На правах рукописи

Калмантаев Тимур Ахмерович

ПОЛУЧЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОЦИНОПОДОБНЫХ

ВЕЩЕСТВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ BACILLUS CIRCULANS

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск – 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ Научные руководители:

д-р техн. наук, ст. научн. сотр. Похиленко Виктор Данилович;

канд. биол. наук, ст. научн. сотр. Перелыгин Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

Герасимов Владимир Николаевич, д-р биол. наук, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ, Оболенск, зав. лабораторией электронной микроскопии Самойленко Владимир Александрович, кандидат биологических наук, ФБУН «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина» РАН, Пущино, руководитель сектора биотехнологических процессов

Ведущая организация:

ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ

Защита состоится «15» мая 2012 г., в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.350.002.01Д при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ по адресу: 142279, Московская обл., п. Оболенск,

ФБУН ГНЦ ПМБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ

Автореферат разослан “13” апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы За последние десятилетия в клиниках мира было выделено множество антибиотико-резистентных микроорганизмов, которые создают проблемы в лечении ряда заболеваний инфекционной этиологии. Так, в 2011 году в Германии банальная кишечная инфекция, вызванная устойчивым к антибиотикам геморрагическим штаммом E.coli О104:H4, унесла жизни более 50 человек, а несколько сотен человек остались инвалидами. В этой связи поиск новых средств антибактериального действия с меньшим, чем у антибиотиков, уровнем развития к ним микробной устойчивости, имеет как научное, так и практическое значение. В качестве таких средств биологического происхождения больший интерес представляют бактериоцины грамположительных бактерий, которые по своей природе являются низкомолекулярными пептидами и, по мнению большинства исследователей, не токсичны; и микроорганизмы к ним, как правило, не привыкают. Известны примеры практического использования наиболее известных бактериоцинов лактобактерий – низина и педиоцина - в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов. Вместе с тем, к бактериоцинам лактобактерий чувствительны только филогенетически родственные виды микроорганизмов, и только в отдельных случаях – грамотрицательные бактерии. Поэтому выделение новых бактериоцинов, способных более эффективно ингибировать развитие возбудителей острых кишечных инфекций, а также микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов, является актуальной задачей современной науки и ее прикладных направлений.

Перспективными источниками антимикробных соединений пептидной природы считаются некоторые виды аэробных спорообразующих бацилл. Представители этих видов являются продуцентами полимиксиновой группы антибиотиков – бацитрацина, бутирозина, грамицидина С, полимиксина и др. Названные антибиотики востребованы до настоящего времени благодаря своей высокой эффективности против грамотрицательных бактерий, однако их применение ограничено в связи с различными побочными эффектами на организм человека. А не так давно было обнаружено, что некоторые штаммы Paenibacillus polymyxa и Bacillus circulans способны продуцировать бактериоцины и бактериоциноподобные соединения (БПС) пептидной природы, обладающие антимикробным действием [Puiri et al., 1998; Svetoch, Stern et al., 2005; Stern, Svetoch et al., 2006; He et al, 2007].

По своему строению и спектру антимикробного действия эти соединения, как показано [Abriouel et al., 2011], близки к бактериоцинам классов I и IIа лактобактерий по принятой классификации [Klaenhammer, 1998], но дополнительно действуют и на грамотрицательные микроорганизмы.

Наибольший интерес представляет вид B. circulans, поскольку в 2001 году у штамма NRRL B-30644 (депонирован в музее ARS USA) впервые был выявлен антимикробный пептид (бактериоцин 1580), который ингибировал сальмонеллы и кампилобактерии.

Представители этого вида практически безвредны, широко используются в биоиндустрии в качестве продуцентов ферментов, сурфактантов, полисахаридов, препаратов для мацерации кормов, бактериальных удобрений. Было высказано предположение о том, что они могут оказаться источниками новых бактериоцинов. Нами были выделены из окружающей среды и депонированы в коллекции микроорганизмов «ГКПМ – Оболенск» новые бактериоциногенные штаммы B. circulans с широким спектром антимикробного действия.

Потребность медицины, ветеринарии и пищевой промышленности в новых более эффективных средствах сдерживания вредных микроорганизмов явилась основанием для более глубокого изучения антимикробных веществ, продуцируемых штаммами B. circulans и для разработки лабораторной технологии их получения.

Цель исследования Выбрать наиболее антагонистически активные и продуктивные штаммы Bacillus circulans, разработать лабораторную технологию получения бактериоциноподобных соединений, изучить их биологические и физико-химические свойства, определить возможные сферы применения.

Основные задачи исследования 1. Найти и выбрать по результатам сравнительных исследований антагонистически активные штаммы B. circulans с практически значимыми выходами по действующему началу бактериоциноподобных соединений.

2. Определить компонентный состав питательных сред и параметры культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающих существенный выход бактериоциноподобных соединений.

3. Найти и отработать способ эффективного извлечения бактериоциноподобных соединений из культуральной жидкости продуцентов, способ сравнительной оценки антимикробной активности.

Получить на основе отобранного штамма B. сirculans и разработанного способа выделения экспериментальные образцы бактериоциноподобного соединения для изучения его основных свойств.

5. Определить с использованием представительного набора индикаторных штаммов различных видов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов качественные и количественные показатели антимикробной активности экспериментальных образцов бактериоциноподобного соединения штамма B. circulans СК 2ч.

6. Изучить с использованием методов электрофореза и жидкостной хроматографии физико-химические и биохимические свойства экспериментальных образцов бактериоциноподобных соединений B. circulans.

Исследовать in vivo антимикробное действие экспериментальных образцов бактериоциноподобных соединений в опытах на цыплятах и оценить степень безвредности для белых мышей.

8. Разработать экспериментальные образцы, содержащие бактериоциноподобные соединения, и определить возможные области их практического применения.

Научная новизна работы Выделены, идентифицированы и охарактеризованы новые антагонистически активные бактериоциногенные штаммы B. circulans, подавляющие рост различных видов грамположительных и грамотрицательных патогенных и условно патогенных бактерий, в том числе – штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

Выявлена зависимость синтеза бактериоциноподобного соединения (БПС) от природы источника азота, энергетической ценности питательной среды и параметров глубинного культивирования продуцента.

Установлено, что временные параметры синтеза БПС B. circulans, спектр антимикробного действия, а также его молекулярная масса отличаются от других антимикробных соединений, продуцируемых данным микроорганизмом.

Обнаружено, что некоторые штаммы B. circulans продуцируют два бактериоциноподобных соединения разных типов: (1) выделяющееся в культуральную жидкость и ингибирующее грамотрицательные микроорганизмы; и (2) накапливающееся на поверхности клеток и активное в большей степени против грамположительных бактерий.

Теоретическая ценность и практическая значимость работы Создана коллекция антагонистически активных штаммов B. circulans, пригодных для использования в качестве источника новых бактериоцинов и бактериоциноподобных соединений.

Установлена зависимость синтеза бактерицидного вещества B. circulans от энергетической ценности и доступности компонентов питательной среды, что может быть вкладом в теорию и практику управляемого синтеза бактериоцинов на основе перспективных видов сапрофитных бактерий.

Разработан способ глубинного культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающий малозатратное выделение БПС из культуральной жидкости B. circulans, который может быть использован для обнаружения и получения в препаративных количествах новых биологически активных веществ антимикробного действия, в том числе и бактериоцинов, синтезируемых другими видами микроорганизмов.

Получен экспериментальный образец БПС, изучены его свойства, определен спектр областей возможного использования.

Разработаны «Методические рекомендации по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов» – учрежденческий уровень внедрения.

Разработан лабораторный регламент получения бактериоцина с обеззараживающими свойствами [ЛР 78095326-100-2011] – федеральный уровень внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту Новые штаммы B. circulans, которые являются продуцентами бактериоциноподобных веществ, подавляют рост и развитие широкого спектра бактериальных патогенов.

Выход и активность бактериоциноподобного соединения B. circulans зависят от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также параметров глубинного культивирования.

Бактериоциноподобное соединение штамма B. circulans Ск2ч представляет собой термостабильное, рН устойчивое, протеин-содержащее соединение с молекулярной массой около 6 кДа, ингибирующее рост ряда грамотрицательных и грамположительных патогенов бактериальной природы.

Бактерициноподобное соединение штамма B. circulans Ск2ч может быть использовано в качестве добавки в корм цыплят - для контроля числа бактериальных патогенов в кишечнике, а также в составе полимерных пленок - для хранения продуктов, обеспечивающего снижение микробной контаминации.

Работа выполнена в отделе биологических технологий ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации 2009 – 2013 годы» (Государственные контракты № 122-Д от 11.06.2009 г. и № 55-Д от 22.07.2011 г.).

Личный вклад соискателя Автором лично выполнена вся экспериментальная работа по выбору штаммапродуцента, выделению и очистке БПС, изучению свойств экспериментального образца, а также интерпретация полученных данных. Автор внес значительный вклад в составление «Методических рекомендаций по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов», а также в разработку Лабораторного регламента на получение бактериоцина с обеззараживающими свойствами.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на: I-ой Оболенской школе-конференции «Биологическая безопасность в современном мире»

[Оболенск, 2009], II научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Биобезопасность в современном мире» [Оболенск, 2010], III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» [Оболенск, 2011].

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 10 публикациях, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 124 цитируемых работы, из которых 24 – отечественных и 100 – иностранных авторов. Материалы диссертации изложены на 112 страницах машинописного текста, иллюстрированы 11 рисунками и 16 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы Для выполнения работы использовали идентифицированные антагонистически активные штаммы Bacillus circulans (C2/2, Ск2ч, 1580, КСП18, ППС2а), Paenibacillus polymyxa Р602 и Bacillus subtilis ПС50, выделенные из образцов почвы, корневой системы растений, растительных остатков и водного настоя стеблей злаков. Данные штаммы депонировали в качестве авторских штаммов в «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ. В качестве контрольных штаммов использовали штаммы Bacillus circulans Jordan 1890 (B-222, B-1969) и Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) B-436, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино-на-Оке). В качестве индикаторных культур для оценки антагонистической активности исследуемых микроорганизмов использовали грамотрицательные (Escherichia coli M15, Salmonella enteritidis 237, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa 468, Acinetobacter lwoffii 125, Shigella sonne, Klebsiella pneumoniae 114, Enterobacter cloacae 190, Haemophilus influence XAU1) и грамположительные (Listeria monocytogenes 766, Bacillus spp., Lactococcus spp., Staphylococcus aureus 46) бактерии, полученные из коллекции микроорганизмов «ГКПМОболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Штаммы бацилл культивировали на чашках с питательным (Nutrient Agar M001, HiMedia, Индия; ГРМ-агар ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия), либо крахмальным агаром (Starch agar, Ref.1-283, Scharlau, ЕС) при температуре 30 °С в течение двух суток.

Для получения посевных материалов одиночные типовые колонии микроорганизмов суспендировали в изотоническом растворе хлористого натрия (рН 7,0-7,2). Клеточными суспензиями в количестве 1 % засевали качалочные (750 мл) колбы со 100 мл питательной среды. Инкубацию посевов осуществляли на качалке (28–30 °С, 130 об/мин). В качестве питательных сред использовали коммерческие (ГРМ-бульон, питательный бульон для листерий из ГНЦ ПМБ, Россия) и экспериментальные варианты на основе различных гидролизатов белка с добавлением различных углеводов, экстракта дрожжей и минеральных солей.

Микробиологические методы Идентификация изолятов. После первичной оценки морфо-культуральных признаков, давших основание отнести выделенные изоляты к роду Bacillus, дальнейшую их видовую принадлежность определяли с помощью стандартизованной системы биохимических тестов API® 50 СН (BioMerieux, Франция) и программного обеспечения API 4.0. В случае спорной идентификации для уточнения вида бацилл привлекали дополнительные тесты, описанные в литературе [Logan, 1984].

Проверка на антагонистическую активность. Первичный скрининг антагонистически активных изолятов бацилл проводили методом нанесения образцов клеточной массы в виде агаровых блоков или пятен (spot-test) на поверхность свежих газонов индикаторных штаммов. Уровень активности выделенных образцов бактерицидных веществ выражали в арбитражных единицах (АЕ/мл) путем нанесения спотов из серии двукратных разведений (по 10 мкл) на свежие газоны тест-культур. За одну АЕ принимали величину, обратную степени разведения образца, при которой отчетливо определялась минимальная зона ингибирования.

Определение молекулярной массы бактерицидного вещества проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). После окраски и отмывки гель помещали в стерильные чашки Петри и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма ( мл взвеси клеток смешивали с 10–15 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара M001 HiMedia). После инкубации чашек в термостате (37 °С) в течение 18– 20 ч отмечали наличие и расположение зоны подавления роста тест-культуры на агаре над полосой электрофореграммы, содержащей активный пептид. Сравнение с маркерами позволяло определить молекулярную массу активного пептида.

Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) в отношении тесткультур проводили методом двукратных серийных разведений препарата (от 128 до 0,06 мг/л) в 1 мл жидкой питательной среды, соответствующей по составу их потребностям. Результаты учитывали после инкубации при 37 °С, отмечая изменение оптической плотности сред по сравнению с контролем.

Выбор среды культивирования осуществляли, используя в качестве основы питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт – 5,0; калия фосфат 2-х замещенный, 3-х водный – 3,0; натрия хлорид – 1,0; калия хлорид – 1,0 и магния сульфат – 0,005. На первом этапе исследований к основе питательной среды добавляли по отдельности (0,3 – 0,5 %) различные источники аминного азота – виннокислый аммоний, сульфат аммония, хлористый и щавелевокислый аммоний, а также гидролизаты казеина (солянокислый – СГК), рыбной муки (панкреатический – ПГРМ) и глутамат натрия (рН сред составляла 7,3 – 7,5 ед.). Во все варианты сред добавляли 0,5 % глюкозы. В качестве контроля использовали коммерческий ГРМ-бульон (Оболенск, Россия).

На втором этапе исследований к питательной основе с выбранным по результатам первого этапа источником азота дополнительно вводили кроме глюкозы и другие источники углерода – различные моно-, ди-, три-, олиго- и полисахариды.

Биотехнологические методы Посевной материал готовили в колбах на термостатированных качалках, культивирование микроорганизмов проводили в ферментерах, разделение культуральной жидкости (КЖ) на клеточную массу и супернатант осуществляли на центрифугах или фильтрационных аппаратах. В работе использовали термостаты ТС-80М (Россия), качалки NBS (New Brunswick Scientific, США), ферментеры АКА-210, 3У (Россия) или Bioflo 110 NBS (США). Для стерилизации питательных сред, растворов использовали установку стерилизующей фильтрации АСФ-011 и автоклав ВК-75 (Россия).

При выборе способа выделения из КЖ и частичной очистки бактериоциноподобных соединений использовали методы солевой преципитации, вакуумного выпаривания, сорбции на твердых носителях, фазовой сепарации органическими растворителями, а также методы ультрафильтрации. Для разделения КЖ на клеточную массу и бесклеточный супернатант использовали центрифугу J2-21 Beckmann (Германия), фильтрационную установку на полых волокнах (Россия) с отсечением по молекулярному весу в 100; 15; и 5 кДа. Концентрирование целевых продуктов проводили на вакуум-выпарной установке Laboretta 4000 Heindolh (Германия). Для обезвоживания биоматериалов применяли лиофилизатор Virtis BT-4k (США) и анализатор влажности MF-50 (Moisture Analyzer, Япония).

Биохимические методы Постановка трицин-ДСН-ПААГ-электрофореза. Пробы для исследования подвергали предварительной очистке, используя патроны Bond Elut® С18 (Analytichem Intern., Habor City, CA, США), руководствуясь инструкцией производителя. Концентрацию протеинов в образцах определяли по методу Бредфорд [Bradford, 1976] на спектрофотометре Spekol 11 (Analytik Jena AG, Германия) при длине волны 595 нм.

Концентрация разделяющего полиакриламидного геля составляла 16,5 %, а концентрирующего – 10 %. В лунки предварительно залитого геля наносили по 4 мкл исследуемых образцов и маркеры. В качестве молекулярных меток использовали маркеры фирм SpectraTM Multicolor Low Range Protein Ladder (1,7 – 40 кДа, Fermentas, ЕС), PageRulerTM Unstained Low Range Protein Ladder (3,4-100 кДа, Fermentas, ЕС), а также очищенные пептиды – инсулин (5,7 кДа) и лизоцим (14,5 кДа). Электрофорез проводили в катодном (100 мМ Трис-НСL,100 мМ, 0,1 % SDS, рН 8,25) и анодном (200 мМ Трис-НСL, рН 8,9) буферах в камере для вертикального электрофореза Hoefer (США) по методу [Shagger, 1987] для низкомолекулярных белков и пептидов. Разделение проводили при U = 125 В и I = 25 мА в течение 4 ч.

Фиксацию низкомолекулярных пептидов проводили в 5 % растворе глутарового альдегида в течение 30 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде. Окраску пептида проводили в растворе, содержащем 25 % этанола,10 % уксусной кислоты, 0,001 % Кумасси G250 и 500 мл воды. Для определения молекулярной массы пептидной полосы, ответственной за антимикробную активность, гель отмывали в 10 % растворе уксусной кислоты при температуре 80 °C в течение 2 ч, затем еще 30 мин в дистиллированной воде и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма, как было описано выше.

Компонентный состав образцов БПС изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром-6 (ЗАО «Научприбор», Россия) с использованием обращенно-фазовой аналитической колонки (КАХ-6-80-4), заполненной сорбентом Сепарон-С18. Образцы БПС предварительно готовили, используя патроны Bond Elut® С18. Элюцию проб с аналитической колонки проводили в градиенте концентрации водного раствора ацетонитрила от 0 до 30 % с добавлением 0,1 % трифторуксусной кислоты с регистрацией оптической плотности при двух длинах волн: 220 и 280 нм. Полученные данные обрабатывали в программе UniChrom® указанного хроматографа. Выявление «биоактивных» пиков проводили нанесением элюатов на свежие газоны тестовых культур. Для этого пробы элюатов высушивали при 105 °С и отдельно разводили в 50 мкл дистиллированной воды.

В отдельных случаях для идентификации биоактивных фракций в образцах БПС использовали метод тонкослойной хроматографии на алюминиевых силикагельных пластинах Silufol UV254 (Чехия) в системе: бутанол/ледяная уксусная кислота/вода.

Методы in vivo. Полученные образцы антимикробных веществ исследовали в опытах на цыплятах и белых мышах. Цыплятам в течение 3 дней давали стандартный коммерческий корм (контроль) и такой же сухой корм, но предварительно насыщенный бесклеточным супернатантом B. circulans Ск2ч с активностью 100 АЕ/мл в отношении E. сoli (опытная группа). В опытах на мышах кроме варианта кормления стандартным сухим кормом, содержащим концентрат БПС, изучили вариант его введения внутрибрюшинно (до 100 мг на особь), используя стерильные растворы. В ходе 7 суточного эксперимента, наблюдали за активностью животных, отбирали фекальную массу для анализа микрофлоры, а в конце опыта проводили их вскрытие и визуальную оценку состояния внутренних органов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 2 посвящена сравнительной характеристике новых штаммов антагонистически активных бацилл, вопросам идентификации, а также обоснованию выбора некоторых из них в качестве продуцентов бактерицидных веществ. При отборе изолятов из окружающей среды обращали внимание на их активность в отношении грамположительных (Гр+) и грамотрицательных (Гр–) бактерий, в большей части на примере Listeria monocytogenes и Escherichia coli, соответственно. В таблице 1 приведены краткие данные о штаммах бацилл, использованных в работе на первоначальном этапе исследований. Пять из них с наиболее выраженной антагонистической активностью и по совокупности морфокультуральных, биохимических свойств идентифицированые как B. сirculans, были депонированы в «ГКПМ – Оболенск».

Таблица 1 - Основные сведения о штаммах бацилл, используемых в работе Рабочее Источник выделения Музейные параметры штамма Антагонистическая На рис. 1 представлены фотоизображения колоний, клеток и спор, типичных для отобранных штаммов B. circulans. Характерным признаком молодых колоний являются выросты, часто направленные циркулярно, а также подвижные палочковидные клетки.

Споры обычно образуются на 3-4 сутки, имеют терминальное расположение и шире материнской клетки.

Рисунок 1 - Типичная морфология колоний, вегетативных клеток и спор В опытах по отработке условий получения бактериоциноподобных веществ были использованы в основном два штамма – B. circulans C2/2 и B.circulans Ск2ч, которые давали наибольшие по диаметру зоны ингибирования (до 20 мм) Гр(–) бактерий. Другие, указанные в таблице 1 штаммы, использовали для проведения сравнительных исследований. Так, B. circulans 1580 является продуцентом бактериоцина, P. polymyxa 602 не только бактериоцина, но и, возможно, антибиотика полимиксина, тогда как штаммы B. circulans Jordan 1890 и B.subtilis Cohn 1872 не описаны как бактериоциногенные.

В главе 3 представлены результаты по экспериментальному обоснованию выбора компонентного состава питательных сред, условий глубинного культивирования B. circulans, способов выделения бактериоциноподобной субстанции и оценки антагонистической активности образцов. В табл. 2 представлены данные о зависимости антагонистической активности супернатантов B. сirculans Ск2ч от состава среды культивирования.

Таблица 2 - Зависимость антимикробной активности супернатантов B. сirculans Ск2ч от источника азота и концентрации глюкозы в жидкой питательной среде Антагонистическая активность (АЕ/мл) проб* при одном источнике энергии (глюкоза – Сульфат Тартрат Глутамат Гидроли- Щавелевокислый Хлористый Гидролизат Антагонистическая активность (АЕ/мл) проб при одном источнике азота (сульфат аммония - 0,5%) и различных источниках энергии Галактоза, Мальтоза, Манноза, Лактоза, Сахароза, Глице- Глюкоза, Глюкоза, *активность рассчитана для супернатантов, сконцентрированных в 10 раз, 0** - отсутствие зоны ингибирования в данных условиях.

Синтез бактериоциноподобных соединений четко фиксировали в случае использования в питательной среде азота минерального происхождения и практически отсутствовал при культивировании в среде на основе азота органического происхождения. Определенное влияние на продукцию БПС оказывали также тип и концентрация источника энергии в составе питательной среды – концентрация глюкозы не должна превышать 1,0 %.

Удовлетворительную воспроизводимость результатов по уровню продукции БПС достигали при температуре 28–30 °С, вращении качалки 120–130 об/мин и культивировании в течение не более 50 ч. Полноценность состава питательных сред и выбранный режим культивирования позволяли поддерживать вегетативный рост клетки B. circulans без перехода к стадии споруляции.

Таким образом, уже на стадии предварительных исследований установили существенную зависимость выхода БПС от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также условий глубинного культивирования.

При получении бактериоцинов их выход зависит не только от штамма продуцента, условий его культивирования, но и способа выделения. Молекулы бактериоцинов и подобные им пептиды, как известно, обладают амфифильными свойствами и склонностью к агрегации, как между собой, так и с бактериальными клетками, их дебрисом, что приводит к снижению удельной активности [Pingitore et al., 2007]. В этой связи провели эксперименты с целью определения оптимальных путей извлечения БПС из супернатантов. В табл. 3 представлены результаты сравнительных исследований по эффективности выделения бактериоциноподобных соединений при использовании различных способов обработки супернатанта штамма B. сirculans Ск2ч.

Таблица 3 - Сравнение выхода бактериоциноподобных соединений в зависимости от способа обработки супернатанта КЖ штамма B. circulans Ск2ч Способ выделения и действующее начало Солевая преципитация Сульфат аммония, 60% 48000 ± 17000 ной системе * исходный супернатант имел активность 100 АЕ/мл, общее количество АЕ в 100 мл принято за 100%, **представлены средние показатели суммарных значений активности из 3 опытов.

Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что при использовании двухфазной системы выделения с хлороформом или дихлорметаном выход бактериоциноподобных соединений из супернатанта КЖ штамма B. circulans Ск2ч составляет 93–95%.

Таким образом, подобранные условия культивирования штамма-продуцента и режимы получения антимикробных соединений из супернатантов КЖ дали основание для разработки лабораторной технологии получения БПС, продуцируемых B. circulans.

В главе 4 представлены результаты разработки лабораторной технологии получения препарата БПС на основе штамма B. circulans Ск2ч на ферментационных аппаратах объемом 10 л, с использованием аппаратов мембранного и гравитационного разделения КЖ, методов выделения и грубой очистки бактериоциноподобных соединений с помощью органического растворителя, а также приготовления готовой формы препарата методом лиофильного высушивания.

Принципиальная схема получения экспериментальных образцов БПС представлена на рис. 2.

Рисунок 2 - Технологическая схема получения препаративных образцов бактерицидного Ключевой стадией технологии является получение КЖ вегетативных клеток B.circulans в условиях, которые обеспечивают продукцию БПС на уровне как минимум 100 АЕ/мл. Типовую динамику роста клеток в ферментере и продукции бактерицидных веществ иллюстрируют данные представленные на рисунке 3. Как показали опыты с выращиванием штамма - продуцента БПС в среде выбранного состава при наблюдении в течение 5 суток, рост клеток был наиболее интенсивен в срок до 48 – 50 часов, после чего намечается тенденция падения оптической плотности и, соответственно, снижения числа клеток, что свидетельствует о переходе клеток в состояние спор. Известно, что у некоторых бацилл максимальный уровень синтеза антибиотиков, например, бутирозина, совпадает с активной стадией процесса спорообразования [Schaeffer, 1969, Nam and Ryu,1985].

Обычно процесс спорообразования начинается на 3–5 сутки культивирования штаммов-продуцентов. Как следует из результатов наших опытов, приведенных на рисунке 3, синтез БПС штаммом B.circulans Ск2ч начинается уже на стадии логарифмического роста (16–20 ч) и достигает максимума к 40 – 50 ч, когда еще в КЖ отсутствуют признаки спорообразования. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что время культивирования штамма B.circulans Ск2ч, достаточное для накопления БПС, составляет 48–50 часов.

Рисунок 3 - Динамика роста клеток, изменения рН, ОП и накопления БПС при культивировании B. circulans Ск2ч в ферментере объемом до 10 л.

Обозначения: рН – показатель кислотности среды, ед. рН; ОП – оптическая плотность при 600 нм; КОЕ – колониеобразующие единицы, log/ml; АА – антагонистическая активность, измеренная по отношению к тест-штамму E.coli, х100 АЕ/мл.

Стадия концентрирования БПС, находящегося в КЖ в достаточно разбавленном состоянии (мкг/л), имеет решающее значение для получения его в практически значимых количествах. В процессе концентрирования супернатанта необходимо уменьшить количество примесных соединений, солей и воды, при этом повысить концентрацию низкомолекулярного бактериоциноподобного соединения. Для решения этой задачи использовали принципы мембранного разделения КЖ с применением ультрафильтрационных половолоконных мембран с отсечением, обеспечивающим отделение клеток и низкомолекулярного пептида (100 и 5 кДа, соответственно). Такой подход существенно повышает производительность процесса переработки бактериоцинсодержащего супернатанта и, по сравнению с другими методами, уменьшает временные и материальные затраты, связанные с последующей обработкой концентратов БПС дорогостоящими реагентами (растворителями, сорбентами и др.).

Выделение БПС из водных растворов (супернатантов/фильтратов) проводится различными приемами – от часто используемой солевой преципитации (сульфат аммония) до одно- или двухэтапных методов хроматографического разделения на колонках со смолами ионного и гидрофобного взаимодействия [Pingitore et al., 2007]. Однако эти методы в одних случаях не избирательны, а в других – являются высокозатратными. Наши исследования показали, что более предпочтительным является метод фазовой сепарации БПС с использованием безводного гидрофобного растворителя. Теоретической предпосылкой для выбора указанного метода явилось свойство аффинности бактериоцинов к гидрофобным растворителям, что предполагает возможность их сбора на границе раздела фаз (вода/растворитель). Практическое доказательство возможности использования такого способа для выделения бактериоцинов получили сотрудники Университета штата Огайо [Burianek and Yousef, 2000], которые использовали в качестве растворителя хлороформ.

Поскольку это соединение обладает относительно высокой токсичностью и сильным наркотическим действием мы модифицировали этот метод, заменив хлороформ менее токсичным растворителем – дихлорметаном (ДХМ). Кроме того, ДХМ отличался от хлороформа меньшей плотностью (1,32 против 1,48 г/см3) и температурой кипения (40 °С против 61 °С), что существенным образом облегчает его возгонку из водных растворов и дает возможность повторного использования.

Суть метода заключается в том, что бактериоцинсодержащая жидкость смешивали с эквивалентным объемом ДХМ и подвергали скоростному гомогенизированию для получения эмульсии. После центрифугирования в результате сепарации формируется верхняя фаза (водная), промежуточная фаза (интерфаза) и нижняя фаза – ДХМ. Данные типичного эксперимента по приготовлению БПС методом фазовой сепарации приведены в табл. 4. Из представленных данных следует, что обработка супернатанта ДХМ позволяет выделить из него до 94,6 % от активности целевой субстанции с одновременным снижением на 86,2 % массы сухих веществ.

Таблица 4 – Количественные показатели фракционирования супернатанта B. circulans Ск2ч с использованием дихлорметана (*) АЕ, арбитражная единица – минимальное количество вещества, дающего эффект Таким образом, результаты исследований по отработке элементов технологической схемы показали возможность получения препаративных образцов бактериоциноподобного соединения B. circulans в количестве, достаточном для всесторонней оценки их биологических и физико-химических свойств.

В главе 5 описаны результаты исследований основных биологических и физикохимических свойств образцов БПС штаммов B. сirculans С2/2 и B. сirculans Ск2ч.

Активность образцов БПС наблюдали в отношении штаммов эшерихий, сальмонелл, листерий, некоторых бацилл и вакцинного штамма сибиреязвенного микроба. В то же время при тестировании штаммов B. сirculans С2/2 и B. сirculans Ск2ч друг против друга зон ингибирования не наблюдали, что свидетельствует об иммунности этих штаммов к собственным метаболитам.

Выполненные эксперименты показали, что при действии органических растворителей – ацетона, бутанола, метанола, хлороформа, дихлорметана, ацетонитрила, а также после высушивания при 105° C антимикробная активность образцов БПС полностью сохранялась, но частично терялась после автоклавирования при 121 °C (15 мин) в щелочной зоне (рН 10 – 11). Полная потеря активности происходила при нагревании сухих проб до 150° C. Лиофилизированные препараты БПС сохраняют активность при хранении в течение 1 года (срок наблюдения) в условиях комнатной температуры (24 ± 3 °C) и полностью восстанавливаются при регидратации. Отметили также, что высушивание при 105 °C приводит к частичному снижению растворимости препарата БПС, которая, однако, восстанавливается при суспендировании порошка в щелочной среде (рН 10) с последующим доведением рН суспензии до физиологических значений (рН 6 – 7).

В отличие от бактериоцинов лактобактерий класса 1 и 2а образцы БПС оказались устойчивы к некоторым протеазным и гидролазным ферментам – химотрипсину (10 мг/мл), папаину (30 мг/мл), протеиназе К (10 мг/мл), лизоциму (10 мг/мл). Частичная инактивация БПС происходила лишь под воздействием панкреатического комплекса ферментов (30 мг/мл). Из данных литературы известно [Takeuchi Y, et al., 1979], что устойчивость такого рода соединений микробного происхождения может быть связана с наличием в их структуре - диаминобутириковых кислот, которые способствуют формированию циклических молекул, устойчивых к внешним воздействиям.

Исследование компонентного состава БПС.

На рис. 5 приведены данные по хроматографическому анализу грубо очищенного препаративного образца БПС B. circulans Ск2ч с использованием обращено-фазовой колонки.

Рисунок 5 - Типовой профиль элюирования БПС B. circulans Ск2ч на колонке КАХ-6-80-4, заполненной сорбентом Сепарон-С Как показали результаты тестирования на культуре Е. coli «биоактивным» было только вещество пика, выходящего на 5–6 мин после начала элюирования. При этом данный пик регистрировали и при длине волны 280 нм (ароматические аминокислоты), и при длине волны 220 нм (пептидная связь). Пики, регистрируемые при этих двух длинах волн, полностью совпадали по времени выхода.

Таким образом, установили, что экспериментальный препарат БПС состоит из нескольких компонентов с различным временем удержания, но только один из них, выделяющийся на 5–6 мин, обладает антагонистической активностью по отношению к культуре Е. coli.

Для оценки молекулярной массы компонентов БПС провели трицин-ДСН-ПААГэлектрофорез проб с использованием пептидных маркеров: лизоцима (14,3 кДа) и инсулина (5,7 кДа). Данные электрофоретического разделения образцов БПС, полученных из бесклеточных ферментатов B. circulans Ск2ч и B. circulans С2/2, приведены на рис. 6.

Рисунок 6 - Оценка молекулярного веса антимикробных фракций штаммов B. circulans с помощью трицин-ДСН-ПААГ - электрофореза и заливки геля агаром с E. coli М Как следует из представленных данных на рис. 6, БПС штамма B. circulans Ск2ч имеет молекулярную массу около 6 кДа, а БПС штамма С2/2 около 7 кДа. Эти образцы БПС показали одинаковую устойчивость к действию протеолитических ферментов, выдерживали нагревание при 105 °С, но теряли активность после автоклавирования при рН 10–11. Описанные свойства отличают БПС штаммов B. circulans Ск2ч и B. circulans С2/2 от бактериоцина, продуцируемого штаммом B. circulans 1580, который имел молекулярную массу 3,5 кДа и был чувствителен к протеазам [Svetoch, et al., 2005].

Таким образом, образцы БПС штаммов Ск2ч и С2/2 B. circulans по основным биологическим и физико-химическим свойствам практически не отличаются друг от друга.

При этом, по молекулярному весу они значительно отличаются от антибиотиков, продуцируемых представителями этого же вида бацилл – полимиксина М (1157 Да), бутирозина (1050 Да) и циркулина (854 Да).

Исследование спектра и величины антимикробной активности. Образцы БПС штаммов Ск2ч и С2/2 B. circulans имели выраженную ингибирующую активность в отношении ряда грамотрицательных бактерий, в том числе обладающих резистентностью к антибиотикам. Так, если для Escherichia coli (штаммы M17, 3R, O157:H7, 4/10R) по методу «spot-test» размер зоны ингибирования составил – 15–17 мм, для Salmonella Enteritidis (штаммы 237, 92 rif100, 204) – 11–12 мм, для Yersinia pseudotuberculosis 699 – 15 мм и Klebsiela pneumonia 964R – 13 мм, то для Listeria monocytogenes 776 и Staphylococcus aureus MR 218, всего 2–3 мм. Данные по оценке величины минимальных ингибирующих концентраций препаративного образца БПС B. circulans Ск2ч в отношении антибиотикорезистентных клинических изолятов микроорганизмов представлены в табл. 5.

Таблица 5 – Минимальные подавляющие концентрации (МПК) образца БПС штамма B. circulans Ск2ч в отношении антибиотикорезистентных клинических изолятов микроорганизмов Тестируемый штамм (*) определяли по методу [Bradford, 1976]. Исходная концентрация протеина – 27,2 мкг/мл; растворимой части – 25 мг/мл.

Как следует из представленных данных, образцы препаратов БПС штаммов Ск2ч и С2/2 B. circulans, полученные по разработанной технологии, ингибируют рост ряда бактериальных патогенов, в том числе представителей родов Salmonella, Campylobacter и Escherichia, включая штаммы, резистентные к антибиотикам.

Глава 6 посвящена изучению возможностей практического применения антимикробных продуктов B. circulans в опытах на мелких животных и цыплятах с оценкой переносимости ими БПС, а также по защите пищевой продукции в составе полимерных покрытий. В опытах на мышах после 7 дней кормления сухим кормом, пропитанным БПС, не отмечали изменений в поведенческой активности животных и не наблюдали заметных изменений в составе аэробной микрофлоры кишечника. Сделали вывод о том, что препарат БПС, инкорпорированный в состав стандартного корма в количестве 100 мг на 1 гранулу (700 мг) из расчета на одну мышь, хорошо и без последствий переносится животными. В опытах по оценке токсичности на мышах при внутрибрюшинной инъекции стерильной суспензии, приготовленной на основе сухой субстанции БПС в концентрациях до 100 мг/мл, величина LD50 составила 5000 мг/кг, что соответствует категории малотоксичных препаратов.

В табл. 6 приведены результаты опыта по оценке лечебной эффективности сухого корма, приготовленного с добавлением бесклеточного супернатанта B. circulans Ск2ч, для экспериментальной группы бройлеров, которые естественным образом были инфицированы патогенным для человека возбудителем кампилобактериоза – Campylobacter jejuni.

Таблица 6 – Лечебное действие корма, содержащего супернатант культуры B. circulans Ск2ч при трехдневном кормлении 35- суточной бройлерной птицы Группа цыплят №№ кур слепом отростке кишечника Контрольная:

Опытная:

корм «ПК-6», содержащий супернатант B.circulans * (*) получали смешиванием стандартного сухого корма ПК-6 с бесклеточным супернатантом 48 ч бульонной культуры B.circulans Ск2ч и последующим высушиванием корма конвективным методом Из представленных в табл. 6 данных следует, что кормление цыплят кормом, содержащим продукты ферментации B. circulans Ск2ч, приводит к достоверно значимому уровню падения (на 3,5 log) концентрации кампилобактерий в кишечнике птицы.

Известны попытки использования бактериоцинов, в частности низина, в составе полимерных пленок для защиты мясных продуктов от микробной порчи и ослизнения, однако этот бактериоцин активен только против узкого спектра грамположительных бактерий. На основе поливинилового спирта и БПС штаммов B. circulans и Р.polymyxa 602 изготовили защитные пленки и провели опыты для оценки возможности их нанесения на пищевые продукты в качестве биологического средства бактериальной деконтаминации.

На примере покрытия мясных изделий (нарезок сосисок) полимерами, содержащие бесклеточные стерильные супернатанты бактериоцинпродуцирующих бацилл, показана реальная возможность существенного снижения уровня их естественной контаминации.

Таким образом, результаты опытов с использованием бройлерных цыпляткампилоносителей и скоропортящихся мясных изделий дают основание для практического применения БПС штаммов B. circulans при создании новых средств с обеззараживающими и деконтаминирующими свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Из природных источников выделили, изучили и депонировали в Государственной коллекции микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск» пять новых штаммов B. circulans, которые являются источниками антимикробных соединений пептидной природы.

2. Изучили питательные потребности новых штаммов B. circulans, разработали условия и режимы приготовления КЖ, обеспечивающие уровень выхода антимикробных соединений, приемлемый для создания лабораторных технологий.

3. Разработали лабораторную технологию приготовления препаратов БПС штамма B. circulans, включающую стадии культивирования, концентрирования КЖ и получения препаратов БПС в количестве, достаточном для всесторонней оценки их биологических и физико-химических свойств.

4. БПС штамма B. circulans Ск2ч имеет, по данным трицин-ДСН-ПААГэлектрофореза, молекулярную массу около 6 кДа. Соединение устойчиво к действию протеолитических ферментов, выдерживает нагревание при 121 °С в течение 15 мин, разрушается при автоклавировании в щелочных зонах рН (10 – 11), и по этим свойствам отличается как от ранее описанного бактериоцина штамма B. circulans 1580, так и от антибиотиков группы полимиксинов.

5. Экспериментальные образцы препаратов БПС штамма B. circulans Ск2ч ингибируют рост ряда бактериальных грамотрицательных и грамположительных патогенов, в том числе представителей родов Salmonella, Campylobacter и Escherichia, включая их варианты, резистентные к антибиотикам.

6. Экспериментальные образцы БПС штамма Ск2ч безвредны для мышей и цыплят при пероральном способе введении в составе сухих кормов, а, по данным внутрибрюшинного введения белым мышам, относятся к группе слаботоксичных веществ (LD50 = 5000 мг/кг).

7. Результаты опытов с использованием бройлерных цыплят и вареных мясных продуктов показывают возможность использования БПС в составе лечебных кормов, защитных полимерных покрытий, а также при разработке обеззараживающих и деконтаминирующих биологических средств нового поколения.

А) Статьи в рецензируемых журналах:

1. Похиленко В. Д., Перелыгин В.В., Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Храмов В.М.

Культуральные особенности бацилл группы circulans-subtilis-polymyxa как продуцентов бактерицидных веществ широкого спектра действия. // В мире научных открытий. – 2010. - № 5 (11). – Часть 1. – С. 64–72.

2. Храмов В.М., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.

Поиск антагонистически активных энтерококков, получение и свойства синтезируемых ими бактерицидных веществ // В мире научных открытий. – 2010. – № (11). – Часть 4. – С. 41–46.

3. Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Перелыгин В.В., Похиленко В.Д. Получение и оценка эффективности антимикробных полимерных покрытий на основе бактерицидных веществ Bacillus circulans и Paenibacillus polymyxa // Биомедицинский журнал «Medline.ru». – 2011. – Том 12 (121). – Микробиология. – С. 1478–1486.

4. Калмантаев Т.А., Храмов В.М., Перелыгин В.В., Похиленко В.Д. Новые сферы применения некоторых антагонистически активных штаммов бацилл // Наука Красноярья. – 2012. – №1. – С. 29–38.

5. Калмантаев Т.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Разработка способа получения антимикробных веществ Bacillus circulans: влияние состава питательной среды и условий культивирования продуцента. //. Тезисы из материалов І школы - конференции молодых ученых и специалистов. – 2009. – С. 183–184.

6. Храмов В.М., Калмантаев Т.А.,Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Новый штамм Streptococcus faecium 3322 и бактериоцин Е-3322, обладающий антилистериозной активностью. // Тезисы из материалов ІІ школы - конференции молодых ученых и специалистов. – 2010. – С. 338–340.

7. Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Новые бактериоциноподобные вещества антагонистически активной группы бацилл. // Тезисы из материалов ІІ школы-конференции молодых ученых и специалистов. – 2010. – С. 324–325.

8. Калмантаев Т.А., Храмов В.М., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.

Получение и исследование бактериоциноподобных субстанций из культуральной жидкости штамма продуцента Bacillus circulans Cк2ч. // Тезисы из материалов научно-практической школы - конференции молодых ученых и специалистов. – 2011.

– С. 263–265.

9. Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.

Антимикробные полимерные покрытия: пример использования бактерицидных веществ, продуцируемых группой Bacillus circulans. // Тезисы из материалов научно-практической школы- конференции молодых ученых и специалистов. – 2011. – 10. Храмов В.М., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.

Оценка возможности использования концентратов бактериоцинов в качестве кормовой добавки // Журнал Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2011. – № 4. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (СанктПетербург, 24–25 ноября 2011 г.). – М40 – М41.

моим руководителям – д.т.н. Похиленко В.Д и к.б.н. Перелыгину В.В. за ценные консультации и оказанную помощь при выполнении диссертации;

профессору Светочу Э.А. за помощь в организации проведения экспериментов и ценные консультации;

сотрудникам отдела биологических технологий Садиковой Г.Т., Чукиной И.А., сотрудникам отдела молекулярной биологии к.м.н. Мицевичу Е.В., Мицевич И.П. за помощь и содействие в работе;

ФБУН ГНЦ ПМБ, в лице директора чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Дятлова И.А., за предоставленную возможность провести необходимые эксперименты и выполнить данную работу.