Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Тверская государственная медицинская академия

Министерства здравоохранения

Российской Федерации

На правах рукописи

Беляева Екатерина Андреевна

Микробиота кишечника коренного жителя Центрального

федерального округа РФ как основа для создания региональных пробиотических препаратов 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Ю.В. Червинец Тверь,

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………….. 1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта здоровых людей……………. 1.2. Дисбиоз…………………………………………………………………………. 1.3. Пути коррекции дисбиоза. Пробиотики……………………………………… 1.4. Лактобациллы как пробиотики…………

1.5. Бифидобактерии как пробиотики……………………………………………... 1.6. Изучение антагонистической активности лактобацилл, бифидобактерий…. 1.7. Адгезивные свойства лактобацилл и бифидобактерий………………………. 1.8. Современные подходы в поиске новых пробиотиков………………............... ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………... 2.1. Выделение и идентификация представителей микробиоценоза кишечника здоровых людей………………………………………………………... 2.2. Отбор антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий………………………………...…..……….... 2.3. Биохимическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий…………………….………........... 2.4. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий…………………………………..... 2.5. Характеристика пробиотического потенциала лактобацилл и бифидобактерий…………………………………………………………………….. 2.6. Адгезивная активность лактобацилл и бифидобактерий………….………... 2.7. Симбиоз лактобацилл и бифидобактерий ………….…..…………….…........ ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………….……………………………………………............. Выводы………………………………………………………………………………. Практические рекомендации……………………………………………………….. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………... ПРИЛОЖЕНИЕ…………………………………………………………………….

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Микробиота кишечника человека представлена более 1014 микроорганизмов, активно участвующих в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса). Последние научные данные указывают на специфичность в составе кишечной микрофлоры, как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения (наличие различных энтеротипов). Огромное число микроорганизмов, составляющих микробиоту кишечника, пока не позволяет провести ее полный анализ; существуют различные подходы, позволяющие охарактеризовать отдельные элементы микробиоты. Предлагаемый в данной работе анализ видового и штаммового разнообразия микроорганизмов рода Lactobacillus и Bifidobacterium из кишечной микробиоты здоровых жителей одного конкретного региона России (Центрального федерального округа) позволит разработать новые подходы и оценить региональную специфичность состава этого компонента микробиоты. Эти данные могут быть в дальнейшем использованы для разработки научной основы создания пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины.

Симбиотическая микрофлора людей, проживающих в регионах, различающихся климатическими условиями, бытовыми традициями населения, рационами питания, не является абсолютно одинаковой, поскольку биоценозы имеют выраженный индивидуальный характер и заметно отличаются даже у индивидуумов одного региона. Еще более значительные различия отмечаются в микробной экологии окружающей среды, особенности которой в значительной степени отражаются на составе транзиторного компонента эндогенных микробных систем населения. Поэтому следует принимать во внимание тесную взаимосвязь между индигенной микрофлорой человека и экзогенным микробным миром, поскольку собственная микробиота человека является частицей биосферного микробного звена, а одной из очень важных функций эндогенной микроэкологической системы является поддержание гармоничных, мирных взаимоотношений человека с микробным сообществом окружающей среды. Между аутофлорой людей и экзогенным микробным миром региона, в котором они проживают, эволюционно сформировались определенные компромиссные отношения, которые в нормофизиологических условиях позволяют предупредить агрессивное воздействие на организм человека экзогенных потенциальных патогенов [65].

Адаптация организма человека к экзогенному микробному миру региона прослеживается в онтогенезе. Уже в период новорожденности начинает активно развиваться эффективный иммунный ответ организма человека относительно экзогенной микрофлоры, специфической для конкретного региона. Поэтому наиболее высокую эффективность обычно проявляют пробиотики, основу которых составляют «местные» штаммы микроорганизмов.

Повышенное внимание к пробиотическим препаратам в настоящее время вызвано ростом контингента лиц, имеющих микроэкологические нарушения и требующих коррекции собственной микрофлоры [3]. Наиболее эффективными и физиологичными средствами коррекционного воздействия на микрофлору при дисбактериозах являются микробные биопрепараты с живыми культурами лактобацилл и бифидобактерий. Создание и широкое внедрение в медицину высококачественных пробиотиков на основе региональных биовариантов физиологической микрофлоры является в настоящее время актуальной и важной задачей [68].

Глобальные национальные и международные проекты сегодня активно занимаются изучением нормального микробиоценоза и его изменений при различных заболеваниях. Микробиота человека изучается в рамках программы Human Microbiome Project (http://nihroadmap.nih.gov/hmp/), где определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. По проекту «Русский метагеном» осуществлено глубокое секвенирование свыше 150 образцов ДНК, выделенных из кала здоровых людей, проживающих на территории Российской Федерации. В географию выборки входили города из различных федеральных округов – Центрального (Москва, Ростов), СевероЗападного (Санкт-Петербург), Приволжского (Казань, Самара, Саратов), Западной Сибири (Омск, Новосибирск). В рамках проекта были выявлены территориальные различия микробиоты у людей, проживающих в Российской Федерации, но был показан общий схожий метаболизм.

В 2003 году региональная оценка микробиоты кишечника проводилась у населения Западной Сибири. Было установлено, что характер дисбиотических нарушений зависит от уровня загрязненности атмосферного воздуха. Распространенность дисбактериоза у жителей Западной Сибири составила 762±0,05 случаев на 1000 населения [35].

История создания пробиотических препаратов в России связана с именем Г.И. Гончаровой, которая в 1966 году впервые разработала технологию изготовления «Бифидумбактерина сухого». Среди бифидофлоры у детей и взрослых был отобран целый ряд штаммов, перспективных как по технологическим, так и медико-биологическим характеристикам.

В настоящее время современные пробиотики получены в Германии, Бельгии, Дании. В России широкое применение находят отечественные пробиотики IV поколения, представляя собой живые B.bifidum1 (Бифидумбактерин форте, Пробифор) либо B.bifidum1+L.plantarum8RA-3 (Флорин форте), сорбированные (иммобилизованные на частицах измельченного активированного угля). В связи с тем, что эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав, большое внимание уделяется созданию поликомпонентных пробиотиков [3, 4].

Ни один из имеющихся отечественных или импортных лекарственных пробиотических препаратов не создан на основе микроорганизмов, отвечающих этнорегиональным критериям, а наиболее эффективным стало бы использование штаммов, которые могут адаптироваться к конкретному организму. Поэтому создание пробиотических препаратов, основанных на принципах персонализированной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны, является инновационным направлением по улучшению здоровья населения.

Цель исследования:

Охарактеризовать микробиоту кишечника коренных жителей Центрального федерального округа Российской Федерации и селекционировать новые штаммы лактобацилл и бифидобактерий для создания региональных пробиотических препаратов.

Задачи исследования:

1. Выделить и идентифицировать микрофлору кишечника от здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, проживающих на территории Центрального федерального округа Российской Федерации.

2. Селекционировать лактобациллы и бифидобактерии, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам людей, проживающих на территории Центрального федерального округа Российской Федерации, для создания новых пробиотиков.

3. Провести генетическую идентификацию антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.

4. Определить адаптационный и пробиотический потенциал антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.

5. Определить симбиотические взаимоотношения антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.

Впервые охарактеризована микробиота кишечника клинически здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, коренных жителей Центрального федерального округа РФ, проживающих в Тверской, Ярославской, Московской, Костромской и др. областях ЦФО в третьем поколении; были выявлены нарушения микроэкологии кишечника у 75% здоровых людей.

Впервые определена ведущая роль представителей рода Bacillus в дисбиотических нарушениях кишечника у клинически здоровых людей, данный микроорганизм преобладал среди условно-патогенной микрофлоры.

Из кишечника здоровых людей с нормобиоценозом, коренных жителей бифидобактерий, обладающие высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антимикробным препаратам, широким спектром пробиотического и адаптационного потенциала.

Характеристика микроорганизмов родов Lactobacillus и Bifidobacterium как потенциальных пробиотических штаммов из кишечной микробиоты здоровых жителей конкретного округа России позволит разработать новые подходы и установить региональную специфичность микробиоты для создания адаптированных к этно-географической группе пробиотиков.

Выделено и охарактеризовано 6 штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий, которые проявили наиболее выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной и грибковой микрофлоре ЖКТ. Селекционированные штаммы являются перспективными для создания новых пробиотических препаратов.

Данные исследования могут быть в дальнейшем использованы для разработки научной основы создания региональных пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны.

Материалом для исследования служили фекалии 156 здоровых студентовдобровольцев медицинской академии в возрасте от 18 до 21 года (120 девушек и 36 юношей), коренных жителей, проживающих в третьем поколении в Тверской, Ярославской, Московской, Костромской, Брянской, Тульской, Воронежской, Калужской, Тамбовской, Смоленской и Владимирской областях ЦФО. У всех студентов материал брали в зимний период. На момент обследования никаких жалоб на нарушение функций пищеварительного тракта добровольцы не предъявляли.

Исследования проводились с разрешения этического комитета Тверской государственной медицинской академии. У всех лиц получено информированное согласие на сбор материала. Проводилось анкетирование (Приложение), включающее в себя данные об отсутствии хронических заболеваний ЖКТ, острых кишечных инфекций за полгода до взятия материала, наличии аппендикса (с удаленным аппендиксом труднее восстанавливать микрофлору кишечника после инфекционного заболевания), смешанном питании, переносимости лактозы (т.к.

непереносимость лактозы характеризуется избыточным ростом и усилением жизнедеятельности микрофлоры кишечника, усваивающей лактозу). В течение семи дней студенты не должны были принимать антимикробные препараты.

Таким образом, критериями включения студентов в исследование являлись отсутствие хронических заболеваний ЖКТ, острых кишечных инфекций за полгода до взятия материала, наличие аппендикса, смешанное питание, переносимость лактозы и проживание каждого в третьем поколении в одной из областей ЦФО.

Выделение микроорганизмов Подготовка фекалий для исследования проводилась следующим образом:

1 г фекалий вносили в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (0,9% р-ра NaCl) и тщательно суспендировали путем встряхивания в шуттельаппарате в течение 20-30 мин. Затем отстаивали и через 1 час из надосадочной жидкости делали разведения с изотоническим раствором хлорида натрия с 10 2 до 1011. Из разведений делали посев на питательные среды с последующей инкубацией.

Для комплексного изучения аэробной и анаэробной микрофлоры посевы производили на отечественные и импортные питательные среды, включающие:

желточно-солевой агар (г. Оболенск), МакКонки агар (BBL®), Колумбиа агар (BBL®, Himedia), Эритрит агар (ФГУП НПО «Микроген», Москва), Sabouraud Dextrose Agar (BBL®), MRS Agar (BBL®), Schaedler Agar (BBL®) с кровью, Mulагар (BBL®). Посевы культивировали в аэробных, ler-Hinton II микроаэрофильных и анаэробных условиях с использованием микроанаэростатов (BBL) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBL) в течение 24-72 часов при температуре 37о С.

Из изолированных колоний, выросших на соответствующих питательных средах, готовили мазки и окрашивали по методу Грама. Морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов изучали, пользуясь программноаппаратным комплексом Диаморф Цито (увеличение 1:1000 с использованием бинокулярного микроскопа «Биолам»). Количество бактерий определяли путм подсчта колониеобразующих единиц на 1 г фекалий (lg КОЕ/г).

Биохимическая активность определялась с помощью тест систем api® (bio Mrieux) и программного обеспечения API WEB на базе бактериологической лаборатории кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России.

Методы идентификации выделенных микроорганизмов Биохимическая идентификация микроорганизмов А) Идентификация микроорганизмов рода Lactobacillus, Bacillus Грамположительные палочки, располагающиеся одиночно, или небольшими скоплениями, выросшие на MRS среде и кровяном МПА в микроаэрофильных и аэробных условиях, определяли, используя тест-систему api® 50 CH (bioMrieux Vitek, Inc.). Исследовали ферментацию микроорганизмами глицерина, эритрита, D-арабинозы, L-арабинозы, D-рибозы, D-ксилозы, L-ксилозы, D-адонитола, метил-D-ксилопиранозида, D- галактозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-маннозы, Lсорбозы, L-рамнозы, D-маннитола, D-сорбитола, метил-D-маннопиранозида, метил-D-гликопиранозида, N-ацетилглюкозамина, амигдалина, арбутина, Dцелобиозы, D-мальтозы, D-лактозы, D-мелибиозы, D-сахарозы, D-трегалозы, гентиобиозы, D-туранозы, D-ликсозы, D-тагатозы, D-фукозы, L-фукозы, Dарабитола, глюконата калия, 2-кетоглюконата калия, 5L-арабитола, кетоглюконата калия; продукцию дульцита, инозита, а также гидролиз эскулина салицина. Из исследуемой микробной культуры готовили взвесь в среде api ® CH Medium плотностью не менее 3 единиц по стандарту McFarland. Полученную взвесь вносили по 150 мкл в ячейки тест-системы. Тест-систему api® 50 CH помещали во влажную камеру и инкубировали при 37С 24 часа в анаэробных условиях.

Б) Идентификация микроорганизмов рода Clostridium, Bifidobacterium, Actinomyces, Bacteroides, Peptostreptococcus, Leptotrichia грамположительные кокки, грамотрицательные палочки и кокки, выросшие на средах Schaedler-agar в анаэробных условиях, определяли, используя тест-систему api® 20 A (bioMrieux Vitek, Inc.). Исследовали ферментацию микроорганизмами глюкозы, маннита, лактозы, сахарозы, мальтозы, салицина, ксилозы, арабинозы, глицерола, целлобиозы, маннозы, мелецитозы, раффинозы, сорбита, рамнозы, трегалозы; продукцию индола (IND), уреазы, а также гидролиз желатина (GEL) и эскулина (ESC). Из исследуемой микробной культуры готовили взвесь в среде api® 20 A Medium плотностью не менее 3 единиц по стандарту McFarland.

Полученную взвесь вносили следующим образом: 250 мкл – в ячейку GEL, по мкл в остальные ячейки тест-системы, кроме того в ячейку IND наслаивали стерильное вазелиновое масло. Тест-систему api® 20 A помещали во влажную камеру и инкубировали при 37С 24 часа в анаэробных условиях. Затем для определения продукции индола в ячейку IND вносили одну каплю ксилола, перемешивали и добавляли одну каплю реактива Эрлиха (рдиметиламидобензальдегид 8,75 г, этанол 825 мл, 37% хлористоводородная кислота 175 мл). В положительном случае через 5 минут наблюдали изменение цвета содержимого ячейки с желтого на красный. Для учета результатов ферментации углеводов в ячейки вносили по одной капле 0,02 % водного раствора бромкрезолпурпура, в положительных случаях индикатор изменял цвет на желтый или желто-зеленый. Наличие -гликозидазы (гидролиз эскулина) дополнительно изучали по отсутствию флюоресценции ячейки ESC при ее ультрафиолетовом облучении с длиной волны 365 нм.

В) Идентификация микроорганизмов рода Candida, а также семейства Enterobacteriaceae Грам- и оксидазоотрицательные палочки (энтеробактерии) изучали с помощью тест-системы BBLEnterotube II (Becton Dickinson GmbH) на предмет ферментации глюкозы, лизина, орнитина, адонитола, лактозы, арабинозы, сорбитола, дульцитола, мочевины, цитрата, а также продукции сероводорода, индола, ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра) и дезаминирования фенилаланина.

Грамположительные крупные овальные, округлые микроорганизмы, образующие псевдомицелий (кандиды, криптококки), идентифицировали с применением тестBBLMycotube ферментации декстрозы, ксилозы, сахарозы, раффинозы, лактозы, трегалозы, цитрата и мочевины.

Инкубацию тест-систем проводили при 37С: BBLEnterotube II 24 часа, BBLMycotube - 48-72 часа. Для изучения продукции индола в отверстие в пленке, покрывающей ячейку H2S/Indol (BBLEnterotube II), вносили три – четыре капли реактива Ковача, через несколько секунд при положительной реакции наблюдали покраснение реактива. Для проведения реакции ФогесПроскауэра в ячейку Voges-Proskauer вносили три капли 6%-го спиртового раствора -нафтола и две капли 40%-ого водного раствора гидроокиси калия, спустя 10 минут в положительных случаях отмечали изменение цвета реагентов на красный.

Г) Идентификация микроорганизмов рода Enterococcus Грамположительные каталазоотрицательные кокки, расположенные преимущественно цепочками или парами исследовали по биохимическим свойствам, используя тест-систему api 20 STREP (bioMrieux Vitek, Inc.), по ферментации рибозы (RIB), L-арабинозы (ARA), маннита (MAN), сорбита (SOR), лактозы (LAC), трегалозы (TRE), инулина (INU), раффинозы (RAF), крахмала (AMD), гликогена (GLYG), гиппурата (HYP); по наличию -гликозидазы (ESC), пирролидонилариламидазы (PYRA), - и -галактозидаз (-, -GAL), глюкуронидазы (-GUR), щелочной фосфатазы (PAL), лейцинариламидазы (LAP), аргининдигидролазы (ADH); по продукции ацетоина (VP).

Чистую исследуемую культуру микроорганизмов субкультивировали на агаре Колумбия, содержащем 5 % взвеси бараньих эритроцитов при 37С в течение 24 часов в анаэробных условиях. Определяли реакцию на каталазу.

В случае отрицательной каталазной активности из полученной биомассы готовили взвесь микробных клеток плотностью не менее 4 единиц по оптическому стандарту мутности McFarland в 2 мл стерильной дистиллированной воды. В первые десять ячеек тест-системы вносили по 150 мкл микробной взвеси.

Оставшиеся 0,5 мл взвеси бактерий смешивали с содержимым ампулы GP Medium. Получившуюся взвесь по 150 мкл вносили в следующие десять ячеек тестсистемы и наслаивали в них стерильное вазелиновое масло. Тест-систему api STREP помещали в инкубационную камеру, в которую для создания влажной камеры наливали 5 мл дистиллированной воды. Культивирование проводили четыре часа при 37С.

Затем в ячейку VP вносили по одной капле 6%-го спиртового раствора нафтола и 40%-ого водного раствора гидроокиси калия, в ячейку HYP – две капли 7% раствора нингидрина в 2-метоксиэтаноле, в ячейки PYRA, -, -GAL, GUR, PAL, LAP - по одной капле препаратов ZYM1 (трис-гидроксиметиламинометан 25г, 37% хлористоводородная кислота 11 мл, лаурилсульфат 10 г, дистиллированная вода до 100 мл) и ZYM2 (0,35% раствор Fast blue BB в 2метоксиэтаноле). Результаты указанных реакций учитывали через 10 минут.

Инкубацию тест-системы api 20 STREP продолжали еще 20 часов, после чего согласно интерпретационной таблице учитывали результаты ферментации RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD,GLYG, ADH указанных тестов определяли гемолитическую активность бактерий.

Д) Идентификация микроорганизмов рода Staphylococcus Грамположительные кокки, расположенные гроздьями, выросшие на ЖСА в аэробных условиях определяли, используя тест-систему api® Staph (bioMrieux Vitek, Inc.). Исследовали ферментацию микроорганизмами глюкозы, фруктозы, маннозы, мальтозы, лактозы, трегалозы, маннитола, ксилитола, мелибиозы, нитрата калия, нафтил фосфата, пирувата натрия, раффинозы, ксилозы, сахарозы, метил-гликопиранозида, ацетилглюкозамина, аргинина; а также продукцию уреазы. Из исследуемой микробной культуры готовили взвесь в среде api ® Staph Medium плотностью не менее 3 единиц по стандарту McFarland. Полученную взвесь вносили следующим образом: по 150 мкл в ячейки тест-системы, кроме того в ячейку с аргинином и уреазой наслаивали стерильное вазелиновое масло.

Тест-систему api® 20 A помещали во влажную камеру и инкубировали при 37С 24 часа в аэробных условиях. Затем в ячейку с нитратом калия, нафтилом фосфата, пируватом натрия вносили соответствующие реактивы и ждали 10 мин.

Результаты всех реакций обозначали цифровыми кодами согласно инструкции. Микроорганизмы идентифицировали соответственно цифровому профилю, используя программу Api WEB для ПК.

А) Схема выделения и идентификации аэробных бактерий Сбор транспортировка и подготовка материала Макроскопическое и микроскопическое изучение колоний, отсев для получения чистой культуры бактерий Enterotube II, Mycotube (BBL), API 20 Staph; API 20 Strept, API Б) Схема выделения и идентификации анаэробных бактерий Сбор, транспортировка и подготовка материала Инкубация в условиях анаэробиоза с использованием Gas Pak Plus (BBL) изучение колоний, отсев принадлежности (Schaedler Agar +кровь) (Schaedler Agar +кровь) Инкубация в условиях анаэробиоза с использованием Gas Pak Plus (BBL) (в микроанаэростате в атмосфере CO2+H2), 48 часов, при 37OC. Инкубация в Генетическая идентификация чистой культуры лактобацилл и А) Генетическую идентификацию лактобацилл определяли по стандартному методу с использованием нуклеотидной последовательности гена 16S РНК на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова (г. Москва).

ПЦР, реакционная смесь:

трифосфатов добавляется при работе с хромосомной ДНК 5.Taq-полимераза 5 ед/мкл 6. ДНК 8. Праймеры – прямой (F) и обратный(R) 5 пкмоль каждого 20 пкмоль 8 мкл из 25 мкл смешивается с краской и наносится на форез.

Для подбора нужной концентрации MgCl2 делали реакционную смесь в объеме 100 мкл, разливали на 4 пробирки по 25 мкл и добавляли в них 0,5мкл -1, мкл - 1,5 мкл – 2 мкл MgCl2 из р-ра 50 mM. По результатам фореза выбрали нужную концентрацию MgCl2, при которой образуется минимальное число и максимальное количество продуктов полимеразноцепной реакции (ПЦР).

Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР были синтезированы фирмой «Синтол». Реакцию ПЦР ставили в стандартных условиях (94°С– 5 мин.; циклов 94°С 30сек., 54°С 40 сек., 72°С 1 мин.; 72°С - 5 мин). В качестве матрицы для ПЦР использовали 0,5 мкл биомассы штаммов (отцентрифугированной и промытой буфером Т10Е0,1, состоящего из 10мM Трис-HCl и 0.1мM ЭДТА, pH 8.0). Амплификацию проводили в термоциклерах Терцик фирмы ДНКТехнология. Разделение продуктов ПЦР проводили в 1% геле агарозы, использовали трис-боратный буфер.

Электрофорез в агарозном геле в горизонтальной камере:

Камеру для фореза установливали горизонтально с помощью уровня, в камере расположили съемные бортики и гребенку. Зубцы гребенки были на несколько миллиметров выше дна камеры. Был сделан 1% раствор агарозы в 0,5кратном форезном буфере, раствор нагрели в кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, добавили этидиум бромид до концентрации 0,5 мкг/мл ( мкл водного раствора этидиум бромида (10 мг/мл) на 100 мл раствора агарозы).

Чуть остывший раствор агарозы с этидиум бромидом (5-10 мин остывает) выливали в форезную камеру, толщина слоя агарозы была 5-6 мм. Через 30 мин раствор агарозы перешел в гель.

Гребенку и бортики вынули из камеры, налили в форезную камеру форезный буфер так, чтобы он на несколько миллиметров был выше агарозного геля. Подсоединили электроды (ДНК движется от – к +), включили напряжение.

Далее выключили напряжение, нанесли пробы (водные растворы ДНК с буфером для нанесения на гель, объем проб 10-25 мкл). Снова включили напряжение. Для маленькой камеры использовали напряжение 80 V, для большой 120 V.

Длительность разгонки ДНК определялась величиной фрагментов ДНК, обычно 0,5 – 1,5 час.

Гель сфотографировали на хемископе в ультрафиолетовом свете через оранжевый светофильтр.

5-кратный Трис-боратный форезный буфер, на 0,5 л Трис-боратный форезный буфер хранили при комнатной температуре. Рабочий раствор 0,5-кратного буфера держали в холодильнике.

Буфер для нанесения проб на 5мл Бромфеноловый синий 0,25%; добавлять в раствор сахарозы 0,5 мл 2,5% р-ра Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили в НИИ ФХМ ФМБА РФ на приборе 3730xl DNA Analyzer (AppliedBiosystems,USA) с набором реактивов BigDye® Terminator v3. CycleSequencingKit (AppliedBiosystems, USA). Для определения вида по гену 16S РНК использовали стандартные праймеры 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT); ожидаемый размер ПЦР-фрагментов – пн [45, 116].

Анализ нуклеотидной последовательности проводили с помощью алгоритма BLASTn и базы данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Б) Родовое и видовое генетическое типирование бифидобактерий проверялось методом ПЦР на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (г.

Москва) с использованием следующих праймеров:

Родовые праймеры для Bifidobacterium (16S RNA gene-targeted primers) представлены в таблице 1.

g-Bifid-R GGTGTTCTTCCCGATATCTACA Видовые праймеры для рода Bifidobacterium представлены в таблице 2.

Название вида Название Структура олигонуклеотида Ожидаемы

BiADO-2 CGAAGGCTTGCTCCCAGT

BiANG-2 GAAGGCTTGCTCCCCAAC

BiBIF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA

BiBRE-2 ACAAAGTGCCTTGCTCCCT

BiLON-2 GGGAAGCCGTATCTCTACGA

BiINF-2 GGAAACCCCATCTCTGGGAT

BiDEN-2 GAAGGGCTTGCTCCCGA

BiGAL-2 ACATCCCCGAAAGGACGC

subsp. lactis Blact-R AAGGGAAACCGTGTCTCCAC Методика бактериологического исследования кала на дисбактериоз кишечника Сбор материала. Кал для исследования отбирали в стерильную посуду, стеклянную или пластиковую, разрешенную к использованию в специальных микробиологических исследованиях. В стерильную емкость кал отбирался в количестве около 1 г и доставлялся в лабораторию в пределах 2 ч.

Обработка материала. В стерильный, предварительно взвешенный стеклянный сосуд вносили порцию кала и, после повторного взвешивания, определяли массу биоматериала; затем добавляли такое количество стерильного 0,9%-го изотонического раствора хлорида натрия, чтобы получилось исходное разведение 1:10. В процессе приготовления суспензии кал тщательно растирали о стенки лабораторного сосуда для получения равномерной взвеси и встряхивали в штуцеле до образования гомогенной массы.

После отстаивания 1 мл суспензии переносился в следующую пробирку с мл буфера с последующим получением в ней разведения 10-2. Из полученного разведения материала готовили еще шесть разведений, перенося мерной пипеткой по 1 мл разведения в 9 мл изотонического раствора хлорида натрия. Для большей точности анализа в каждой пробирке оставалась пипетка и в дальнейшем с данным разведением соприкасалась только она.

На следующем этапе производился посев на плотные питательные среды по секторам. Из соответствующих разведений на сектор наносился 0,1 мл суспензии.

Для идентификации и подсчета колоний микроорганизмов использовались среды Эндо, кровяной агар, ЖСА, Сабуро, лактоагар.

Второй день исследования. Вынимали из термостата засеянные накануне чашки (кроме лактоагара и анаэростата), подсчитывали количество колоний микроорганизмов, готовили мазки с окраской по Граму и определяли морфологические и тинкториальные свойства. Дальнейшая идентификация проводилась по приведенной выше схеме.

Оценка результатов. При оценке результатов бактериологического исследования фекалий исходили из показателей относительной нормы. Для определения степени дисбактериоза имело значение количество анаэробных микроорганизмов. Из этой группы микроорганизмов обязательно исследовали количество бифидобактерии и лактобактерий, учитывают количество лактозоположительных эшерихий и др.

Степень дисбактериоза определяли, пользуясь ОСТ [47].

Методы изучения пробиотического потенциала лактобацилл и бифидобактерий Определение антагонистической способности лактобацилл и бифидобактерий проводили методом прямого и отсроченного антагонизма.

Первичное исследование антагонизма проводили согласно методике прямого антагонизма, описанной у Л.П.Блинковой [11]. Поверхность плотной питательной среды (лактоагар (MRS) для лактобацилл и Шедлер агар для бифидобактерий) петлей засевали суточную культуру лактобацилл (концентрация 1109 по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича) и бифидобактерий в виде прямой полосы от края до края через центр чашки. Для определения антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий в отношении тестовых культур грамотрицательных, грамположительных микроорганизмов и дрожжевых грибов рода Candida. Свежевыделенные тестовые культуры подсевали штрихами перпендикулярно к исследуемой. Посев тест-штаммов проводили петлей диаметром 1мм в направлении от зоны роста штамма лактобацилл и бифидобактерий, не касаясь ее, и перпендикулярно ей. В качестве тестовых культур был использованы штаммы Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Escherichia coli АТСС 25922.

Результаты учитывали через 24 - 48 часов инкубирования при 37C в термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры. Контролем служил их параллельный посев на чашки с той же средой без испытуемой культуры.

Степень антагонизма определяли по следующим критериям: 10 мм и менее – низкая, 10-20 мм – средняя, 21 мм и более – высокая.

После биохимической и генетической идентификации антагонистическую способность микроорганизмов выявляли методом агаровых слоев или методом отсроченного антагонизма [11]. На поверхность соответствующего для используемого штамма плотного питательного агара наносили бляшками исследуемые штаммы бифидобактерий или лактобактерий и культивировали в термостате 24 часа при температуре 37°С, затем убивали их парами хлороформа и наносили слой питательной полужидкой среды с равномерно распределенной в ней тестовой культурой бактерий и вновь культивировали в термостате 24 часа при 37°С. Положительный результат учитывали по появлению вокруг бляшки зоны отсутствия роста.

В качестве тестовых культур были использованы следующие штаммы: Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534, Escherichia coli АТСС 25922.

Степень антагонизма определяли по следующим критериям: зона отсутствия роста 10 мм и менее – низкая, 10-20 мм – средняя, 21 мм и более – высокая.

Определение ферментов агрессии лактобацилл и бифидобактерий У лактобацилл и бифидобактерий определяли наличие лецитиназной, казеинолитической, уреазной, желатиназной, нуклеазной, каталазной и гемолитической активности.

Для выявления лецитиназной активности исследуемые культуры засевали на желточный агар. Через 18-24 часа инкубации при 37С вокруг продуцирующих лецитиназу колоний наблюдали зоны опалесценции [42].

Продукцию казеиназы изучали модифицированным экспресс-методом, предложенным Е.М. Горской с соавторами.

Метод заключался в изучении казеинолитической активности суточной бульонной культуры лактобацилл и 48-часовой культуры бифидобактерий, которую вносили в лунки с казеиновым агаром по 20 мкл. После 24-48-часовой инкубации в микроаэрофильных и анаэробных условиях зоны протеолиза проявляли добавлением 5% трихлоруксусной или соляной кислоты.

Казеинолитическая активность определялась по следующим критериям: низкая – диаметр зон до 10 мм, средняя – 11-15 мм, высокая – выше 16 мм.

Определение продукции микроорганизмами уреазы проводили, используя стандартный Urease Test Broth (BBL, USA), который вносили по 150 мкл в лунки микропланшет для иммуноферментного анализа (ИФА). В них добавляли по мкл суспензии суточных микробных культур и инкубировали при 37С в течение 18-24 часов. Реакцию считали положительной при изменении цвета среды с желтого на красный.

Желатиназную активность исследуемых культур определяли ускоренным методом [42]. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии бактериальной желатиназы в питательной среде с желатином, находящимся в виде тонкого слоя черной эмульсии на полимерной фото- или рентгеновской пленке, происходит гидролиз желатины. Это выражается в удалении слоя желатина и просветлении пленки. Исследуемые культуры сеяли бляшками на оптимальные питательные среды, инкубировали сутки при 37С. Затем на бактериальные бляшки с помощью стерильного пинцета помещали квадратики пленки. Инкубация при 37С в течение 18-24 часов. Положительной реакцией на желатиназу считали просветление квадратика пленки над бляшкой.

Дезоксирибонуклеазную и рибонуклеазную активности исследуемых культур определяли стандартными методами [42]. Принцип методов основан на том, что бактериальные ДНК-азы и РНК-азы деполимеризуют соответствующие нуклеиновые кислоты. Проявление реакции происходит путем добавления хлористоводородной кислоты (осадителя нуклеиновых кислот). Агаровая среда, содержащая соответствующие нуклеиновые кислоты, становится мутной, тогда как вокруг микробных бляшек, в случае продукции нуклеаз, образуются прозрачные зоны.

Для определения ДНК-аз 1 % ДНК-азный агар стандартный (Sigma) разливали в стерильную чашку Петри. Сразу же вносили 0,1 мл 10 % раствора хлорида кальция, поскольку большинство нуклеаз являются металлозависимыми ферментами. После образования геля чашки подсушивали 30 минут. Исследуемые суточные культуры засевали бляшками на чашку. Посевы инкубировали при 37С в течение 24-48 часов. Для проявления результатов опыта на поверхность среды наносили 5 мл 1 хлористоводородной кислоты. Результаты регистрировали визуально в проходящем свете или на черном фоне. При положительной ДНК-азной активности микробной культуры вокруг соответствующей бляшки отмечали наличие зоны просветления радиусом 2 мм и более на мутном фоне среды.

РНК-азную активность культур определяли аналогичным методом, но в качестве субстрата использовали 5 % водный раствор дрожжевой РНК (Sigma), который добавляли в МПА.

Для определения каталазной активности микроорганизмов использовали метод раздавленной капли на предметном стекле [42]. На обезжиренное предметное стекло наносили одну каплю взвеси суточной агаровой культуры в 0, % растворе натрия хлорида, в которую вносили каплю 3 % раствора перекиси водорода, затем капли накрывали покровным стеклом. Результаты регистрировали визуально по феномену образования пузырьков газа под покровным стеклом.

Гемолитическую активность определяли по наличию вокруг колоний зоны гемолиза после суточной инкубации посевов исследуемых культур микроорганизмов на 5% кровяном питательном агаре при 37°С в течение 18- часов. В опыте использовалась кровь человека О (I) группы Rh+.

Определение чувствительности лактобацилл и бифидобактерий к желчи Для культивирования микроорганизмов применяли следующие питательные среды: лактобульон – для лактобацилл, бифидобульон – для бифидобактерий. В опытные пробирки с соответствующей средой добавляли желчь для получения следующих концентраций: 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%, 0,625%.

Суточную бульонную культуру исследуемого штамма лактобацилл добавляли по 0,5 мл в каждую из опытных пробирок и контрольную пробирку и культивировали при температуре 37C. Через 24 часа измеряли оптическую плотность при длине волны 600 нм по отношению к исходному бульону.

В пробирки с различными концентрациями желчи вносили 48-часовую бульонную культуру бифидобактерий и проводили инкубацию в анаэростате при 37°С в течение 24 часов. Из каждой пробирки делали пересев исследуемой смеси в объеме 0,3 мм на чашку Петри с плотной питательной средой бифидум агар с последующей инкубацией в анаэробных условиях в течение двух суток. Чувствительность бифидобактерий к различной концентрации желчи определяли путем подсчета количества колоний, выросших на плотной питательной среде по сравнению с контролем бульонной культуры без желчи.

Определение чувствительности лактобацилл и бифидобактерий к Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводили методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton в соответствие с методиками, рекомендованными NCCLS с помощью стандартных дисков фирмы BBL. Агар разливали в чашки Петри (толщина 4 мм).

Суспензия исследуемой культуры готовится на 0,9% растворе натрия хлорида до мутности 0,5 по стандарту McFarland из 18-24-часовой культуры лактобактерий и бифидобактерий, выращенных на оптимальных питательных средах. Для инокуляции используются стерильные ватные тампоны. Тампон погружается в пробирку с суспензией, отжимается избыток инокулюма о стенки пробирки и наносится на поверхность агара, т.е. посев газоном. На газон наносятся стандартные диски с антибиотиками. Чашки инкубируют в течение 18часов при температуре 37°С. Учет результатов осуществляют по величине зоны задержки роста.

Определение способности микроорганизмов створаживать молоко Суточную бульонную культуру лактобацилл и 48-часовую культуру бифидобактерий в объеме 0,3 мл вносили в пробирки с 10 мл стерильного обезжиренного молока. Пробирки помещали в термостат при температуре 37°С и учитывали результаты каждые 2 часа по образованию творожистого осадка.

бифидобактерий. Определение адгезивной способности Степень адгезии микроорганизмов определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В.И. [39] на эритроцитах человека О (I) группы Rh+.

При постановке опыта на предметное стекло наносили одну каплю буферного раствора (0,1М раствор фосфата натрия на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2 – 7,3) в котором суспендировали по одной петле взвесь эритроцитов, предварительно дважды отмытых буферным раствором путем центрифугирования (300 – 1000 об/мин), концентрацией 100 млн/мл и одну петлю густой суточной суспензии культуры микроорганизмов (№ 6 по Mc Farland), выращенных в оптимальной жидкой питательной среде. На одно стекло наносили 3 капли суспензии разных микроорганизмов. Предметное стекло с эритроцитами и суспензией бактерий помещали во влажную камеру на 30 минут при температуре 37oC. Затем препарат высушивали при той же температуре, фиксировали в пламени спиртовки и окрашивали по методу Грама. При микроскопии определяли среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту. Подсчитывали не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения, это СПА.

Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от 1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА свыше 4,0.

Вариации результатов при данном методе 15%.

Совместное культивирование на поверхности плотной питательной среды Биосовместимость исследуемых лактобацилл и бифидобактерий между собой изучалась методом совместного культивирования на плотной питательной среде по Н.А. Глушановой [23].

Суточную первую бульонную культуру наносили на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри бактериологической петлей диаметром 2-3 мм и оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносили каплю суточной второй бульонной культуры. Растекаясь, вторая капля затекала на пятно первой культуры, примерно на половину диаметра. В наложенной части культуры размножались при взаимном наложении (совместное культивирование), конкурируя друг с другом. Свободные части пятен каждой культуры служили контролем жизнеспособности каждой из культур и «всхожести» бактерий на питательной среде. После подсыхания капли второй культуры чашки с посевами инкубировали при температуре 37C. Предварительный учет результатов проводили через 18-20 часов инкубации, окончательный учет результатов через 48 часов. Результат учитывали по наличию признаков подавления или даже зоны задержки роста чувствительной культуры.

Статистическая обработка материала Данные экспериментов обрабатывались с помощью прикладной программы STATISTICA (Stat Soft Russia) и «Excel». Вычисляли средние значения, доверительный интервал среднего -95,000%, доверительный интервал среднего +95,000%, медиану, минимум, максимум, нижнюю квартиль, верхнюю квартиль, стандартное отклонение, стандартную ошибку, асимметрию, эксцесс [12].

Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Клинически здоровые люди в возрасте от 18 до 21 года, проживающие в Центральном федеральном округе России, обладают разной степенью нарушений микробиоценоза кишечника.

2. Селекционированные штаммы лактобацилл и бифидобактерий могут быть использованы для создания региональных пробиотиков у людей Центрального федерального округа РФ.

Степень достоверности и апробация результатов Достаточный объем выборки и статистическая обработка материала свидетельствуют о достоверности полученных результатов.

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской академии Минздрава Российской Федерации (протокол №4 от 16.01.2014).

Результаты исследования были доложены на V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012». Доклад «Лактобациллы и бифидобактерии кишечной микрофлоры здоровых людей, перспективные для создания пробиотиков для населения Центрального федерального округа» занял первое место на секции «Микробиология».

Основное содержание работы

отражено в 15 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ – 3, рецензируемых РАЕ – 1, в зарубежном журнале – 1, в других изданиях – 10.

Работа состоит из введения, основного текста (обзор литературы и главы собственных исследований), заключения, списка сокращений, списка литературы, приложения. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, 23 таблицами. Библиографический указатель включает 224 наименования, из них 68 отечественных и 156 зарубежных источников литературы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта здоровых людей Пищеварительный тракт представляет собой одну из наиболее сложных экосистем, которая представлена ассоциацией резидентной микробиоты и клетками различных фенотипических линий эпителиальной стенки. Термин микробиота, предложенный D.C. Savage [206], представляет собой коллективное сообщество бактерий на слизистых оболочках каждого индивидума. Взаимно дополняя друг друга, макроорганизм и микробиота человека образуют единую симбиотическую систему. При этом макроорганизм представляет не только среду обитания, находясь в состоянии динамического равновесия с собственной микрофлорой, но и является частью этой системы [6, 18, 34, 35, 41, 49].

На суммарной площади слизистой оболочки, составляющей около 400 м2, обитают свыше 500 видов микроорганизмов. Бактерии составляют от 35 до 50% содержимого ободочной кишки человека, а их совокупная биомасса составляет примерно 2-3 кг [21].

Состав нормальной микрофлоры каждого биотопа (полость рта, пищевод, желудок, двенадцатиперстная, тонкая и толстая кишки) различен и специфичен.

Кроме того, микробная флора желудочно–кишечного тракта (ЖКТ) находится в постоянном динамическом равновесии с разнообразными факторами внешней среды, собственного организма и естественной резистентности. Это равновесие обусловлено очень тонко сбалансированным взаимодействием между клетками пищеварительной системы, микробной флорой и иммунной системой [37, 38].

Всех представителей микробной флоры, с которыми взаимодействует макроорганизм, подразделяют на четыре группы: облигатная флора (основная микрофлора кишечника); факультативная (условно-патогенные и сапрофитные микроорганизмы); транзиторная (случайные микроорганизмы, неспособные к длительному пребыванию в макроорганизме); патогенная (возбудители инфекционных заболеваний) [59].

Облигатная микрофлора кишечника - бифидобактерии, лактобактерии, кишечные палочки, пропионобактерии, пептострептококки, энтерококки, бактероиды. Видовой состав этих микроорганизмов и содержание их в кишечнике относительно постоянно. Бифидобактерии относятся к наиболее распространенным и значимым представителям облигатной флоры кишечника. У детей, находящихся на грудном вскармливании, преобладают Bifidobacterium bifidum, большая часть из которых располагается в толстой кишке, составляя основную пристеночную и просветную микрофлору. Бифидобактерии присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни человека, у детей они составляют от 90 до 98% всех микроорганизмов кишечника в зависимости от возраста [90].

Лактобактерии заселяют организм новорожденных в раннем постнатальном периоде. При рождении у человека в кишечнике отсутствуют Lactobacillus acidophilus, однако в дальнейшем происходит колонизация и быстрый рост этих микроорганизмов. Недавние исследования показали, что в популяции лактобацилл в экологически благополучном районе доминируют виды L.acidophilus, L.fermentum и L.casei, тогда как у жителей неблагополучных топодемов, наряду с L.acidophilus, преобладали L.rhamnosus и L.plantarum [51].

Эшерихии колонизируют кишечник в первые дни после рождения, где обнаруживаются в количестве 107 КОЕ/г фекалий и сохраняются на протяжении всей жизни на этом же уровне.

Заселение кишечника бактероидами происходит постепенно. Они обычно не регистрируются в бактерийных картах фекалий у детей первого полугодия жизни;

у детей в возрасте от 7 месяцев до 1-2 лет содержание бактероидов не превышает 108 КОЕ/г. У взрослого человека количество бактероидов достигает 1010 КОЕ/г [13,16].

Факультативная (условно-патогенная) микрофлора - стафилококки, стрептококки, пептококки, условно-патогенные энтеробактерии, дрожжевые грибы, вейлонеллы, фузобактерии, бациллы. Состав факультативной микрофлоры кишечника меняется в зависимости от действия тех или иных факторов внешней среды: климата, времени года, состояния окружающей среды [31].

К транзиторной микрофлоре относятся неферментирующие грамотрицательные палочки преимущественно родов Acinetobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, легко попадающие в кишечник из окружающей среды. Многие из них являются сапрофитами, некоторые относятся к возбудителям оппортунистических инфекций (флавобактерии, отдельные виды псевдомонад). Транзиторная микрофлора составляет менее 0,6% у здоровых детей дошкольного возраста, от до 4 % - у взрослых людей [58].

Патогенная микрофлора обусловливает развитие инфекционных заболеваний (бактериальная дизентерия, сальмонеллез, эшерихиозы и др.) [29, 62].

Функции нормофлоры представлены в таблице 3.

Колонизационная рези- Межмикробный антагонизм (продукция органичестентность ских кислот, перекиси водорода, мурамидазы, бактерицинов, микроцинов и других антагонистически активных веществ).

иммуноглобулинов, лизоцима, интерферона, цитокинов).

Детоксикационная, Гидролиз продуктов метаболизма белков, липидов, антимутагенная и анти- углеводов, деконъюгация желчных и гидроксилироканцерогенная вание жирных кислот, инактивация гистамина, ксенобиотиков и проканцерогенных веществ.

Синтетическая Образование аминокислот, витаминов, гормонов, Пищеварительная Усиление активности ферментов, пищеварительной и Микрофлора различных микробиотопов различается между собой по количественному и качественному составу. В полости рта находятся следующие микроорганизмы: микрококки, диплококки, стрептококки, стафилококки, коринебактерии, аэробные бациллы, спириллы, спирохеты, вибрионы, лактобактерии, актиномицеты, анаэробные кокки, бактероиды, бифидобактерии и др. Общее количество микроорганизмов составляет 107 -108 КОЕ/мл слюны. Концентрация анаэробных бактерий 107-108, аэробных - 106-107 КОЕ/мл [60, 201].

По имеющимся немногочисленным сведениям, микрофлора пищевода скудная. В проксимальной его части обнаруживаются бактерии типичные для микрофлоры полости рта и глотки, в дистальном отделе выявляются стафилококки, дифтероиды, лактобактерии, сарцины, бациллы, кандиды [14]. Единичными остаются сведения о присутствии H.pylori в микробиоценозе пищевода у здоровых лиц [8]. Отсутствуют сведения о количестве микроорганизмов, их ферментативной активности и проявлениях признаков патогенности.

В качестве резидентной флоры в слизистой оболочке желудка и желудочном соке встречаются молочнокислые бактерии, дифтероиды, дрожжевые грибы рода кандида, стрептококки, стафилококки, микрококки, нейссерии [20]. Количество микроорганизмов в желудке не превышает 103 КОЕ/г. Основная масса бактерий обитает в пилорической части. Доминирующее место среди этой микрофлоры занимают стафилококки и стрептококки, грамотрицательные бактерии [38].

Микрофлора двенадцатиперстной кишки у здоровых людей достаточно скудна. У здорового человека в 1 мл дуоденального содержимого находится 103– 105 различных бактерий. В дуоденальном содержимом чаще обнаруживались стрептококки, лактобактерии, дифтероиды, кишечные палочки. Были выявлены аэробные и анаэробные кокки, лактобациллы, бифидобактерии, энтеробактерии, бактериоды, вейлонеллы [7, 36]. Считается, что часть из них поступает из желудка вместе с пищей, а другая часть – из слизистой оболочки 12-перстной кишки.

Обсемененность кишки возрастает после приема пищи, а затем в процессе пищеварения возвращается к исходному уровню [50].

В кишечнике взрослого человека количество микроорганизмов составляет 1013 КОЕ/г. Облигатная микрофлора является превалирующей (95–98 %) и представлена анаэробами: бактероидами (105–12 мк/г), лактобациллами (105–7 мк/г) и бифидобактериями (108–10 мк/г). Среди аэробной микрофлоры преобладают кишечная палочка (106–9 мк/г) и энтерококк (103–9 мк/г) [64]. Индигенные бактерии создают зону закисления (бифидобактерии – до рН 5,0; лактобактерии – до рН 4,0), конкурируют с другими бактериями за сайты адгезии на энтероцитах, образуя защитную микропленку на поверхности слизистой оболочки кишечника. Добавочная и транзиторная микрофлора составляет лишь 1–4 % от общего количества биомассы микробов кишечника. Различные условно-патогенные микроорганизмы могут быть представлены в количестве до 105 мк/г [15, 31, 62].

кишечника учитывается при исследовании фекалий на дисбактериоз согласно ОСТ 91500.11.0004-2003[46] (таблица 4).

Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого Бифидобактерии Лактобактерии Бактероиды Энтерококки