На правах рукописи

Сальников Алексей Владимирович

ИЗОФЕРМЕНТЫ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ ИЗ АМАРАНТА: ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, РЕГУЛЯЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ

icl1 И icl2 И ИХ ЭКСПРЕССИЯ

Специальность 03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Воронеж 2013 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ») Научный рудоводитель: доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Ершова Антонина Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный педагогический университет, кафедра биологии растений и животных, заведующая Гойкалова Ольга Юрьевна, кандидат биологических наук, Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра биохимии и биотехнологии, доцент

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Защита состоится «23» декабря 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан «21» ноября 2013 года Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Грабович М. Ю.

Введение Актуальность проблемы. Одним из приоритетных направлений развития физиологии и биохимии растений является исследование регуляции метаболических процессов, происходящих в растительном организме. Особый интерес вызывает функционирование важнейшего этапа глюконеогенеза – глиоксилатного цикла, а также изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1.) – ключевого фермента в процессе трансформации липидов в доступные для организма формы углеводов.

Изоцитратлиаза имеет широкое распространение в природе и функционирует в различные физиологические периоды жизни у многих организмов. Этот фермент считается большинством авторов маркерным ферментом глиоксилатного цикла [Епринцев и др., 2008], физиологическая роль которого для растений – участие в глюконеогенезе, обеспечивающим растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества.

Изоцитратлиаза, как правило, является матриксным ферментом глиоксисом, однако, в работах А. У. Игамбердиева (1990) сообщалось о наличии второй изоформы, локализованной вне глиоксисом – внеглиоксисомальной формы. Известно также, что активность изоцитратлиазы увеличивается при старении растения, что даёт возможность преобразовывать липиды клеточных мембран в транспортные формы органических веществ. Таким образом, изоцитратлиаза в растениях представлена двумя формами, имеющими глиоксисомальную и внеглиоксисомальную локализации.

В последнее время появились сообщения о полифункциональности данного изоферментного комплекса. Функционирование изоцитратлиазной системы позволяет метаболизировать двухуглеродные соединения и использовать их как строительный материал. В растительном организме в процессе фотодыхательного метаболизма образуется глиоксилат и, благодаря синтазной реакции ИЦЛ, он может использоваться как в катаболических, так и в анаболических реакциях [Игамбердиев, 1992].

Амарант, являющийся нетрадиционной сельскохозяйственной продовольственной культурой, относится к С4-растениям и обладает способностью накапливать большие количества белка, аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов [Железнов и др., 2009]. Для него характерна очень большая засухоустойчивость и при этом он очень хорошо реагирует на полив, что позволяет выращивать его в районах, непригодных для традиционных зерновых и зернобобовых культур. Эти особенности делают амарант перспективной культурой, которая может занять свою нишу в сельском хозяйстве. Поэтому исследование в онтогенезе характеристик изоферментов изоцитратлиазы, которая регулируют процессы мобилизации запасных жиров, особенно, при смене типов питания, представляет значительный научный интерес.

Исследование отдельных звеньев метаболических процессов, связанных с трансформацией липидов в углеводы, является актуальной задачей не только биохимии, но и молекулярной биологии.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось очистка изоферментов изоцитратлиазы из проростков амаранта, исследование их физикохимических и регуляторных характеристик, идентификация генов icl1 и icl2 и их экспрессия.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику активности и изоферментный состав изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта разных сортов.

2. Изучить субклеточную локализацию изоферментов ИЦЛ.

3. Очистить изоцитратлиазу из проростков амаранта и стареющих листьев до электрофоретически гомогенного состояния.

4. Определить молекулярные массы и субъединичное строение полученных изоферментов изоцитратлиазы.

5. Изучить кинетические и регуляторные характеристики полученных ферментативных препаратов.

6. Подобрать праймеры для идентификации генов изоцитратлиазы, провести ОТ-ПЦР анализ кДНК из проростков амаранта и осуществить секвенирование полученных ампликонов.

7. Исследовать экспрессию генов изоцитратлиазы в проростках амаранта.

8. Разработать гипотетическую схему участия изоферментов ИЦЛ в различных метаболических процессах.

Научная новизна. Научные положения данной работы расширяют и дополняют современные представления о механизмах переключения метаболических процессов в растительной клетке при участии изоферментов, обеспечивая ей нормальное развитие.

Изоферментный состав ИЦЛ в амаранте представлен двумя формами фермента, которые различаются не только по электрофоретической подвижности и субклеточной локализации, но и по кинетическим и регуляторным свойствам. При старении листа наблюдается появление изоцитратлиазной активности, которая свидетельствует, видимо, о функционировании глиоксилатного цикла.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из проростков амаранта разных сортов позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики. Сравнительный анализ свойств выделенных изоформ указывает на их значительное отличие друг от друга.

Подбор праймеров для ИЦЛ на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов, а также последующее секвенирование полученного в ходе ПЦР продуктов показали, что полученные изоформы исследуемого фермента являются изоферментами, то есть имеют различную генетическую детерминированность и, следовательно, функциональную значимость.

Практическая значимость. Выделение и получение в гомогенном состоянии препаратов изоферментов изоцитратлиазы из амаранта открывает перспективы их использования в научно-исследовательских работах для изучения кинетики ферментативной реакции, субъединичного строения фермента, термодинамических параметров реакций. Электрофоретически гомогенные препараты изоферментов ИЦЛ могут служить маркерами при проведении иммуноферментного анализа тканей организмов в стрессовых условиях [Волвенкин и др., 1999; Попов и др., 2000].

Применение препаратов изоферментов ИЦЛ позволит создать биосенсор для определения количества глиоксилата и изоцитрата в растительных и животных экстрактах.

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете ВГУ, при чтении лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии, различных спецкурсов. Кроме того, они находят применение при проведении практимумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изоцитратлиазная активность обнаруживается в проростках всех исследованных сортов амаранта: «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый». Динамика активности и изоферментный состав изоцитратлиазы свидетельствует о важной роли энзима в функционировании глиоксилатного цикла, являющегося этапом глюконеогенеза, и фотодыхательного метаболизма в зеленых листьях, обуславливающего сериновый путь образования аминокислот.

2. Субклеточная локализация изоформ изоцитратлиазы в амаранте связана с глиоксисомально-пероксисомальной фракцией, а также с цитоплазмой клетки.

3. С помощью модифицированной схемы многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты из амаранта сортов «Рыжик» и «Кинельский». Получение гомогенной ИЦЛ1 и ИЦЛ2 позволило установить физико-химические и регуляторные характеристики этих энзимов. Значительные отличия свойств (рН, Км и др.) изоферментов изоцитратлиазы обуславливают их участие в разных физиолого-биохимических процессах.

4. Данные по определению нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-продуктов указывают, что изучаемые изоформы ИЦЛ являются изоферментами, т.е. генетически детерминированными белками. Профиль экспрессии генов icl1 и icl2, осуществленный с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени, свидетельствует о корреляции с динамикой изоцитратлиазной активности в прорастающих семенах амаранта.

5. Разработана гипотетическая схема роли изоферментов изоцитратлиазы в регуляции метаболических процессов в амаранте. ИЦЛ1 обеспечивает протекание глиоксилатного цикла, важнейшего этапа глюконеогенеза. ИЦЛ2 функционирует в процессе ацидоза, т.е. закислении, необходимом для эффективной мобилизации запасных жиров, и, кроме того, в фотодыхательном метаболизме зеленых листьев.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой и 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века» (Пущино, 2010; 2011), на 7-й съезде Общества физиологов растений России международной научной школе «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011), на 10-й Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы» (Воронеж, 2012), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009, 2010,2011,2012,2013) Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 13 публикациях – 9 статьях и 4 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (237 источников). Иллюстрационный материал включает 29 рисунков, 3 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

экспериментальной работе являлись прорастающие семена амаранта Amaranthus caudatus L. сортов «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый», выращенные гидропонным способом при температуре 25°С и стареющие листья сорта «Рыжик», выращенного на опытном поле ВГАУ.

Определение активности изоцитратлиазы. Активность ИЦЛ (К.Ф. 4.1.3.1) определяли спектрофотометрическим методом на СФ-2000 (Россия) при длине волны 324 нм [Kornberg, Krebs, 1957].

Выделение и очистка фермента. Для очистки изоцитратлиазы из проростков амаранта разных сортов была использована следующая схема:

1. Гомогенизация материала. 2. Высаливание сульфатом аммония (NH4)2SO4.

3. Гель-фильтрация на сефадексе G-25. 4. Хроматография на ионообменнике ДЭАЭцеллюлозе. Исследования проводились с использованием линейного градиента KCl (50 – 150 мМ).

Определение содержания белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Lowry et al., 1951].

Содержание белка в высокоочищенных препаратах определяли по поглощению при 280 и 260 нм.

Электрофоретические исследования белков. Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса [Davis, 1994]. Растворы мелко- и крупнопористого гелей готовили, согласно рекомендациям Мауэра [Мауэр, 1971].

При определении гомогенности ферментов использовали методику окрашивания с нитратом серебра. Специфическое проявление изоцитратлиазы осуществляли при помощи модифицированного реагента Шиффа [Reeves, Volk, 1972].

Субклеточная локализация. Субклеточную локализацию определили с помощью дифференциального центрифугирования [Волвенкин и др., 1999].

Определение молекулярной массы нативного фермента. Для исследования четвертичной структуры и определения молекулярной массы фермент пропускали через колонку с сефадексом G-150 [Детерман, 1970] Определение молекулярной массы субъединиц ферментов. Для определения молекулярной массы ИЦЛ методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергенной системой, описанной Лэмли [Laemmli, 1970].

Выделение суммарной клеточной популяции РНК. Суммарную клеточную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [Chomczynski, Sacchi, 1987] Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия.

Обратная транскрипция. Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. В качестве затравочного использовался олиго-(dT)20 праймер. Для предотвращения деградации матриц РНК в реакционную смесь вносилось 20 ед. ингибитора РНКаз IRNasine [Okayama, 1987.].

Подбор праймеров. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из разных организмов.

Поиск гомологичных последовательностей в геномах нематоды, прокариот и растений проводился с использованием базы данных NCBI (США, http://www.ncbi.hlm.nih.gov/). Для этого проводили выравнивание последовательностей с помощью программы AliBee – Multiple alignment Release 2. (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) с целью выявления наиболее консервативных участков.

Проведение полимеразной цепной реакции. Последующую полимеразную цепную реакцию [Епринцев и др., 2001] с ген-специфичными вырожденными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия). Реакция ПЦР проводилась на приборах «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия).

Секвенирование ПЦР-продукта. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом в ВНТК «Генной активности» ИБФМ РАН.

Проведение ПЦР в реальном времени. Для выяснения изменения уровня экспрессии генов icl1 и icl2 амаранта, проводили ПЦР-РВ на приборе DNA Engine® Thermal Cycler «Chromo4» (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I [Tzachi, 2003]. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ с использованием программного обеспечения Primer3 [Rozen, Skaletsky, 2000]. Праймеры для ПЦР-РВ анализа были следующими: прямой - 5'-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5'DCTRCARTTRTANGC-3'.

Статистическая обработка данных. Опыты проводились в трех повторностях. Аналитическое определение для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. В таблицах приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента [Лакин, 1990; Чернышев, Стариков, 1998].

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В ПРОРОСТКАХ

АМАРАНТА

Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта Amaranthus caudatus L. сортов «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый» в течение 10 дней показало, что наблюдается ее индукция с первых дней прорастания, достигающая максимального значения уже на 3 сутки (рис.1А). Активность ИЦЛ свидетельствует о функционировании глиоксилатного цикла, который обеспечивает конверсию запасных липидов в растворимые формы углеводов. К 10 суткам величина активности ИЦЛ снижалась, что говорит о снижении уровня запасных жиров в проростках семян. В условиях гетеротрофного питания в масличных растениях важную роль играет глюконеогенез, обеспечивающий мобилизацию запасных липидов. Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает корреляцию ее величины от этапа онтогенеза амаранта. В ходе исследования динамики активности изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта сорта «Рыжик» было установлено, что активность фермента резко возрастала на 3 сутки, что связано с активизацией глиоксилатного цикла при прорастании, а так же гидролизом запасных веществ. Однако, к 8 суткам, когда запас питательных веществ уменьшался, величина активности ИЦЛ постепенно снижалась. В стареющих же листьях происходило увеличение активности изоцитратлиазы, что связано с реутилизацией липидо-мембранных комплексов, для которой необходимо включение процессов глюконеогенеза (рис.1Б).

Рис.1. Динамика активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта разных сортов (А) и в онтогенезе амаранта сорта «Рыжик»(Б)

ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ ИЦЛ

С помощью электрофореза в 7,5% ПААГ с последующим специфическим окрашиванием на активность был проанализирован изоферментный состав изоцитратлиазы в семенах амаранта сортов «Рыжик», «Кинельский» и в стареющих листьях амаранта сорта «Рыжик». В семенах 3х-дневных проростков амаранта было обнаружено по две изоформы фермента с различной электрофоретической подвижностью (Rf 0,27 и 0,31) (рис.3). В стареющих листьях амаранта было показано присутствие только одной формы фермента (рис. 2). Причем значение её электрофоретической подвижности (0,27) совпадало с величиной Rf медленнодвижущейся формы в проростках.

На нашей кафедре при работе с другими объектами были получены аналогичные результаты. Так, в семенах сои и щитках кукурузы так же обнаружены две изоформы изоцитратлиазы с различным значением Rf: 0,28 и 0, для сои [Епринцев и др., 2010]; 0,25 и 0,29 для кукурузы [Епринцев, Маслова, 2009]. В зелёных листьях данных объектов выявлено лишь по одной белковой полосе, причём значения их электрофоретических подвижностей совпадали с медленнодвижущими формами в семенах. В корнях активность фермента была низкая.

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИЦЛ

В проростках амаранта сорта «Кинельский» субклеточную локализацию изоцитратлиазы определяли методом дифференциального центрифугирования, в ходе которого выделили цитоплазматическую, глиоксисомальную, митохондриальную фракции. Как видно из рисунка 3, активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно. Наибольшая активность фермента сосредоточена преимущественно в осадке, содержащем грубую фракцию микротелец.

Для изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик» субклеточная локализация, определенная методом дифференциального центрифугирования, носит аналогичный характер, отличаются только значения удельной активности фермента. Полученные данные позволяют предположить, что исследуемый фермент имеет преимущественно две изоформы, одна из которых имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая находится в цитоплазме.

ОЧИСТКА ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ

В ходе четырёхстадийной очистки изоцитратлиазы из 3-х-дневных проростков семян амаранта сортов «Кинельский» и «Рыжик» были получены гомогенные препараты двух изоформ ИЦЛ, а из стареющих листьев сорта «Рыжик»

– ферментативный препарат одной формы фермента. Из сорта «Кинельский»

удельная активность для первой изоформы ИЦЛ составила 0,7 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 35,3 раза; выход 5,3 %. Для второй изоформы удельная активность составила 3,1 Е/мг белка, а степень очистки 164,2 раз; выход 6,7 %. В ходе элюции получили 2 пика изоцитратлиазной активности, причём максимальная для одной из форм наблюдалась при концентрации 66 мМ KCl, а для второй - при 110 мМ хлорида калия.

Из проростков амаранта сорта «Рыжик» также были получены ферментные препараты двух изоформ ИЦЛ. Удельная активность для ИЦЛ1 составила 3,4 Е/мг белка, степень очистки 17,6 и выходом 10,7 %. Для второй изоформы ИЦЛ удельная активность составила 3,5 Е/мг белка, а степень очистки 18,6 раз; выход 10,1%. В ходе элюции изоцитратлиазы тоже получили 2 пика ферментной активности, причём максимальная элюция одной из форм наблюдалась при концентрации 62 мМ KCl, а второй – при 95 мМ KCl.

В результате очистки изоцитратлиазы из стареющих листьев амаранта сорта «Рыжик» был получен ферментный препарат одной изоформы ИЦЛ с удельной активностью 1,7 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 21,8 раза; выход 5,4%. При очистке ИЦЛ был 1 пик элюции ферментативной активности при концентрации раствора 66,4 мМ КСl.

Результаты очисток представлены в табл. 1.