольших количеств чистых компонентов в лабораторных условиях;
– промышленной, применяемой для получения чистых веществ в значительных количествах.
Распространены также комплексные (гибридные) методы.
В настоящее время получили распространение следующие виды хроматографии:
1. Газовая. Производится разделение и анализ газообразных веществ в потоке элюента-газа (водород, гелий, азот).
2. Жидкостная. Разделение веществ производится в потоке жидкого элюента (н-гексан, диметилформамид, ацетонитрил Более подробная классификация вариантов хроматографического анализа в зависимости от используемых подвижной и неподвижной фаз и характера межмолекулярных взаимодействий дана в таблицах 1-3.
Варианты хроматографии по фазовым состояниям Подвижная фаза Неподвижная фаза Название метода Газ или пар в Тврдый адсорбент Флюидно-адсорбционная сверхкритиче- Жидкость Флюидно-жидкостная ском состоянии Коллоидная Сложная композиция Полифазная Варианты хроматографии по характеру взаимодействий Механизм процесса разделения Вариант хроматографии Различная сорбируемость компонентов Адсорбционная смеси тврдым неподвижным адсорбентом Различная растворимость компонентов Распределительная смеси в жидкой НФ Различие констант ионного обмена между Ионообменная НФ и компонентами разделяемой смеси Разная проницаемость молекул компонентов Эксклюзионная в неподвижную фазу (высокопористый не- (молекулярно-ситовая) ионогенный гель).
Различная способность разделяемых ком- Осадочная понентов выпадать в осадок на тврдой НФ Образование водородных связей, химиче- Хемосорбционная ское сродство отдельных компонентов и т.д.
Различная скорость движения заряжнных Электрохроматография частиц компонентов под воздействием внешнего напряжения Варианты хроматографии по способу проведения процесса В цилиндрическом слое сорбента Колоночная В пленке жидкости или слое сорбента, размещенном на внутренней стенке трубки В полях электрических, магнитных, цен- Хроматография в полях В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие варианты хроматографии: фронтальный, проявительный и вытеснительный.
При фронтальном варианте в слой сорбента непрерывно вводится разделяемая смесь, состоящая из газа-носителя и разделяемых компонентов, например 1, 2, 3, 4, которая сама является подвижной фазой. Через некоторое время после начала процесса наименее сорбируемый компонент (например, 1) опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов: 1 + 2, 1 + 2 + 3, 1 + 2 + 3 + 4 (рис. 1, a).
Проявительный (элюационный) метод заключается в том, что компоненты смеси (сорбаты) переносятся через сорбционный слой потоком вещества (элюента), сорбирующегося хуже любого из сорбатов. В ходе проявительного анализа разделенные компоненты анализируемой смеси выходят из хроматографической колонки в потоке элюента отдельными зонами, между которыми (при достаточно четком разделении) из колонки выходит чистый элюент (рис. 1, б). Это наиболее употребительный вариант хроматографии.
Вытеснительный метод заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующегося сильнее любого из компонентов смеси. В ходе вытеснительного анализа образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, между которыми окажутся зоны их смеси (рис. 1, в). Порядок элюирования компонентов характеризует их физико-химические свойства, а ширина полосы (не высота!) пропорциональна концентрации данного компонента. Вытеснительный анализ как метод разделения имеет весьма ограниченное применение и крайне редко используется в количественном анализе.
Рис. 1. Основные варианты проведения хроматографического процесса:
а – фронтальный; б – проявительный; в – вытеснительный; 1, 2, 3, 4 – разделяемые вещества; C – несорбирующаяся подвижная Существуют два основных метода хроматографического определения состава смесей:
1) метод выходной кривой (применяется в основном, в колоночной и капиллярной хроматографии); основан на непрерывном определении свойства выходящего из колонки потока как функции времени или объема пропущенного вещества;
2) метод слоя, заключающийся в определении изменения свойства смеси по длине сорбционного слоя.
В первом варианте проба, растворнная в подвижной фазе, вводится в верхнюю часть колонки. Затем с использованием подвижной фазы осуществляется элюирование разделяемых веществ до тех пор, пока они не будут детектированы в конце колонки.
Поясним принцип элюирования на примере разделения веществ А и В (рис. 2). После того как проба введена в колонку, е компоненты распределяются между подвижной и неподвижной фазами. Если подвижная фаза после этого непрерывно поступает в форме элюента, вещества распределяются вдоль колонки между порциями подвижной и новыми частями неподвижной фаз. Для соединений, удерживающихся сильнее на неподвижной фазе, требуется больше времени для разделения, чем для веществ, взаимодействующих слабее. В идеале вещества разделяются после соответствующего времени элюирования и индивидуально детектируются в конце колонки.
а) развитие внутренней хроматограммы на неподвижной фазе б) внешняя хроматограмма, регистрируемая детектором сигнал детектора Рис. 2. Принцип получения хроматограммы.
Хроматограммой называется запись сигнала детектора как функции времени элюирования.
Простейший пример второго метода хроматографического определения состава смесей – бумажная хроматография, когда на специальную бумагу наносится растворитель с исследуемой смесью веществ. Под действием капиллярных сил растворитель движется от точки нанесения пробы, а разделяемые вещества сорбируются на бумаге, образуя зоны, как, например, показано на рисунке 3.
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Среди всех методов хроматографического анализа газовая хроматография пользуется наибольшей популярностью. Это связано с универсальностью применяемых методов анализа в отношении многих классов летучих и термически устойчивых веществ, высокой разделительной способностью хроматографических колонок, малой продолжительностью анализа в расчте на один компонент, высокой чувствительностью, малой величиной анализируемой пробы и высокой точностью.В то же время метод имеет и недостатки, связанные, прежде всего с техническими трудностями при анализе высококипящих жидкостей, тврдых и нелетучих веществ.
В качестве ПФ используется газ (как правило, инертный), НФ представляет собой либо пористый тврдый сорбент, либо жидкость, нанесенную тонким слоем на тврдый носитель или на стенки длинной капиллярной трубки.
Принцип разделения веществ в газовой хроматографии – неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. После прохождения колонки вещества последовательно выходят из не и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы автоматическим потенциометром (самописцем) или же регистрируется компьютером.
Принципиальная схема газового хроматографа Газовый хроматограф представляет собой прибор, использующий принцип хроматографии в системах газ - адсорбент или газ - жидкость. В аппаратурном оформлении это совокупность нескольких самостоятельных, параллельно функционирующих систем: источник газа-носителя и блок подготовки газов, испаритель, термостат колонок и сами хроматографические колонки, детектор, система регистрации и обработки данных.
Типичная блок-схема газового хроматографа изображена на рисунке 4.
Газовые функциональные связи показаны стрелками, электрические – одинарной линией, термостатируемые элементы заключены в пунктирный контур.
Система подготовки газов служит для установки, стабилизации и очистки потоков газа-носителя и дополнительных газов.
Она включает блок регулировки расходов газов, обеспечивающий очистку, подачу и стабилизацию скорости и расхода газа-носителя в колонку, а также других газов, необходимых для работы детектора, например, воздуха и водорода для пламенно-ионизационного детектора Система дозирования позволяет вводить в поток газа-носителя определенное количество анализируемой смеси в газообразном или жидком состоянии. Представляет собой устройство с самоуплотняющейся резиновой мембраной или кран-дозатор. Устройство ввода пробы необходимо термостатировать при температуре, равной температуре колонки или выше на 20-30°С.
Система детектирования преобразует соответствующие изменения физических или физико-химических свойств бинарных смесей (компонент – газ-носитель по сравнению с чистым газом носителем) в электрический сигнал. Величина сигнала зависит как от природы компонента, так и от содержания его в анализируемой смеси.
Система термостатирования служит для установки и поддерживания рабочих температур термостатов колонок (до 350°С), испарителя, детектора и других узлов хроматографа.
Система регистрации преобразует изменения физико-химических параметров в электрический сигнал, величина и форма которого регистрируются на ленте самописца или в современном варианте на мониторе компьютера. Прибор должен быть снабжен соответствующим электрометрическим усилителем, обеспечивающим получение на выходе электрического сигнала, пропорционального концентрации определяемого компонента в газе-носителе, выходящем из колонки.
Система инструментальной обработки данных позволяет вести управление экспериментом и обработку результатов в диалоговом режиме. С помощью компьютерных программ, имеющих алгоритм распознавания, и сформированных банков данных, можно решать задачи расшифровки сложных хроматограмм и количественного определения компонентов.
Рассмотренная схема типична для обычного газового хроматографа, используемого в количественном анализе, однако газовый хроматограф может иметь гораздо более сложную схему, содержащую несколько колонок и детекторов, включающий автоматические устройства для подготовки и дозирования пробы.
Помимо этих общих основных элементов дополнительное оснащение газового хроматографа определяется его назначением:
он может служить в качестве универсального аналитического прибора, для изучения физико-химических величин, в качестве универсального аналитического анализатора для контроля за составом смесей и для регулирования производственного процесса или в качестве анализатора элементного состава органических соединений.
Во всех случаях для надежного функционирования прибора необходимо подбирать соответствующие газы, параметры электрической схемы, насадочные или капиллярные колонки, приспособления для закрепления колонок в термостате и устройства для отбора и внесения проб в дозатор.
Каждому компоненту смеси на хроматограмме соответствует максимум регистрируемого сигнала детектора или концентрации компонента хроматографируемой смеси в элюенте. Кривую зависимости сигнала детектора от объема газа-носителя или от времени называют хроматограммой (элюционной кривой). В зависимости от типа используемого детектора получают дифференциальные (рис. 5, а) и интегральные хроматограммы (рис. 5, б).
сигнал детектора Рис. 5. Дифференциальная и интегральная хроматограммы На дифференциальной хроматограмме различают следующие составные части: нулевую линию 1 – участок хроматограммы, полученной при регистрации сигнала дифференциального детектора во время выхода из колонки чистого газа-носителя; пик 2 – несорбирующегося компонента; пик 3 – участок хроматограммы, полученной при регистрации сигнала детектора во время выхода из колонки одного из определяемых компонентов (или смеси нескольких неразделенных компонентов).
Пик ограничивается фронтом, соответствующим возрастанию концентрации компонента до максимальной, и тылом, отвечающим убыванию концентрации компонента в газе-носителе.
Расширение полосы компонента по мере прохождения ее через колонку, ведущее к получению широкого хроматографического пика, называют размытием пика. Размытие может быть симметричным и асимметричным.
В последнем случае образуется пик либо с размытым фронтом, либо с размытым тылом. Исходными экспериментальными данными, с помощью которых выполняется качественный газохроматографический анализ, являются элюционные характеристики.
Каждое соединение имеет характерный для него коэффициент распределения в колонке (Г), вычисляемый как отношение возможных концентраций его в неподвижной (CS) и в подвижной (CM) фазах.
К числу первичных параметров удерживания относятся:
время удерживания, объем удерживания и соответствующий им отрезок на хроматограмме – расстояние удерживания (рис. 6).
Рис. 6. Хроматограмма для двухкомпонентной смеси.
Общее время удерживания (R) – это время, прошедшее от момента ввода пробы до выхода максимума концентрации определяемого компонента. Время удерживания экспериментально определяется по секундомеру либо с помощью интегратора или системы автоматизации анализа (САА) и измеряется в минутах и секундах (n'n").
По мере движения вещества по колонке происходит размытие фронта вещества, поэтому пики получаются более широкими. По ширине пиков и общему времени удерживания можно рассчитать эффективность колонки (по аналогии с ректификационной колонкой):
где n – эффективность колонки (число теоретических тарелок);
R – время удерживания, 0,5 – ширина пика на половине его высоты.
Время удерживания несорбируемого компонента (M) – время выхода неудерживаемого компонента (подвижной фазы).
Расстояние удерживания (LR) – это расстояние на хроматограмме от момента ввода пробы до выхода пика определяемого компонента. Измеряется на хроматограмме с помощью линейки от линии старта до вершины пика (в мм). Расстояние удерживания – непредставительная величина, так как она зависит от скорости перемещения диаграммной ленты и от других факторов.
Удерживаемый объем (VR) – это объем газа-носителя (в см3), прошедший через хроматографическую колонку от момента ввода пробы до момента выхода максимальной концентрации определяемого вещества, измеренный при давлении и температуре на выходе из колонки. Объем удерживания находят по уравнению:
где Fоб – объемная скорость газа-носителя (объем газа-носителя, протекающего за единицу времени через пенный расходомер, т.е. на выходе из колонки и при температуре колонки), см3/мин. При наличии специальных блоков точного задания и измерения расхода газа-носителя, с табло этих приборов снимаются показания скорости газа-носителя.
Поэтому при вычислении удерживаемых объемов следует использовать значение объемной скорости, учитывающей температуру колонки и давление водяного пара при температуре измерения;
где Fизм – измеренная объемная скорость, см3/мин; ТК – температура колонки, К; Тср – температура окружающей среды, К; PH 2O – давление насыщенных паров воды при температуре измерения, Па; Рв – атмосферное (барометрическое) давление, Па.
Перечисленные параметры при условии использования одной и той же температуры опыта и скорости газа-носителя являются качественной характеристикой анализируемых веществ в данных условиях на одном и том же приборе. Поэтому ими можно пользоваться для выполнения качественного анализа, только используя один и тот же прибор, строго соблюдая неизменность режима его работы.
Для сопоставления получаемых значений первичных параметров удерживания с литературными данными или полученными на другом приборе или в иных условиях (для той же неподвижной фазы и температуры колонки) необходимо помнить, что на них влияют следующие факторы:
а) свойства и количества НФ (адсорбента в газоадсорбционной хроматографии и сорбента в ГЖХ), причем в газожидкостной хроматографии влияет отдельно и НФ, и твердый носитель;
б) температура колонки и скорость газа-носителя;
в) конструктивные особенности применяемой аппаратуры;
г) перепад давления газа-носителя на входе и выходе колонки.
Чтобы исключить влияние некоторых факторов на первичные параметры удерживания, используют следующую группу параметров.
Исправленные и приведенные параметры удерживания Исправленное время удерживания (’R) – время, прошедшее с момента появления пика несорбируемого газа до появления пика соответствующего соединения:
где M – время удерживания несорбируемого компонента (иногда употребляют термин «мертвое» время удерживания).
Исправленное время удерживания 'R отвечает времени, в течение которого элюируемое вещество находится в неподвижной фазе (в растворенном или сорбированном состоянии). В газовой подвижной фазе все вещества, независимо от времени удерживания, проводят одно и то же время, равное M – поправка на объем колонки, занимаемый газовой фазой, объем дозатора, детектора и соединительных газовых линий. Для экспериментального определения M необходимо измерить время удерживания какого-либо несорбируемого соединения, отличного от газа-носителя. В случае работы с катарометром можно заM взять время выхода пика воздуха. При работе с ДИПом можно приравнять к M времени удерживания метана. Если в лаборатории нет метана, можно воспользоваться временами удерживания трех н-алканов и сделать расчет по следующей формуле:
где Cz-1; Cz, Cz+1 – времена удерживания соответственно трех последовательных членов гомологического ряда н-алканов. Отношение приведенного времени удерживания к «мертвому» времени называется коэффициентом емкости (извлечения) k:
Это отношение является характеристикой продолжительности нахождения молекул анализируемого соединения в неподвижной фазе относительно времени их пребывания в подвижной газовой фазе.
Отношение коэффициентов мкости компонентов смеси 1 и называют коэффициентом разделения а, или селективностью колонки:
Исправленное расстояние удерживания – расстояние от выхода максимума пика несорбируемого газа (LM) до выхода максимума пика соответствующего компонента (LR):
Исправленный удерживаемый объем (V0R) рассчитывается по формуле:
где J – поправочный коэффициент, учитывающий перепа давления в колонке (коэффициент сжимаемости); РВХ – давление на входе в колонку; РВЫХ – давление на выходе из колонки.
Исправленные объемы удерживания можно сравнить в том случае, если они получены на одной и той же колонке при прочих равных условиях, но давление на входе в колонку может различаться, поскольку в приведенную выше формулу входит поправка на перепад давления. При РВХ РВЫХ V0R становится равна предельному значению VR.
Приведенный удерживаемый объем (V’R) – объем удерживания, пересчитанный с учетом поправки на объем удерживания несорбируемого газа VM («мертвый» объем колонки, учитывающий свободные объемы колонки, дозатора, детектора и соединительных линий):
Приведенные объемы удерживания можно сравнить в том случае, если они получены на одной и той же колонке или на разных колонках, но при одинаковом перепаде давления, так как поправка на перепад давления не вводится.
Приведенный объем удерживания, исправленный с учетом перепада давления, называется эффективным (чистым) удерживаемым объемом VN:
Таким образом, эффективный объем удерживания не зависит от «мертвого объема», приведен к среднему давлению в колонке, но зависит от количества сорбента, измеренного при температуре Т (К). Эту зависимость можно исключить, учитывая количество жидкой фазы в колонке или поверхность адсорбента. Тогда получаем принципиально новые параметры.
Удельный удерживаемый объем (VgT) при температуре колонки Т (К) равен чистому объему удерживания, отнесенному к единице массы неподвижной жидкой фазы в колонке:
где VN – чистый объем удерживания; тж – масса НФ в колонке, г.
Итак, для ГЖХ абсолютный удельный удерживаемый объем рассчитывается по формуле:
Vg0 VgT Этот параметр является такой же характерной константой, как температура плавления (кипения), показатель преломления и плотность, связывающей термодинамические функции сорбции со строением и физико-химическими свойствами веществ. В справочной литературе приводятся данные по удельным удерживаемым объемам различных веществ на различных фазах.
Используя эти данные, можно проводить качественный анализ. Абсолютный удельный объем удерживания является наиболее полно скорректированной характеристикой удерживания и обладает наилучшей сопоставимостью по сравнению со всеми иными абсолютными характеристиками удерживания.
Однако в практике качественного газохроматографического анализа этим параметром пользуются редко, т.к. выполнить точный расчет Vg0 трудно (девять параметров входят в состав уравнения и сложно определить их все с высокой точностью). Поэтому в повседневной практике получила большее распространение другая группа параметров – относительные параметры удерживания.
Относительные параметры удерживания Относительное время удерживания (Rотн) – отношение удельного или чистого времени удерживания (’Ri) данного соединения к соответствующему времени удерживания соединения выбранного в качестве стандарта (’Rcc):
Относительный удерживаемый объем (VRотн) – отношение приведенного, чистого или удельного объема удерживания данного соединения к соответствующему объему удерживания соединения, выбранному в качестве стандарта:
где V’Ri – приведенный объем удерживания исследуемого соединения; V’Rcc – приведенный объем удерживания вещества, принятого за стандарт; VRi – чистый объем удерживания компонента i; VRcc – чистый объем удерживания стандарта; Vg0 – удельный объем удерживания компонента i; Vgcc0 – удельный объем удерживания стандарта.
Стандартом может быть любое вещество, однако в большинстве случаев используются либо нормальные парафины, либо бензол, либо вещество, принадлежащее к тому же классу, что и определяемое.
Относительные величины удерживания не зависят от количества сорбента в колонке, от объема колонки, занятого газовой фазой, от перепада давления в колонке, от скорости газа-носителя.
Они зависят только от природы анализируемого вещества, стандарта и сорбента, а также от температуры колонки, поэтому используются для идентификации и публикуются в виде таблиц, как в оригинальной литературе, так и в справочниках.
Точность определения относительных величин параметров удерживания выше, чем абсолютных, а трудоемкость определения гораздо ниже. Еще удобнее определять параметры удерживания относительно двух н-алканов, один из которых имеет меньшее, другой большее время удерживания, чем определяемое соединение.
При этом появляется возможность представлять данные об относительных величинах удерживания в форме так называемых интерполяционных параметров удерживания, из которых наибольшее распространение получили индексы удерживания.
Индекс удерживания Ковача I, характеризующий удерживание вещества х в колонке с неподвижной фазой при температуре t (°С) относительно двух н-алканов с числом углеродных атомов n и n + 1, рассчитывается путем линейной интерполяции логарифмов исправленных параметров удерживания:
при соблюдении условия:
Главным достоинством системы индексов удерживания является ее наглядность. По определению н-алканам приписываются значения индексов удерживания, равные числу углеродных атомов в молекуле, умноженному на 100 ед. Например, для метана – 100, пропана – 300, декана – 1000 и т.д. Водороду приписывают значение индекса равное нулю. Эти числа и образуют в шкале индексов удерживания серию фиксированных точек.
Индекс удерживания определяемого вещества х равен умноженному на 100 ед. числу атомов углерода n гипотетического нормального алкана, имеющего такое же исправленное время (расстояние или объем) удерживания, что и вещество х.
Графическое определение индексов удерживания не обеспечивает необходимой точности результатов, и поэтому при выполнении ответственных анализов рекомендуется находить индексы расчетным путем. Индексы удерживания являются весьма информативной и удобной формой представления данных по относительному удерживанию органических соединений различных классов и в настоящее время широко используются в качественном анализе для решения сложных задач.
Поскольку численное значение индексов Ковача определяется лишь физико-химическими свойствами анализируемого вещества, природой неподвижной фазы и температурным режимом колонки, индекс удерживания вещества той или иной неподвижной фазой, отнесенный к определенной температуре, можно поставить в ряд с такими известными константами, как температура кипения (плавления), плотность или показатель преломления.
Воспроизводимость и правильность измерений всех перечисленных параметров зависят от класса применяемой аппаратуры, опыта оператора и его квалификации.
Основные ошибки, вызывающие погрешности измерений, возникают по следующим причинам:
а) нестабильность температурного режима колонок, испарителя и скорости газа-носителя;
б) перегрузка колонки за счет большой дозы, немгновенность дозирования;
в) несинхронность операции дозирования и включения средств измерения времени удерживания или отметки начала ввода пробы.
При выполнении качественного анализа нужно стремиться исключить ошибки измерения или свести их к минимуму.
Оптимизация хроматографического процесса в целом должна предусматривать как улучшение разделения компонентов, так и уменьшение размывания зон. Параметр, учитывающий оба эти требования, служит критерием достигнутой оптимизации хроматографического процесса. Его называют разрешением Rs и определяют как отношение расстояния между максимумами двух соседних пиков (с соответствующими временам удерживания R1 и R 2 ) к среднему арифметическому их ширины (соответственно 1 и 2) по нулевой линии:
Цель: Усвоение основ метода ГЖХ, овладение навыками работы с газовым хроматографом, определение содержание веществ в лекарственной форме методом ГЖХ. Обработка результатов анализа.
Задание к самостоятельной работе.
1. Получить задание у преподавателя.
2. Приготовить образец для анализа.
3. Провести исследование образца.
4. Сделать необходимые расчеты.
5. Сопоставить полученную информацию с информацией из НД.
6. Сделать выводы.
7. Составить отчет по образцу и сдать его преподавателю.
На анализ получен образец:
Распространяется на масло пихтовое (природная смесь борнилацетата, монотерпеновых углеводородов, борнеола и сесквитерпенов), применяемое в качестве лекарственного средства, а также являющееся основой для приготовления «Пихтонола» и других лекарственных средств, в композиционный состав которых оно входит. Препарат содержит не менее 40% борнилацетата и 45% монотерпеновых углеводородов.
Подлинность Условия проведения и аппаратура:
1. Газовый хроматограф с катарометром;
2. Колонка 200 0,3 см, заполненная сорбентом 5% ДС на хроматоне N-AW-DMCS (0,20-0,25 мм);
3. Температура колонки программируется от 90 до 175°С со скоростью 4°С/мин;
4. Температура детектора – 150°С;
5. Температура испарителя – 175°С;
6. Скорость газа-носителя (гелий) – 40-50 мл/мин;
Ход работы: По 1 мкл раствора препарата в ацетоне (1:1) хроматографируем и этого же раствора с добавлением борнилацетат (ТУ 6-09-3423-73) в количестве 10-15% от массы препарата, хроматографируют попеременно в условиях описанных выше.
Результат: На хроматограмме раствора смеси масла пихтового и борнилацетата по сравнению с хроматограммой раствора исходного препарата какой-либо дополнительный пик не обнаружен. Пик, соответствующий борнилацетату, увеличился.
Вывод: Испытуемый препарат соответствует требованиям НД по показателю «Подлинность».
Количественное определение Ход работы: Пробу препарата 1 мкл, разбавленную ацетоном (1:1) анализируют в условиях, указанных в разделе «Подлинность». Содержание борнилацетата или суммы монотерпеновых углеводородов (x) рассчитывают по формуле:
kx, ki – поправочные коэффициенты соответствующих компонентов;
sx – площадь пика борнилацетата или сумма площадей пиков монотерпеновых углеводородов;
si – сумма площадей всех пиков на хроматограмме ( с учетом соответствующих поправочных коэффициентов) за исключением пика растворителя (ацетона).
Поправочный коэффициент для монотерпеновых углеводородов определяют по искусственным смесям. Он равен 0,80. Для борнилацетата, борнеола и сесквитерпенов поправочный коэффициент принимают за 1,0.
Вывод: Препарат удовлетворяет требованиям НД по показателю «Количественное определение» (норма для монотерпеновых не менее 45%, для борнилацетата не менее 40%).
Этилового эфира -бромизовалериановой кислоты (ФС 42-3096-94) – 20 г Фенобарбитала (ФС 42-2424-93) – 18,26 г Натра едкого (ГОСТ 4328-77, х.ч) – 3,15 г Масла мяты перечной (ГФ Х, ст. 477) – 1,42 г Спирта этилового ректификованного (ГОСТ 5962-67, высшей очистки) – 580 мл Воды очищенной (ФС 42-2619-89) – 420 мл Подлинность Условия проведения и аппаратура:
1. Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором;
2. Колонка длиной 3 метра, внутренним диаметром 3 мм, заполненная сорбентом 5% ПЭГ-1500 на хроматоне N-AW, зернением 0,16-0,20 мм;
3. Температура термостата колонки 120°С;
4. Температура испарителя 180°С;
5. Скорость газа-носителя азота 30 мл/мин.
Ход работы: По 2 мкл препарата и раствора стандартного образца свидетеля (СОВС) ментола вводят в газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором.
Результат: Отличие времени удерживания ментола на хроматограмме препарата от времени удерживания раствора СОВС ментола не превышает 2,0%.
Вывод: Испытуемый препарат соответствует требованиям НД по показателю «Подлинность».
Количественное определение:
Ход работы: 5 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 1 мл раствора внутреннего стандарта и перемешивают. По 1 мкл полученного раствора и раствора РСО этилового эфира -бромизовалериановой кислоты вводим попеременно в газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором, получая не менее, чем по три хроматограммы.
Содержание этилового эфира -бромизовалериановой кислоты (Х) в граммах в 1 мл препарата рассчитывают по формуле:
S’cm – средняя площадь пиков внутреннего стандарта раствора РСО;
Scm – средняя площадь пиков внутреннего стандарта испытуемого раствора препарата;
Sэ – средняя площадь пиков этилового эфира -бромизовалериановой кислоты испытуемого раствора препарата;
-бромизовалериановой кислоты раствора РСО этилового эфира;
Мэ - навеска этилового эфира -бромизовалериановой кислоты в растворе РСО, г;
Vп – объем препарата, взятый для анализа, мл;
Содержание этилового эфира -бромизовалериановой кислоты в 1 мл препарата должно быть от 0,019 до 0,021 г Вывод: Препарат удовлетворяет требованиям НД по показателю «Количественное определение».
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
1. Основные особенности метода.В жидкостной хроматографии используется разделение смеси веществ в виде раствора в жидком растворителе (ПФ). В качестве НФ может быть использован либо тврдый сорбент, либо несмешивающаяся с растворителем жидкость.
Основные виды жидкостной хроматографии: бумажная, колоночная, тонкослойная (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография. Принцип бумажной хроматографии описан на стр. 10. Усовершенствованной версией бумажной хроматографии является ТСХ, когда в качестве НФ используется слой адсорбента, нанеснный на специальную пластинку.
Наиболее перспективный метод – высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), являющейся вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза – элюент - проходит через колонку, заполненную сорбентом, с большей скоростью за счет значительного давления (десятки и сотни атмосфер) на входе в хроматографическую колонку.
ВЭЖХ является удобным способом разделения и проведения количественного и качественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой.
Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5- мкм) в колонке, позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси.
Жидкостная хроматография стала усиленно развиваться с 1960 года. Разработка новых методов детектирования, создание специальных носителей и сорбентов, углубление понимания механизма хроматографических процессов дало возможность резко увеличить скорости разделения и сократить время проведения анализов до нескольких минут и даже секунд.
В настоящее время ВЭЖХ широко применяется в экологической аналитической химии, для анализа лекарственных средств, пищевых продуктов и т.д.
Принципиальная схема жидкостного хроматографа Аппаратура для проведения ВЭЖХ близка по конструктивному решению газовым хроматографам, за исключением того, что вместо баллона с газом установлен резервуар с жидким элюентом, насос и система регулирования потока элюента, обеспечивающая его высокую постоянную скорость.
Общая схема современного жидкостного хроматографа приведена на рисунке 7. Элюент из резервуаров 16, 17 насосами и 2 подается в дозатор 3, а через него – в предколонку 4 и в колонку 5. В дозатор вводится проба анализируемого вещества (или смеси веществ). Предколонка и колонка помещены в термостат, в котором поддерживается определнная очень стабильная температура (±0,1°С). Из колонки вещества последовательно проходят через детектор 7 и далее – в коллектор фракций 8. Показания детектора передаются на интегратор 10 и затем на регистратор 11.
Вся система управляется с помощью персонального компьютера 13. Иногда в описанную схему вводится дегазатор (между резервуарами и насосами), поскольку наличие растворнных газов в элюенте сильно влияет на точность показаний прибора.
Емкости для элюента изготавливаются из стекла, полиэтилена, полипропилена, политетрафторэлилена или из нержавеющей стали. Для гидравлических соединений в хроматографической системе наиболее часто используются капилляры из полиэтилена или тефлона).
Рис. 7 Схема высокоэффективного жидкостного хроматографа:
1, 2 – насосы, 3 – дозатор, 4 – предколонка, 5 – колонка, 6 – термостат колонки, 7 – детектор, 8 – коллектор фракций, 9 – блок управления коллектором, 10 – интегратор, 11 – регистратор, 12 – блок регулирования температуры, 13 – микропроцессор, 14 – блок автоматики ввода пробы, 15 – блок управления градиентного элюирования, 16, 17 – резервуары с растворителем.
Сплошная линия – электрический кабель, пунктир – поток растворителя.
Насосы изготавливаются из титановых сплавов. Они должны создавать стабильный непульсирующий поток ПФ и развивать (при необходимости) большое давление. Ранее, в основном использовались насосы, где поступление элюента в хроматографическую систему создавалось за счт давления сжатого газа, причм газ контактировал с элюентом непосредственно, либо через систему поршней (гидропневматическое усиление). Достоинства таких насосов – высокая стабильность потока, однако, при их использовании практически невозможно градиентное элюирование и создание высокого давления на входе в колонку. Ввиду этого, настоящее время на рынок оборудования ВЭЖХ поступают только насосы шприцевого или плунжерного типа, представляющие собой одно-, двух- или трехпоршневые возвратно-поступательные насосы с диафрагмой или без нее. Такие насосы способны создавать высокое давление ( до нескольких сотен атмосфер), а также позволяют формировать градиент элюирования с использованием трех, и даже более растворителей. Для подавления пульсаций элюента в насосах плунжерного типа используют демпфер пульсаций.
При низких давлениях могут использоваться перистальтические насосы, в которых подача элюента осуществляется диском, сжимающим силиконовую трубку и по мере вращения сдвигающим область обжима от начала к концу трубки.
Дозаторы оснащены системой ввода пробы. Проба вводится краном либо шприцем через самозатягивающуюся мембрану. В первом случае на дозаторе установлен кран, который соединен с главной магистралью потока и мкостью определнного объма (дозирующая петля), в которую вводится проба. После введения пробы кран переключают в рабочее положение, при котором мкость соединяется с главной магистралью, проба вымывается потоком элюента и поступает в колонку. Во втором случае проба вводится шприцем (прокалывая самозатягивающуюся мембрану) непосредственно в верхнюю часть колонки. Этот способ используется крайне редко, и при очень невысоких давлениях на входе в колонку (не более 5 атм).
Хроматографические колонки представляют собой трубки из нержавеющей стали марки 316 и отличаются высокой степенью обработки. Внутренние стенки трубки полируются или покрываются стеклом, полимером, золотом. Иногда используют стеклянные колонки. Диаметр трубок – 4-8 мм (полупрепаративные колонки), 2-4 мм (аналитические), 1-2 мм (микроколонки). В трубки помещается адсорбент в виде порошка с определнным размером частиц (например, 5 мкм). В качестве адсорбента широкое распространение получили оксид алюминия и силикагель.
Наиболее важными характеристиками адсорбента являются площадь частиц или объм пор, приходящихся на единицу объма колонки. Колонки соединяются с трубками особыми торцевыми соединениями, которые обеспечивают плавный перенос ПФ из соединительного капилляра в колонку.
Термостат используется, главным образом, как средство ускорения анализа, а также с повышением температуры может возрастать эффективность колонки ( с повышением температуры от комнатной до 70°С увеличение эффективности может составлять 20-40%), за счет снижения вязкости подвижной фазы.
Используются термостаты с воздушной, водяной и металлической (алюминиевой) рубашкой.
Детекторы, применяемые в жидкостной хроматографии, предназначены для непрерывного определения концентрации растворнного вещества в ПФ на выходе из колонки. Детектор может быть специфическим, если он избирательно реагирует на конкретный тип соединения (класса соединений) и неспецифическим. По способу действия они классифицируются следующим образом:
1) Оптические a) рефрактометрические (измерение показателя преломления элюента);
b) ультрафиолетовые (измерение абсорбции веществ, растворенных в подвижной фазе на выходе из колонки в УФ-области спектра – 190-380 нм);
c) флуоресцентные (измерение флуоресценции вещества при возбуждении УФ-излучением определнной длины волны).
2) Электрические a) кондуктометрические (измерение разности потенциалов);
b) вольтамперометрические и кулонометрические (измерение 3) Электрохимические (измерение электрических параметров при окислении или восстановлении веществ).
4) Масс-спектрометрические (улавливающие излучение, испускаемое определнными атомами вещества при возбуждении).
5) Термометрические (регистрирующие теплоту адсорбции и десорбции на поверхности).
Расчт параметров удерживания веществ при ВЭЖХ аналогичен описанному для газовой хроматографии (см. стр. 16 и далее) с поправкой на жидкий элюент.
Цель: Усвоение основ метода ВЭЖХ, овладение навыками работы с жидкостным хроматографом, определение содержание веществ в лекарственной форме методом ВЭЖХ. Обработка результатов анализа.
Задание к самостоятельной работе.
1) Получить задание у преподавателя.
2) Приготовить образец для анализа.
3) Провести исследование образца.
4) Сделать необходимые расчеты.
5) Сопоставить полученную информацию с информацией из НД.
6) Сделать выводы.
7) Составить отчет по образцу и сдать его преподавателю.
На анализ получены таблетки «Антипохмелин»:
Описание: Таблетки белого цвета, слегка пористые, без запаха, плоскоцилиндрические.
Состав на одну таблетку:
Глицин (содержание 0,15 - 0,3 г);
Лимонная кислота (содержание 1,5 - 1,8 г);
Янтарная кислота (содержание 0,07 - 0,09 г).
Определение содержания компонентов проводим методом ВЭЖХ.
Условия хроматографирования:
– колонка из нержавеющей стали «Vydak c18» (250 х 3,9 мм) с размером частиц 5 мкм;
– спектрофотометрический детектор с рабочей длиной волны – объм пробы 10-20 мкл – скорость потока (расход подвижной фазы) 0,7 мл/мин;
– подвижная фаза: 0,2 М раствор калия дигидрофосфата;
– температура комнатная.
Приготовление подвижной фазы: 27,22 г калия фосфата однозамещнного (ГОСТ 4198-75) растворяют в 500 мл воды в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят водой объм раствора до метки. рН полученного раствора доводят потенциометрически до значения 2,4, прибавляя по каплям кислоту ортофосфорную концентрированную (ГОСТ 6552-80). Раствор фильтруют и дегазируют. Срок годности раствора 1 месяц.
Приготовление РСО: около 0,02 г (точная навеска) порошков глицина, лимонной кислоты и янтарной кислоты помещают в колбы вместимостью 20-25 мл, добавляют 10 мл подвижной фазы и растворяют с использованием ультразвуковой бани (15 мин.).
Приготовление испытуемого раствора: около 0,2 г (точная навеска) порошка измельчнных 10 таблеток помешают колбу вместимостью 20-25 мл, растворяют в 10 мл подвижной фазы с использованием ультразвуковой бани (15 мин.).
Методика: Отдельно хроматографируют стандартный и испытуемый раствор в равных объмах (10 мкл). Содержание веществ: глицина (x1), лимонной кислоты (х2), янтарной кислоты (х3) рассчитывают по формуле:
где Sx – площадь пика вещества на хроматограмме раствора испытуемого препарата; S0 – площадь пика вещества на хроматограмме раствора РСО; а0 – навеска вещества в растворе РСО, г; ах – навеска порошка растртых таблеток, г; b – средняя масса таблетки (b = 4,0).
Проведение анализа:
m (глицина) = 0, m (лимонной кислоты) = 0, m (янтарной кислоты) = 0, Навеска порошка растртых таблеток = 0,1704.
Результаты анализа Компонент Заключение: Исследуемая лекарственная форма соответствует требованиям НД по количественному содержанию веществ.
ПЕРЕЧЕНЬ
ПРИОБРЕТАЕМЫХ НАВЫКОВ И УМЕНИЙ
1. Практические навыки проведения фармакопейного анализа субстратов и готовых лекарственных средств методами хроматографии.2. Получение практических навыков по выбору оптимальной схемы анализа, температуры, детектора, колонки в ГЖХ и ВЭЖХ.
3. Получение навыков обработки полученных результатов.
4. Умение работать с нормативной документацией (ГФ XI, фармакопейные статьи) СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Коган Л.А. Количественная газовая хроматография – М.:Химия, Микеш О. и др. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. Т I, II. – М.: Мир, 1982.
Набиванец Б.И., Мазуренко Е.А. Хроматографический анализ:
Пособие для вузов. – Киев: Вища школа. Главное изд-во, 1979.
10. Руководство к лабораторным занятиям по фарм. химии /под ред. А.П. Арзамасцева. – М.: Медицина, 11. Супина В. Насадочные колонки в газовой хроматографии. – М.: Мир, 12. Хеншен А., Хупе К.П., Лотшпайх Ф., Вльтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. – М.: Мир, 13. Хефтман Э. Хроматография. Практическое приложение метода, в двух частях. – М.: Мир, 1986.
ПРИЛОЖЕНИЯ
Газожидкостная хроматограмма корвалола Газожидкостная хроматограмма пихтового масла Газовая и газожидкостная хроматография в фармакопейном анализе п/п 1. Ампициллина натриевая соль Аскорбиновая кислота Acidum ascorbinicum Валидола 0,06г таблетки с глюкозой Tabulette Validoli 0,06 cum glucoso Состав: хлорбутанолгидрат, камфора, ментол, Количественное определение камфоры, Camphora «Корвалол»Состав: этиловый эфир -бромизовалериановой -бромизовалериановой кислоты кислоты, фенобарбитал, натр едкий, масло мяты перечной, спирт этиловый ректификованный Ментол рацемичекий Mentholum racemicum Парацетамола 2,4% сироп Sirupus Paracetamoli 2,4% Состав: парацетамол, натрия бензоат, сахар, спирт этиловый, вода очищенная 10. Спирт этиловый 95% Spiritus aethylicus 95% 11. Стрептомицина сульфат 0,25 г, 0,5 г и 1,0 г Streptomycini sulfas 0,25, 0,5 aut 1, Высокоэффективная жидкостная хроматография в фармакопейном анализе п/п 1. Анаприлина таблетки 0,01 г и 0,04 г Tabulette Anaprilini 0,01 et 0, Tabulette «Andipalum» ление: анальгина, фенобарбитала, папаСостав: анальгина 0,25 г, фенобарбитала 0,02 верина гидрохлорида, дибазола. Расг. папаверина гидрохлорида 0,02 г, дибазола творение папаверина гидрохлорида.
Sirupus Paracetamoli 2,4% Состав: парацетамол, натрия, бензоат, сахар, Посторонние примеси (п-аминофенол) спирт этиловый, вода очищенная 4. «Ревит» драже Состав: ретинола ацетат или пальмитат (витамин А), тиамина хлорид или бромид (витамин В1), рибофлавин (витамин В2), кислота аскорбиновая (витамин С) г, кофеина 0,05 г, кодеина 0,008 г определение анальгина, фенобарбитала, кофеина, кодеина.
по хроматографическим методам анализа 1) Метод ВЭЖХ основан на a) различной адсорбции компонентов смеси на тврдом сорбенте;
b) различном распределении компонентов между двумя жидкими фазами при прохождении одной из них через колонку под давлением;
c) различном распределении компонентов смеси между потоком газа-носителя и тврдым сорбентом, находящимся в колонке.
2) Выберите блок-схему хроматографа в методе ВЭЖХ a) сосуд для подвижной фазы, насос, фильтр, термостат, инжектор, колонка, детектор, самописец;
b) баллон с газом-носителем, испаритель, термостат, инжектор, колонка, детектор, самописец;
c) сосуд для неподвижной фазы, термостат, устройство для ввода пробы, колонка, детектор, самописец;
d) баллон с газом-носителем, инжектор, испаритель, насос, колонка, детектор, самописец.
3) Закончите формулировку: дозировку пробы осуществляют a) шприцем;
b) автоматическим дозатором;
c) микропипеткой;
d) введением пробы в виде таблетки.
4) Укажите сорбент, применяемый в ВЭЖХ a) активированный уголь;
b) силасорб;
c) полисорб;
d) сепарон.
5) Укажите материал, из которого изготавливают колонки для ВЭЖХ a) стекло;
b) нержавеющая сталь;
c) алюминий;
d) тефлон.
6) Укажите принцип, на котором основана работа рефрактометрического детектора a) излучение света;
b) люминесценция определяемых веществ;
c) поглощение света;
d) преломление света.
7) Закончите формулировку: работа спектрофотометрического детектора основана на a) излучении света;
b) люминесценции определяемых веществ;
c) поглощении света;
d) преломлении света.
8) Какой блок жидкостного хроматографа оказывает наибольшее влияние на эффективность разделения компонентов?
a) дозатор;
b) насос;
c) детектор;
d) колонка.
9) Как проводят идентификацию веществ?
a) по температуре кипения и диэлектрической проницаемости;
b) по площади хроматографического пика;
c) по времени удерживания, исследованию зон в колонке методами спектрального или химического анализа;
d) подключением спектрального анализатора к колонке.
10) Закончите формулировку: количественный анализ включает a) ввод пробы, расчет времени удерживания;
b) разделение, расчет состава смеси;
c) градуировку прибора, разделение, измерение площади пиков;
d) ввод пробы, разделение, расчет индекса удерживания.
11) Какой параметр хроматографического пика наиболее часто применяется в количественном анализе?
a) высота пика;
b) ширина пика на уровне нулевой линии;
c) ширина пика на уровне полувысоты;
d) площадь пика.
12) Укажите основное преимущество УФ-детектора a) селективность;
b) возможность определения большого числа органических соединений;
c) низкий предел обнаружения;
d) стабильность нулевой линии.
13) Укажите наиболее часто применяемый параметр удерживания a) абсолютное время;
b) относительное время;
c) относительный объем;
d) абсолютный объем.
14) Какой блок жидкостного хроматографа применяется для автоматического вычисления площади пика?
a) электронный усилитель;
b) самописец;
c) интегратор;
d) электрометр.
15) Укажите преимущество ВЭЖХ по сравнению с методом газожидкостной хроматографии a) низкий предел обнаружения;
b) возможность определения нелетучих и труднокипящих соединений;
c) селективность определения;
d) надежность прибора в эксплуатации.
16) Укажите механизм разделения веществ в методе газожидкостной хроматографии a) адсорбция на поверхности неподвижной фазы;
b) распределение между двумя несмешивающимися фазами;
c) обратимый обмен ионами между определяемым веществом, неподвижной и подвижной фазами;
d) химическое взаимодействие определяемого вещества с подвижной фазой.
17) Укажите блок-схему газожидкостного хроматографа a) сосуд для подвижной фазы, насос, колонка, детектор;
b) баллон с газом-носителем, инжектор, колонка, детектор, самописец;
c) баллон с газом-носителем, термостат, испаритель, инжектор, колонка, детектор, самописец;
d) сосуд для неподвижной фазы, термостат, инжектор, насос, колонка.
18) Закончите формулировку: отклик дифференциального детектора пропорционален a) концентрации определяемого вещества;
b) объму определяемого вещества;
c) длине хроматографической колонки;
d) массовой скорости потока анализируемого вещества через ячейку детектора.
19) Укажите параметр, характеризующий хроматографическую колонку a) длина;
b) материал колонки;
c) химический состав твердого носителя;
d) природа неподвижной фазы.
20) Закончите формулировку: время удерживания – это время, прошедшее от начала ввода пробы до a) появления на выходе из колонки зоны соответствующего компонента с максимальной концентрацией;
b) начала сигнала детектора;
c) окончания сигнала детектора;
d) последнего максимального сигнала детектора.
21) Закончите формулировку: детектор предназначен для a) равномерного перемещения анализируемой пробы в колонке;
b) регистрации компонентов анализируемой смеси;
c) введения пробы в хроматограф;
d) полного разделения компонентов анализируемой пробы.
22) Какая величина служит основой качественного анализа в газовой хроматографии?
a) время удерживания;
b) высота пика;
c) площадь пика;
d) ширина пика.
23) Закончите формулировку: площадь хроматографического пика характеризует a) качественный состав пробы;
b) количественное содержание отдельных компонентов в пробе;
c) содержание жидкой фазы в твердом носителе;
d) полноту разделения.
24) Что является газом-носителем в газовой хроматографии?
a) газ, проходящий через ячейку катарометра одновременно с анализируемым газом;
b) анализируемая газовая смесь;
c) газ, используемый для перемещения анализируемой смеси вдоль колонки и ее разделения;
d) воздух.
25) Что отличает газоадсорбционную хроматографию от газожидкостной?
a) аппаратурное оформление;
b) механизм разделения;
c) объекты анализа;
d) детекторы.
26) В качестве газа-носителя в газовой хроматографии применяют a) гелий;
b) воздух;
c) азот;
d) аргон;
e) пропан.
27) В фармацевтическом анализе ВЭЖХ, ГЖХ и ГХ применяют при a) установлении подлинности лекарственных веществ;
b) испытании на чистоту;
c) исследовании сложных смесей;
d) количественном определении компонентов сложных смесей;
e) исследовании стабильности лекарственных веществ в процессе хранения.
ВВЕДЕНИЕ
В ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Учебно-методическое пособие для студентов 5 курса фармацевтического факультета Подписано к печати _ Формат 60841/16.Бумага писчая. Гарнитура «Таймс». Печать офсетная.
Усл. печ. л. _. Уч.-изд. л.. Тираж 300 экз. Заказ _ Издательство Нижегородской государственной 603005, Н.Новгород, пл. Минина 10/ Полиграфический участок НижГМА 603005, Н.Новгород, ул. Алексеевская, 1.
«