На правах рукописи

СКОБЕЕВА Виктория Александровна

ИЗМЕНЧИВОСТЬ КОЛИЧЕСТВЕННО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ

ГАСТРУЛЯЦИИ АМФИБИЙ И ЕЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.03.05 – биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре биологической эволюции Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Черданцев Владимир Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Белоусов Лев Владимирович кафедра эмбриологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова доктор биологических наук Самсонова Мария Георгиевна отдел компьютерной биологии Центра Перспективных Исследований Санкт-Петербургского Политехнического Университета

Ведущая организация Институт биоорганической химии им.

академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «15» ноября 2011 г. в 15.:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 в Московском Государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Московский Государственный университет имени М.В. Ломоносова, д.1 стр. 12, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан « » октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

По мере накопления данных об изменчивости количественно-морфологических признаков живых организмов все острее встает проблема их интерпретации. Общепринятое разложение фенотипической дисперсии на компоненты (Falconer, 1981) основывается на представлении, согласно которому изменчивость целиком обусловлена генотипом, средой и их взаимодействием. К средовой компоненте относят и различия в изменчивости повторяющихся частей организма, и единственным исключением считается дисперсия, возникающая в результате случайных «ошибок развития» (developmental noise, или intangible variation, см. Falconer, 1981). В рамках господствующей в современной биологии развития парадигмы однозначной детерминация развития структур совместными усилиями генотипа и среды, изменчивость, обусловленная «ошибками» развития, вообще не может иметь биологического значения и в лучшем случае является показателем качества условий, в которых находится и развивается зародыш. При такой каузальной установке «шум развития»

ничем принципиально не отличается от теплового движения молекул, его источником служат случайные колебания, например, концентраций морфогенов, или случайная неравномерность клеточных делений в разных частях зародыша (Суле, 1984).

Следовательно, в начале развития изменчивость должна быть минимальной, постепенно нарастая к его концу, поскольку чем дольше происходит процесс, тем больше времени на накопление случайных ошибок. Изменчивость признаков взрослого организма должна быть гораздо выше изменчивости признаков в начале формирования биологических структур, изза того, что «совершенная» программа развития сталкивается с несовершенством реального мира. На фоне становления неравновесной термодинамики и открытия диссипативных структур, возникающих на основе случайных флюктуаций (Николис, Пригожин, 1979), такая концепция выглядят анахронизмом, точно таким же, как представление о разложимости развивающегося зачатка на потенциально бесконечное число блоков, каждый из которых может иметь собственную изменчивость (Суле, 1984).

А. Г. Гурвич (1911) был первым, кто обратил внимание на то, что морфологическая изменчивость эмбриональных структур in status nascendi может быть выше изменчивости этих структур в дефинитивном состоянии. В сравнительной эмбриологии накоплен огромный экспериментальный материал, показывающий возможность фиксации новых направлений развития структур на основе случайного выбора (Beloussov, 1998; Черданцев, 2003) из-за потери устойчивости систем морфогенетических корреляций в процессе их перестройки при нормальном ходе развития. Поэтому возможно, что изменчивость морфогенеза нельзя считать только результатом накопления случайных ошибок, т. е., случайных отклонений развития от запрограммированного пути. Уровень изменчивости, неизбежно меняющийся в ходе нормального развития из-за разрушения исходных и возникновения новых морфогенетических корреляций, может иметь сигнальное значение, не менее важное, чем концентрация информационных молекул.

Интерес к этой проблеме особенно возрос в последнее десятилетие, когда изучение изменчивости зональной экспрессии генов в эмбриогенезе дрозофилы (Houchmandzadeh et al, 2002; Jaeger et al., 2004; Самсонова и др., 2008; Surkova et al., 2008) показало, что эта изменчивость максимальна на ранних этапах разметки пространственной структуры и снижается по мере ее завершения. Объяснение канализации генной экспрессии можно искать, не выходя за пределы собственно взаимодействия генов (Самсонова и др., 2008;

Surkova et al., 2008), однако не менее продуктивным представляется изучение обратных связей между внутренней динамикой развития эмбриональных зачатков и их геометрической формой (Черданцев, 2003; Cherdantsev, 2006). Построению таких моделей мешает отсутствие количественных данных об организации и динамике нормальной изменчивости раннего морфогенеза, а также методов анализа изменчивости количественно-морфологических признаков, учитывающих ее вклад в организацию нормального морфогенеза, прежде всего, коллективных морфогенетических движений клеток эмбриональных тканей.

Цели и задачи исследования.

Цель работы – на примере гаструляции нескольких видов бесхвостых амфибий изучить, с помощью статистических методов анализа, причины и общие закономерности изменчивости количественно-морфологических признаков эмбриональных структур, связанной с процессом их формирования, и оценить роль этой изменчивости в нормальном формообразовании.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Минимизировать влияние внешних воздействий, а также генетических различий, на ход развития, обеспечив зародышам максимально комфортные условия и ограничившись изучением сибсов.

2. Адаптировать обычные методы корреляционного и факторного анализа к изучению изменчивости морфогенетических движений гаструляции, так чтобы основные направления изменчивости анализируемых количественноморфологических признаков имела ясную геометрическую и механическую 3. С помощью стандартного набора количественно-морфологических признаков исследовать динамику изменчивости формы и внутреннего строения зародышей на последовательных этапах гаструляции, анализируя фиксированный материал и индивидуальные траектории развития живых 4. Провести сравнительно-морфологический анализ организации изменчивости у двух видов рода Rana (R. temporaria и R. arvalis) и чесночницы (Pelobates fuscus), пытаясь проследить пути и закономерности перехода индивидуальной и внутри-индивидуальной изменчивости в таксономические Материалом для решения поставленных задач были взяты кладки бесхвостых амфибий рода Rana и рода Pelobates, развивающиеся в оптимальных условиях температуры и аэрации. В первую очередь изучалась изменчивость признаков дорсальной губы бластопора, как структуры, существующей только в период гаструляции и являющейся организатором развития осевых структур зародыша, необходимых для его дальнейшего развития.

Научная новизна работы.

Впервые на уровне количественно-морфологического анализа стандартного набора признаков, характеризующих отдельные компоненты гаструляционных движений и их взаимодействие, изучена нормальная изменчивость гаструляции бесхвостых амфибий в максимально благоприятных условиях среды и при минимальном вкладе генетических различий. Показано, что и в таких условиях изменчивость структур в процессе их формирования на порядок выше их изменчивости в дефинитивном или стационарном состоянии.

Впервые установлена общая закономерность динамики нормальной морфологической изменчивости, единая для всех изученных признаков у всех изученных видов амфибий:

изменчивость максимальна при инициации новых для данной стадии развития эмбриональных структур, а затем уменьшается. Установлена положительная связь между уровнем изменчивости признаков на данной стадии гаструляции и темпами их направленного изменения на ближайшей по времени стадии. В основе индивидуальной изменчивости лежат внутри-индивидуальные различия, возникающие в процессе формирования структуры и исчезающие по завершении ее морфогенеза.

С помощью статистического анализа индивидуальных траекторий гаструляции впервые доказано их реальное существование и, в то же время, низкий уровень их устойчивости. Впервые показано отсутствие монотонности изменений формы дорсальной губы бластопора в процессе основного гаструляционного движения.

Впервые проведено сравнение устойчивости индивидуальных траекторий морфогенеза у двух близких видов амфибий (остромордой и травяной лягушки). Травяная лягушка оказывается производным видом, отделение которого от остромордой лягушки связано с дестабилизацией индивидуальных траекторий гаструляции в результате отбора, направленного на акселерацию развития.

Теоретическое и практическое значение.

Результаты работы позволяют выделить собственную изменчивость морфогенеза как особую компоненту изменчивости, не сводящуюся ни к взаимодействию его генетической и средовой компоненты, ни к накоплению «ошибок развития». Уровень нормальной изменчивости морфогенеза следует рассматривать как важное звено в системе морфогенетических сигналов, информирующее развивающуюся систему о состоянии системы морфогенетических корреляций. Выявленные общие закономерности пространственно-временной динамики изменчивости морфогенеза позволяют объяснять многие общеизвестные, но не имевшие объяснения факты, такие как повышенная изменчивость структур, формирующихся в онтогенезе в последнюю очередь, правило Спалланцани, и, в более общем виде, связь между уровнем изменчивости сериальногомологичных элементов структуры пространственно-временному порядку их формирования.

Результаты работы позволяют использовать методы статистического анализа, прежде всего, факторного анализа, для реконструкции структуры коллективных морфогенетических движений и могут быть применены в любых исследованиях, в которых стоит такая задача.

По уровню нормальной изменчивости можно оценивать темпы формообразования, а также выделять процессы, имеющие на данной стадии развития собственную динамику, и отличать их от процессов, динамика которых зависит от предшествующих стадий развития.

Апробация работы и публикации.

Материалы и основные положения диссертации доложены на Шестой Международной Конференции по Биоинформатике Регуляции и Структуры Генома (Новосибирск, 2008), I, II и III конференциям Meeting of the European Society for Evolutionary Developmental biology (EED) (Прага, 2006, Гент, 2008, Париж 2010). По материалам работы опубликованы три статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Работа включает введение, 7 глав, выводы и список литературы. Диссертация изложена на 203 страницах, включает 78 рисунков и таблицs. Список литературы состоит из источников, в том числе – на иностранных языках.

Сформулированы цели и задачи исследования, обоснованы актуальность темы, ее научная новизна, теоретическое и практическое значение.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор начинается с изложения традиционного подхода к анализу изменчивости количественно-морфологических признаков и его применимости к анализу изменчивости развивающихся структур. Данные об изменчивости структур в процессе их формирования крайне скудны, а из огромного массива данных по изменчивости дефинитивных признаков ближе всего к проблемам развития данные по внутри-индивидуальной изменчивости структур с модульной организацией.

Обзор многочисленных работ по флюктуирующей лево-правой асимметрии билатерально симметричных структур показывает, что два самых важных вопроса остаются нерешенными. Не ясно, является ли такая асимметрия следствием внутренней дестабилизации морфогенеза, или же средового стресса. Не ясно также, к какой из компонент разложения фенотипической дисперсии принадлежит эта изменчивость. Если она относится к средовой компоненте, то как объяснить данные, свидетельствующие об эффективности отбора? Если же она имеет ненулевую аддитивную компоненту и адаптивную ценность, то загадкой становится ее высокий уровень, превышающий уровень изменчивости обычных фенотипических признаков.

Аналогичные проблемы возникают с внутри-индивидуальной изменчивостью признаков повторяющихся структур (метамеров или антимеров). Повторяемость таких структур в пределах особи является не пространственной, а пространственно-временной, так их расположение является следствием очередности их формирования. В количественной генетике внутри-индивидуальную изменчивость относят к средовой компоненте, но этому противоречат две группы фактов. Между уровнем изменчивости одинаковых признаков разных метамеров существуют устойчиво воспроизводимые различия, зависящие исключительно от порядка формирования метамеров в онтогенезе, а изменение уровня изменчивости часто оказывается косвенным следствием отбора по важным для приспособленности признакам. Еще больше проблем возникает в случаях, когда повторяющиеся структуры являются антимерами (например, зубные бугорки), а число этих структур варьирует. В обзоре доказывается несостоятельность попыток объяснения различий в уровне изменчивости «эффектом шкалы».

Более реалистичным и простым является объяснение, основанное на прямом участии механизма морфогенеза данной структуры в определении уровня и направлений ее изменчивости. В частности, зависимость уровня изменчивости элементов от порядка их формирования в онтогенезе может объясняться различием их биологического возраста. Это позволяет сформулировать более общую гипотезу, по которой изменчивость, возникающая в процессе развития структур, является не помехой, а фактором их нормального морфогенеза.

По-видимому, эта изменчивость представляет собой нечто совершенно отличное от изменчивости структур в их дефинитивном состоянии и в принципе не укладывается в традиционную схему противоборства генетической программы развития со случайным шумом.

Это подчеркивает необходимость и актуальность прямого исследования изменчивости нормального морфогенеза и ее источников. В качестве объекта выбрана гаструляция у трех видов бесхвостых амфибий, принадлежащих к двум разным родам, и во второй части обзора анализируются данные о механизме и механике гаструляции амфибий, и данные об их генетической регуляции. Подчеркивается, что гаструляционные движения складываются из нескольких относительно независимых, но при этом взаимодействующих друг с другом блоков, что позволяет использовать корреляционный и факторный анализ не только для изучения изменчивости, но и для реконструкции структуры морфогенетических движений гаструляции. По организации изменчивости можно судить о геометрии и механике формообразования, и наоборот, сама изменчивость может являться прямым следствие геометрии движения эмбриональных клеточных пластов.

В заключительной части обзора анализируется природа таксономических различий в гаструляции бесхвостых амфибий и возможные факторы эволюции гаструляции. Анализ сравнительного материала позволяет предполагать, что таксономические различия возникают из-за внутри-индивидуальных гетерохроний развития одних и тех же морфогенетических блоков гаструляции, и для ее успешного завершения (эквифинальности) достаточно просто их наличия. Тем самым возникает возможность дивергенции таксонов на основе внутреннего резерва даже не индивидуальной, а внутри-индивидуальной изменчивости. Основными нерешенными проблемами являются причины возникновения таких гетерохроний, фиксация внутри-индивидуальных различий на генетическом уровне и их связь с приспособленностью.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

В работе использованы кладки икры бесхвостых амфибий R temporaria (травяная лягушка), Rana arvalis (остромордая лягушка) и Pelobates fuscus (чесночница). Кладки R.

temporaria и R. arvalis были собраны в водоемах Московской области, в естественный сезон размножения каждого вида а кладки икры P. fuscus – в Киевской области на естественных нерестилищах. Для минимизации влияния на изменчивость факторов, не связанных собственно с морфогенезом, в работе использовали икру, отложенную особями природных популяций в сезон размножения, причем зародыши каждой анализируемой группы были сибсами. Для выравнивания температурных условий и условий аэрации галлерты разрыхляли до образования монослоя, после чего икра развивалась в лаборатории при температуре 16-16,5°для P. fuscus и R. temporaria, и 18° для зародышей R. arvalis. В таких условиях гибель зародышей на эмбриональных стадиях развития (до начала вылупления) была меньше 1%. Изменчивость анализировали на фиксированном материале и у живых зародышей путем повторных прижизненных измерений.

Зародышей R. temporaria и R. arvalis фиксировали на последовательных стадиях дробления и гаструляции, ориентируясь на «табличные» стадии нормального развития травяной лягушки (Дабагян, Слепцова, 1975): стадии 4 (8 бластомеров), 6 (32 бластомера), (инициация гаструляции), 12 (серповидный бластопор) и 13 (полукруглый бластопор). Во время гаструляции фиксации производились через равные промежутки времени (2,5 – 3 часа при указанных выше температурах). Зародышей P. fuscus фиксировали во время гаструляции на стадиях 1, 2, 3 и 4 через такие же промежутки времени, где стадия 1 соответствует стадии инициации гаструляции у лягушек (Скобеева, Черданцев, 1999).

У фиксированных зародышей изучали наружную морфологию и внутреннее строение на анатомических срезах. Зародышей фиксировали вместе с галлертами 7,5% формальдегидом, приготовленным на стандартном растворе Гольфретера. Для приготовления анатомических срезов зародышей извлекали из галлерт и желточных оболочек, а затем бритвой разрезали в сагиттальной плоскости.

В выборе измеряемых признаков мы руководствовались следующими соображениями.

Во-первых, реперные точки измеряемых признаков должны были соответствовать естественным геометрическим особенностям строения гаструлы. Во-вторых, для каждого признака должно было быть известно основное направление его изменение при нормальном ходе гаструляции. Схемы измерения признаков представлены на рис. 1 и 2. Линейные характеристики были измерены с помощью окуляр-микрометра и выражены в условных единицах (0,01мкм), угловые характеристики – с помощью гониометра Wild-320, приспособленного к обычному бинокулярному микроскопу МБС-11. Для обозначения морфологических признаков мы использовали буквенные обозначения, представляющие аббревиатуры английских названий соответствующих морфологических структур.

Уровень изменчивости измеренных признаков оценивали по величине коэффициентов вариации (CV). Помимо изучения динамики частотных распределений измеренных признаков, задачей статистического анализа была реконструкция структуры морфогенетических движений на предгаструляционных и гаструляционных стадиях развития. Для этого использовали корреляционный и факторный анализ. Вычисленные корреляции признаков изображали в виде корреляционных графов, но из-за сложности их структуры для ее изучения использовали факторный анализ, где каждый фактор представляет собой линейную сумму взвешенных вкладов дисперсии отдельных признаков в общую дисперсию (Окунь, 1974; Джеффрис, 1981). Во всех случаях общая дисперсия распределялась между двумя (редко тремя) главными компонентами (ГК) изменчивости, и первые две ГК всегда имели однозначную морфогенетическую интерпретацию. ГК- соответствовала совместному изменению признаков в составе доминирующего на данной стадии морфогенетического движения, а ГК-2 – движению, доминировавшему на предыдущей стадии, или подготовке движения, которому предстоит доминировать на следующей стадии гаструляции. Отрицательная связь признаков в составе ГК-2 служила критерием циклических изменений, происходящих на фоне общего роста значений признаков. Изучение индивидуальных траекторий также было основано на корреляционном и факторном анализе. Помимо средних значений и дисперсии признаков в каждой серии измерений, были вычислены удельные скорости изменения признаков V = (Mn+1 – Mn)/Mn, где Mn и Mn+1 – средние значения признаков в последовательных сериях измерений.

Числовые значения признаков нормировали по наименьшей величине значения данного признака в начальной серии измерений данного опыта. Наличие положительных корреляций между средними значениями признака в последовательных сериях измерений служило критерием наличия индивидуальных траекторий развития, а отрицательные корреляции между последовательными значениями величины V – критерием цикличности изменений.

Объем материала. Для R. temporaria на фиксированном материале изучены четыре кладки икры на стадиях раннего дробления (всего 240 зародышей), и четыре кладки на последовательных стадиях гаструляции. Одна кладка была использована в качестве модельной (всего 300 зародышей), и еще три – для сравнения с ней (по 60 зародышей каждой кладки). Изменчивость гаструляции R. arvalis изучена на пяти кладках, по 100 зародышей в каждой. Изменчивость и морфогенез зародышей P fuscus изучен на одной модельной кладке (всего 200 зародышей). Для прижизненного анализа гаструляции были использованы зародыши 11 кладок R. temporaria (всего 159 зародышей) и 5 кладок R. arvalis (всего зародышей).

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ НОРМАЛЬНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГАСТРУЛЯЦИИ

АМФИБИЙ В ВЫБОРКАХ СИНХРОННО ФИКСИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ.

Выделенные признаки можно разделить на три группы. У лягушек признаки первой группы (harc, aarc и larc) характеризуют форму и размеры «арки» дорсальной губы бластопора (ДГБ), впервые появляющейся только при инициации гаструляции. На стадии серповидного бластопора к Таблица 1. Характеристики распределения значений признаков гаструлы Rana temporaria на последовательных стадиях гаструляции.

Признак Величина Инициация Серповидный Полукруглый ним добавляются признаки gil и giav, характеризующие форму и размер крыши архентерона, а на стадии полукруглого бластопора новые признаки отсутствуют. Признаки второй группы (albaD, albaV, lth и dvd) характеризуют размер и форму краевой (супрабластопоральной) зоны гаструлы, которая начинает формироваться еще во время бластуляции, но окончательно оформляется только с началом гаструляции. Наконец, признаки blcav и vh относится к третьей группе признаков, измерение которых не зависит от появления ДГБ и может быть сделано еще во время дробления. У чесночницы к признакам первой группы добавляются характеристики вентральной губы бластопора (ВГБ), появляющейся одновременно с ДГБ на стадии 1, а признаки gilD, gilV, giavD и giavV впервые можно измерить на стадии 3.

У всех изученных видов наиболее высокие значения CV имеют признаки первой группы, а наиболее низкие – признаки второй и третьей групп, причем для признаков первой группы частотные распределения обычно отличаются от нормальных распределений (табл.

1). При логарифмировании ненормальных распределений они не нормализуются, что позволяет исключить влияние «эффекта шкалы». При сравнении зародышей разных кладок одного и того же вида, фиксированных на одной и той же табличной стадии развития, оказывается, что чем больше среднее значение признака в данной кладке (для признаков, значения которых при нормальном ходе гаструляции увеличиваются), тем меньше величина CV и сильнее ненормальность частотных распределений. У лягушек частотные распределения полностью нормализуются только на стадии серповидного бластопора, а у чесночницы – на стадии 4, т. е., на стадиях, на которых признаки первой группы отсутствуют.

Таким образом, удается вывести две общие закономерности. Во-первых, наиболее высокие величины CV (иногда больше 50%) имеют количественно-морфологические признаки структур, впервые появляющихся на данной стадии гаструляции, а по мере формирования этих структур их изменчивость сокращается. Такая динамика прямо противоположна тому, что можно было бы ожидать при накоплении «ошибок развития».

Увеличение масштабов изменчивости в начале формирования структуры, впервые возникающей у данного зародыша говорит о том, что эта структура, хотя ее появление предусмотрено генетической программой развития, возникает на основе самоорганизации.

Значит, генетическая программа развития вовсе не исключает того, что новые гены включаются у порога естественной потери устойчивости действующей системы морфогенетических корреляций. Во-вторых, при возникновении новой структуры частотные распределения характеризующих ее признаков не нормальны, что исключает простейшую модель направленного изменения количественных признаков, основанную на сдвиге моды нормального распределения. Как правило, в начале формирования структуры выделяются две группы зародышей, одна из которой, менее многочисленная, соответствует будущей, а другая, более многочисленная – исходной моде (рис. 3).

Рисунок 3. Распределения признака harc у зародышей Rana temporaria на последовательных стадиях гаструляции