на правах рукописи

РЫКОВ Ростислав Станиславович

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ

ОЦЕНКИ АЛКОГОЛЬСОДЕРЖАЩЕЙ ПРОДУКЦИИ

И ДРУГИХ НАПИТКОВ В ЭНДОЭКОЛОГИИ

Специальности 03.00.16 – экология и 03.00.02 -- биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва --2007 2

Работа выполнена на кафедре системной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Геннадий Александрович Калабин

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Юрий Павлович Козлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ирина Ивановна Пелевина доктор физико-математических наук, профессор Сергей Иванович Аксёнов

Ведущая организация: Институт биохимической физики им.Н.М.Эмануэля РАН.

Защита состоится « 20 » марта 2007 г. в 16 час. на заседании диссертационного совета Д212.203.17 в Российском университете дружбы народов по адресу: 115093 г. Москва, Подольское шоссе, 8/5, экологический факультет РУДН.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « » февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета А.Я.Чижов доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современных экономических и политических условиях России обеспечение безопасности и качества пищевой продукции требует немедленного технического перевооружения и существенных изменений системы её контроля и идентификации на всех стадиях жизненного цикла.

Федеральный Закон «О техническом регулировании» знаменует начало разработки новых требований к каждому виду продуктов питания, включая и напитки, которые должны быть сформулированы в виде технических регламентов, главное требование которых – обеспечение биологической безопасности в целях защиты жизни и здоровья граждан, а также предотвращение действий, вводящих в заблуждение потребителей.

Объект исследования настоящей работы - напитки, для которых в последние годы многократно возрос ассортимент и появилось большое число фальсификатов, часто с повышенной токсичностью. Разработка, апробация, отбор и использование новых принципов и подходов, алгоритмов и методик для исследования и контроля токсичности напитков и примесей в них, а такжевыявление подлинности напитков - одна из важнейших национальных задач, прямо соответствующая ряду критических технологий РФ “Безопасность и контроль качества с/х сырья и пищевых продуктов”, ”Производство и переработка с/х сырья”, “Системы жизнеобеспечения и защиты человека”. Создание системы новых подходов - от интегральных методов экотоксикологии до наиболее информативных количественных инструментальных методов детального анализа состава (изотопного, элементного, компонентного) и дифференциальной идентификации токсикантов - наиболее наукоемкий этап на пути её решения и официального введения в практику экспертиз.

Цель работы- исследовать воздействие различных видов этанола на живой организм и метаболизм этанола при различных концентрациях и при наличие активных добавок, провести критический анализ существующей практики и новых тенденций в области техники контроля напитков и их сырья, разработать новые и усовершенствовать известные методики для контроля их безопасности, качества, подлинности. Поставленная цель определила следующие задачи:

--На основе анализа публикаций и опыта отечественных и международных организаций сформулировать с учетом специфических особенностей России наиболее актуальные проблемы в анализе напитков.

--Разработать и опробовать в лабораторных условиях новые надежные, экспрессные и экономичные подходы, методы и алгоритмы комплексного контроля безопасности, токсичности, качества и подлинности напитков.

Научная новизна и практическая значимость --Установлено, что физиологический и биологический эффект отрицательного влияния на живой организм при умеренных дозах потребления водных растворов этанола определяется преимущественно примесями в технических видах этанола.

-- Подтверждено экспериментально, что скорость метаболизма этанола в живом организме определяется в значительной мере концентрацией и при больших концентрациях может регулироваться активными добавками.

--Установлены недостатки отечественной системы комплексного контроля подлинности, качества и безопасности напитков, выявления контрафактной и фальсифицированной продукции, обусловленные ограниченным арсеналом и несовершенством методов их анализа, отсутствием, стандартов и баз данных.

--Разработана методика пробоподготовки и реализован подход к определению суммарной токсичности примесей в некоторых типах крепкой алкогольсодержащей продукции (АП) на отечественных токсикометрах.

--Создан экспресс-метод идентификации подлинности и косвенной оценки безопасности различных напитков на основе явления объемного светорассеяния и лазерного компьютерного анализатора(ЛКА).

--Предложена методика экспресс - контроля подлинности водно-спиртовых смесей с помощью реактивных индикаторных полосок (РИП).

--Экспериментально оценена перспективность некоторых методов изотопного анализа водорода, углерода, кислорода в идентификации напитков и контроля их безопасности.

--Расширены возможности современной количественной спектроскопии ЯМР Н, 2Н, 13С, 17О, 31Р для идентификации сырьевой, географической и технологической природы напитков путем создания новых методик выполнения измерений природного содержания в них изотопов 2Н и 17О, разработки оригинальных экспресс- алгоритмов анализа виноматериалов спиртовых купажей и АП на их основе.

--Разработан экспресс-метод идентификации синтез-этанолов методом количественной спектроскопии ЯМР 2Н, реализуемый на всех современных спектрометрах ЯМР.

--Сформулирована важная национальная проблема: если дифференциация пищевых и технических этанолов высокой степени очистки комплексом методов анализа невозможна, то следует признать запрет использования технических этанолов в пищевой продукции необеспеченным нормативнотехническим контролем, что должно быть обязательно учтено при разработке новых технических регламентов на этанолы различного генезиса.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых ВАК периодических изданиях и 15 тезисов докладов, а её основные результаты представлены на конференциях: X Международной "Магнитный резонанс в химии и биологии "(Суздаль,1998); I и III Научнопрактических "Идентификация качества и безопасность алкогольной продукции" (Пущино,М.О.,1999,2001); Всероссийской "Химический анализ веществ и материалов"(г.Москва,2000);I Научно-практической ГТЛ ГТК"Экспертно-исследовательская деятельность в таможенных целях"(Москва,2001); IV Международной научно-практической "Экология и жизнь"(Пенза, 2001); Международной научно-практической "Проблемы экологии и безопасности жизнедеятельности в XXI веке (Москва,2001); IX Всероссийской"Структура и динамика молекулярных систем"(Уфа,2002);

Всероссийской «Аналитика России 2004» (Москва,2004); Европейской “Modern Analitical Methods for Food and Beveradge Autentification”,(Czech Republic, природопользования и природоохраны "(Пенза,2003 ).

машинописного текста. Состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы, приложения. Работа содержит 31 таблицу, 30 рисунков. Список литературы включает 128 наименований.

Глава I. Специфические проблемы России в области безопасности и подлинности напитков, методов их контроля.

Безопасность жизни человека в существенной степени зависит от качества потребляемой пищи и напитков, среди последних -АП. Потребление АП имеет в России ряд уникальных негативных особенностей: преимущественно употребляются крепкие водно-спиртовые смеси ( водки ), не имеющие никакой пищевой ценности, но обладающих наиболее ярко выраженным наркотическим и токсическим действием; потребление АП неуклонно возрастает за счёт жизненно активной и репродуктивной части населения; негативное воздействие алкоголя усиливается за счёт содержания в нём опасных для здоровья или жизни примесей и потребления других некачественных или фальсифицированных продуктов; контрафактная продукция с неконтролируемой биологической безопасностью наносит России значительный экономический ущерб;

неумеренное потребление алкоголя плохого качества сокращает среднюю продолжительность жизни мужчин в России до 15 лет и представляет главную угрозу генетическому здоровью поколений.

Анализ причин смертности в России в период 1990-2001г.г.,связанной с алкоголем, показал, что с ним связано 72% убийств, 42% самоубийств, 53% смертей при прочих внешних причинах (аварии, пожары, травмы и т.д.),68% при церрозах печени,60% при панкреатитах, 23%- при сердечно-сосудистых заболеваниях, 25%- при прочих причинах. Показано (А.В.Немцов, «Алкогольный урон регионов России»,М.,2003г.,136с.),что снижение потребления АП всего на 5—10% сохранит жизнь 100—200 тыс.человек в год. По тем же данным только от острых отравлений АП ежегодный урон России составляет до 70 000 человек (по данным Госкомстата – в 1,6 раза меньше). Таким образом, снижение потребления АП при условии контроля её безопасности и подлинности – наиболее очевидный фактор преодоления демографического кризиса в России. К сожалению, этот вопрос не находит до сих пор адекватного отклика в национальном сознании большой и сильно пьющей страны.

Проблемы подлинности напитков в России можно выстроить в следующий ряд по их приоритетности : широкое использование для производства АП технического этанола -- фальсификация вин путём их «синтеза» -фальсификация натуральных соков -- фальсификация популярных минеральных вод. Поскольку две первых имеют наиболее прямое отношение к безопасности жизни населения России, они стали предметом основного внимания в последующих главах работы.

Примеси в этаноле, виноматериалах, купажах, состав которых формируется в процессе производства и зависит от исходного сырья и используемых технологических приёмов, определяют потребительские свойства и безопасность продукции. Задача быстрых токсикологических испытаний пищевых продуктов и химических соединений в них становится всё более острой и актуальной. Современный арсенал химических, физических и биологических методов и подходов для контроля безопасности, подлинности, т.е.

и качества напитков, по решаемым задачам, признанности, экспрессности, характеру информации, технической сложности можно условно разделить на следующие основные группы:

-нормативные – официально принятые в России методики качественного и количественного анализа токсичности, элементного и компонентного состава, радиоактивности с использованием химических реагентов, хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, оптической, рентгеновской и атомноадсорбционной спектроскопии;

-токсикологические – выявление интегральной токсичности напитка, его компонентов или примесей путём биотестирования;

-экспрессные – общедоступные приёмы качественной разбраковки напитков по степени соответствия эталону на основе реактивных индикаторных трубок и бумаг, рН-метрии, контроля цвета, прозрачности, плотности и т.д.;

-многофакторные – аппаратурно-генерирующие обобщённый образ для оценки аутентичности напитка ранее идентифицированным образцам из базы данных :

«кибер-нос», «кибер-язык», «кибер-глаз» и т.д.;

-арбитражные – количественные прецизионные методы и методики макро- и микроанализа содержания изотопов, элементов и компонентов.

Безопасность и подлинность напитков, как их наиболее важные потребительские свойства, могут быть охарактеризованы как по интегральным проявлениям этих свойств, так и на основе исчерпывающего анализа совокупности характеристик химического состава (изотопного, элементного и компонентного),пространственного и электронного строения компонентов, надмолекулярной структуры растворов. В практике контролирующих организаций в России используются ныне только методы элементного и компонентного анализа, чего явно недостаточно, особенно, для АП, являющейся изначально токсичной ввиду присутствия этанола. Соизмеримость объёма продаж АП легального и контрафактного происхождения, несоответствие используемых нормативных требований на АП задачам надёжного выявления токсичных и опасных фальсификатов представляют большую проблему, т.к. у контролирующих органов в России нет возможности выявления АП, содержащей вместо или наряду с пищевым этанолом (ПЭ) хорошо очищенные от примесей технические этанолы – синтетический (СЭ) и гидролизный (ГЭ).

Анализ принципиальных возможностей отдельных методов, не входящих ныне в РФ в группу нормативных, позволил уточнить конкретные задачи, решаемые в последующих главах. Главная из них – выявление использования в АП технических этанолов.

1.1. Исследование токсичности различных видов этанола и особенностей его метаболизма в зависимости от концентрации и физиологических особенностей организма.

Целью работы было подтвердить опасное действие синтетического спирта ( фактически опасность и вред примесей, так как использовали спирт только первичной степени очистки, экономически целесообразной для технического использования в технических приложениях ) на организм животных при длительном употреблении его водных растворов.

Эксперимент проводился на 4-х группах мышей SHK из питомника «Столбовая»

АМН,сертификат №22018,( по 30 голов в группе )в течение 9 недель.

Первая группа пила только водный раствор хлебной водки; вторая группа пила только хлебный раствор самогона; третья группа пила только водный раствор синтетического технического спирта; четвёртая группа ( контрольная ) пила качественную питьевую воду.

Концентрация алкоголя в питьевых растворах составляла 8%.

Первичный контроль проводился визуально по состоянию мышей и изменению ( прибавлению ) их веса.

Через каждые 3 недели часть животных (10 голов)забивалась декаптацией ( перед забоем каждая мышь взвешивалась) и проводился контроль веса и внешнего вида печени и селезёнки, морфологические изменения печени.

У забитых животных отбиралась кровь и после отделения форменных элементов полученная плазма использовалась для контроля её состава на ЛКА ( лазерный компьютерный анализатор ) и ЯМР-спектрометре ( снимались протонные спектры ЯМР ).Кровь от всех 10 мышей одной группы сливалась вместе (проводилось своеобразное усреднение).Потребление любого алкоголя, даже в тех щадящих дозах, которые использовались в эксперименте, замедляло рост животных.Водный раствор хлебной водки кроме замедления роста практически не сказался на внешнем виде животных и на состоянии печени и селезёнки. Цвет органов нормальный. Спектры ЯМР плазмы практически идентичны плазме контрольной группы. Спектры ЛКА показывают малую склонность к интеграции органических компонентов плазмы.

Водный раствор самогона замедляет рост ( уменьшает вес ), печень увеличена, селезёнка уменьшена. Цвет органов близок к нормальному.

Спектры ЯМР плазмы близки к плазме контрольной группы, но появляется следовая концентрация альдегидов и кетонов. Спектры ЛКА показывают малую склонность к агрегации органических компонентов плазмы.

Водный раствор синтетического спирта значительно замедляет рост животных, печень и селезёнка изменены. Цвет печени глинистый. Глинистый цвет,по-видимому, объясняется тем, что,как известно из литературы, у получающих алкоголь грызунов развивается жировая печень.Увеличение количества жира в печени может быть обусловлено поступлением его с пищей, проникновением в печень свободных жирных кислот из жировой ткани или синтезом жиров в самой печени, как защитной реакции на алкоголь и (главным образом!) токсичные примеси в нём. В каждом случае глубина такого перерождения печени должна определяться дозой употребляемого алкоголя и содержащимися в нём примесями. В спектрах ЯМР плазмы кроме следовых концентраций альдегидов и кетонов отмечается значительная концентрация эфиров и нитросоединений. Спектры ЛКА показывают заметную склонность к агрегации органических компонентов плазмы.

Так сам этанол токсичен, его потребление в любом виде сказывается на животных.

Хлебная водка ( пищевой спирт ) и самогон ( высокого качества ) незначительно сказываются на физиологии животных ( при используемых в эксперименте умеренных дозах ). Но самогон ( по-видимому из-за присутствия сивушных масел) оказывают уже более заметное влияние на животных и вызывает появление в крови следов токсичных соединений.

Примеси в синтетическом техническом спирте вызывают фактически слабое отравление организма животных.

Глава2. Разработка и совершенствование некоторых прямых и косвенных методов контроля токсичности и идентификации напитков.

2.1.Определение общей суммарной токсичности примесей в АП.

Методы биотестирования, незаменимые для оценки возможной токсичности любых напитков, для контроля АП ограничиваются токсичностью самого этанола. Трудности представляют разработка корректных методик пробоподготовки, выбор приборов и биологических объектов тестирования проб, позволяющих получить воспроизводимые результаты. Нами использованы отечественные приборы, прошедшие аттестацию и используемые для экспрессконтроля токсичности водных растворов:"Биотокс" (биолюминесцентный тест, изготовитель НТЦ "Аргумент", производитель тест-системы " Эколюм " - МГУ) и "АТ-1" (анализатор токсичности, изготовитель ВНИИ МТ, тест-система сперма быка). Для водных растворов оба прибора и основанные на них методики дают близкие результаты, хотя имеют специфические преимущества и недостатки. Контроль токсичности спиртов и водок осложнён необходимостью прецизионно исследовать концентрационные зависимости водных растворов этанола. Информацию о токсичности удаётся получить на основе малых разностных величин при сопоставлении результатов для растворов стандартного пищевого этанола и испытуемого образца. Для «Биотокса» критерием токсического действия является уменьшение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ, которое пропорционально токсическому эффекту и выражается в виде безразмерной величины - индекса химической токсичности Т=100(I0-I)/I0, где I0 и I интенсивности биолюминесценции контрольного и исследуемого образца. В качестве критериев токсичности аналитов принимаются величины Т: 0 - 20 - допустимая степень токсичности; 20 - 49 - токсичен; >50 – сильно токсичен.

Рис.1 Зависимость индекса химической изменения Т по сравнению с воде,С% об.

Исследование собственно токсичности этилового спирта осуществлено в экспериментах с серией из 15 концентраций этилового спирта 96,6 %, высшей очистки из зерна. Из представленной на рис.1 усреднённой концентрационной зависимости для Т следует, что значимые отклонения от сильной токсичности начинаются при концентрациях этанола в воде около 10 % об. При последующем разбавлении Т уменьшается нелинейно, достигая допустимой степени токсичности при концентрации этанола ниже 10% об. В качестве рабочей концентрации для измерения Т образцов спиртов и водок выбрана концентрация 5,0% об. Результаты разработанной методики хорошо согласуются с результатами химической экспертизы. Так, при анализе серии из коммерческих водок 4 образца были забракованы на основании результатов контроля методом компонентного анализа в соответствии с действующим ГОСТ12712-80 «Водки и водки особые». Они также оказались токсичными по шкале Т( см.рис.1). Использование дистиллированной воды в качестве как растворителя, так и контроля существенно упрощает методику.

В некоторых случаях оказалось перспективным использовать методы концентрирования или выделения примесей в спиртовых растворах и иной АП с последующим анализом их токсичности. Выделение примесей проводили по двум разработанным нами методикам: вакуумная отгонка спирта из пористого химически нейтрального сорбента, насыщенного испытуемым раствором; вымораживание примесей из спиртового раствора на посеребрённой медной пластине при температуре –(90-95)С0. Определение суммарной токсичности нелетучих компонентов ректификата из пищевого сырья, гидролизного и синтетического технического спирта, коньяков на токсикометре АТ-1 по стандартной методике дало результаты, согласующиеся с определением токсичности выделенных компонентов образцов спирта на "Биотоксе". В частности, для исследованных спиртов получены следующие результаты: технические гидролизные, Т=30-70; технические синтетические, Т=50-70; ректификаты из зерна, Т= 2.2. Экспресс-идентификация спирта и водок с помощью реактивных индикаторных полосок ( РИП ) Наиболее экономичные экспресс-методы массового контроля водных растворов (сточных вод, питьевой воды, минеральной воды, спирто-водочной продукции и т.д.) -- методы контроля с помощью индикаторных реактивных бумаг, полосок, трубок. Нами создан метод качественного и полуколичественного контроля водно-спиртовых растворов на основе стандартной промышленной листовой фильтровальной бумаги и 4-х красителей ( красный – псевдогиперицин, зелёный - бриллиантовая зелень, синий – автоцианидин, чёрный - штемпельная краска ТУ- 6-00-06916705-19-94 ).

Созданные РИП -- специально обработанные бумажные полоски с нанесёнными в определённой последовательности активными цветными индикаторными рисками ( ЦИР ). Отогнутая под определённым углом часть полоски без цветных рисок опускается в испытуемый раствор, а затем после "подсушивания " рисунок на РИП сравнивается с рисунком от эталонных образцов. Примеры экспрессконтроля даны на.рис2:

Рис.2 Образцовые серии использования метанол,2—спирт этиловый чистый,3— частично смыта, зелёная сивушные масла, 4—водка с добавкой практически не размыта, водка чистая (33град.),8—исходная РИП. "голова" чётко выражена;

после красной ЦИР цветовая дорожка до тёмной "головы" однородно закрашена в розовый цвет.

Качественная водка ( 400 ). Красная и зелёная риски практически не затронуты;

цветовая дорожка между реперной полосой и чёрной риской практически чистая с еле заметным фоном, чёрная риска смыта почти полностью на расстояние 15- мм (в зависимости от внешних условий ) ;закрас цветовой дорожки после ЦИР однородный, тёмный, с чёткой чёрной "головой" и оранжевой "бахромой" спереди.

Время индикации при комнатной температуре 10 мин., при пониженной (5-15) Со – 20мин. Оценку содержания этанола в водном растворе (N) можно проводить по формуле:N=, где:

- длина цветовой дорожки от чёрной ЦИР в дистиллированной воде, С - длина цветовой дорожки от чёрной ЦИР в спирто-водном растворе.

Разбраковка этанола и метанола, их растворов в воде (30% об. и более) практически однозначна. Проведено изучение возможности применения созданных РИП для других напитков. Установлено, что в стандартных условиях вероятность правильной диагностики идентичности образцов в случае АП, минеральной и питьевой воды не ниже 85%. Для вин и соков методика не испытывалась, т.к. последние чаще всего окрашены.

2.3. Выявление аутентичности напитка эталону с помощью лазерного компьютерного анализатора ( ЛКА ).

Идентификация аутентичности образцов продуктов питания по их многопараметровым образам -- современная информационно-аналитическая технология, которая обеспечивает создание и применение электронных банков образов продукции ( "файл-паспортов" ). Они («образы») позволяют исключить необходимость использования контрольных образцов в процедуре установления подлинности продукции (ГОСТ 51293-99 ).

Разработана методика, основанная на том, что тестируемые напитки могут отличаться друг от друга совокупностью характеристических параметров молекулярной динамики растворов. Наилучшим образом эту специфику отражают частота максимума " ядра " спектрального распределения, параметр его ассиметрии, полуширина спектрального "ядра", интегральная интенсивность динамического светорассеяния. Разработан макет ЛКА для идентификации АП.

Получены высокие показатели надёжности идентификации различных видов АП.

ЛКА позволяет за 5-15 минут практически со 100 % вероятностью определять идентичность любого жидкого прозрачного продукта (водка, вино, прозрачный сок, минеральная вода, лекарственные растворы и т.д. ) эталону, объективно оценивать наличие взвешенных частиц в растворе, идентифицировать по создаваемому банку данных различные пищевые продукты и химические композиции. Использование растворимых веществ - идентификаторов позволяет значительно расширить аналитические возможности ЛКА. На рисунке приведены результаты тестирования на ЛКА 6 образцов спирта и 16 видов водки.

Для большинства образцов наблюдаются значительные количественные и качественные отличия характеристических функций от эталонных. Образец даёт распределение наиболее отличное от такового у эталонных образцов.

Обнаружено, что аналогичную образцу 7 функцию даёт разбавленный спирт " Royal ", производства Голландии. Протестированные водки условно можно разделить на несколько групп: 1-5;12 и 13; 8,11,15; 9,14,16,17; 10. По-видимому, каждая из перечисленных групп произведена из близкого по составу сырья. Из пяти образцов водок завода «Кристалл» 3 (образцы 2, 4, 5 ) дали практически идентичное распределение сигнала светорассеяния. Они могут служить в дальнейшем в качестве эталона при оценке качества безопасности тестируемой продукции. Образцы 1 и 3 по полученным характеристикам несколько отличаются от эталонных, однако близки к ним,что отражает особенности их рецептуры, т.е. требует дополнительного контроля токсичности. Водки 12, 13 и 7 произведены возможно с использованием спирта 4, а группа 8, 11, 15 на основе спирта 6.

Рис. 3 Распечатка сигнала светорассеяния водок (а) и спиртов (б), представленных ГТЛ и заводом «Кристалл».

Расшифровка обозначений спиртов 1. Спирт - этанол ( Россия );2. Дексокарбон ( Чехия );3. Спирт зерновой ( Люкс ); 4. Спирт синтетический ( ТУ 38.402-62; 5.

Спирт гидролизный (ВНИИ ПБТ );6. Спирт - смесь синтетического спирта и синтетических ароматизаторов..

При небольшой модификации ЛКА может быть использован для идентификации любых питьевых и минерализованных вод.

Глава 3. Анализ изотопного состава как арбитражный метод идентификации и контроля безопасности алкогольной продукции.

При осуществлении контроля безопасности и подлинности напитков принципиально важны арбитражные методы и подходы, результаты которых являются однозначными и не могут быть оспорены. Так, содержание некоторых органических веществ в этиловом спирте и водке нормировано и внесено в Государственные стандарты (например, ГОСТ 12712-80 "Водки и водки особые.

Технические условия "; ГОСТ 7190-88 "Изделия ликёро-водочные. Общие технические условия" ).Однако в готовом продукте могут быть вещества, определение которых не предусмотрено ГОСТами на АП. В официальные протоколы контроля состава этанола и водок недавно введены хроматографические методики, что заметно улучшило показатели их безопасности и качества. Их применение, как и измерение других стандартных физико-химических характеристик, к сожалению, не решает задачу однозначного определения природы применённого в АП спирта.

В зарубежной диагностической практике всё более широкое применение находят методы, основанные на количественном измерении содержания в веществе соотношения стабильных и радиоактивных изотопов. Подход основан на способности материи сохранять или закономерно варьировать ( в случае нестабильных изотопов ) первоначальные изотопные отношения, возникшие в момент его образования. У природных органических веществ изотопный состав определяется местом произрастания растений - предшественников, типами и условиями ферментативных реакций, процессами и технологиями выделения и переработки. Атомы водорода, углерода, кислорода молекул, наряду с основными изотопами 1Н, 12С, 16О, содержат минорные - 2Н, 3Н, 13С, 14С, 17О, 18О.

Содержание последних может быть определено количественно специфическими ионизационными, спектроскопическими и ядерно-физическими методами.

Поскольку методы элементного и компонентного анализа часто неэффективны для прямой идентификации сырьевой основы напитков (особенно АП ), нами экспериментально изучена применимость для этих целей интегральных (жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия – ЖСС и масс-спектрометрия изотопных отношений – МСИО ) и дифференциальных ( спектроскопия ЯМР ) методов изотопного анализа,. Разрабатываемые подходы призваны, в первую очередь, оценить различия изотопного состава водорода (1Н, 2Н,3Н), углерода (12С, 13С, 14С) и кислорода (16О, 17О, 18О) этиловых спиртов различного генезиса, как наиболее практически важной и технически сложной проблемы.

3.1. Интегральный анализ изотопов углерода.

Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия.

По экономичности одним из наиболее привлекательных методов дискриминации ферментативных (пищевой, гидролизный) и синтетического спиртов является определение содержания в них и в АП минорных радиоактивных изотопов С14 и Н3 методом ЖСС. Содержание указанных выше "чистых " - излучателей в Таблица №1.

Показатели радиоактивности этанолов различного генезиса № Сырьевое Измер. газ), из которых получают синтетические п/п происхождение число Пшеница Картофель Древесина Этилен(50%) и 2021± Число -частиц, излученных в минуту, для образца синтез-спирта характеризует фоновую составляющую. Видно, что радиоактивность пищевых и гидролизных спиртов существенно превосходит таковую синтетических. Это подтверждает также значение для смешанной пробы.

Анализ погрешностей измерений при доверительном уровне 0, позволяет заключить, что использованная методика позволяет выявить присутствие синтез-этанола в пищевом только при содержании первого 20 % и более, а технический гидролизный и пищевой этим методом неразличимы.

Поэтому рассмотренный метод может быть привлечён для решения практических задач при условии значительного совершенствования аппаратурно-методической базы, снижения погрешностей в 5 и более раз и при условии проведения скрининга представительного массива образцов спиртов достоверно известного происхождения.

Масс-спектрометрия изотопных отношений Проведен анализ этанолов из разного сырья методом МСИО углерода (табл.2). Основу методики составляет измерение различий в соотношении природных содержаний стабильных изотопов 12С и 13С. Если известен состав углерода модельных этиловых спиртов, то по составу углерода смеси легко вычислить соотношение компонентов. Без учёта возможных вариаций изотопных соотношений в этанолах однородной сырьевой природы погрешность пробоподготовки и непосредственно измерений не превышает ± 0,5 0/0 об.

Анализ серии смесей ПЭ и СЭ показал (табл.3), что надёжное определение синтетического компонента в ПЭ возможно при содержании его 10 % и выше.

Таблица № 2. Относительное содержание изотопа 13С в образцах этанола из различного сырья*.

п/ Этанол / сырьё Синтетич./нефть.

Гидролиз./древесина.

Гидролиз./древесина Гидролиз./древесина.

Пищевой/рожь.

ПищевойрРожь.

Пищевой/пшеница.

Пищевой/пшеница.

Пищевой/пшеница.

Пищевой/пшеница.

Пищевой/пшеница.

Пищевой/кукуруза.

Пищевой/кукуруза.

Пищевой/кукуруза.

Пищ./сах. тростник.

*Эталон МАГАТЭ.

Благодаря высокой точности измерений метод МСИО очень ценен для доказательства изотопной аутентичнтношения известных компонентов. Однако, его использование для идентификации этанолов неизвестного генезиса необходимо дополнять результатами иных аналитических процедур, в частности, разработанных нами и рассмотренных ниже.

3.2. Дифференциальный изотопный анализ методами количественной спектроскопии ЯМР.

Предложен новый метод идентификации бинарных и тройных смесей гидролизного, пищевого и синтетического спиртов по максимально упрощённой методике с помощью определения содержания изотопов углерода и водорода в метильной и метиленовой группах купажных этанолов методами ЯМР 2Н и 13С. В простейшем варианте в качестве идентификационных параметров используются шесть параметров: 1R=[CDH]/[CDH2], 2R=[CDH]/[CH2], 3R=[CDH2]/[CH3], R=[13CH2]/[13CH3], 5R=[13CH2]/[12CH2], 6R=[13CH3]/[12CH3], получаемых из спектральных данных 1Н, 2Н и 13С.Установлено, что в качестве идентификационных параметров тройных смесей достаточно использовать параметры - 1R, 2R и 3R, характеризующие распределение дейтонов в метильной и метиленовой частях этилового спирта. По измеренным параметрам 1R, 2R, 3R для тройной смеси использованных этанолов -- гидролизного (ГЭ), пищевого (ПЭ)и синтетического (СЭ) -- можно достаточно точно вычислить их процентное содержание в тройной смеси.

Диаграмма параметров 1R=[СDH]/[CDH2 ] и 2R= [CDH]/[CH2] для Рис. ПЭ,ГЭ,СЭ и их тройных смесей, содержание которых (% об.) указано в последовательности ПЭ:ГЭ:СЭ Очевидно, что чем ближе идентификационная точка смеси к одной из вершин треугольника, тем выше процентное содержание в ней того спирта, которому соответствует эта вершина. Для бинарных смесей спиртов идентификационные точки находятся на его сторонах. На рис. 4 представлены некоторые результаты для тройных смесей ) спиртов : синтетического, пищевого и гидролизного. Методика даёт ошибку определения процентного содержания исходных спиртов в смесях менее5 % ( при известных компонентах ). Судить о составе реальных тройных и бинарных смесей с определённой вероятностью можно лишь имея банк различных пищевых, гидролизных и синтетических спиртов.

Спектроскопия ЯМР высокого разрешения на ядрах 2Н, 13С,17О может быть дифференциальным количественным методом прямой идентификации сырьевой природы этанола, если позволяет измерять их содержание в группах СН3, СН2 и ОН с достаточной точностью. Нами разработана, аттестована в Госстандарте России (погрешность измерений менее 3 % при расхождении результатов двух параллельных измерений содержания 2Н до 1 %) и на различной АП опробована оригинальная методика выявления природы этанола в крепких алкогольных напитках и спиртовых смесях методом ЯМР 2Н. При её апробации сделан ряд важных заключений: известная методика SNIF-NMR, используемая в Европе для идентификации географического происхождения и фальсификации виноградных вин при определении сырьевой природы этанола не имеет преимуществ по сравнению с разработанной нами более простой методикой; неполная дистилляция этанола из АП вносит значительные погрешности в распределение в нём изотопа 2Н, которых нет у методик без дистилляции этанола из АП; методика реализуема на любых спектрометрах ЯМР с сильными магнитными полями (более 6Т) и каналом наблюдения 2Н без использования канала стабилизации резонансных условий ( отношение частота/поле).

Проведение экспериментов на спектрометрах ЯМР с рабочей частотой для ядер 2Н 76,8 МГц показало возможность осуществления регистрации спектров ЯМР 2Н крепкой АП ( < 35 % об. этанола ) без дистилляции этанола. Работа с образцами крепкой АП возможна даже без вскрытия запаянных ампул, что удобно как для создания банка эталонных образцов, так и целей длительного хранения образцов в условиях арбитражных анализов. Идентификация ГЭ из чисто древесного сырья методом спектроскопии ЯМР 2Н оказалась сложнее, чем СЭ. Это обусловлено тем обстоятельством, что сырьё для ГЭ может относиться к разным ботаническим типам. Большую роль, чем для ПЭ из зерна, играет в этом случае климатически-географический фактор. Распределение изотопа 2Н в этанолах этой группы весьма различно, как видно из данных для заведомых образцов 11, 12, 16, 17, 20, 22 Табл.4. В образцах 12, 16, 17 и 22 распределение дейтерия соответствует таковому в ПЭ, а в образцах 11 и 20 - СЭ.

Анализ серии ПЭ, СЭ и ГЭ (около200 образцов) позволил установить диапазон вариаций природного содержания дейтерия в метильной и метиленовой группах (рис.5).Исключение ПЭ из нетипичного для России сырья сформировало как отдельные области для ПЭ и СЭ, так и «нейтральную зону», их разделяющую (рис.6). Каждая область охарактеризована предельными значениями содержаний 2Н:

-СЭ: D/H СН3.>120ppm;D/H CH2.>140ppm.