«ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

«ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОГО

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА

На правах рукописи

Кофиади Илья Андреевич

ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В

БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

«03.03.03 – иммунология»

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013 1

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О РОЛИ

ГЕНОВ В ФОРМИРОВАНИИ

ИММУНОАССОЦИИРОВАННЫХ ПРИЗНАКОВ

1.1.1 «Догеномный» период развития генетического направления в иммунологии 1.1.2 Иммуногенетика в постгеномную эру

1.2 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ

РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ЕСТЕСТВЕННОЙ

УСТОЙЧИВОСТИ К ИММУНОЗАВИСИМЫМ

ЗАБОЛЕВАНИЯМ 1.2.1 Роль HLA-генов в развитии предрасположенности к иммунозависимым заболеваниям 1.2.2 не-HLA гены иммунной системы в ответе на инфекции и измененные собственные антигены

1.3 ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

ФОРМИРОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

К ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД 1.3.1 Роль HLA в формировании генетически обусловленной устойчивости и чувствительности к ВИЧ-инфекции 1.3.2 не-HLA гены в ответе на ВИЧ 1.3.3 Популяционный подход к изучению ВИЧ-инфекции/СПИД 1.3.4 Фармакогенетика противовирусных средств

1.4 ГЕНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТРОЛЕ

КАНЦЕРОГЕНЕЗА 1.4.1 Иммунологический контроль опухолеобразования 1.4.2 Современная теория иммунологического надзора за опухолями

1.5 РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА В ОТВЕТЕ НА

РАДИАЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

1.5.1 Эффекты радиационного воздействия 1.5.2 Контроль клеточного цикла 1.5.3 Репарация ДНК 1.5.4 Гены иммунного ответа в реакции организма на облучение

1.6 ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

В ИММУНОЛОГИИ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ОБРАЗЦАХ

2.1.1 Установление особенностей распределения генетических маркеров, ассоциированных с устойчивостью/ чувствительностью к ВИЧ-инфекции/СПИД и препаратам АРТ: характеристика групп сравнения 2.1.2 Установление ассоциации генетических маркеров с вероятностью развития радиационных осложнений онкологического генеза: характеристика групп сравнения 2.1.3 Разработка нового подхода к мониторингу вирусной нагрузки и оценке эффективности терапии у пациентов клиники трансплантации органов: клинический материал 2.1.4 Разработка лабораторного метода для оценки эффективности подавления экспрессии генов вируса гептита С кандидатными препаратами миРНК:

клетки и их источники

2.2 ВЫБОР ГЕНОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ

АССОЦИАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

С ВЕРОЯТНОСТЬЮ РАЗВИТИЯ РАДИАЦИОННЫХ

ОСЛОЖНЕНИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА

2.4 ПРОВЕДЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР

2.4.1 Параметры, использовавшиеся для описания 2.4.2 Специфичность и чувствительность тест-систем 2.6.1 Проведение ПЦР с целью получения матрицы 2.7 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

2.9 ПРОЕКТИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МОЛЕКУЛ

2.10 КО-ТРАНСФЕКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ

ПЛАЗМИД И СИНТЕТИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ МИРНК

2.11 ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И ПОЛИМЕРАЗНАЯ

ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

2.13 ИСПОЛЬЗОВАННОЕ В РАБОТЕ ПРОГРАММНОЕ

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И БАЗЫ ДАННЫХ

3.1 РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА

3.1.1 Генотипирующие тест-системы для определения маркеров устойчивости/чувствительности 3.1.2 Генотипирующие тест-системы для определения фармакогенетических маркеров, ассоциированных с развитием гиперчувствительности у лиц, принимающих препараты АРТ 3.1.3 Генотипирующие тест-системы для определения маркеров устойчивости/чувствительности к развитию радиационных

3.3 ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА В

ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ

3.4 ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ЧАСТОТНОГО

РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАННЫХ МАРКЕРОВ В

ПОПУЛЯЦИЯХ РОССИИ И

СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ

3.4.1 Популяционное распределение маркера CCR5delta32 rs333 3.4.2 Популяционное распределение маркера CCR2-64I 3.4.3 Популяционное распределение маркеров SDF1-3’A 3.4.4 Популяционное распределение маркеров HLA-B*57: 3.4.5 Популяционное распределение маркеров ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG1 (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135), rs9642880, rs6983267, rs

3.5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ОПАСНОСТИ

РАЗВИТИЯ СПИД И СМЕРТИ В РЕЗУЛЬТАТЕ СПИД В

ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ

3.6 АССОЦИАЦИЯ МАРКЕРОВ ГЕНОВ СИСТЕМ

РЕПАРАЦИИ ДНК И ИММУННОГО ОТВЕТА

С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАДИАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ

ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА

3.7 РАЗРАБОТКА НОВОГО ПОДХОДА К МОНИТОРИНГУ

ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ВЗРОСЛЫХ РЕЦИПИЕНТОВ

ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА

3.8 РАЗРАБОТКА ПОДХОДА К МОНИТОРИНГУ

ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ АНТИСМЫСЛОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

4.1 ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ, КАК ПОДХОД

К УСТАНЛЕНИЮ ЕСТЕСТВЕННОЙ

УСТОЙЧИВОСТИ/ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К

ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД НА ИНДИВИДУАЛЬНОМ И

4.2 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И

БЕЗОПАСНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ИМУНОГЕНОТИПИРОВАНИЯ

4.3 НОВЫЙ ПОДХОД К СНИЖЕНИЮ ВЕРОЯТНОСТИ

РАЗВИТИЯ ОНКОПАТОЛОГИЙ,

АССОЦИИРОВАННЫХ С ОБЛУЧЕНИЕМ,

В ГРУППАХ ПОВЫШЕННОГО РАДИАЦИОННОГО РИСКА

4.4 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МОНИТОРИНГ ВИРУСНОЙ

НАГРУЗКИ КАК СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ТЕРАПИИ В КЛИНИКЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОРГАНОВ

4.5 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОДАВЛЕНИЯ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ

ВРЕМЕНИ ПРИ СОЗДАНИИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CMV - цитомегаловирус EBV - вирус Эпштейна-Барр FDA - Федеральная администрация США по пищевым продуктам и лекарственным препаратам FISH - флуоресцентная гибридизация in situ GWAS - геномное ассоциативное исследование HHV-6 - вирус герпеса человека 6 типа HLA - антигены тканевой совместимости человека HSV - вирус простого герпеса LCMV - вирус димфоцитарного хориоменингита MCA - метилхолантрен MHC - главный комплекс гистосовместимости NCBI - Национальный центр биотехнологической информации США SNP - однонуклеотидный полиморфизм TCR - рецептор Т-клеток TTV - Transfusion Transmitted Virus или Torque teno virus АРТ - антиретровирусная терапия ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота миРНК - малые интерферирующие РНК МКРЗ - Международная комиссия по радиологической защите ООР - относительная опасность развития СПИД ООС - относительная опасность смерти в результате СПИД ОТ - обратная транскрипция ПНК - полинуклеотид киназа ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота РР - коэффициент риска развития СПИД РС - коэффициент риска смерти в результате СПИД ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования Одним из крупнейших научных достижений на рубеже XX-XXI веков стала расшифровка генома человека. В качестве новой задачи на пути практического использования полученных знаний постулируется изучение молекулярных основ изменчивости, в том числе определение роли генетического полиморфизма в формировании уникальных признаков организма. Прогресс в этой области напрямую связан с внедрением методов генетических подходов к изучению механизмов реализации жизненноважных функций организма уже сегодня привело к прорыву во многих областях науки и медицины (Bell 2010, Hamburg and Collins 2010).

Наиболее ярким примером проявления полиморфизма генов является гистосовместимости. Именно с исследованием системы генов HLA (Human Leukocyte Antigen), гистосовместимости, была связана одна из первых международных программ в области молекулярной генетики, результаты которой были представлены на XI Международном рабочем совещании и конференции по изучению HLA (г.

Йокогама, Япония, 1991 г.). На сегодняшний день эта система генов www.hla.alleles.org).

Важнейшим достижением биомедицинской науки последних лет стало формирование представлений о роли генетического полиморфизма на уровне одиночных нуклеотидных замен (SNP – Single Nucleotide Polymorphism). В настоящий момент в геноме человека насчитывается более 50 миллионов уникальных вариантов последовательности генов человека, представленных SNP (по данным сайта www.ncbi.nlm.nih.gov). Многие из них расположены в так называемых не-HLA генах иммунного ответа, играющих ключевую роль в распознавании сигналов, дифференцировке и регуляции компонентов клеточного и гуморального иммунитета и, как следствие, в защите человека от огромного числа внешних и измененных собственных антигенов.

Нарушение функций генов иммунного ответа и их продуктов ведет к развитию тяжелых форм иммунологической недостаточности и иммунозависимым заболеваниям. В связи с этим, одной из наиболее актуальных и перспективных задач современной биомедицинской науки является расширение теоретических знаний в области иммуногенетического контроля канцерогенеза и противоинфекционного иммунитета (Hill 2001).

Одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в биомедицине является изучение молекулярных и генетических механизмов ВИЧ-инфекции. На сегодняшний день описано лишь два случая излечения от ВИЧ и, по крайней мере, один из них связан с иммуногенетическими особенностями носителя инфекции (Allers, Hutter et al. 2011, Cohen 2013). Так в 2006 году у ВИЧ-инфицированного пациента госпиталя Charite при Берлинском университете была диагностирована лейкемия. В целях терапии заболевания больному была проведена пересадка красного костного мозга.

При этом для пересадки лечащим врачом Gero Hutter была подобрана ткань, клетки которой характеризовались гомозиготностью по делеции CCR5delta32. Ген CCR5 кодирует хемокиновый рецептор, контакт с которым проникновения в клетку (Feng 1996). В отличие от более распространенного полноразмерного варианта гена CCR5, ген, несущий делецию на обеих гомологичных хромосомах, не экспрессируется и рецептор CCR5 исчезает с поверхности клетки (Dean, Carrington et al. 1996). Это приводит к формированию генетически обусловленной устойчивости человека к инфицированию ВИЧ. После пересадки показатель вирусной нагрузки пациента, известного в литературе, как «берлинский пациент», понизился до недетектируемого уровня, что позволило диагностировать первый в истории исследования ВИЧ случай излечения (Hutter, Nowak et al. 2009).

Идентификация маркера CCR5delta32 и других иммуногенетических маркеров, ассоциированных с врожденной (естественной) устойчивостью к антиретровирусным препаратам может стать важным этапом при разработке эффективных стратегий превенции и терапии ВИЧ-инфекции/СПИД как на индивидуальном, так и на популяционном уровне (Cohen 2011).

Сохранение уровня генетического разнообразия, необходимого для выживания человека в условиях агрессивной окружающей среды, решается представителей тех или иных этнических групп отличаются крайне выраженным разнообразием. Это определяет адаптационный потенциал человека как вида и в целом отражает эволюционную роль мутационного процесса. В связи с этим чрезвычайную актуальность для биомедицинской науки приобретает исследования, направленные на установление популяционных особенностей распределения иммуногенетических маркеров.

В особенности это актуально для таких многонациональных государств, как Россия (Болдырева 2007).

В отличие от особенностей взаимодействия человека и инфекционных агентов, вопрос влияния на организм факторов физико-химической природы изучен в меньшей степени. Наибольшую значимость для биомедицины представляют техногенные факторы вредности, связанные с онко- и иммунопатологиями. При этом одним из наиболее актуальных вопросов, представляющих научно-практический интерес, является вопрос о действии радиации на организм человека.

Установлено, что при радиационном воздействии даже невысокой мощности тяжесть негативных последствий облучения варьирует на индивидуальном уровне (Crompton, Shi et al. 2001). На сегодняшний день детально изучены патогенез, патологическая морфология и клиника заболеваний, обусловленных патогенным действием облучения, риски их возникновения и зависимость от дозы радиации. При этом одной из важнейших, нерешенных до настоящего времени проблем, остается поиск биологических маркеров, позволяющих выявлять лиц чувствительных к радиационному воздействию (Greve, Bolling et al. 2012). Результатом этого является не прогнозируемая в настоящее время индивидуальная реакция человека на действие ионизирующего излучения, как техногенного и естественного фактора вредности.

В первую очередь это связано с отсутствием адекватной модели исследования. Эксперименты с лабораторными животными, равно как и с культурами клеток не позволяют учесть параметры индивидуальной генетической изменчивости. Поэтому для дальнейшего развития знаний и создания теоретической базы в данном направлении могут быть адаптированы современные клинико-статистические методы, позволяющие устанавливать связь индивидуальных генетических особенностей с устойчивостью или чувствительностью человека к радиационному воздействию. С фундаментальной точки зрения связь ионизирующего совершенствовании концепций канцерогенеза и поиске молекулярных маркеров, определяющих риск развития онкологических заболеваний (Hino, Klein-Szanto et al. 1993, Hahn, Wojnowski et al. 1998).

Генотипирование на уровне установления аллельных вариантов генов иммунного ответа, а также ряда других генетических систем, которые рассматриваются в качестве мишеней неблагоприятного воздействия, может стать перспективным подходом для оценки риска развития патологий, ассоциированных с радиационным воздействием, в том числе, в отдаленные периоды времени. Решение этой задачи позволит повысить эффективность профессионального подбора, снизить смертность и раннюю инвалидизацию персонала объектов использования атомной энергии. В то же время, поиск путей оценки риска развития осложнений радиационного воздействия, является важнейшим звеном в выборе и назначении эффективной приемлемой дозы при радиотерапии больных онкологическими заболеваниями, а также при радиодиагностике (Barnett, West et al. 2009).

Говоря о необходимости дальнейшего развития фундаментальных представлений иммуногенетики, не следует забывать и о преимуществах практического внедрения в биомедицине молекулярно-генетических подходов, которые имеют преимущества по сравнению с клеточными и гистологическими методами.

В частности, в связи с широким распространением и повышением эффективности антиретровирусной терапии остро встает вопрос об оценке риска развития осложнений, вызванных приемом некоторых препаратов. Так, гиперчувствительности у лиц, принимающих Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine) – ингибиторы протеазы ВИЧ. Наличие побочных эффектов достоверно ассоциировано с носительством аллелей HLA-B*5701 и HLA-DRB*01 (Tozzi 2010). Кроме того, с генетическим полиморфизмом связана эффективность применения антиретровирусных препаратов, препятствующих проникновению ВИЧ в клетку, в том числе основанных на блокировании рецептора CCR5. Так, препарат Маравирок (Maraviroc), одобренный в 2011 году FDA (Food and Drug Administration), оказался неэффективен для лиц, инфицированных синцитиеобразующими штаммами ВИЧ (фенотип X4) или же его субпопуляциями, сохраняющими способность использовать рецептор CCR5 для проникновения в клетку (Hirsch, Gunthard et al. 2008). Последнее может может быть объяснено, как мутациями в гене CCR5, так и генетическим полиморфизмом генома самого вируса.

Таким образом, наряду с исследованием полиморфизма генов человека, важным направлением в сфере совершенствования методов борьбы с иммуноассоциированными заболеваниями может стать диагностика самого патогена, а также использование генома вируса в качестве мишени для создания новых лекарственных препаратов.

фармакологическим подходам, основанным на понижении уровня экспрессии репликативного цикла вирусов, и в частности, вируса гепатита С (Randall, Grakoui et al. 2003). Среди них наибольшего внимания заслуживают методы, основанные на механизме интерференции РНК. Суть процесса заключается в ингибировании трансляции за счет комплементарного связывания РНКмишени с короткими молекулами РНК (миРНК) (Fire, Xu et al. 1998). Однако для отбора лекарственных средств, наиболее перспективных с точки зрения экспрессии. Единственным методом, отвечающим условиям точности и специфичности анализа, является количественная полимеразная цепная реакция ПЦР.

биомедицинских задач ПЦР используется либо как основной метод анализа, либо как необходимый этап многоступенчатой диагностики. На сегодняшний день сложно представить себе фундаментальную или прикладную работу в сфере исследования живых систем, результаты которой не были бы основаны классических областей - медицины, биотехнологии и генетики - ПЦР все чаще находит применение в промышленном процессе, в оборонном сегменте для более эффективной реализации принципов биологической безопасности, а также при тестировании и сертификации продукции, основанной на использовании геносодержащих компонентов.

количественной ПЦР, предназначенной для специфического выявления фрагментов вирусного генома, является трансплантология. Вирусные инфекции, среди которых особое клиническое значение имеют условно патогенные вирусы, широко распространенные в человеческой популяции, относятся к первоочередным факторам риска, угрожающим здоровью реципиента. В первую очередь это вирусы, относящиеся к семейству Herpesviridae, а также вирусы BK и JC (Nickeleit, Singh et al. 2006, Tanenbaum, Alla et al. 2007). Кроме того, активно изучается роль вируса TTV (р. Anellovirus) в развитии тяжелых осложнений трансплантации (Burra, Masier et al. 2008, Piaggio, Dodi et al. 2009). Диагностика инфекций и мониторинг вирусной нагрузки у пациентов в посттрансплантационный период позволяет повысить эффективность профилактики и лечения пациентов, и, таким образом, снизить число осложнений трансплантации, в том числе летальных. Поэтому внедрение количественных методов генодиагностики в области трансплантологии может стать универсальным инструментом оценки адекватности применяемой программы ведения реципиентов органного трансплантата.

Таким образом, актуальность настоящего исследования обусловлена необходимостью обобщения накопленных и получения новых данных в фундаментальных областях иммуногенетики, а также актуальностью разработки новых молекулярно-ориентированных подходов к борьбе с иммунозависимыми нарушениями.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Цели работы:

1. Определение наиболее перспективных в настоящее время областей применения молекулярно-генетических методов в фундаментальной и прикладной иммуногенетике; разработка спектра оригинальных тест-систем для оценки полиморфизма генов на индивидуальном и популяционном уровне.

2. Получение новых данных в области установления факторов наследуемой устойчивости и чувствительности к социально-значимым заболеваниям, в том числе к ВИЧ-инфекции и онкопатологиям, с помощью методов генодиагностики и иммуногенотипирования.

3. Разработка новых подходов в области клинико-иммунологического, лабораторного и фармакогенетического использования методов детекции нуклеиновых кислот, в том числе для мониторинга эффективности противоинфекционной терапии в клинике органной трансплантации, а также для анализа безопасности и эффективности препаратов, обладающих противовирусной активностью.

Задачи работы:

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

генодиагностических подходов, в том числе методов SNP- и HLAгенотипирования, в биомедицине.

2. Охарактеризовать особенности популяционного распределения аллельных вариантов генов, определяющих устойчивость к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД, возможность контролирования вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции и развитие осложнений терапии ВИЧ в популяциях, проживающих на территории России и сопредельных государств.

3. Исследовать возможности адаптации метода полимеразной цепной реакции в реальном времени к выявлению аллеля HLA-B*57:01, ассоциированного с развитием гиперчувствительности к препарату Абакавир, входящему в состав антиретровирусной терапии.

4. Выбрать гены-кандидаты, перспективные для поиска маркеров наследуемой устойчивости или чувствительности человека к радиационному воздействию, как фактору риска развития онкологических осложнений.

5. Разработать тест-системы для генотипирования иммуногенетических локусов и молекулярно-генетической оценки эффективности подавления экспрессии генов вируса гепатита С, а также для установления маркеров ассоциированной с приемом антиретровирусных препаратов.

6. Установить частоты генетических маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний в группе лиц без онкопатологии, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, а также в группе лиц с онкопатологией и в группе популяционного контроля.

7. Охарактеризовать распределение аллелей, ассоциированных с повышенной устойчивостью или чувствительностью к радиационному воздействию, как фактору риска развития онкологических осложнений в исследованных группах сравнения, дать популяционно-генетическую характеристику обнаруженных отличий.

противоинфекционного иммунитета реципиентов почечного трансплантата в целях профилактики развития инфекционных осложнений, в том числе ведущих к летальному исходу.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые проведен комплексный анализ распределения аллельных вариантов генов CCR5, CCR2, SDF1, HCP5, HLA-C, определяющих устойчивость к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД и возможность контроля вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции в выборках из 10 популяциий (аллельные варианты генов CCR5, CCR2, SDF1) и 5 популяций (аллельные варианты генов HCP5, HLA-C), проживающих на территории России и сопредельных государств; дана характеристика генетической структуры популяций. Оценена относительная опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях для носителей аллельных вариантов, ассоциированных с динамикой определить уровень межэтнической гетерогенности в распределении исследованных маркеров. Обсуждена значимость полученных данных с точки зрения молекулярной эпидемиологии, фундаментальной иммунологии и популяционной генетики.

Впервые продемонстрирована ассоциация иммуногенетических маркеров системы HLA класса II с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний. Проведен анализ иммунологических основ формирования индивидуальной реакции человека на радиационное воздействие. Полученные данные позволяют по-новому оценить роль главного комплекса гистосовместимости в реализации защитных функций организма человека в ответ на цитотоксическое и мутагенное воздействие радиации.

Показаны достоверные отличия в распределении аллельных вариантов генов ATM (rs1801516, rs664677), OGG1 (rs1052133), XRCC1 (rs1799782) в группе лиц без онкопатологии, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, а также в группе лиц с онкопатологией и в группе популяционного контроля.

Полученные данные служат теоретической основой для создания нового подхода к оценке индивидуальной реакции на радиационное воздействие. Данные о частотах распределения клинически значимых генетических маркеров могут быть использованы при проведении клиникостатистических исследований, а также при анализе факторов онкологического риска.

С помощью ПЦР-тест-систем для экспресс-скрининга патогенов, способных вызывать реактивацию латентных вирусных инфекций у посттрансплантационной терапии в отделении органной пересадки.

Охарактеризована представленность вирусных инфекций, являющихся основным фактором риска развития тяжелых инфекционных осложнений.

Показано, что из числа исследованных условно-патогенных вирусов наиболее часто встречающимся у реципиентов почечного трансплантата является вирус TTV. Такая распространенность делает его перспективным терапевтической схемы.

На основе международного опыта использования анти-ВИЧ препаратов и модели инфекции вирусом гепатита С проанализированы возможности применения молекулярно-генетических данных в терапии вирусных заболеваний. Проведена оценка распределения аллелей HLA-B*57:01 и HLADRB*01, ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧинфицированных лиц, принимающих ингибиторы протеазы ВИЧ Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine), в российской популяции (N=800) и продемонстрирована эффективность метода количественной ПЦР с обратной транскрипцией при разработке антисмысловых препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработаны и внедрены в лабораторную практику тест-системы для определения однонуклеотидных полиморфизмов CCR5delta32 (rs333), CCR2I (rs1799864), SDF1-3’A (rs1801157), HCP5 (rs2395029), HLA-C (rs9264942) и аллельного варианта HLA-B57:01 методом ПЦР в реальном времени. Тестсистемы просты в использовании, экономичны, обладают высокой пропускной способностью и полностью адаптированы к производимому в использования данных тест-систем в клинической практике, в качестве инструмента для оценки предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции.

Полиморфизм исследованных генов иммунной системы обеспечивает межпопуляционные различия в устойчивости к ВИЧ-инфекции.

генотипирующие ПЦР-тест-системы для выявления аллелей генов ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135) и региона 8q24 (rs9642880, rs13281615, rs1447295) Данные маркеры играют важную роль в механизмах канцерогенеза, а также восстановления и адаптации организма после генотоксического воздействия и могут быть использованы при комплектации панелей молекулярно-генетических тестов в области практической иммуногенетики и онкологии.

Разработанная методика также перспективна для формирования комплексного подхода к определению риска развития отдаленных последствий радиационного воздействия. Определение таких рисков должно быть основано на учете аллелей, ассоциированных с устойчивостью к облучению либо с достоверным повышением радиочувствительности у облученных лиц. Эти параметры могут использоваться для оптимизации радиационной защиты.

Полученные данные об эффективности противовирусных препаратов дают основания для продолжения клинических исследований, как в области посттрансплантационный период, так и в области создания новых средств индивидуальной непереносимости ингибиторов протеаз ВИЧ могут служить основанием при принятии решения о целесообразности внедрения и безопасности назначения препаратов на их основе в России.

Результаты исследования могут быть включены в научно-методические программы для студентов медицинских ВУЗов, а также в образовательные программы учреждений высшего профессионального и последипломного образования.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Впервые в отечественной практике проведено комплексное популяционно-гентическое исследование по установлению особенностей распределения аллельных вариантов, определяющих устойчивость человека к ВИЧ-инфекции; на основании установленных частот аллелей и генотипов оценены популяционные риски, отражающие динамику развития ВИЧинфекции.

Предложен и реализован подход к исследованию механизмов генетического контроля восстановления и адаптации организма в условиях хронического радиационного воздействия. В результате анализа частот групповых специфичностей генов системы HLA класса II установлена ассоциация группы аллелей HLA-DRB1*11 и подтверждена ассоциация SNPмаркера rs1799782 гена с формированием фенотипа, характеризующегося повышенной предрасположенностью к развитию онкопатологий. Установлены достоверные отличия в распределении аллельных вариантов генов ATM (rs1801516, rs664677) и OGG1 (rs1052133) в группе лиц без онкопатологии, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, а также в группе лиц с онкопатологией и в группе популяционного контроля.

противоинфекционного иммунитета у пациентов клиники трансплантации органов и тканей, основанный на мониторинге показателей вирусной нагрузки.

Установлены частоты аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB*01, ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧ-инфицированных лиц, принимающих препараты Абакавир и Невирапин.

Метод ПЦР в реальном времени эффективен при отборе антисмысловых препаратов, обладающих наибольшей противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на III Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2005, Москва), XVIII и XIX зимней молодежной научной школе ИБХ РАН (2005, Москва; 2007, Москва), конференции Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine (2006, Новосибирск), Международной конференции «Генетика в России и мире, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И.

Вавилова РАН» (2006, Москва), конференции Human Genome Meeting (2006, Хельсинки, Финляндия), VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (2006, Москва), на 16 европейском конгрессе по иммунологии (2006, Париж, Франция), 21 и 24 Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместиммости (2007, Барселона, Испания; 2010, Флоренция, Италия), I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (2010, Москва, Россия), на семинаре по урегулированию радиационной безопасности и медицинскому аварийному реагированию в случае аварий при транспортировании радиоактивных веществ (2011, Сочи, Россия), на III Европейском совещании «Successful R&D in Europe» (2011, Дюссельдорф, Германия), VII Международном ядерном форуме «Безопасность ядерных технологий: транспортирование радиоактивных материалов – «Атомтранс – 2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), научно-практической конференции ФМБА России «Медицинское обеспечение работников ядерно-энергетического комплекса, химических производств, предприятий водного транспорта» (2012, Саратов, Россия), II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины» (2012, Санкт-Петербург), 16 рабочем совещании и совместной конференции Европейской федерации иммуногенетиков и британского общества гистосовместимости и иммуногенетики (2012, Ливерпуль, Британия), на 19 международном симпозиуме по вирусу гепатита С и ассоциированным заболеваниям (2012, Венеция, Италия).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, из них 14 статей в 10 научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Российский аллергологический журнал», «Доклады Академии наук», «Молекулярная биология», «Генетика», «Кардиология», «Молекулярная медицина», «Прикладная биохимия и микробиология», «Микробиология», «Ядерная и радиационная безопасность»), 7 статей в отечественных и международных конференций и конгрессов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

иммунологии» ФМБА России, ЗАО «НПФ ДНК-Технология», ФГБУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 21 рисунок. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», а также два приложения.

Библиография включает 435 источников, в том числе 42 отечественных и зарубежных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О РОЛИ ГЕНОВ В

ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОАССОЦИИРОВАННЫХ ПРИЗНАКОВ

Иммунитет является важнейшим свойством многоклеточных организмов, филогенетически берущим свое начало, как двух компонентная система (включающая различные анатомические структуры для продукции T- и B-подобных клеток), еще у бесчелюстных (Bajoghli, Guo et al. 2011).

Эволюция иммунной системы, продолжавшаяся в ряду позвоночных вплоть до человека, привела к формированию многокомпонентного и, в то же время, чрезвычайно интегрированного механизма, обеспечивающего защиту организма от факторов инфекционной природы, а также от негативного влияния собственных трансформированных, или мутировавших антигенов (Хаитов 2005). Таким образом, функционирование иммунной системы обеспечивает поддержание физиологического и генетического гомеостаза, что является естественным условием существования живых организмов.

Именно значимостью иммунной системы определяется динамика развития иммунологической науки и смежных с ней биомедицинских дисциплин.

В настоящее время, благодаря исследованиям, большая часть которых выполнена с середины 20 столетия, охарактеризованы основные механизмы иммунного ответа на воздействие инфекций, заложены представления о роли иммунной системы в процессах канцерогенеза и аутоиммунной патологии, установлены ключевые компоненты клеточного и гуморального иммунитета, раскрыты механизмы формирования уникального разнообразия рецепторов и медиаторов иммунного ответа (табл. 1).

Одним из наиболее активно развивающихся направлений имунологии в наше время является иммуногенетика – наука, направленная на изучение генетически детерминированных механизмов чувствительности и резистентности к заболеваниям.

Табл. 1. Основные открытия, послужившие развитию иммунологии и иммуногенетики Теория фагоцитоза (нобелевская премия Илья Мечников 1883- Теория гуморального иммунитета Немедленная гиперчувствительность, Charles R. Richet* (нобелевская премия 1913 года) Теория иммунологического надзора за Paul Ehrlich (Ehrlich Теория иммунологической толерантности Frank Табл. 1. Продолжение.

Открытие HLA (нобелевская премия 1980 Baruj Определена роль тимуса в клеточном Jacques Структура антитела (нобелевская премия Gerald M. Edelman, (нобелевская премия 2011 года) Открытие соматической рекомбинации в Susumu Tonegawa* генах иммуноглобулинов (нобелевская Табл. 1. Продолжение.

Открытие ВИЧ (нобелевская премия 2008 Harald zur Hausen, Формирование представлений о Th1 и Timothy Открытие биохимических активаторов Т- Christopher Открытие первых хемокинов Роль пептида в формировании структуры Scheherazade Табл. 1. Продолжение.

Окончание проекта «Геном человека»

* По данным сайта www.nobelprize.org 1.1.1 «Догеномный» период развития генетического направления в иммунологии Основы «генетического направления» в иммунологии были заложены еще на рубеже XIX-XX веков. Так в 1915 году профессором Тиззером (Tyzzer E.E.), проводившим эксперименты с инбредными линиями японских танцующих мышей (Mus bactrianus), была высказана мысль о решающей роли наследуемых факторов в формировании предрасположенности к определенным типам опухолей (Little and Tyzzer 1916, Авербах, Мороз и др.

1985). Аналогичные идеи получили развитие в ряде работ по исследованию иммуногенетической предрасположенности животных и человека к инфекционным заболеваниям. Так Heidelberger и Avery в 1923 году показали, что специфичность, а также вирулентность различных типов пневмококков определяется, по крайней мере, двумя полисахаридами, входящими в состав их оболочки (Heidelberger and Avery 1923). Таким образом, авторы исследования впервые постулировали связь между химической структурой антигенов и особенностями иммунного ответа. Уже тогда Heidelberger указывал на перспективность применения иммунологических методов в определении генетических основ развития того или иного типа реакции (Irwin 1974).

Вопрос об участии генетического фактора в формировании иммунного ответа определенного типа был более подробно обсужден в работе Schott R.G. В серии экспериментов на мышах автор показал, что устойчивость животных к Salmonella aertrycke может быть значительно повышена путем направленного скрещивания (Schott 1932). Кроме того было установлено, что «концентрацией наследуемых факторов» и передается в ряду поколений по доминантному принципу. Похожие результаты были описаны для крыс, кур и кроликов (Irwin 1929, Cole 1930).

экспериментальное подтверждение участия многих «генетических факторов»

(генов) в развитии устойчивости к инфекции паратифоидного энтерита у мышей (Webster and Pritchett 1924, Webster 1925, Webster 1933). Позже, исследуя устойчивость кроликов к инфекционно-индуцированному участия одного гена в формировании данного признака (Manresa 1932).

Данные результаты хорошо укладывались в теорию наследования признаков сформулированную Грегором Менделем и Теодором Бовери и служили дальнейшему развитию генетического направления в иммунологии.

самостоятельной дисциплины стало установление антигенов, участвующих в реакции гемагглютинации. Собственно термин «иммуногенетика» был впервые использован в работе Irwin и Cole, посвященной определению видов Антисыворотка была получена путем введения кроликам очищенных представителям различных видов голубей и их гибридов авторами был установлен видоспецифичный характер антигенов, представленных на поверхности эритроцитов, а также сделан вывод об их наследуемости.

Затем Питером Горером (Peter A. Gorer) были опубликованы работы по результатам экспериментов, проведенных на мышах (Schutze, Gorer et al.

1936). В ходе работы он выделил три антигена, каждый из которых был специфичен определенной линии мышей. В дальнейшем при пересадке опухолей он выяснил, что один из антигенов (антиген II) достоверно ассоциирован с устойчивостью животных к развитию опухоли. В ходе дальнейших исследований антисыворотка к антигену II была использована для определения трех аллелей кодирующего антигены локуса, названного локусом гистосовместимости (H2) (Gorer 1948).

Открытие в 1958 году Жаном Доссе, Йоном ван Рудом и Роуз Пейн (Jean Dausset, Jon van Rood, Rose Payne) аналогичной системы у человека привело к настоящему буму в области иммуногенетики. За последующие лет были заложены основные представления о структуре и полиморфизме системы HLA. Именно в «догеномный» период изучения HLA (1960-1980 гг.) были выполнены фундаментальные исследования, посвященные функции HLA-антигенов, а также определена их роль в трансплантации тканей (Svejgaard, Hauge et al. 1975, van Rood, van Leeuwen et al. 1977). Более того, тестирование большого числа пациентов привело к пониманию критической роли HLA-фенотипа в формировании предрасположенности к определенным заболеваниям (табл. 2) (Dausset 1977).

Важность дальнейшего исследования системы главного комплекса гистосовместимости, а также связи молекул определенного фенотипа с развитием имунозависимых заболеваний была очевидна. Однако ни одной лаборатории в мире было не под силу установить все разнообразие аллельных вариантов генов, кодирующих столь полиморфную систему. Это привело к формированию совместных межлабораторных проектов по изучению данной проблемы. Консолидация работы и регулярный обмен опытом привели к быстрому накоплению сведений о широчайшем полиморфизме этой системы.

Табл. 2. Данные об ассоциации HLA с рядом заболеваний, накопленные с по 1985 г. (Tiwari 1985) (болезнь Бехтерева) энтеропатия (целиакия) Важной частью, недостающей для формирования общей картины биологической роли HLA, было определение фундаментального смысла существования столь сложной в генетическом плане системы.

Одна из наиболее перспективных идей в этой области была высказана Lawrence H.W. в 1959 году (Lawrence 1959). Он предположил, что молекулы HLA формируют внутриклеточные комплексы с инфекционными агентами и стимулируют экспрессию распознающего их рецептора на поверхности лимфоцита. Таким образом, полиморфизм напрямую связан с процессом презентации антигенных детерминант. Эта идея нашла развитие в работах швейцарского иммунолога Рольфа Цинкернагеля и его австралийского коллеги Питера Доэрти. В 1974 году ими был установлен феномен «двойного цитотоксических тестов по оценке ответа на инфицирование вирусом LCMV была показана зависимость иммунного ответа от молекул MHC класса I (Zinkernagel and Doherty 1974). Было установлено, что рецепторы Т-клеток специфически взаимодействуют как с иммуногенным пептидом, так и с самой молекулой MHC.

В те же годы, благодаря работам Памелы Бьеркман. была установлена трехмерная структура белков комплекса MHC класса I (Bjorkman, Saper et al.

1987).

иммуногенных пептидов и молекул главного комплекса гистосовместимости.

Стало понятно, что для развития иммунного ответа на тот или иной контактирующей с ним молекулы MHC должны находиться специфические участки для связывания с этим пептидом. Именно этот феномен определяет уникальный полиморфизм генов HLA и специфичность иммунного ответа.

Параллельно с развитием представлений о роли HLA в развитии иммунного ответа на инфекционные агенты, развивалось направление, исследующее роль HLA в формировании популяционно-специфических признаков. Было установлено, что степень выраженности ассоциаций зависимости от рассовой и/или этнической принадлежности обследуемой группы (Thorsby 1974, Bodmer 1975).

Эти данные стали основой для сравнительных исследований по изучению особенностей HLA-полиморфизма в различных этнических группах. Впервые результаты этих исследований были обобщены на Международном рабочем совещании по гистосовместимости (г. Йокогама, Япония). В работе совещания принимали участие представители лабораторий и в частности из Института иммунологии (в настоящее время ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России). За наибольший вклад в развитие направления «HLA и антропология» исследователям Института была вручена медаль.

Еще одним важным результатом 11 совещания по гистосовместимости стала широкая презентация метода полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных олигонуклеотидных проб (PCRSSOP), как нового подхода к типированию HLA. Кроме того были представлены и другие молекулярные подходы к ДНК-типрованию HLA, в том числе: обратный дот-блот, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP), формирование ПЦР-гетеродуплексов, анализ комформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). По результатам совещания было принято решение принять новую номенклатуру HLA-специфичностей, основанную на их корреляции с установленной нуклеотидной последовательностью (www.ihiwg.org). На сегодняшний день название аллеля HLA включает как минимум четыре цифры и разделяется двоеточиями. Цифры, расположенные до первого двоеточия, как правило, обозначают группу аллелей, кодирующих антиген, определяемый серологическими методами. Второй набор цифр призван отличать аллели, различающиеся несинонимичными (приводящими к замене аминокислот) заменами нуклеотидов. Аллели, отличающиеся только синонимичными (не влияющими на аминокислотную последовательность белка) заменами, определены третьим набором цифр. Четвертый набор цифр определяет аллели, различающиеся последовательностью 5’ и 3’неколирующих областей, а также интронов. Дополнительно к цифровым обозначениям часто используют буквенные суффиксы, отражающие экспрессионный статус (нуль-аллели – N или аллели, экспрессирующиеся в различных частях клетки: L – в пределах плазматической мембраны, S – за ее пределами, С – в цитоплазме). В случае возникновения сомнений в экспрессионном статусе аллели маркируют суффиксами A (aberrant) или Q (questionable).

Переход с серологических на молекулярно-генетические методы иммуногенетике. Так за последующие 30 лет, во многом благодаря внедрению молекулярно-генетических методов типирования, число вариантов HLA возросло с 260 специфичностей до 8794 аллелей (по данным сайта www.hla.alleles.org на январь 2013 года). На рисунке 1 представлена динамика накопления данных о полиморфизме системы HLA начиная с года.

Рис. 1. Динамика накопления данных о полиморфизме системы HLA (по данным сайта www.hla.alleles.org (Robinson, Mistry et al. 2011) В целом процесс формирования полиморфизма является наглядным отображением эволюционной роли мутационного процесса. Именно полиморфизм генов иммунного ответа обеспечивает выживание человека, как вида в условиях агрессивной окружающей среды (Пальцев 2009). Однако мультифакториальный характер наследования большинства признаков, следует отметить, что при определенных условиях позитивный эффект, нивелирован или даже перекрыт негативным эффектом, сказывающимся на ином этапе биохимической реакции или в ином биологическом пути.

настоящее время среди европеоидов, сыграл положительную роль во время средневековых пандемий. Носители этого гаплотипа имели преимущество в выживании, поскольку его наличие связано с показателями врожденного иммунитета, играющими важную роль в защите от инфекционных агентов.

Однако в изменившихся с тех пор условиях окружающей среды данный гаплотип демонстрирует достоверную ассоциацию с заболеваниями аутоиммунного генеза, включая сахарный диабет I типа и ряд других эндокринных патологий (Price 1999). Этот пример является весьма показательным для определения роли окружающей среды в развитии имуноассоциированных заболеваний. Так новые типы внешних воздействий, накрадываясь на уникальный для данной популяции набор генетически детерминированных признаков, могут стать причиной достаточно быстрого с эволюционной точки зрения распространения заболеваний среди носителей определенного генотипа.

1.1.2 Иммуногенетика в постгеномную эру иммунологии требовало перехода на «геномный» уровень исследований с привлечением данных о генетических основах регуляции иммунных реакций, иммуноассоциированных признаков.

Новые возможности в данной области открылись с завершением проекта «Геном человека» в 2001 году (Venter, Adams et al. 2001). Важным формирование представлений о роли генетического полиморфизма на уровне одиночных нуклеотидных замен. На сегодняшний день в наиболее известной и полной базе данных dbSNP сервера NCBI (National Center for Biotechnology Information) полиморфных участков в геноме человека и о 38 миллионах валидированных SNP (по данным сайта www.ncbi.nlm.nih.gov/snp, сборка №137).

Наиболее ярким примером данного типа полиморфизма являются гены иммунного ответа и, в том числе система генов HLA, где определенные аллельные варианты «закрепились» в силу той или иной биологической целесообразности (Klein and Figueroa 1986). Однако наряду генами, кодирующими молекулы главного комплекса гистосовместимости, установлено значительное число вариантов, так называемых не-HLA генов, которые кодируют огромное разнообразие, сигнальных, регуляторных и эффекторных компонентов иммунного ответа, формирующих единую в физиологическом смысле систему (Dickinson and Charron 2005, Serrano, Millan et al. 2006).

В заключение хотелось бы отметить, что развитие генетического направления в иммунологии с середины прошлого века окончательно оформившегося в отдельную дисциплину иммуногенетику, идет параллельно генодиагностики. С появлением новых данных становится понятно, что биомедицинских исследований, направленных на разработку новых методов диагностики, а также современных подходов для создания лекарственных средств и средств профилактики, основанных на индивидуальном подходе к пациенту. Этот индивидуальный подход должен строиться на понимании молекулярных механизмов функционирования органов и тканей с учетом уникальности генетически детерминированного иммунного статуса каждого организма. Поэтому идентификация генетических маркеров наследуемой предрасположенности к биологическим и физическим угрозам, а также к новым лекарственным препаратам становится одним из перспективных направлений биомедицины.

1.2 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ РОЛЬ В

ФОРМИРОВАНИИ ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К

ИММУНОЗАВИСИМЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Варианты генов иммунной системы формируют уникальный для данного человека иммуногенетический профиль и ассоциированы с индивидуальными особенностями функционирования иммунной системы.

сформировавшимся в течение веков продуктом воздействия факторов испытывающий на себе регулирующее воздействие внешних факторов, является основным механизмом адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и во многом определяет различия в индивидуальной реакции на то или иное воздействие (Hedrick 1976, Nei and Chesser 1983).

Нарушение баланса между различными звеньями иммунной системы может приводить к развитию аутоиммунных и онкологических патологий, понижает сопротивляемость организма инфекциям, повышает риск предрасположенность человека к развитию иммунозависимых заболеваний (Goulmy, Schipper et al. 1996, Dunn, Old et al. 2004).

иммуноассоциированных нарушений подтверждается исследованиями степени генетической конкордантности у близнецов. Так, например, показатель конкордантности по сахарному диабету 1 типа значительно выше свидетельствует о значительной роли генетической составляющей в развитии этого заболевания (табл. 3) Табл. 3. Генетическая конкордантность в проявлении иммунозависимых заболеваний у монозиготных (MZ) и дизиготных (DZ) близнецов Системная красная волчанка 25-57 0-5 (Grennan, Parfitt et al.

До недавнего времени основное внимание в области исследования генетических основ заболеваний было сосредоточено на изучении моногенных нарушений (менделирующие болезни), однако, в соответствии с современными представлениями, большая часть распространенных заболеваний, несущих в своей основе генетический компонент, зависит от совместного влияния аллелей, расположенных в нескольких генах (мультифакториальные заболивания) (Perez-Iratxeta, Bork et al. 2002, Bodmer 2008). Показать достоверную взаимосвязь генотипа с предрасположенностью к таким заболеваниям значительно сложнее. Во многом созданию целостной картины препятствует неоднозначность получаемых данных. Причиной возникновения неточностей является недостаточная изученность межпопуляционных отличий в распределении маркеров и структуре сцепления генома (Pfaff, Parra et al. 2001, McClellan and King 2010). Кроме того, важным параметром, практически не поддающимся оценке, но, тем не менее, влияющим на риск развития заболевания является воздействие факторов окружающей среды (курение, инфекционные заболевания, стресс, неправильное питание и т.д.) (Ottman 1990, Smith and Ebrahim 2003, Hunter 2005).

Тем не менее, установление генетической вариации, которая может послужить надежным маркером того или иного признака (заболевания) позволяет оценить насколько риск развития заболевания для данного человека выше или ниже среднего риска для популяции. Область поиска таких маркеров можно уменьшить, если обратить внимание на гены, лежащие в самой основе формирования фенотипа с повышенной предрасположенностью к заболеванию. Варианты этих генов, как правило, ассоциированы с несколькими заболеваниями (табл. 4) (Lettre and Rioux 2008, Smyth, Plagnol et al. 2008). Исследуя генетический полиморфизм этих генов можно установить маркеры, влияющие на уровень экспрессии гена или свойства его продукта, и, таким образом, приводящие к формированию фенотипа с повышенной предрасположенностью к развитию заболевания.

Еще одной важной задачей при исследовании ассоциаций маркеров с заболеваниями является выбор типа генетической вариации. Маркер, ассоциированный с мультифакториальным заболеванием должен иметь высокую частоту в популяции, должен обладать эволюционной стабильностью (не испытывать на себе влияние естественного отбора) и, наконец, должен быть легко адаптируем к диагностическим задачам.

Табл. 4. Гены, ассоциированные с несколькими иммунозависимыми заболеваниями IL23R IL2- IL2RA STAT IRF CTLA TNFSF ATG16L Всем этим условиям отвечают SNP – наиболее распространенный тип генетических вариаций в геноме человека (Marth, Korf et al. 1999, TaillonMiller, Piernot et al. 1999). SNP – это вариабельные позиции в последовательности ДНК. Полиморфизмом принято считать только те распространенного варианта составляет не менее 1%. Каждый отдельный полиморфизм может быть представлен в популяции двумя тремя или четырьмя аллельными вариантами (по числу возможных нуклеотидов в данной позиции ДНК), однако большинство SNP существует в двух вариантах (биаллельны), что определяет простоту их диагностики (Brookes 1999). Высокая плотность и эволюционная стабильность SNP делают их одним из наиболее перспективных для изучения генетических маркеров.

Кроме того, следует отметить универсальность этого типа вариаций.

Однонуклеотидные полиморфизмы встречаются повсеместно в геноме и, в особенности в тех местах, где поддержание генетического разнообразия является залогом успешного выполнения функций. Так, например, важным механизмом формирования многообразия последовательностей, кодирующих молекулы HLA, наряду с полигенностью и кодоминантной экспрессией, является полиморфность – в том числе на уровне одиночных нуклеотидов (Parham 1988).

предрасположенностью к иммунозависимым заболеваниям, можно отнести к трем большим группам: это гены региона HLA, гены, связанные с дифференцировкой и активацией Т-лимфоцитов (приобретенный иммунитет) компонентов врожденного и приобретенного звеньев иммунитета. В настоящее время последние две группы принято объединять в общую систему не-HLA генов иммунного ответа (Абрамов, Кофиади и др. 2010).

иммунозависимым заболеваниям Полиморфизм системы HLA является одним из основных генетических факторов развития большинства иммунозависимых заболеваний (Alves, Davini et al. 2012, Nurzia, Narzi et al. 2012, Sun, Wei et al. 2012, Hughes, Coit et al. 2013, Nouri-Aria 1985). Система генов тканевой совместимости человека расположена на 6 хромосоме в пределах участка длиной 4 млн.п.н. Регион содержит 224 гена более половины, из которых экспрессируется. По организма. Реализация этих функций обеспечивается особенностями строения главного комплекса тканевой совместимости и в первую очередь разнообразием его генетической структуры и полиморфизмом продуктов – HLA-антигенов. Аллели HLA представляют собой участки ДНК, которые отличаются как минимум одним нуклеотидом (однонуклеотидным аминокислотной последовательности белка и незначительному изменению его функции (Hughes 1990).

определенных аллелей (или гаплотипов) HLA и предрасположенностью ко многим аутоиммунным, инфекционным, воспалительным заболеваниям, а также эффективностью трансплантации. Кроме того, установлены ассоциации между риском и тяжестью иммунозависимых заболеваний и степенью совместимости донора и реципиента при трансплантации с полиморфизмом генов, расположенных в пределах региона HLA, но не выполняющих антигенпрезентирующей функции (например, TNF, белки системы комплемента, белки теплового шока и др.) (Vyse and Todd 1996, Simmonds and Gough 2004). Кроме того, гены HLA тесно сцеплены с другими иммунорегуляторными генами, расположенными за пределами классических локусов.

ассоциированных с полиморфизмом генов HLA, является сахарный диабет типа (Todd, Bell et al. 1987, Pociot and McDermott 2002). Установлена достоверная ассоциация аллелей DRB1*03 и DRB1*04 с развитием диабета.

Продукты генов HLA класса II, в частности DRB1, DQA1 и DQB1 высоко полиморфны и играют роль, как в презентации антигена CD4 Т-хелперам, так и в формировании иммунологической толерантности. Высокая степень сцепленности между DRB1-DQA1-DQB1 сделало задачу определения этиологического маркера довольно сложной. Однако, дальнейшие исследования показали, что аллели DRB1*03 и DRB1*04 являются частью гаплотипов DRB1*03-DQB1*02-DQA1*05:01 (DR3) и DRB1*04-DQB1*03:02DQA1*03:01 (DR4), ассоциированных с заболеванием у европеоидов (и в особенности у гетерозигот DR3/4). Повышение риска у гетерозигот, вероятно, связано с формированием транс DQ димеров между HLA-DQA1 и HLA-DQB1 аллелями, расположенными на гомологичных хромосомах.

Ассоциация HLA с диабетом 1 типа показана также для представителей азиатской популяции. Так в японской и корейской популяциях существует достоверная ассоциация заболевания с HLA-DR4 (DRB1*04:05-DQB1*04:01) и HLA-DR9 (DRB1*09:01-DQB1*03:03) (Erlich, Valdes et al. 2008, Zhang, Wang et al. 2009) На эффект отдельных аллелей генов HLA-DR и HLA-DQ может влиять их окружение (полиморфизм сцепленных локусов, эпигенетические факторы). Так, например, в пределах HLA-DQB1 действие аллелей может варьировать от выраженного протективного (HLA-DQB1*0602) до негативного (HLA-DQB1*0302) (Erlich, Valdes et al. 2008).

Кроме того, HLA регион играет одну из основных ролей в развитии таких заболеваний, как рассеянный склероз и системная волчанка. Открытие ассоциации HLA-DR2 (гаплотип HLA-DRB1*15:01-HLA-DQB1*06:02) с рассеянным склерозом до сих пор не потеряло своей значимости. Существует предположение, что HLA-DRB1*15:01 и тесно связанный с ним аллель HLADRB1*15:03 достоверно ассоциированы с заболеванием у афро-американцев и, вероятно, у европейцев. Кроме того есть основания предполагать наличие независимой от гаплотипа HLA-DRB1*15:01-HLA-DQB1*06:02 ассоциации с аллелями HLA класса I (HLA-A*02:01, HLA-A3 и HLA-Cw05), а также с аллелем HLA-C1_3_2*354 (микросателлит), тесно сцепленным с HLA-DR (Fernando, Stevens et al. 2008, Hafler 2007).

Наиболее достоверная связь с развитием системной волчанки показана для аллелей HLA класса II - DRB1*03:01, *14:01, *15:01 и *05:01, однако оценка относительного вклада этих аллелей в развитие заболевания требует дальнейшего уточнения (Fernando, Stevens et al. 2008). Ниже приведена таблица обобщающая данные по ассоциации аллелей HLA класса II с развитием основных иммунозависимых заболеваний (табл. 5).

В пределах региона HLA расположены также гены, не участвующие непосредственно в презентации антигена, но играющие важную роль в реализации этой функции. Это в первую очередь гены TAP и LMP, ответственные за процессинг антигенов. Продукты генов LMP2 и LMP входят в состав протеасом, обеспечивающих процессинг пептидов, благодаря чему достигается соответствие размеров пептидного фрагмента и связывающего сайта молекулы HLA I класса. Функция продуктов генов TAP и TAP2 также связана с регуляцией размера пептидных фрагментов, презентируемых молекулами HLA I класса. Нарушение функций генов TAP и TAP2 могут быть связаны с предрасположенностью к онкологическим и аутоимунным заболеваниям, в том числе к сахарному диабету (Deshpande, Wheeler et al. 2008, Brorsson, Tue Hansen et al. 2010, Deshpande, Nolan et al.

2005).

Табл. 5 Ассоциации аллелей HLA с развитием основных иммунозависимых заболеваний (Handunnetthi, Ramagopalan et al. 2010) Рассеянный DRB1*03:01; DRB1*15:01 DRB1*04: склероз Системная DRB1*03:01; DRB1*15:01 волчанка DRB1*14:01; DRB1*08: Открытие механизма иммунного распознавания Т-лимфоцитами вирусных антигенов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости позволило предположить, что полиморфизм генов HLA может играть решающую роль в эффективности и интенсивности иммунного ответа на инфекцию. Впоследствии эта догадка нашла подтверждение во многих исследованиях. В таблице 6 приведены данные по ассоциации аллелей и гаплотипов HLA с генетически обусловленной устойчивостью и предрасположенностью к распространенным инфекционным заболеваниям.

Табл. 6. Ассоциация аллелей и гаплотипов HLA с устойчивостью и чувствительностью к распространенным инфекционным заболеваниям (Hill, Elvin et al. 1992, Almarri and Batchelor 1994, Desombere, Willems et al. 1998, Hirayama, Chen et al. 1998, Angyalosi, Neveu et al. 2001, Shaw, Donaldson et al.

2001, Stephens, Klaythong et al. 2002, Shankarkumar 2004, Hananantachai, Patarapotikul et al. 2005, Alves, Meyer et al. 2006, Tripathy, Shankarkumar et al.

2009, Duarte, Carvalho et al. 2011, Kuniholm, Gao et al. 2011).

HLA-B*44, -B*62, -B*76 - Устойчивость к повторному HLA-B*08, HLA-A*01-B*08- Персистенция инфекции DRB1*03, -B*44-Cw*16:01, B*44-Cw*05: Табл. 6. Продолжение.

Малярия HLA-B53, HLA-DRB1*13:02- Протективный эффект 1.2.2 не-HLA гены иммунной системы в ответе на инфекции и измененные собственные антигены Среди генов, не принадлежащих системе HLA, и относящихся к группе генов регуляции и активации иммунных клеток наиболее достоверные установлены для генов фосфотаз PTPN2 и PTPN22, а также рецептора Тклеток CTLA4. Варианты этих генов играют роль в таких тяжелых патологиях, как сахарный диабет 1 типа, ревматоидный артрит и хроническое воспалительное заболевание кишечника (Cope, Schulze-Koops et al. 2007, Kleppe, Lahortiga et al. 2010, Lessard 2012, Chapman 2006, Ueda 2003).

Среди наиболее значимых генов, связанных с дифференцировкой Т-кл и ассоциированных с развитием большинства иммунозависимых заболеваний можно отметить гены IL18RAP, IL18, IL10, STAT3 и STAT4 (дифференцировка Th1). Гены, ассоциированные с Th17 (например IL23R и IL21) также играют важную роль в развитии иммунозависимых заболеваний, в первую очередь связанных с воспалением тканей (ХВЗК, ревматоидный артрит, астма, псориаз). Кроме того, в основе многих иммунозависимых нарушений лежат гены IL2 и IL2RA, ответственные за активацию регуляторных Т-клеток (Zhernakova, van Diemen et al. 2009, Cho and Brant 2011).

С развитием ассоциативных исследований на уровне генома, возросла и роль генов, обеспечивающих ключевые механизмы врожденного иммунитета. Так, например, большая часть распространенных иммунозависимых заболеваний ассоциирована с генами системы TNFопосредованной передачи сигнала, осуществляющего связь между врожденным и приобретенным звеньями иммунитета (Chen and Goeddel ассоциированный с болезнью Крона, играет роль, как в механизмах врожденного иммунного ответа, так и при активации эффекторных Т-клеток (Takedatsu, Michelsen et al. 2008, Xavier and Rioux 2008). Нарушения взаимодействий (главным образом посредством TNF-опосредованной приобретенного иммунитета определяют патогенез таких заболеваний как ревматоидный артрит и системная волчанка (Mathew 2008, Faustman and Davis 2010, Абрамов, Кофиади и др. 2012).

Установлено, что нарушения процессов аутофагоцитоза, в клетках врожденного иммунитета, а также изменения баланса между популяциями Тклеток являются одним из основных механизмов патогенеза так называемых «барьерных» заболеваний (болезнь Крона, псориаз), а также системной волчанки (Parkes, Barrett et al. 2007, Barrett 2008). Так, например, при болезни Крона белок NOD2 приводит к сенсибилизации микрофлоры кишечника и высвобождению антимикробных пептидов. Это активирует дендритные клетки, что приводит к передаче сигнала на рецептор IL-23R Th-17 и определяет активацию и экспансию последних. В то же время белки системы аутофагоцитоза (ATG5, ATG16L1), вовлеченные в систему антимикробной защиты и выполняющие функцию процессинга антигена, участвуют в стимуляции макрофагами Th1 и Th2, в патологии, проявляющейся при болезни Крона и системной красной волчанке (Xavier and Rioux 2008, Kaser and Blumberg 2011, Levine, Mizushima et al. 2011).

За последние 5 лет сотрудниками Института иммунологии определены частоты аллельных вариантов генов воспалительного ответа, продукты которых отвечают за апоптоз, дифференцировку и пролиферацию клеток (табл. 7) (Кофиади 2011). Полученные данные о частотах встречаемости клинически значимых SNP могут быть использованы при проведении популяционно-генетических исследований, направленных на определение иммуноассоциированных заболеваний в русской популяции. Для подобных исследований наличие информации о генетическом профиле контрольной группы (как правило, здоровых индивидов) достаточного объема, является залогом адекватного проведения статистической обработки и корректного результата исследования в целом.

В состав другой системы, играющей ключевую роль в процессах реализации иммунного ответа, входят цитокины, хемокины и их рецепторы.

На настоящий момент обнаружено большое количество полиморфизмов в генах практически всех известных цитокинов и большинства хемокинов.

Рис. 2 Гены приобретенного (А), врожденного (Б) звеньев иммунитета, а также гены, осуществляющие связь между ними (В), играющие важную роль в предрасположенности человека к имунозависимым заболеваниям (пояснения в тексте).

Кадочникова и др. 2011). Участие в воспалительном пути определяли на (www.biocarta.com).

Табл. 7. Продолжение.

Для некоторых из них показана ассоциация с характером течения и исходом инфекционных заболеваний, а также с развитием иммунопатологий.

предрасположенностью к инфекционным заболеваниям может служить установление ассоциации вариантов генов хемокиновых рецепторов и хемокинов с устойчивостью или чувствительностью к ВИЧ-инфекции (Locati and Murphy 1999). Более подробно этот вопрос рассмотрен в следующей главе.

Проблема прогнозирования распространения и лечения различных инфекционных заболеваний почти всегда обусловлена одними и теми же факторами. В первую очередь, это трудности с определением групп повышенного риска и изменчивость патогенов, помогающая вирусам и бактериям избегать действия иммунной системы, лекарственных препаратов и вакцин. К группам повышенного риска относятся люди, которые по тем или иным причинам предрасположены к заболеванию в большей степени, чем остальные представители популяции. Эти причины могут быть обусловлены, как поведенческими особенностями, так и особенностями функционирования защитных систем организма. Например, асоциальное поведение является важным фактором развития многих заболеваний передающихся половым путем, таких как гепатит С, сифилис, ВИЧ (Ma, Zhang et al. 2007, Todd, Abed et al. 2007, Coleman and Curtis 1989). В свою очередь, отличия в реакции организма на инфекцию связаны с фактором естественной устойчивости и восприимчивости к заболеванию.

На сегодняшний день известно несколько примеров устойчивости и восприимчивости к паразитарным, бактериальным и вирусным заболеваниям, обусловленной не-HLA генами иммунного ответа (табл. 8) (Simoes, Goncalves et al. 2005, Burgner, Jamieson et al. 2006, Lykouras, Sampsonas et al. 2008).

Табл. 8 Роль не-HLA генов иммунного ответа в формировании устойчивости и восприимчивости к инфекционным заболеваниям Противоположный по эффекту комплекс наследуемых признаков, связанных с повышенной восприимчивостью к патогену, является важным предрасположенности к инфекционным заболеваниям.

уникальных взаимоотношений организма и патогена, но и с индивидуальной реакцией на лекарственные препараты и вакцины, применяемые при терапии заболеваний (Roses 2000). Так, например, прием одного и того же препарата может вызывать острую реакцию у одних людей и быть совершенно безвредным для других (Phillips 2002). На сегодняшний день около 10% фармакогенетическую информацию и противопоказаны генетически восприимчивым индивидуумам (www.fda.gov). В России в настоящее время подобные исследования не ведутся, однако реализация таких программ позволила бы существенно оптимизировать затраты государства в сфере здравоохранения.

1.3 ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ

ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД

ВИЧ всегда был и остается одной из наиболее загадочных инфекций.

По поводу самого его появления в человеческой популяции до сих пор не угасли споры. Наиболее вероятной на сегодняшний день представляется версия о происхождении ВИЧ в пределах африканского континента. Причем до определенного времени он сохранял специфичность в отношении различных видов африканских обезьян (Gao, Yue et al. 1992, Gao, Bailes et al.

1999). В поддержку этой теории можно привести наличие тесной связи между географическими регионами с наибольшим полиморфизмом штаммов экспериментальных работ по молекулярной эволюции ВИЧ.

Так естественный резервуар ВИЧ-2 был определен в пределах популяции дымчатого мангобея (Cercocebus atys) (Lemey, Pybus et al. 2003).

С филогенетической точки зрения на родство этих вирусов указывает крайняя схожесть геномов ВИЧ-2 и ВИО (вируса иммунодефицита африканских обезьян) (Wertheim and Worobey 2009). По всей видимости, ВИЧ-1 также имеет зоонозное происхождение. В работе, проведенной под руководством профессора Беатрис Хан (Beatrice Hahn), приведены доказательства общих истоков эволюции ВИЧ-1 и ВИО, циркулирующих в популяциях шимпанзе (Pan troglodites troglodytes) (Gao, Bailes et al. 1999).

Если говорить о времени появления ВИЧ, то наиболее вероятной датой возникновения современных штаммов вируса, ставших причиной пандемии, являются 30 годы двадцатого столетия. Этому свидетельствует анализ ретроспективно проследить эволюцию вируса вплоть до общего предка (Korber, Muldoon et al. 2000). По всей видимости, человечество уже встречалось с ВИЧ. Считается, что подтипы наиболее распространенной в циркулировавших ранее в локальных африканских популяциях (Zhu, Korber et al. 1998, McCutchan, Carr et al. 1999).

Однако, несмотря на то, что многие специалисты указывают на более раннее появление ВИЧ у людей, первый зарегистрированный случай гибели человека от ВИЧ датирован июнем 1981 года. Майкл Готлиб (Michael Gottlieb) опубликовал статью, в которой описал диагностированную antemortem пневмоцистную пневмонию (Pneumocystis carinii), осложненную инфекцией CMV и кандидозом у 5 пациентов, проходящих лечение в различных госпиталях Лос-Анджелеса (Gottlieb, Schroff et al. 1981). Для троих из них (два других погибли и не были обследованы) была установлено необычное иммудефицитное состояние, характеризующееся лимфопенией, а также слабым пролиферативным ответом лимфоцитов на митогены и антигены. Через два года исследователям из института Пастера (Франция) удалось выделить вирус, принадлежащий семейству Retroviridae, который, по их мнению, был связан с развитием иммунодефицита данного типа (BarreSinoussi, Chermann et al. 1983, Francki 1991). В последующие годы, как и в случае с большинством новых вирусных инфекций, был зафиксирован рост показателей заболеваемости и смертности, ассоциированной с носительством ВИЧ (Хаитов и Игнатьева 1992).

Уже на ранних этапах изучения ВИЧ были определены основные механизмы взаимодействия вируса с клетками иммунной системы, расшифрован вирусный геном (Chatterjee, Basak et al. 1992, Chazal and Gerlier 2003, Chehimi, Starr et al. 1992, Chirmule, Kalayanaraman et al. 1990, Clerici and Shearer 1993, Clerici, Stocks at al. 1989, Clouse, Cosentino et al. 1991, Coffin, Haase et al. 1996, Coffin 1979, Cullen 1992). Однако, многие классические подходы, хорошо зарекомендовавшие себя в борьбе с другими вирусными заболеваниями, оказались неэффективны в отношении ВИЧ-инфекции.

Вирус во многом уникален: его субтипы по-разному распределены в различных географических регионах, общая динамика распространения инфекции отличается от классического «вирусного» типа, многообразие форм и способность к быстрой реорганизации структуры не позволяют разработать противовирусные вакцины (Morgado, Guimaraes et al. 2002).

Необходимо признать, что эффективных барьеров на пути распространения инфекции на сегодняшний день нет. Все это определяет необходимость создания нового комплексного подхода к проблеме распространения ВИЧинфекции. Три основных направления это мониторинг групп повышенного риска, разработка индивидуальных программ лечения ВИЧ-инфицированных и поиск перспективных молекулярных мишеней, как в геноме вируса, так и в геноме человека, которые позволят разработать новые эффективные способы лечения (De Clercq 2002, Marks, Crepaz et al. 2005, Cooper, Imrie et al 1987, Гудима, Богова и др. 2004, Сидорович, Николаева и др. 2004).

значительные отличия в предрасположенности к ВИЧ-инфекции. Скорость развития клинических проявлений заболевания у разных людей варьирует от 2-3 до 10-15 лет, а восприимчивость к инфекции охватывает весь спектр реакций организма на патоген - от высокой восприимчивости до практически полной устойчивости к ВИЧ (Kaslow, Dorak et al. 2005, Lama and Planelles 2007). В основе этих отличий лежит генетический аппарат человека, а точнее межиндивидуальные генетические отличия, формирующие уникальный набор признаков, ответственных за формирование естественной устойчивости к ВИЧ (Ioannidis, Rosenberg et al. 2001).

устойчивости и чувствительности к ВИЧ-инфекции Одной из самых важных систем регулирующих взаимоотношения организма человека и ВИЧ является система HLA. В конце 2010 года группой американских ученых были опубликованы результаты исследования мультиэтнических когорт, включающих, как людей характеризующихся замедленной прогрессией инфекции, так и ускоренным течением ВИЧ (Pereyra 2010). В качестве метода авторы использовали технологию полногеномного скрининга. По результатам анализа наибольшее количество генетических маркеров, ассоциированных с устойчивостью или восприимчивостью к ВИЧ, оказалось локализовано на 6 хромосоме в регионе комплекса генов, кодирующих систему HLA.

Среди индивидуумов, принадлежащих европейской расе, наиболее достоверная ассоциация с признаком показана для маркеров, расположенных в регионе HLA I класса. Из них наибольший положительный (защитный) эффект, связанный с поддержанием постоянного уровня вирусной нагрузки и пониженной вероятностью передачи ВИЧ другим людям, показан для отрицательный с маркерами B*35 и Cw*07 (информация по ассоциации Табл. 9. Ассоциации HLA с устойчивостью к ВИЧ-инфекции (Trachtenberg 2001) B*58:01+ВИЧ2 смешанная группа Африканцы Табл. 10. Ассоциации HLA с предрасположенностью к ВИЧ-инфекции (Trachtenberg 2001).

Конкордпнтность перинатальное Африканцы матери и ребенка инфицирование DRB1*03: DQB1*06: DQB1*06: DQB1*06: DQB1*06: DQB1*06: 1.3.2 не-HLA гены в ответе на ВИЧ Всплеск интереса к проблеме индивидуальной (и популяционной) генетически обусловленной предрасположенности к ВИЧ/СПИД, привел к появлению данных об отдельных вариантах, так называемых, не-HLA генов, которые также могут быть использованы в качестве надежных генетических маркеров устойчивости к заболеванию (An and Winkler 2010).

Так, например, известно, что помимо рецептора CD4, необходимого для проникновения ВИЧ в клетку, активность и специфичность вирусиндуцированной фузии определяется наличием корецепторов, относящихся к семейству 7TM рецепторов хемокинов (G-белок-связывающие рецепторы) (Moore, Trkola et al. 1997, Bushman, Fujiwara et al 1990, Capon, Ward et al. 1991, Fauci 1988). Суперсемейство хемокинов состоит из набора белков (около 50), разделяемых по структуре на три класса: С, СС и CXC, в соответствии с различиями в общем цистеиновом мотиве. Хемокины являются медиаторами, обуславливающими хемотаксическую активность клеток (Zlotnik and Yoshie 2000). Структурные особенности молекул различных классов суперсемейства коррелируют с отличиями в их биологической активности. Так CXC хемокины являются хемоаттрактантами для нейтрофилов, класс СС хемокинов для моноцитов, лимфоцитов, базофилов и эозинофилов, а C для предшественников Т-клеток. Указанным классам хемокинов соответствуют группы рецепторов. На основе способности связывать различные хемокины, хемокиновые рецепторы делятся на связывающие С, СС, СХС или связывающие разные классы хемокинов одновременно (Moser and Loetscher 2001). Ключевая роль в формировании естественной устойчивости к ВИЧ-инфекции/СПИД принадлежит рецепторам CCR5 и CXCR4, определяющим помимо прочего тропизм изолятов ВИЧ-1 (рис. 3). (Bleul, Wu et al. 1997).

Одним из наиболее изученных генетических факторов устойчивости к ВИЧ является генетический маркер CCR5delta32. Он расположен в гене CCR5 и приводит к исчезновению рецептора с поверхности клетки, что делает невозможным проникновение вируса в клетку и значительно уменьшает риск заражения ВИЧ (Smith, Dean et al. 1997, Mitchell, Walley et al.

2000, Апрятин, Николаева и др. 2001, Галлеева, Хуснутдинова и др. 1998).

Однонуклеотидные полиморфизмы в генах других хемокиновых рецепторов так же могут оказывать влияние на устойчивость к заболеванию.

Показано, что замена валина на изолейцин в первом трансмембранном домене рецептора - CCR2 (полиморфизм CCR2-64I) продлевает период между инфицированием и развитием симптомов СПИД (Smith, Dean et al.

1997).

Еще одним фактором, влияющим на устойчивость к ВИЧ, служит маркер в гене, кодирующем хемокин SDF1 (лиганд для рецептора CXCR4). У ВИЧ-инфицированных, несущих этот маркер, позже проявляются симптомы СПИД (Winkler, Modi et al. 1998).

Рис. 3. В процесс проникновения ВИЧ в клетку вовлечены рецепторы CD4 и (лиганда рецептора CXCR4) приводит к уменьшению числа «свободных»

рецепторов и делает их недоступными для вируса. В свою очередь делеция в инфицирование клетки (Farnet and Haseltine 1990, Fauci 1996).

Наконец в Fellay с соавторами с помощью полногеномных подходов (GWAS – Genome-Wide Association Study) удалось установить роль полиморфизмов rs9264942 (локус HLA-C) и rs2395029 (ген HCP5), с динамикой развития ВИЧ-инфекции. По данным авторов оба варианта достоверно ассоциированы с пониженной вирусной нагрузкой у ВИЧинфицированных лиц. Кроме того была установлена ассоциация семи SNP (rs9261174, rs3869068, rs2074480, rs7758512, rs9261129, rs2301753, rs2074479), расположенных в области генов RNF39 и ZNRD1 с прогрессией заболевания (Fellay, Shianna et al. 2007). Интересно, что полиморфизм rs2395029 находится в неравновесии по сцеплению с вышеуказанным гиперчувствительности на препарат Абакавир – наиболее распространенный препарат, входящий в состав антиретровирусной терапии. Полиморфизм был идентифицирован у всех носителей аллеля HLA*B57:01 (N=98) и у 999 из 1005 HLA*B57:01-негативных представителей европеоидной популяции (Colombo, Rauch et al. 2008).

1.3.3 Популяционный подход к изучению ВИЧ-инфекции/СПИД Однако при использовании данных полногеномных ассоциативных исследований следует учитывать несколько важных ограничений. Так, например, генетическая гетерогенность (слабая привязанность генетических маркеров к заболеванию) и возможность существования редких вариантов, являющихся истинной причиной развития заболевания (функциональные мутации), может значительно повлиять на результаты исследований с Функциональная мутация может существовать на независимом генетическом фоне в отрыве от распространенных маркеров или может быть связана с ними по-разному в различных популяциях. Причиной этому служит межпопуляционная вариабельность организации генома, связанная с историей развития популяции, дрейфом генов и частотой рекомбинации (Campbell and Tishkoff 2008, Hamblin, Buckler et al. 2011, Novembre and Ramachandran 2011).

фенотипов и генотипов (этническая гетерогенность) также могут приводить к некорректным результатам (McClellan and King 2010). Вместе эти факторы формируют специфическую для данной популяции генетическую структуру.

Таким образом, одним из основных вопросов, требующих прояснения является применимость существующих генетических карт к широкому спектру популяций (Sim, Rebecca et al. 2011, Prasad, Kumar et al. 2012).

Установление генетических маркеров связанных с повышенной устойчивостью к инфекции позволит разобраться в самых базовых механизмах взаимодействия патогена и клетки, а также сформировать новые подходы к лечению, как в плане разработки новых препаратов, так и в плане создания геноинженерных конструкций, регулирующих основные этапы жизненного цикла патогена и защитной реакции организма. Кроме того, генетическая устойчивость к инфекции может быть уникальным эволюционным механизмом, призванным ограничивать распространение заболевания в пределах популяции.

В соответствии с распространенной на сегодняшний день точкой зрения, массовые эпидемии являются мощным инструментом естественного отбора, позволяющим за короткое время повысить частоту определенного признака. Так, например, эпидемия бубонной чумы (Yersinia pestis), которая привела к колоссальным человеческим потерям в середине прошлого тысячелетия, могла стать важным фактором в распространении на территории Европы генетического маркера CCR5delta32, связанного с устойчивостью к ВИЧ-инфекции (Dean, Carrington et al. 1996, Samson, Libert et al. 1996, Blanpain, Libert et al. 2002). Однако для подтверждения этой гипотезы требуются дополнительные данные (Elvin, Williamson et al. 2004, Hummel, Schmidt et al. 2005).

Географическое распределение штаммов ВИЧ, их неслучайное распространение в пределах различных этнических групп, а также необычная «не классическая» динамика распространения инфекции давно ставит в тупик многих исследователей. А между тем, как наблюдаемый спад заболеваемости в некоторых популяциях, так и специфические особенности встречаемости штаммов ВИЧ по крайней мере отчасти могут быть обусловлены фактором естественной генетически обусловленной устойчивости к ВИЧ-инфекции по аналогии с другими вирусными инфекциями (Bieniasz 2004, Rumyantsev 2006).

1.3.4 Фармакогенетика противовирусных средств Наконец еще одним важным аспектом комплексного подхода к лекарственные препараты, применяемые при терапии ВИЧ/СПИД. Наиболее гиперчувствительность ВИЧ-инфицированных пациентов на Абакавир (Mallal, Nolan et al. 2002). В 1998 году препарат был одобрен FDA. Однако при использовании Абакавира были выявлены многочисленные побочные эффекты. Наиболее тяжелым из них стала реакция гиперчувствительности, проявляющаяся в зависимости от расовой принадлежности у 5-10% пациентов. На фоне повторного приема у сенсибилизированных после гиперчувствительности, в ряде случаев приведшая к летальному исходу (Escaut, Liotier et al. 1999).

Значительные средства, потраченные фармацевтическими компаниями на разработку препарата, а также судебные иски вынудили производителей провести исследование по поиску генетических маркеров чувствительности к препарату. В ходе исследования несколькими группами независимо был установлен маркер HLA B*57:01 связанный с острой реакцией на Абакавир (Martin, Nolan et al. 2004, Mallal, Phillips et al. 2008). В 2008 году FDA выпустило рекомендации по проведению генетического анализа на наличие аллеля HLA B*57:01 перед назначением препарата (www.fda.gov). На сегодняшний день генетический тест доступен во всех западноевропейских странах и в США.

Изучение реакции организма на препараты, входящие в состав антиретровирусной терапии, а также выяснение генетических основ этой реакции может не только предотвратить развитие нежелательных последствий, вызванных приемом препаратов, но и значительно повысить эффективность лечения ВИЧ-инфицированных.

Один интересный случай, связанный с успешным применением препаратов АРТ для лечения ВИЧ-инфекции датирован мартом 2013 года. У двухлетнего ребенка, инфицированного ВИЧ перинатально, и с рождения проходящего курс антиретровирусной терапии (зидовудин, ламивудин, невирапин), после 18 месяцев лечения было диагностировано понижение показателя вирусной нагрузки до недетектируемого уровня (излечение) (Persaud 2013). По мнению руководителя исследования доктора Ровены Джонстон (Rowena Johnston) секрет успеха терапии в данном случае кроется в неустановленных на сегодняшний день особенностях иммунитета новорожденных детей. Этот случай с девочкой из штата Миссисипи, а также описанный выше случай излечения «берлинского пациента» подчеркивают важность дальнейшего изучения механизмов иммунного ответа и основ их генетического контроля.

Таким образом, установление генетических вариантов, связанных с предрасположенностью к ВИЧ-инфекции на индивидуальном и популяционном уровне является важной задачей современной медицинской генетики. Реализация этого перспективного подхода позволит отойти от дорогостоящих и малоэффективных мер по борьбе с инфекцией и поспособствует формированию нового взгляда на проблему ВИЧ/СПИД.

Дальнейшие исследования генетически обусловленной естественной устойчивости к ВИЧ/СПИД помогут разобраться в самых базовых механизмах патогенеза ВИЧ и реакции организма на инфекцию, объяснят многие вопросы и вероятно откроют новые пути к созданию эффективных методов лечения ВИЧ-инфекции.

1.4 ГЕНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТРОЛЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

С расширением знаний о наследуемости заболеваний значительный прогресс достигнут и в области установления генетических основ канцерогенеза. Ранние исследования генетической природы рака, основанные высокопенетрантных мутаций, обуславливающих практически стопроцентную вероятность развития заболевания у их носителей. Эти мутации испытывают на себе действие естественного отбора и, в связи с этим, характеризуются весьма низкой распространенностью в популяции.

Однако помимо тяжелых наследственных форм рака существует доля патологий, развитие которых обусловлено сочетанным действием генов и факторов окружающей среды, в том числе физической и химической природы. Учитывая то, что такие формы рака часто проявляются на поздних стадиях онтогенеза, генетическая предрасположенность к ним формируется на фоне слабого влияния отбора и наследуется набором весьма частотных генетических маркеров.

Таким образом, онкологические заболевания обусловлены как высокопенетрантными мутациями, так и большим числом генетических полиморфизмов, оказывающих незначительный эффект на риск развития заболевания (Pharoah, Dunning et al. 2004, Di Bernardo, Broderick et al. 2013).

онкоперерожденных клеток, а также воспалительных реакций, как триггеров можно предположить, что гены иммунного ответа играют решающую роль в механизме канцерогенеза (Karin and Greten 2005, Garrido, Cabrera et al. 2010, Бережная 2009).

1.4.1 Иммунологический контроль опухолеобразования Теория иммунологического контроля опухолеобразования описывает как минимум три супрессорных пути, препятствующих развитию опухоли или позволяющих компетентным клеткам своевременно реагировать на возникновение онкоперерожденных клеток. Первый обусловлен зависимостью клеток от специфических сигналов, способных подавлять запуск программы гибели клетки (так например стабилизация внеклеточного матрикса препятствует его разрушению, вызывающему гибель клетки) (Lowe, Cepero et al. 2004).

Второй путь основан на механизмах регуляции полярности делящихся клеток и контроле процессов клеточного взаимодействия и пролиферации.

Запуск данного защитного механизма приводит к остановке клеточного цикла в случае нарушения целостности генетического аппарата клетки (Lee, Cekanova et al. 2008).

трансформации онкоперерожденных клеток посредством клеток иммунной системы (Dunn, Bruce et al. 2002).

Иммунная система защищает организм от опухолей, ассоциированных с вирусными инфекциями, элиминирует антигены, вызывающие воспаление и способна специфически распознавать и элиминировать клетки экспрессирующие опухолевые антигены. В последнем случае принято говорить об осуществлении иммунологического надзора за опухолевыми клетками, избежавшими действия других супрессорных механизмов.

Инструментарий иммунных клеток, осуществляющих иммунологический надзор за опухолями достаточно широк. Они способны к многообразным взаимодействиям с рецепторами митохондрий и компонентами пути, ответственного за запуск апоптоза и, таким образом, обладают к возможностью к выборочному уничтожению онкоперерожденных клеток (Smith, Berrieman et al. 2006).

1.4.2 Современная теория иммунологического надзора за опухолями За последнее столетие концепция иммунологического надзора за опухолями несколько раз претерпевала серьезные изменения. В конце 90-х годов прошлого столетия интерес к данному вопросу практически угас.

Однако с появлением новых данных о более интенсивном росте опухолей, пересаженных экспериментальным животным, обработанным антителами к интерферону гамма (IFNG), а также о большей чувствительности мышей с подавленной функцией IFNG к формированию метилхолантрен (MCA)ассоциированных сарком, интерес к проблеме иммунологического надзора за опухолями вновь возрос. С тех пор регулирующая роль иммунной системы в процессе роста большинства типов первичных и трансплантированных опухолей неоднократно подтверждалась (Nishikawa, Jager et al. 2005, Bui, Uppaluri et al. 2006, Wakita, Chamoto et al. 2009). Важным этапом в развитии представлений о роли иммунной системы в защите организма от опухолей стало открытие влияния иммунных клеток не только на размер опухоли, но и на ее тип. Так опухоли от иммунодефицитных мышей с подавленной функцией IFNG или гена RAG2, регулирующего процесс рекомбинации, способны вызывать иммунный ответ у наивных мышей дикого типа, в то время как MCA-индуцированные опухоли иммунокомпетентных мышей демонстрируют стабильный рост (Dunn, Bruce et al. 2005). Таким образом, опухоли, сформировавшиеся в условиях иммунной системы с ограниченной функциональностью, более иммуногены по сравнению с опухолями, сформировавшимся у животных с интактной иммунной системой. Эти данные несколько модифицировали теорию иммунологического надзора и в современной интерпретации она построена как на представлениях о протективном действии иммунной системы в отношении опухолей, так и на регулирующей роли иммунитета в изменении их свойств.

Современная теория изучает три этапа взаимодействия иммунной системы с опухолью: фазу элиминации, фазу равновесия и фазу потери иммунлогического контроля над опухолеобразованием (Dunn, Old et al. 2004, Swann and Smyth 2007, Grivennikov, Greten et al. 2010).

В фазе элиминации молекулы и клетки врожденного и приобретенного иммунитета работают в тесной связке с целью установления и уничтожения опухоли еще до проявления клинических симптомов. Однако некоторые типы опухолевых клеток способны уходить от действия иммунной системы.

Эти клетки преходят в следующую фазу, на которой иммунная система способна контролировать их рост – фазу равновесия. Считается что опухолевые клетки, перешедшие в фазу равновесия, не способны проявлять патогенных свойств и остаются безопасными на протяжении всей жизни организма. Реализация третей фазы возможна в случае трансформации опухолевых клеток (в том числе под воздействием иммунной системы) или в случае изменения функциональных свойств иммунной системы, вызванного старением или нарушением баланса защитных механизмов. Именно эта фаза проявляется клинически, поэтому поиск причин, лежащих в ее основе, является приорететной задачей современной науки и медицины.

1.5 РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА В ОТВЕТЕ НА

РАДИАЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

Молекулярно-генетические механизмы канцерогенеза требуют дальнейшего изучения. Чрезвычайно интересным с фундаментальной и важным с практической точки зрения является поиск путей развития злокачественных образований, ассоциированных с радиационным воздействием. Особенно перспективным данное направление выглядит в свете убедительных доказательств различия реакции тканей и клеток разного генотипа на радиационное воздействие одной и той же силы (Bentzen and Overgaard 1994, Zimmermann, Kumpf et al. 1998, Andreassen, Alsner et al.

2002). Однако следует отметить, что специфика заболевания - зависимость от факторов окружающей среды, отсроченное развитие и неспецифичность клинических симптомов, накладывают определенные ограничения на подобные исследования.

До 1945 года, когда было изготовлено и применено атомное оружие, случаи наблюдения эффектов радиационного воздействия носили эпизодический характер. Первыми повреждающее действие радиации испытали на себе медики и исследователями радиобиологи (Вильгельм Конрад Рентген, открывший Х-лучи, Анри Беккерель – первооткрыватель естественной радиоактивности урана, семья Складовских-Кюри, открывших радиоактивные свойства полония и радия) (Lederman 1981, Reed 2011).

Предположения об общем негативном влиянии радиации подтверждались в ряде работ, описывающих клинические проявления у пациентов принимавших весьма широко используемые в 30 годы препараты радия для лечения онкологических заболеваний кожи, губ, ротовой полости и других легкодоступных для применения радия мест, а также ряда других заболеваний воспалительного и даже инфекционного характера (Mould 1993).