На правах рукописи

РУСАНОВА Ольга Александровна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АНТИТЕЛ К ТИРОКСИНУ И ТРИЙОДТИРОНИНУ У БОЛЬНЫХ

СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ ПРИ ПОМОЩИ

МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ ИММУНОСОРБЕНТОВ

14.01.22 Ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград – 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии»

Российской академии медицинских наук и Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Зборовская Ирина Александровна доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Козлова Лилия Константиновна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ, кафедра факультетской терапии и эндокринологии, профессор кафедры Чижов Петр Александрович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ, кафедра факультетской терапии с военно-полевой терапией, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_»2014г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.08 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте организации (www.volgmed.ru) ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Автореферат разослан «_» 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Магницкая Ольга Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и степень ее разработанности Системная красная волчанка (СКВ) является одной из распространенных патологий в группе системных поражений соединительной ткани. Заболеваемость СКВ в развитых странах находится в диапазоне от 1,8 до 27,1 случаев на 100 000 населения с большими различиями в разных популяциях. Есть данные, что за последние 40-50 лет этот показатель увеличился почти втрое, и тенденция к росту сохраняется [Kausman, 1995; Picavet, 2003]. В России за последние 7 лет отмечается увеличение показателя распространенности системных заболеваний соединительной ткани на 6,8%. Лечение больных ревматических заболеваний отличается высокой «стоимостью» [Фоломеева, 2003; Эрдес, 2004].

Патогенез CКВ сложен, в его основе лежит нарушение коллагенообразования, гуморального и клеточного иммунитета [Ананьева, 2002]. Активно обсуждается вопрос об участии в патогенезе аутоиммунных заболеваний различных нарушений, связанных с метаболическими процессами. Так как СКВ является полисистемным аутоиммунным заболеванием, при котором может поражаться любой орган - мишень, некоторые авторы выдвигают гипотезу о том, что сочетанная аутотиреоидная патология может являться следствием антитиреоидной активности какой – либо группы антител (АТ), продуцируемых при системных коллагенозах [Серебряков, 1991]. Не исключено, что аутотиреоидная патология – результат иммунного повреждения щитовидной железы при СКВ, сопровождающегося отложением иммунных комплексов. Имеющиеся в литературе сведения по изучению аутоантител к гормонам щитовидной железы при некоторых ревматических заболеваниях разрознены и не систематизированы. При этом следует отметить, что патологическое действие подобных антител (АТ) до конца не определено. Поэтому возникла необходимость об определении антител непосредственно к гормонам щитовидной железы – тироксину (Т4) и трийодтиронину (Т3), и определение их роли и влияния на тиреоидную функцию и на течение СКВ.

Таким образом, исследование АТ к тиреоидным гормонам представляется весьма актуальной задачей, направленной на улучшение качества иммунологической диагностики поражения щитовидной железы при СКВ, обозначающей перспективы изучения отдельных механизмов патогенеза этого заболевания и проведения контроля над эффективностью терапии.

Учитывая, что СКВ чаще поражает пациентов молодого и среднего возраста, вызывая высокий процент инвалидизации, очень важно правильно и в ранние сроки поставить диагноз. Поэтому изучение патогенетических механизмов болезни, разработка новых диагностических тестов, объективно отражающих активность патологического процесса и позволяющих провести дифференциальную диагностику в группе диффузных заболеваний соединительной ткани и аутоиммунной гормональной дисфункции, является актуальной задачей современной ревматологии.

Результаты исследования могут дать дополнительные критерии эффективности проводимой терапии СКВ с поражением щитовидной железы.

Цель исследования Усовершенствование иммунологической диагностики поражения щитовидной железы при системной красной волчанке с использованием магнитоуправляемых иммуносорбентов, а также исследование динамики антителообразования к тироксину и трийодтиронину в зависимости от режима терапии СКВ.

Задачи исследования 1. Изучить распространенность антител к Т3 и Т4, их концентрацию у больных СКВ и пациентов контрольной группы;

2. Исследовать статистическую взаимосвязь антител к Т3 и Т4 с клиникоиммунологическими проявлениями СКВ;

3. Оценить эффективность использования антител к Т3 и Т4 для дифференцирования между СКВ с поражением щитовидной железы и воспалительными ревматическими заболеваниями без поражения щитовидной железы;

4. Проанализировать взаимосвязь между динамикой содержания антител к Т3 и Т4, динамикой активности СКВ и изменениями тиреоидного статуса на фоне лечения.

Выявить влияние вида проводимой терапии на концентрацию антител к тироксину и трийодтиронину.

Научная новизна исследования Впервые для иммунодиагностики заболеваний щитовидной железы при СКВ разработан вариант иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированной гранулированной формы тиреоидных гормонов и подобраны оптимальные условия его постановки. В ходе работы в сыворотках крови больных СКВ обнаружены антитела к тироксину и трийодтиронину. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных АТ в сыворотке крови здоровых лиц.

Выявлено, что концентрация антител к гормонам щитовидной железы у больных СКВ коррелирует с активностью основного патологического процесса. Установлено, что наличие висцеральных проявлений сопровождается максимальными значениями исследуемых АТ, что особенно выражено при вовлечении в патологический процесс щитовидной железы (развитии аутоиммунного тиреоидита, диффузно-токсического зоба или гипотиреоза). Определена способность исследованных показателей к изменению в ходе лечебно-реабилитационных мероприятий, что обеспечивает возможность оценки их эффективности.

Теоретическая и практическая значимость работы Впервые разработана доступная для применения в клинико-лабораторной практике методика иммуноферментного определения уровня антител к тиреоидным гормонам на основе иммобилизированных магнитосорбентов. Выявление антител к тироксину и трийодтиронину в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики поражения щитовидной железы при СКВ и прогнозирования клинических форм заболевания.

Отмечается взаимосвязь количества тиреоидных гормонов от уровня антител к ним – чем выше концентрация АТ, тем, ниже уровень трийодтиронина, что отражает процесс разрушения тиреоцитов и блокирования нормального процесса синтеза гормонов антителами к ним. Использование в практическом здравоохранении разработанных лабораторных тестов на основе иммобилизированных антигенных препаратов с применением тиреоидных гормонов позволит улучшить диагностику системной красной волчанки с поражением щитовидной железы, что особенно важно на ранних стадиях аутотиреоидного процесса, осуществлять контроль адекватности проводимой терапии.

Выявленные закономерности уровней антител к гормонам щитовидной железы могут быть использованы для возможности судить об эффективности проводимых лечебнореабилитационных мероприятий.

Методы определения уровня АТ к Т3 и Т4 с помощью иммобилизированных магнитосорбентов у больных СКВ внедрены в ГУЗ ГКБ СМП №25 г. Волгограда.

Методология исследования Выполнение научной работы состояло из 2 этапов – теоретического и экспериментального. Теоретический этап исследования посвящен сбору и анализу литературных данных, свидетельствующих о взаимосвязи между повышением уровня антител к тиреоидным гормонам у больных с ревматическими заболеваниями.

Эмпирический этап выполнен с применением двух базовых гносеологических методов – научного наблюдения и эксперимента. Задачей научного наблюдения стало изучение динамики антителообразования к тироксину и трийодтиронину у больных СКВ в зависимости от режима терапии. Исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Международной медицинской ассоциации, принятой в году, и рекомендациями по этике биомедицинских исследований. Соблюдение требований биоэтики подтверждено результатами экспертизы Регионального этического комитета.Выводы сделаны на основании результатов, полученных в ходе наблюдений и экспериментов и обработанных методами статистики.

Положения, выносимые на защиту 1. Содержание антител к тиреоидным гормонам зависит от активности и тяжести патологического процесса при СКВ.

2. Определение антител к Т3 и Т4 может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики степени активности аутоиммунного процесса, уточнения характера поражения внутренних органов и выделения клинических вариантов заболевания, дифференциальной диагностики и оценки эффективности проводимой терапии.

3. Одной из причин изменения активности гормонов щитовидной железы могут быть антитела к ним.

4. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности и коррекции проводимых лечебно-реабилитационных мероприятий.

Степень достоверности и апробация результатов Достоверность полученных результатов обеспечена использованием достаточного числа наблюдений, формированием однородных по клиническим характеристикам групп наблюдения, сравнения и контроля, использованием современных методов лабораторных и инструментальных исследований, а также методов статистической обработки данных. Полученные данные полностью согласуются с опубликованными ранее результатами исследований со сходными целями и задачами. Материалы диссертации были представлены на ХVIII Российском национальном конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2011 г.), на VII научно - практической конференции молодых ученых с международным участием (Ростов-на-Дону, 2012 г.), VII и VIII Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием (СанктПетербург, 2012, 2013 гг.), 70 и 71 открытых ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых с международным участием ВолГМУ (2012-2013гг.), ежегодных научных конференциях ФГБУ «НИИ КиЭР» РАМН (2011-2013 гг.). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 10 – в центральной и 4 – в местной печати, из них 4 - в сборниках, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных материалов диссертационных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем материала и методы исследования (глава 2) Для выполнения поставленных задач были сформированы группа больных с верифицированным диагнозом СКВ, а также контрольная группа. В состав последней были включены пациенты с другими ревматическими заболеваниями не аутоиммунной этиологии, при которых не отмечается вовлечения щитовидной железы в патологический процесс (остеоартроз, подагра, реактивный артрит).

Для установления нормальных характеристик изучаемых лабораторных показателей использовали референтную группу, состоящую из 30 практически здоровых лиц – доноров Волгоградской областной станции переливания крови (17 женщин и мужчин в возрасте от 25 до 50 лет), прошедших тщательное медицинское обследование.

Концентрацию свободного тироксина и трийодтиронина в плазме крови определяли путем иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы ЗАО «Алкор-Био» (Санкт-Петербург, Россия) и ООО «Хема-Медика» (Москва, Россия) соответственно, согласно инструкциям изготовителя.

В качестве антигена в ИФА был использованы препараты L-тироксина и трийодоSigma-Aldrich, США), очищенные методом высокоэффективной L-тиронина жидкостной хроматографии. Концентрация раствора тироксина составила 245 мкг/мл, трийодтиронина - 160 мкг/мл. Антитела к тироксину и к трийодтиронину определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием полиакриламидных гранул, синтезированных по оригинальной технологии [Гонтарь И.П. с соавт., 2007].

Иммобилизацию производили ковалентным связыванием Т3 и Т4 с предварительно полученными инертными полиакриламидными гранулами при помощи глютарового альдегида. Учет результатов проводили на многоканальном спектрофотометре АС-8К (Белоруссия) при длине волны 450 нм. Полученные значения выражали в условных единицах оптической плотности (е.о.п.), которые вычисляли как разность между средним значением оптических плотностей исследуемого образца и средним значением фона. Результаты статистической обработки представляли в форме: «среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение» (М±) либо среднее арифметическое (95% доверительный интервал) (М (95% ДИ)). Количественную оценку эффективности диагностического теста производили путем анализа четырехпольной чувствительности, специфичности, отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов [Гринхальх Т., 2006, Флетчер Р., 1998]. Перечисленные показатели были представлены в виде значений. Поиск оптимальных точек разделения между исследуемыми группами осуществляли с помощью непараметрического варианта ROC-анализа дифференцирования СКВ с поражением щитовидной железы от контрольной группы проверяли раздельно для положительных и отрицательных результатов с помощью отношений правдоподобия положительного (LRP) и отрицательного результата (LRN), учитывая зависимость этих показателей от значения точки разделения. Общую точность непараметрической характеристической кривой (AUC). Достоверность отличия данного показателя от 50% (абсолютной неинформативности) и от 100% (референтного стандарта) определяли с помощью 95% доверительного интервала. Различие между точностями двух диагностических исследований тестировали посредством сравнения их AUC с помощью z-статистики [N.A. Obuchowski, 2005]. В случае превышения точки разделения 0,115 е.о.п. для антител к тироксину и 0,086 е.о.п. для антител к трийодтиронину значения оптической плотности считали отражающими концентрацию изучаемых антител, в противном случае результат считали отрицательным.

Клиническая характеристика исследуемых групп (глава 3) Под нашим наблюдением находилось 178 человек, из них 65 больных системной красной волчанкой, 50 больных с другими ревматическими заболеваниями (остеоартроз (n=39), подагра (n=4), реактивный артрит (n=7)), 33 больных только с патологией щитовидной железы и 30 практически здоровых лиц.

Средний возраст пациентов с тиреоидной патологией составил 52,4814,03 лет.

Средняя продолжительность клинически выраженного наличия патологии щитовидной железы- 3,823,21 лет. Стаж заболевания до 1 года имели 9 (27,2 %) человек, от 1 года до 5 лет – 14 (42,4%), более 5 лет-10 (30,3%) человек. Дебют заболевания в среднем приходился на 48,613,6 лет. По наличию тиреоидной патологии пациенты распределились следующим образом: 10 (30,3%) больных имели ХАИТ в фазе эутиреоза, 9 (27,2%) - первичный гипотиреоз, 14 (42,4%) - пациенты с синдромом гипертиреоза (из них 4 (28,5%) - смешанный токсический зоб (СТЗ) (узловая форма ХАИТ) и 10 (71,4%) пациентов – ДТЗ).

У больных системной красной волчанкой диагноз ставился на основании тщательного клинико-лабоpатоpного обследования больных и верифицировался по критериям американского общества ревматологов 1982 года, пересмотренным в году. Больные отбирались по мере поступления в стационар, после клинического, лабораторного и инструментального обследования. Среди обследованных больных СКВ было 63 женщины (96,9%) и 2 мужчины (3,1%) в возрасте от 19 до 65 лет. По данным анамнеза средний возраст больных на начало заболевания составил 28,39±10,06 лет.

Практически у половины наблюдаемых (у 43,07%) дебют заболевания приходился на возрастной промежуток от 21 до 30 лет. В возрасте до 20 лет первые симптомы болезни отмечены у 13 человек (20,0%), в 21-30 лет - у 28 (43,7%), в 31 – 40 лет – у 12 (18,4%), в 41–50 лет – у 10 (15,4%) и в возрасте старше 50 лет – у 2 (3,1%) больных.

Средний возраст больных составил 42,5±12,1 лет. В возрастную группу до 20 лет вошло 5 человек (7,7%), 21–30 лет – 17 человек (26,2%), 31–40 лет – 21(32,3%), 41– лет – 15 (23,1%), 51–60 лет – 5 (7,7%) и старше 60 лет – 2 человека (3,1%). Приведенные данные демонстрируют преобладание среди больных СКВ лиц трудоспособного возраста (89,3% в возрасте менее 55 лет).

Распределение больных по степени активности, оцененной с использованием классификации Насоновой В.А. (1972г.), выявило: минимальная активность заболевания выявлена у 19 человек (29,2%), умеренная – у 39 (60,0%), высокая – у 7 (10,8%) пациентов. Среднее значение индекса SLAM у больных исследуемой группы составило 10,2±6,7 (диапазон значений от 2 до 28), для индекса SLEDAI – 5,1±3,4 (диапазон от 0 до 23). Была выявлена тесная корреляция между оценками, полученными при использовании шкал SLAM и SLEDAI (двухсторонний коэффициент корреляции