На правах рукописи

Михайлова Юлия Владимировна

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕПАТИТА С

И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА,

ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО У НАСЕЛЕНИЯ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ

14.02.02 – Эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь – 2013 2

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Быстрова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

Василенко Надежда Филипповна - доктор биологических наук, профессор Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научноисследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологии Ковалишена Ольга Васильевна - доктор медицинских наук, доцент Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры эпидемиологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М.

Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «26» декабря 2013 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.109.01 при Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, д. 13-15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального казенного учреждения здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (355035, г. Ставрополь, ул. Советская, д. 13-15) Автореферат разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Жарникова Ирина Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы гепатита С (ГС) обусловлена повсеместным распространением, значительным социально-экономическим ущербом, высокой частотой хронизации, активным вовлечением в эпидемический процесс лиц репродуктивного и трудоспособного возраста (Быстрова Т.Н., 2010; Масалова О.В., 2011; Heller T. et al, 2005; Ghany M.G. et al., 2009; Albeldawi M., 2010). Несмотря на успехи, достигнутые в изучении ГС, многофакторность развития и сложность структуры эпидемического процесса до сих пор не позволили в полной мере раскрыть закономерности течения этой инфекции (Ершова О.В., 2006; Ющук Н.Д. и др., 2013). ГС отличается значительным преобладанием латентного компонента эпидемического процесса и выраженной территориальной неравномерностью по уровню заболеваемости и широте распространения инфекции, что обусловлено влиянием социальноэкономических факторов и географических условий (Исаева Н.В., 2003;

Шахгильдян И.В. и др., 2007; Заботина Е.Е., 2011).

Как и при других инфекциях с полиморфной клиникой, решение различных аспектов проблемы ГС, в том числе для целей эпидемиологического надзора, определяется используемыми методическими подходами для обнаружения специфических маркеров инфекции. Регламентированное нормативными документами определение косвенного маркера ГС - антител к вирусу ГС (анти-ВГС) - методом иммуноферментного анализа (ИФА) осложняется отсутствием стандартизации в интерпретации результатов и не позволяет диагностировать заболевание на ранних стадиях инфекции до сероконверсии (Рудой С.А. и др., 2009; Сидорова И.Ф., 2010;

Hmaied F. et al., 2006). Обнаружить латентную ГС-инфекцию позволяет определение молекулярно-генетических маркеров ВГС. Учитывая появившиеся сведения о новой форме скрытой ГС-инфекции (с наличием рибонуклеиновой кислоты (РНК) ВГС в ткани печени при не детектируемом уровне в сыворотке крови), особую диагностическую ценность в качестве доступного субстрата для исследования приобретают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), в которых РНК ВГС по разным данным выявляется в 24-90 % (Масалова О.В., 2011; Евплова И.А., 2012; Сastillo I. et al., 2004; Parm T.N.Q., 2010).

ВГС отличается высокой генетической гетерогенностью (Мукомолов С.Л. и др., 2003; Sherman M. et al., 2004; Kurbanov F. et al., 2008). Современная классификация (Simmonds P. et al., 1998) включает 6 генотипов, более 100 субтипов и множество квазивидов вируса. Качественное, количественное определение РНК и генотипа ВГС имеет не только безусловное клиническое значение для подбора схемы и контроля лечения, но и может быть перспективным для решения эпидемиологических задач (Чуланов В.П. и др., 2006; Ghany M.G. et al., 2009; Zeuzem S. et al., 2011). Несмотря на это, о распространенности отдельных генотипов ВГС в различных регионах России имеется ограниченное количество публикаций. Большинство из них отражают только доминирование отдельных генотипов ВГС в общей популяции населения, сведения об особенностях распределения субтипов у отдельных контингентов населения с учетом возраста и пола обследованных лиц встречаются редко (Калинина О.В., 2000; Сергеев И.П. и др., 2010; Казаченко М.Г., 2011). Кроме того, подобные исследования чаще носят одномоментный характер. Сравнительные данные по разнообразию генотипов ВГС за длительный период времени единичны (Цыганко Е.В. и др., 2007; Заботина Е.Е., 2011).

Учитывая предполагаемую взаимосвязь отдельных генотипов ВГС с определенными путями его передачи (Шустов А.В., 2003; Константинов Д.Ю. и др., 2007), изучение динамики изменений в структуре генотипов вируса является особенно актуальным для понимания тенденций распространения ГС на конкретной территории и прогнозирования эволюционных изменений эпидемической ситуации по ГС в целом.

Все вышеизложенное определяет целесообразность проведения исследований по изучению современных проявлений эпидемического процесса ГС с определением качественных и количественных параметров структуры генотипов ВГС по отдельным субъектам РФ для планирования региональной стратегии предотвращения дальнейшего распространения ГС-инфекции.

Цель исследования - с использованием молекулярно-генетических методов исследования установить особенности распространения ГС и генотипическую структуру вируса (на примере Нижегородской области) для совершенствования эпидемиологического надзора за инфекцией.

Основные задачи исследования:

1. На основе официальных статистических данных изучить динамику и тенденции заболеваемости острым, впервые выявленным хроническим ГС и носительства ВГС в г. Н. Новгороде с 1994 г. по 2012 г.

2. Изучить распространенность анти-ВГС и РНК ВГС среди различных контингентов населения.

3. Определить и охарактеризовать структуру генотипов ВГС, циркулирующего на изучаемой территории.

4. Изучить динамические изменения в генотипической структуре вируса, произошедшие за период с 1995 г. по 2011 г.

Научная новизна исследования На примере крупного города европейской части России получены новые знания об особенностях эпидемического процесса ГС-инфекции в современных условиях, проявившиеся в изменении динамики распространенности манифестного и латентного компонентов эпидемического процесса.

Впервые выявлены качественные и количественные параметры структуры генотипов ВГС, циркулирующего на территории Нижегородской области. Выявлены доминирующие субтипы вируса и их соотношение у различных контингентов населения, в зависимости от возраста и пола инфицированных лиц. Определены различия в структуре субтипов вируса при острой и хронической форме инфекции, при наличии моно- и микст-инфекции с вирусными гепатитами (ВГ) иной этиологии.

Установлена региональная неравномерность распространения генотипов ВГС.

Зафиксированы изменения, произошедшие в генотипической структуре ВГС на исследуемой территории за последние 17 лет, проявившиеся в снижении удельного веса субтипа 1b и роста доли субтипа 3а, в появлении с 2006 г. циркуляции ВГС субтипа 1а.

Практическая значимость исследования Проведенные исследования позволили определить тенденции многолетней динамики заболеваемости ГС в г. Н. Новгороде. Получены данные, касающиеся интенсивности распространения скрытопротекающей ГС-инфекции среди совокупного населения исследуемой территории, обосновывающие целесообразность внедрения обязательного тестирования на наличие РНК ВГС в алгоритм обследования серопозитивных и, особенно, анти-ВГС-негативных лиц из групп повышенного риска инфицирования. Одним из необходимых критериев оценки эффективности интерферонотерапии у больных хроническим ГС (ХГС) должен стать отрицательный результат на наличие РНК вируса в МКПК в течение 6-48 месяцев после проведенного лечения.

Для изучения эволюционных проявлений эпидемического процесса ГС в современных условиях показана необходимость исследования региональных особенностей генотипической структуры ВГС, особенно превалирующих генотипов.

Наблюдение за динамикой структуры генотипов ВГС должно явиться необходимой составляющей эпидемиологического надзора и контроля за ГС-инфекцией на конкретной территории.

Внедрение в практику. Материалы диссертации использованы при составлении двух аналитических обзоров: «Молекулярно-генетическая характеристика вируса гепатита С» (принят к использованию Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 22.09.2011 г. № 01/12124-1-26) и «Иммунологические и молекулярно-генетические методы в эпидемиологическом надзоре за гепатит С - инфекцией» (одобрен на Ученом совете ННИИЭМ протокол № от 30.05.2013 г. и направлен в Роспотребнадзор, исх. № 442 от 18.06.2013 г.). Материалы первого аналитического обзора использованы при составлении проекта СП «Профилактика вирусного гепатита С» (протокол совещания рабочей группы по созданию проекта от 15.02.2012 г.). По результатам диссертационного исследования составлен научный отчет «Геноварианты вируса гепатита С, циркулирующего среди населения Нижегородской области» (одобрен на Ученом совете ННИИЭМ протокол № 8 от 24.10.2012 г. и направлен в Роспотребнадзор, исх. № 999 от 26.10.2012 г.).

Результаты исследования внедрены в практику органов здравоохранения (акт внедрения от 23.09.2013 г.). Материалы работы используются в учебном процессе на кафедрах эпидемиологии и профилактической медицины факультета повышения квалификации врачей ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России (акт внедрения от 11.10.2013 г.).

Положения, выносимые на защиту 1. Рост заболеваемости впервые установленным ХГС, по сравнению с предшествующим трехлетним периодом, является неблагоприятным прогностическим признаком дальнейшего развития эпидемической ситуации в регионе.

2. На территории Нижегородской области циркулируют субтипы ВГС: 1а, 1b, 2, 3а, с доминированием в равной доле 1b и 3а. Структура генотипов ВГС характеризуется региональной неравномерностью. Соотношения субтипов ВГС отличаются у отдельных контингентов населения, в разных возрастных группах и зависят от пола обследованных лиц, стадии течения инфекционного процесса и наличия сочетанной ГС-инфекции с ВГ иной этиологии. Изменения в генотипической структуре ВГС на территории региона проявились в снижении удельного веса субтипа 1b и росте доли субтипа 3а, в появлении с 2006 г. циркуляции ВГС субтипа 1а.

3. Определение РНК и молекулярно-генетическая характеристика изолятов ВГС, циркулирующего на территории, являются необходимой составляющей эпидемиологического надзора за ГС-инфекцией для получения объективной информации о распространенности манифестного и латентного компонентов эпидемического процесса, установления эпидемиологических связей между отдельными случаями заболеваний, отслеживания изменений в структуре путей передачи.

Апробация работы. Материалы работы представлены на III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011) - работа отмечена дипломом I степени; XVI Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) (Н. Новгород, 2011); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора, посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной, «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Н. Новгород, 2011) - работа отмечена дипломом I степени; научнопрактической конференции школе-конференции молодых учных и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011) - работа отмечена почетной грамотой за I место; региональной научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Н. Новгород, 2012); III конференции молодых ученых и специалистов «Новые научные достижения молодых ученых в эпидемиологии, клинике, диагностике, лечении и профилактике инфекционных болезней» (Москва, 2012); I Всероссийской XII ежегодной научной сессии молодых ученых и студентов с международным участием «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2013) - работа отмечена дипломом победителя; межрегиональной научно-практической конференции «Основы управления заболеваемостью инфекционными и неинфекционными болезнями» (Н. Новгород, 2013); X научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - этиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2013).

В завершенном виде диссертационная работа доложена и обсуждена на совместном заседании Ученого совета, протокол № 5, и межлабораторного научного семинара, протокол № 2, ФБУН «ННИИЭМ им.академика И.Н. Блохиной»

Роспотребнадзора от 27.06.2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 4 публикации в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, включая материалы и методы, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы; иллюстрирована 17 рисунками и 8 таблицами.

Указатель литературы содержит 148 источников, в том числе 92 отечественных и иностранных авторов.

Личный вклад соискателя. Обсуждение основной идеи диссертации, выбор наиболее эффективных методов для решения поставленных задач осуществлялись автором совместно с д.м.н., проф. Быстровой Т.Н. Автором самостоятельно и в полном объеме выполнены все эпидемиологические исследования, осуществлен сбор клинического материала и его первичная подготовка к исследованию, проведение обратной транскрипции - полимеразой цепной реакции (ОТ-ПЦР) (исключая этап электрофоретической детекции) ИФА, анализ полученных данных, их статистическая обработка, оформление работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Настоящее исследование выполнено в лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов ФБУН «ННИИЭМ им.академика И.Н.

Блохиной» Роспотребнадзора. Решение поставленных в работе задач проводилось с использованием эпидемиологических (поперечного, проспективного и ретроспективного), статистических и лабораторных методов исследования в трех взаимосвязанных направлениях, включающих:

• оценку специфичности и диагностической чувствительности отечественных коммерческих ИФА-тест-систем для обнаружения анти-ВГС и апробацию ОТ-ПЦР с различными вариантами детекции продуктов амплификации для определения РНК, генотипов ВГС;

• изучение широты распространения манифестного и латентного компонентов эпидемического процесса ГС-инфекции на основе анализа динамики заболеваемости официально регистрируемых форм ГС с 1994 г. по 2012 г. и частоты обнаружения специфических маркеров инфекции у различных контингентов населения;

• определение и характеристика структуры генотипов ВГС.

Анализ этиологической структуры острых вирусных гепатитов (ОВГ), а также динамики заболеваемости манифестным острым (ОГС), впервые выявленным ХГС и «носительства ВГС» на территории г. Н. Новгорода проведен на основе данных официальной статистики ФБУЗ «ЦГиЭ по Нижегородской области» (формы отчетности № 1, 2) за период с 1994 г. по 2012 г. Для выявления территорий риска рассмотрены данные по заболеваемости ОГС в 8 районах города за период с 1994 г. по 2010 г. Всего проанализированы 109 единиц форм отчетности.

Для изучения распространенности ГС проведен анализ данных официальной регистрации и результатов лабораторного обследования населения. За период с 2007 г.

по 2011 г. под наблюдением находилось взрослое население в возрасте от 20 до 78 лет, 34,9 % из которых составили лица 20-30 лет. Среди обследованных лиц преобладали мужчины - 68 %, женщины составили 32 %. С целью определения этиологической структуры ОВГ и интенсивности манифестного компонента эпидемического процесса ГС исследована сыворотка/плазма крови от 637 больных с явлениями гепатита, поступивших в инфекционные стационары городов Н. Новгорода, Дзержинска и Балахны. Для оценки интенсивности латентного компонента эпидемического процесса ГС обследованы 1238 человек из групп повышенного риска инфицирования:

медицинские работники двух многопрофильных лечебно-профилактических учреждений, пациенты отделений хронического гемодиализа, гематологии, наркологических стационаров г. Н. Новгорода. Пациентов отделения гемодиализа обследовали дважды с интервалом в 6 месяцев. Все лица, серопозитивные во время первого обследования, имели диагноз ХГС; анти-ВГС, выявленные впервые при повторном заборе крови, свидетельствовали об ОГС. Контрольную группу («условно здоровое» население) составили лица, проходившие догоспитальное обследование в поликлиниках города и первично обратившиеся доноры Станции переливания крови.

С целью определения диагностической и эпидемической значимости тестирования отдельных контингентов населения на наличие молекулярно-генетических маркеров вируса проведено обнаружение РНК в плазме крови всех серопозитивных и 226 анти-ВГС-негативных лиц из групп повышенного риска инфицирования. При этом, 91 образец крови от серопозитивных лиц с ХГС параллельно исследован на наличие геномной РНК ВГС в плазме крови и МКПК с определением вирусной нагрузки в положительных пробах.

Характеристика качественных и количественных параметров структуры генотипов ВГС включала определение особенностей распределения генотипов ВГС среди различных контингентов населения с учетом возрастной и половой принадлежности обследованных лиц. Они были распределены на возрастные группы с интервалом в десять лет: 20-29, 30-39, 40-49 лет и от 50 лет и старше. Для выявления территориальных особенностей распределения субтипов ВГС и в зависимости от формы инфекции проанализировано 149 РНК-позитивных образцов от больных с установленным диагнозом «вирусный ГС» городов Н.Новгорода, Дзержинска, Балахны.

На каждого больного составлены анкеты и сводные рабочие таблицы. В анамнезе инфицированных лиц имелись указания на внутривенное употребление наркотических средств, 28 больных - на медицинские манипуляции в течение 6 месяцев, предшествующих заболеванию. У 187 больных ХГС установлен возможный момент инфицирования в интервале от 1 до 17 лет, на основании которых были проанализированы изменения доли отдельных субтипов в структуре генотипов ВГС с 1995 г. по 2011 г.

иммуноглобулинов классов M (IgM), G (IgG) (core, NS3, NS4, NS5), проведение теста одновременного обнаружения антигена и антител к ВГС (АГ/АТ); РНК, генотипа вируса и вирусной нагрузки (линейный диапазон от 150 до 108 международных единиц/миллилитр (МЕ/мл)) с помощью коммерческих тест-систем.

С целью подбора ИФА-тест-систем для выявления анти-ВГС и белкового спектра проведена сравнительная оценка специфичности и диагностической чувствительности отечественных коммерческих диагностикумов (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; НПО «Диагностические системы», Н. Новгород) на двух стандартных (лиофилизированные образцы, содержащие и не содержащие анти-ВГС) и одной экспериментальной ( образца сыворотки крови доноров, лиц из групп повышенного риска инфицирования и больных ХГС) панелях. В качестве референс-теста был использован диагностикум «BioRad» (Франция), зарегистрированный в России и основанный на пептидах Е1, Е2, дополнительно к core, NS3, NS4, NS5, используемых в отечественных системах. Так, анализ стандартных панелей показал полностью совпадающие результаты, при тестировании экспериментальной панели количество неодинаково реагирующих образцов составило 13,4±5,4 %. При этом, частота обнаружения анти-ВГС IgG NS оказалась в 2 раза выше при использовании диагностикума производства «Вектор-Бест»