На правах рукописи
ЧУДИНОВ Алексей Владимирович
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИЙ
ДЕЙТЕРОВОДОРОДНОГО ОБМЕНА ИОНОВ БИООРГАНИЧЕСКИХ
МОЛЕКУЛ С ДЕЙТЕРОАММИАКОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
РАДИОЧАСТОТНОГО СЕГМЕНТИРОВАННОГО КВАДРУПОЛЯ В
КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ИОННОГО РЕАКТОРА
01.04.17 – химическая физика, в том числе физика горения и взрываАВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук
Черноголовка 2007 г.
Работа выполнена в Филиале Института энергетических проблем химической физики РАН в лаборатории «Масс-спектрометрия в энергетике и экологии»
Научный руководитель: доктор физико-математических наук Зеленов Владислав Валерьевич
Официальные оппоненты: кандидат физико-математических наук Сурин Алексей Константинович доктор физико-математических наук Морозов Игорь Иллиодорович
Ведущая организация: Институт проблем химической физики РАН
Защита диссертации состоится «»_2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.112.01 при Институте энергетических проблем химической физики РАН по адресу: 119334 Москва, Ленинский проспект, 38, корпус 2, ИНЭПХФ РАН, актовый зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН
Автореферат разослан «»_2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.112. кандидат химических наук Николаева М.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность:
1. Перспектива расширения аналитических возможностей метода массспектрометрии, как инструмента для изучения особенностей газофазной конформационной структуры биологических ионов.
2. Информация об устойчивых конформационных состояниях биомолекул в газовой фазе имеет как фундаментальную, так и практическую ценность.
Сюда можно включить:
• изучение влияния водной среды на процесс организации и функционирования биологических макромолекул, • уточнение природы внутримолекулярных взаимодействий, ведущих к формированию нековалентных структур в биологических системах.
3. Потребность в определении мест селективного протонирования в газофазных ионах белков и полипептидов для более глубокого понимания механизмов перехода таких ионов в вакуум в современных источниках ионизации: MALDI и ESI.
Целью настоящей работы является:
Исследование возможности использования сегментированного радиочастотного квадруполя, расположенного в атмосферном интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов, в качестве ион-молекулярного реактора для изучения кинетики реакций H/Dобмена в биоорганических ионах.
Для достижения поставленной цели были сформулированы задачи:
• Разработка методики численной обработки временной последовательности экспериментально полученных масс-спектров дейтерированных продуктов для вычисления кинетических параметров реакций изотопного обмена.
• Реализация экспериментального метода исследования, включая:
полипептидов в продольном электрическом поле сегментированного радиочастотного квадруполя.
b) Исследование кинетики H/D-обмена ряда биомолекулярных ионов с дейтерированным аммиаком внутри сегментированного радиочастотного квадруполя при задании времени контакта этих ионов с газом-реагентом напряженностью продольного электрического поля и последующим детектированием ионов-продуктов времяпролетным массспектрометром с ортогональным вводом ионов.
Основные защищаемые положения:
• Методика численной обработки масс-спектров молекулярных ионов аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе протекания процесса H/Dобмена в этих ионах.
аминокислот с молекулами дейтероаммиака через диссипацию избыточной энергии на внутренних степенях свободы этих комплексов.
аминокислот, усредненные по всем наблюдаемым процессам H/D-замещений дейтерированного аммиака в качестве дейтерирующего агента.
• Разрешение групп активных атомов водорода, участвующих в реакциях H/D-обмена с разными скоростями, в ионах грамицидина S и лейцинэнкефалина.
Научная новизна:
• Предложена оригинальная методика расчета кинетических параметров H/D-обмена, которая использует связь наблюдаемых интенсивностей массспектральных линий с концентрацией активных центров исходного ионареагента. Разработанный подход применим для сложных биоорганических молекул, для которых изотопное распределение является неразрешенным.
• Продемонстрированы возможности сегментированного радиочастотного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора для исследования H/Dобмена в биомолекулярных ионах.
Научная и практическая ценность:
• Разработанный метод определения кинетических параметров процесса H/D-обмена в сложных биоорганических ионах является универсальным. Он применим для широкого круга ионов биомолекул и газов-реагентов.
• Сегментированный радиочастотный квадруполь, предлагаемый в качестве применяться как атмосферный интерфейс во времяпролетных массспектрометрах с целью расширения их аналитических возможностей.
Личный вклад автора:
Автором разработана численная методика для исследования кинетики реакций изотопного обмена при масс-спектрометрическом детектировании продуктов реакции. Автор непосредственно участвовал в обосновании, постановке и проведении всех экспериментов, их интерпретации и обобщении полученных результатов.
Апробация работы:
Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях:
Международная конференция “Desorption-2004”, Санкт-Петербург, Россия, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых); Международная конференция американского массспектрометрического общества, Conference on Mass Spectrometry and Allied проблемы», Москва, 2005; Конференция «Научные школы Черноголовки молодежи», Черноголовка, 2006; 3-я Международная конференция–школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 2007, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых).
Объем и структура диссертации:
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 110 страниц, включая 42 рисунка и 7 таблиц. Список литературы содержит наименование.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение. Обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость.
экспериментов, подтверждающих возможность существования устойчивых конформационных состояний у биомолекулярных ионов в газовой фазе. Дано краткое описание методов исследования газофазных конформационных структур белковых молекул с использованием массспектрометрии. Сделан детальный обзор по исследованию конформационных состояний молекулярных ионов белков и полипептидов в газовой фазе с использованием реакций газофазного H/D-обмена с последующим масс-спектрометрическим детектированием образующихся продуктов. Описаны преимущества и особенности методики, используемой в диссертационной работе.
Глава 2. Методика проведения экспериментов. Описана экспериментальная установка. Приведен список используемых реактивов. Описана процедура проведения экспериментов и подходы, используемые при изучении Экспериментальная установка представляет собой времяпролетный масс-спектрометр с ортогональным вводом ионов (о-ВПМС). Ионы используется сегментированный радиочастотный квадруполь (RFQ) (рис. 1), находящийся во второй ступени дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС. Ионы попадают внутрь реактора из первой ступени дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС (рис. 1(1)).
Под действием эффективного потенциала радиочастотного поля (рис. 1(7)) и соударений с молекулами газа ионы стягиваются к оси RFQ. Под действием постоянного продольного электрического поля (рис. 1(6)) ионы двигаются с постоянной дрейфовой скоростью в атмосфере буферного газа ко входу во времяпролетный масс-анализатор. Основной составляющей буферного газа является N2 газовой завесы источника ESI. Время нахождения ионов внутри RFQ определяется формулой:
электрического поля, – подвижность исследуемых ионов в электрическом поле.
Измерение подвижности в электрическом поле ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys), а также двух- и непосредственно в процессе выполнения работы по методике, разработанной ранее. В диссертации приводится описание этой методики и таблица с полученными значениями ионных подвижностей.
6 – принципиальная электрическая схема подачи постоянного электрического поля на RFQ; 7 – принципиальная электрическая схема подачи радиочастотного электрического поля на RFQ; 8 – орто-время-пролетный масс-спектрометр.
Для проведения реакций H/D-обмена внутрь RFQ через игольчатый вентиль рис. 1(3) подавалась дейтерирующая смесь, представляющая собой ND3, разбавленный в N2. Концентрация дейтерирующего агента в реакторе рассчитывалась по формуле:
где - содержание ND3 в дейтерирующей смеси в долях; p- давление в реакторе, бар; p0 - остаточное давление воздуха в реакторе в отсутствие подачи дейтерирующей смеси, бар; nL- число Лошмидта ( n L = 2.44 1019 см- бар-1).
Все расчеты кинетики реакций в работе производили, пренебрегая переносом ионов вдоль оси RFQ за счет продольной диффузии на основании малости его вклада, что следует из выполнения неравенства:
где D – коэффициент диффузии, а k – эффективная константа реакции.
Неравенство (3) остаётся справедливым практически во всех случаях.
Глава 3. Модельное описание кинетики H/D-обмена в протонированных ионах аминокислот и полипептидов. Выведено уравнение, связывающее наблюдаемую зависимость изотопного распределения относительных изменением содержания атомов дейтерия (D) в независимых реакционных центрах. Предложена кинетическая модель обратимого протекания реакций H/D-обмена и на её основе предложен метод расчета кинетических параметров H/D-обмена. Оценена чувствительность этого метода.
Величина сдвига изотопного распределения в результате реакции H/D-обмена может быть выражена через относительные интенсивности массспектральных пиков изотопного распределения иона в виде:
где Ij – относительная интенсивность j-го пика. Иону, содержащему только самые легкие изотопы в уравнении (4), присваивается порядковый номер j=0.
интенсивностей пиков в масс-спектре их относительным концентрациям в долях от суммарной концентрации наблюдаемых ионов-продуктов:
Процесс H/D-обмена представляет собой сумму химических реакций, приводящих к накоплению атомов D в независимых реакционных центрах ионов биомолекул:
где niH - количество активных атомов в i-том независимом центре, ni(t) – относительная концентрация атомов D в i-том центре в момент времени t, параметр введен для учета природных изотопов, присутствующих в исходных ионах (=(0)). Каждая функция ni(t) является решением системы дифференциальных кинетических уравнений, описывающих кинетику изменения относительной концентрации атомов D в i-том центре по всем возможным продуктам.
Для больших молекул белков в высоких зарядовых состояниях пики отдельных ионов в изотопном распределении могут быть неразрешимы. В этом случае предлагается метод вычисления величины сдвига изотопного распределения с использованием следующего выражения:
где I(M/z) – интенсивность масс-спектра в точке с абсциссой M/z, величина Mmin соответствует молекулярной массе иона, содержащего только самые легкие изотопы, а Mmax – самые тяжелые. В диссертационной работе приводится доказательство справедливости уравнения (6).
Для численной обработки экспериментальных данных по кинетике H/D-обмена в работе использовано аналитическое выражение, следующее из рассмотрения реакции замещения каждого отдельного атома H на атом D, как независимого процесса. Уравнение (5) с точки зрения предлагаемой модели будет иметь вид:
где