На правах рукописи

Шарыпова Наталья Гаврииловна

Механизмы повреждений плазматических мембран лимфоцитов

крови у больных опийной наркоманией в состоянии

абстинентного синдрома

14.00.16 – патологическая физиология

14.00.45 - наркология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск 2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Серебров Владимир Юрьевич

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Балашов Петр Прокопьевич

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дыгай Александр Михайлович кандидат медицинских наук, Аболонин Алексей Федорович

Ведущая организация: ГУ НИИ общей патологии и патологической физиологии РАМН (г. Москва)

Защита состоится «» 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт

С диссертацией можно ознакомиться в научно – медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, пр.Ленина, 107) Автореферат разослан «» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: Суханова Г.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространенность заболевания наркоманией в нашей стране не имеет тенденции к снижению. Показатель заболеваемости наркоманией уже приближается к показателю заболеваемости сердечнососудистыми заболеваниями [Мандель А. И. и соавт.,1997]. В настоящее время употребление “чистых“ наркотиков встречается чрезвычайно редко. Чаще всего, применяемые наркотические вещества представляют собой кустарно приготовленную смесь из наркотических, балластных, психотропных и часто просто токсических веществ. В процессе приготовления наркотика дополнительно привносятся вещества (органические растворители, ангидриды, окислители), обладающие собственным токсическим действием. Использование такой смеси ведет к общему отравлению. Стало очевидным, что употребление психоактивных веществ ведет не только к развитию личностных и психических аномалий, но и является причиной широкого круга соматических заболеваний [Аболонин А.

Ф.,2001].

Опийная наркомания в клиническом отношении, прежде всего, проявляется абстинентным синдромом (состояние отмены), развитие которого связано с целым рядом вегетативных, физиологических и биохимических изменений в организме [Шабанов П. Д., Штакельберг О. Ю., 2000]. По-видимому, в основе развития патологического процесса при абстинентном синдроме лежит дисбаланс клеточного гомеостаза и, как следствие, повреждение и гибель клетки.

В патогенезе опийной наркомании большое значение имеют изменения иммунологического гомеостаза, выражающиеся в большинстве случаев в нарушении клеточного звена иммунитета. Последнее проявляется как угнетением Т-клеточного звена иммунитета, так и повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов [Иванец Н. Н. и соавт.,1997]. Не вызывает сомнения наличия у больных наркоманиями, прежде всего опийной группы, признаков вторичного иммунодефицита, повышающего риск возникновения у них инфекционных заболеваний и новообразований [Гамалея Н. Б.,1990]. Уровень дискоординации иммунологических процессов отражает тяжесть течения заболевания, позволяя дать прогноз в отношении осложнений и отдаленных последствий [Ледванова Т. Ю и соавт., 1998]. Изучение молекулярных механизмов повреждения клеток, в частности иммунокомпетентных, лежащих в основе развития осложнений опийной наркомании представляет значительный научный и практический интерес.

Сегодня большинство заболеваний рассматривают как состояния, сопряженные с поражением, прежде всего, клеточных мембран, поскольку дестабилизация молекулярной ультраструктуры мембран при патологических процессах приводит к потере их функциональной компетентности, изменению жизнедеятельности клеток в целом и, в конечном счете, к их гибели [Нагорнев В.А.,1996]. Хорошо известно, что липиды клеточных мембран являются не только формой депонирования метаболического топлива и основной структурной компонентой клеточных мембран, но и системой биологических эффекторов, регуляторов и медиаторов, участвующих практически во всех физиологических процессах клетки [Финдлей Дж., Эванс С.,1991]. Особый интерес при этом представляет изучение обмена сфинголипидов. Это связано с тем, что сфингомиелин и продукты его ферментативного гидролиза играют определяющую роль в сигнальной трансдукции, регулирующей ведущие клеточные процессы – иммунный ответ, пролиферацию, рост, дифференцировку и апоптоз клеток [Алесенко А. В.,1998].

Многообразие функций сфингомиелина и его производных, прямо или косвенно связанных с важнейшими клеточными событиями в норме и при патологии, определяет необходимость изучения обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией.

В регуляции состояния мембран клеток принимают участие процессы перекисного окисления липидов, фосфолипазы, ферменты протеолитической системы. Изучение их активности может быть важным диагностическим критерием общего состояния организма, характеристикой адаптивных процессов при неблагоприятных воздействиях, компенсаторных возможностей организма [Владимиров Ю.А., 1989; Локшина Л. А., 1994].

Течение и выраженность абстинентного синдрома при наркомании в значительной степени определяет характер лечения и прогноз заболевания.

Существует несколько подходов к лечению абстинентного синдрома [Мандель А.

И, Бохан Н. А., 1999]. Но анализ литературных данных позволяет сделать вывод о минимальной эффективности лечебных программ, используемых для терапии наркоманий. Такое положение во многом обусловлено недостаточной разработкой проблемы патогенеза наркотической зависимости, и абстинентного синдрома.

Необходимость активного поиска новых подходов к лечению больных наркоманиями представляется в этой ситуации чрезвычайно актуальной задачей.

Известно, что опийная абстиненция протекает на фоне адренергического возбуждения [Иванец Н. Н. и соавт.,1997]. Избыток катехоламинов в крови может приводить к активации перекисного окисления липидов, активации фосфолипаз, лабилизации мембран лизосом и освобождению из них протеолитических ферментов с последующим повреждением клетки. Блокада адренорецепторов, через которые реализуется эффект катехоламинов, может ограничить повреждение клеток вызванное избытком катехоламинов [Меерсон Ф. З.,1984]. Соответственно средствами патогенетической терапии могут являться препараты с адреноблокирующим действием. Исследование влияния - адреноблокаторов на липидный спектр плазматических мембран лимфоцитов и механизмы, принимающие участие в его регуляции (перекисное окисление липидов, активность фосфолипаз и активность протеолитических ферментов), безусловно, будут способствовать пониманию патогенеза опийной наркомании, возможности прогнозирования исходов и определения тактики лечения данной патологии.

Цель работы:

Изучить механизмы структурных и функциональных нарушений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома при использовании стандартной и комплексной схем лечения абстинентного синдрома.

Задачи исследования:

1. Установить особенности содержания липидов: фосфолипидов, нейтральных липидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с адреноблокатором).

2. Установить особенности обмена сфинголипидов: активность сфингомиелиназы, содержание сфингомиелина, церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с - адреноблокатором).

3. Изучить состояние системы протеолиза в сыворотке и плазме крови (активность протеолитических ферментов и их ингибиторов) у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с адреноблокатором).

4. Исследовать активность фосфолипаз, процессы перекисного окисления липидов в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии, на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с адреноблокатором), а также установить их роль в механизмах нарушения липидного спектра плазматических мембранах лимфоцитов.

Научная новизна:

Впервые у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции и получавших традиционное лечение, изучен липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и их взаимоотношение с основными механизмами повреждения липидов клетки. В результате выполненного исследования были получены новые данные фундаментального характера о структурных нарушениях в плазматических мембранах лимфоцитов, вызванных употреблением опия-сырца, обработанного уксусным ангидридом. Выявленные изменения характеризуются увеличением содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшением содержания фосфатидилэтаноламина, фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам, увеличением активности сфингомиелиназы, содержания сфингомиелина и снижением количества церамидов. Показано, что у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции, происходит выраженная активация фосфолипазного и перекисного механизмов повреждения липидов. Впервые у больных опийной наркоманией проведено изучение состояния протеиназноингибиторной системы крови. Выявленные изменения, характеризуются увеличением активности протеолитических ферментов и снижением активности их ингибиторов.

В работе впервые изучена возможность коррекции нарушений липидного спектра и обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов с помощью - адреноблокатора обзидана. Был выявлен положительный эффект включения в стандартную терапию обзидана на липидный спектр и соотношение компонентов обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов, а также механизмы, участвующие в их регуляции.

Практическая значимость работы:

Полученные новые знания фундаментального характера, касающиеся изменений липидного состава, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов, участвующих в регуляции состояния мембран у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома раскрывают новые аспекты патогенеза опийной наркомании. Результаты исследования могут служить основой для разработки новых способов коррекции метаболических нарушений, возникающих при употреблении наркотических препаратов опийной группы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитие абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией сопровождается нарушением в липидном спектре и обмене сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов, в механизме нарушений которых особую роль играют увеличение активности фосфолипаз, процессов перекисного окисления липидов и активизация протеолитических процессов крови.

2. Липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией нормализуется при использовании комплексной схемы лечения абстинентного синдрома путем снижения активности фосфолипаз, угнетения процессов перекисного окисления липидов и восстановления баланса протеиназно-ингибиторной системы.

3. Положительных изменений со стороны липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов, и механизмов принимающих участие в их нарушении не было выявлено у больных опийной наркоманией при использовании стандартной схемы лечения абстинентного синдрома.

Апробация работы: Основные положения работы были представлены на заседании Томского Областного общества лаборантов (Томск, 2004), на научном семинаре кафедры биохимии и молекулярной биологии, на кафедре психиатрии, наркологии, психотерапии Сибирского государственного медицинского университета, на четвертом и пятом конгрессах молодых ученых и специалистов (Томск 2003, 2004) Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 251 литературных источника, из которых 212 отечественных и иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты обследования 100 человек, которые были разделены по четырем группам. Первую группу составили 75 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома (шифр по МКБ – 10 F 11.30). В первой группе взятие крови осуществляли в первые сутки после поступления в стационар до начала лечения (Группа 1). Вторую группу составили 41 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на фоне стандартной схемы лечения (Группа 2), в третью группу были включены больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на фоне комплексной терапии (стандартная схема лечения в комплексе с применением препарата группы -адреноблокаторов (обзидан) в дозе 20 мг/сутки) (Группа 3). Во второй и третьей группе взятие крови осуществляли на 4-5 сутки от последней инъекции наркотика. Четвертую группу составили 25 практически здоровых доноров (Группа контроля). Взятие крови осуществляли утром натощак из локтевой вены. Ни у одного из пациентов не был выставлен диагноз ВИЧ. Также в исследование не включались пациенты, инфицированные вирусом гепатита.

Пациенты поступили в стационар областного наркологического диспансера в связи с выраженными проявлениями синдрома отмены, которые развились в результате систематического внутривенного введения опия-сырца, обработанного уксусным ангидридом. Длительность потребления наркотиков составляла от 3 до 7 лет с суточной дозой от 2 до 4 граммов. Пациенты за пределами клинических проявлений синдрома отмены исключались из исследования. Также не включались в исследование пациенты, которые употребляли наркотические препараты эпизодически. Скрининг пациентов проходил с февраля 2002 по июль 2003года.

Исследовали лимфоциты, сыворотку и плазму.

Во всех случаях опийной абстиненции отмечалась выраженная клиническая картина, сопровождавшаяся целым рядом биохимических расстройств. По данным историй болезни при поступлении нарушения биохимических и клинических показателей характеризовались: гипербилирубинемией, снижением уровня гемоглобина, лейкоцитозом, протеинурией. С клинической точки зрения при поступлении в стационар у обследованных больных выявлялся болевой синдром, а также анорексия, рвота, диарея, обильная потливость, повышение артериального давления, повышение температуры тела, неврологические симптомы в виде расстройств периферической нервной деятельности, вегетативная дисфункция (тремор). Стандартная медикаментозная терапия опийной абстиненции проводилась в соответствии со стандартами лечения наркоманий и включала в себя использование клофелина, нейролептиков, седативных средств.

Метод выделения лимфоцитов периферической крови и получения Лимфоциты получали по методу [Натвина Д. и соавт.,1980].

Принцип метода основан на разделении клеток крови по плотности в градиенте “HISTOPAQUE” - 1077 (производства “SIGMA DIAGNOSTICS”). Плазматические мембраны лимфоцитов получали по методу [Финдлей Дж.,1991].

Метод разделения липидов плазматических мембран лимфоцитов Разделение основных классов фосфолипидов (ФЛ) и нейтральных липидов проводили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) по методу [Жухоровой Л. С., 1984]. Получали следующие фракции ФЛ: лизофосфолипиды (ЛФЛ), сфингомиелин (СФМ), фосфатидилинозитол (ФИ), суммарная фракция фосфатидилхолина и фосфатидилсерина (ФХ+ФС), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), церамиды. Церамиды разделяли путем двукратной прогонки в разных системах растворителей. Модификацию мембранных ФЛ проводили по методу [Финдлей Дж.,1991] с помощью тринитробензолсульфоновой кислоты.

При разделении нейтральных липидов получали следующие фракции:

фосфолипиды (ФЛ), холестерол (ХС) и эфиры холестерина (ЭХ). Разделение проводили на пластинках для ТСХ “SORBFIL”(Россия). Хромотограммы проявляли с помощью фосфорномолибденовой кислоты с последующим элюированием каждой фракции и определением неорганического фосфата по методу Боданского [Колб В. Г.,1982].

Методы определения активности липолитических ферментов Активность сфингомиелиназы, фосфолипазы А2 (ФЛ А2), фосфолипазы D (ФЛ D) определяли по методу [Брокерхофа Х.,1978]. Активность сфингомиелиназы определяли по уменьшению концентрации сфингомиелина (“ICN Biomedical”).

Выделение сфингомиелина проводили методом ТСХ и концентрацию выражали в мМоль фосфора. Активность ФЛ А2 определяли по увеличению содержания ЛФЛ, выделение и анализ которых проводили методом ТСХ. Активность ФЛ D определяли по количеству фосфатидной кислоты, выделение и анализ которой проводили в двухфазной системе ТСХ.

Методы оценки активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) Определение содержания ТБК – активных продуктов в лимфоцитах и сыворотке крови осуществляли в реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу [Каган В. Е., 1986]. Активность каталазы в лимфоцитах и сыворотке крови определяли по методу [Королюк М. А.,1988]. Определение активности супероксиддисмутазы в лимфоцитах и сыворотки крови проводили по методу [Каган В. Е., 1986].

Методы определение активности протеолитических процессов Определение активности трипсина в сыворотке крови проводили по методу [Пасхина Т. С.,1988] с использованием синтетического субстрата БАПНА (Nбензоил-L-аргинина-п-нитроанилид) Активность трипсина выражали в МЕ/мл.

Определение содержания плазминогена в плазме крови проводили по методу [Баркаган З. С., 1999]. Содержание растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК) в плазме крови определяли по методу [Момот А. П., 1996]. Активность – протеиназного ингибитора (1 –ПИ) и 2 – макроглобулина (2 – МГ) в плазме крови определяли унифицированным спектрофотометрическим методом по торможению гидролиза N-бензоил- L-аргинин-этилового эфира (БАЭЭ) и выражали в условных ингибиторных единицах (ИЕ/мл). Активность антитромбина – III (АТ – III) в плазме крови определяли по методу [Баркаган З. С., 1999].

Активность фактора Виллебранда (ФВ) в плазме крови определяли по методу [Баркаган З. С., 1999] на агрегометре Биола (модель LA 230).

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATGRAPHICS 5.0. Для проверки на нормальность использовался критерий Колмогорова-Смирнова. Поскольку изучаемые выборки не подчинялись нормальному закону распределения и были независимыми, для определения достоверности различий между группами использовался непараметрический двусторонний критерий Манна-Уитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (Х), ошибку среднего (m), среднеквадратичное отклонение.