На правах рукописи

Ситдыкова Юлия Равильевна

Влияние антиретровирусной терапии на динамику CD4-лимфоцитов и

экспрессию Т-клетками иммунологических маркеров у пациентов,

инфицированных ВИЧ

14.00.10 – инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Покровский Вадим Валентинович

Научный консультант:

Кандидат медицинских наук Серебровская Лидия Васильевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Кожевникова Галина Михайловна Доктор медицинских наук Полякова Алла Марковна Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» Росздрава

Защита состоится 3 ноября 2006 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.114.01 ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора по адресу: 111123,г. Москва, ул.

Новогиреевская, 3а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «_» _ 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич Актуальность проблемы Инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), является одной из наиболее актуальных проблем системы здравоохранения. Пандемия ВИЧ-инфекции, по оценочным данным Объединенной программы Организации Объединенных Наций по ВИЧ/СПИДу и Всемирной Организации Здравоохранения, в 2005 году унесла жизни около 3,1 миллионов жителей Земли [Юнэйдз, ВОЗ, 2005].

Количество российских граждан, инфицированных ВИЧ, с каждым годом увеличивается. Согласно данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом на 30 сентября 2006 года на территории Российской Федерации было официально зарегистрировано более 370 тысяч человек, живущих с ВИЧ-инфекцией. В течение последних 13 лет в г. Москве, как и в других регионах страны, наблюдался ежегодный рост числа погибших ВИЧ-инфицированных больных [Тишкевич О.А., Шахгильдян В.И., Пархоменко Ю.Г., 2004]. Из-за широкого распространения внутривенных наркотиков ВИЧ инфекция поражает людей преимущественно молодого возраста, что приводит к тяжелым демографическим и социально-экономическим последствиям.

ВИЧ-инфекция характеризуется постепенным снижением числа CD лимфоцитов и прогрессирующей иммунной дисфункцией. Количество CD4 Тклеток продолжает оставаться основным лабораторным маркером прогрессии ВИЧ-инфекции и является критерием для назначения антиретровирусной терапии. Многочисленными исследованиями показано, что уровень CD лимфоцитов перед началом лечения определяет его эффективность и прогноз течения болезни.

Несмотря на то, что огромная значимость показателя CD4 очевидна, технологии для подсчета количества CD4-лимфоцитов развиваются медленно.

Количество проточных цитометров – приборов для определения количества CD4на территории Российской Федерации до сих пор ограничено. Однако даже в лабораториях, оснащенных проточными цитометрами, для анализа часто используются устаревшие методики. Отсутствие надежных, доступных, а главное, стандартных и общепринятых подходов для определения количества CD4-лимфоцитов на проточном цитометре, неизбежно компрометирует несвоевременному назначению терапии и неадекватному мониторингу ее эффективности.

Традиционно используемый двух-платформенный метод (ДП) включает определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов на проточном гематологического анализатора, позволяющего определить количество лейкоцитов и лимфоцитов в образце периферической крови, после чего путем математического пересчета получают окончательный результат. В отличие от двух-платформенного одно-платформенный (ОП) метод позволяет получить абсолютные значения числа CD4-лимфоцитов с помощью только одного проточного цитометра, путем добавления к образцу частиц известной концентрации. Использование данного подхода позволяет увеличить сроки хранения образцов до 72 часов, значительно уменьшает внутрилабораторную и межлабораторную вариабельность абсолютных показателей [Gratama JW.et al, 2002]. Трех и четырехцветный анализ с гейтированием по CD45 и одноплатформенным методом является стандартной методикой для определения CD Т-клеток у ВИЧ-инфицированных в Европе и Северной Америке. На территории Российской Федерации до настоящего времени одно-платформенный метод практически не использовался.

В 2002 году Деборой Гленкросс была предложена методика PLG (Panleukogating), в основе которой лежит использование общего лейкоцитарного маркера CD45 для идентификации популяции лейкоцитов. Первоначально этот метод был предложен, как двух-платформенный: для подсчета абсолютного количества CD4 клеток использовалось общее количество лейкоцитов, полученное на гематологическом анализаторе. Преимущество данного подхода по сравнению с традиционным двух-платформенным методом заключается в том, что из подсчета абсолютного количества CD4 клеток исключается наиболее уязвимое звено – определение процентного содержания лимфоцитов на гематологическом анализаторе. Именно этот показатель наиболее скомпрометирован у тяжелых пациентов с лимфопенией и ранее всего страдает при старении образцов крови.

Позднее было предложено использовать методику PLG в качестве одноплатформенного метода, путем добавления к образцу частиц для абсолютного счета. В таком варианте методика позволяет осуществлять подсчет общего количества лейкоцитов, процентное и абсолютное содержание лимфоцитов, процентное и абсолютное содержание CD4 клеток, исключая необходимость использования гематологического анализатора.

Таким образом, апробация и внедрение новых методик для определения количества CD4-лимфоцитов является одной из первоочередных задач для становления инфраструктуры мониторинга ВИЧ-инфекции в Российской Федерации.

Развитие вторичных заболеваний, как правило, наблюдается при снижении оппортунистические инфекции могут развиваться и у пациентов с относительно высоким содержанием CD4. [Рахманова А.Г. и соавт., 2002]. Таким образом, исследование только количества CD4 Т-клеток недостаточно для того, чтобы в полной мере оценить глубину поражения иммунной системы у больных ВИЧинфекцией.

В настоящее время иммунофенотипирование у ВИЧ-инфицированных больных, как правило, ограничивается определением содержания CD4 и CD лимфоцитов, исследование же других поверхностных маркеров используется крайне редко. Это объясняется малой изученностью экспрессии поверхностных молекул у ВИЧ-инфицированных лиц и ее клинического значения. В ранее проведенном исследовании было выявлено, что определение основных субпопуляций лимфоцитов – Т-клеток, В-клеток, натуральных киллеров – недостаточно для оценки нарушений в системе иммунитета [Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Шахгильдян В.И., 1999]. В то же время, исследование других иммунологических маркеров может дать дополнительную информацию о состоянии пациента, прогнозе течения заболевания и эффективности антиретровирусной терапии. У больных ВИЧ-инфекцией CD4 и CD8-лимфоциты имеют ряд аномалий фенотипа, в частности, увеличение экспрессии CD25– рецептора к интерлейкину 2, CD95–маркера, обусловливающего повышенную чувствительность к апоптозу, а также маркера активации CD38. Кроме того, наблюдается изменение соотношения «наивных» Т-клеток (зрелых неиммунных лимфоцитов) – ранее не встречавшихся с антигеном, и клеток памяти, отмечается нарушение экспрессии CD28, CD40L – важнейших ко-стимуляторных молекул, необходимых для эффективного иммунного ответа [Carcelain C., Li T, 1999].

Лимфоциты при ВИЧ-инфекции имеют повышенный уровень экспрессии CD57, отражающий сниженную способность клеток к делению [Brenchley J.M., Karandikar N.J., 2003]. В то же время вопрос о клиническом значении этих маркеров и возможности коррекции иммунных нарушений под влиянием антиретровирусной терапии остается открытым.

Таким образом, использование современных методик подсчета СD4 Тклеток и их стандартизация, а также определение дополнительных иммунологических маркеров необходимы для оптимизации мониторинга течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности лечения.

антиретровирусной терапии с помощью исследования динамики количества CD лимфоцитов и экспрессии Т-клетками иммунологических маркеров.

Задачи:

1. Оценить точность и надежность современных методов определения количества CD4 лимфоцитов на проточном цитометре лимфоцитов и CD4 Т-клеток памяти, и оценить их динамику при проведении антиретровирусной терапии.

3. Изучить экспрессию CD4 Т-клетками молекул CD28, CD40L у пациентов, инфицированных ВИЧ, под влиянием антиретровирусной терапии.

4. Оценить содержание CD8+CD38+ (активированных) клеток у ВИЧинфицированных пациентов и их динамику в процессе лечения.

5. Исследовать содержание CD8+CD57+ и CD8+CD28+ лимфоцитов при ВИЧ-инфекции и под влиянием антиретровирусной терапии.

6. Оценить экспрессию CD4 Т-клетками рецепторов к интерлейкину 2 (CD25) и CD95 (Fas) и их динамику на фоне антиретровирусной терапии.

7. Определить значение исследуемых иммунологических маркеров для оценки эффективности антиретровирусной терапии и прогноза течения ВИЧ-инфекции.

Научная новизна исследования Впервые в России у пациентов, инфицированных ВИЧ, исследовано содержание «наивных» CD4 Т-клеток и клеток памяти, изучена частота экспрессии Т-клетками активационных и функциональных маркеров в сравнении с контрольной группой здоровых лиц, а также экспрессия Т-клетками иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной терапии. Впервые была выявлена зависимость исходного фенотипа лимфоцитов и иммунного ответа на лечение.

Практическое значение работы В результате данной работы оптимизирована и стандартизована технология подсчета СD4 Т-клеток на проточном цитометре. Подготовлены и изданы Методические рекомендации по определению количества СD4 лимфоцитов на проточном цитометре у пациентов, инфицированных ВИЧ [Минздравсоцразвития России, 2004]. Предложены дополнительные критерии для оценки эффективности антиретровирусной терапии и прогноза течения ВИЧ-инфекции.

Внедрение в практику Результаты исследования внедрены в практику работы Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом, а также используются при подготовке лекций для врачей-инфекционистов и врачей лаборантов в рамках обучающих семинаров на базе Федерального научнометодического центра по профилактике и борьбе со СПИДом.

Апробация диссертации По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Материалы диссертации были доложены на II Российской научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и парентеральных вирусных гепатитов, г. Суздаль, 2002 г.; на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», г. Санкт-Петербург, 2004 г.; на 6 Международной конференции по лекарственной терапии ВИЧ-инфекции, г. Глазго, 2002 г.; на Европейском конгрессе по СПИД, г. Варшава, 2003 г.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 10 отечественных и 92 зарубежных источников клиническими примерами.

Содержание работы Материалы и методы исследования Для изучения динамики иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной терапии в исследование были включены 45 пациентов, мужчина и 14 женщин, средний возраст составил 28+9,9 лет. Все пациенты имели подтвержденный диагноз ВИЧ-инфекции.

У 25 пациентов (55,6%) заражение произошло путем внутривенного употребления наркотических средств, 13 пациентов (28,9%) заразились при гетеросексуальных, а 7 (15,6%)– при гомосексуальных половых контактах.

У 40 пациентов (88,9%) на момент включения в исследование была установлена латентная стадия ВИЧ-инфекции (стадия III в соответствии с классификацией В.И. Покровского 2001 года), то есть клинические проявления ВИЧ-инфекции отсутствовали. При физикальном осмотре у этих больных, как правило, удавалось обнаружить лишь увеличение периферических лимфатических узлов; чаще всего - подчелюстных, переднешейных, заднешейных, затылочных, надключичных и подмышечных.

У 25 пациентов (55,6%) на момент начала исследования были выявлены антитела к вирусному гепатиту С, у одного пациента (2,2%) помимо этого обнаруживали поверхностный антиген вируса гепатита В. У 13 из них (52%) регистрировали повышение уровней аминотрансфераз, не превышающее верхнюю границу нормальных значений более чем в 3 раза. У 10 пациентов (40%) выявляли умеренную гепатомегалию.

У 5 пациентов (11,1%) на момент начала лечения или в анамнезе были клинические проявления вторичных заболеваний (IV стадия ВИЧ-инфекции): у двух пациентов (4,4%) в анамнезе был рецидивирующий опоясывающий лишай, у двух других больных (4,4%) на момент начала исследования выявляли кандидоз слизистой оболочки полости рта; у одного пациента до начала лечения были диагностированы остроконечные кондиломы перианальной области.

Среднее содержание CD4 лимфоцитов до начала исследования составило 275+141 клеток/мкл (медиана 271 клеток/мкл). Количество РНК ВИЧ в плазме на момент начала антиретровирусной терапии в среднем составляло 4,75+0,53 log копий/мл (медиана 4,69 log10 копий/мл).

В контрольную группу было включено 27 человек (16 мужчин и женщин), средний возраст которых составил 28+10,8. Критерием отбора лиц в контрольную группу было отсутствие ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов, аутоиммунных состояний, а также любых острых заболеваний на момент обследованиям.

Всем пациентам была назначена антиретровирусная терапия. Показаниями для ее назначения было наличие клинических проявлений вторичных заболеваний и/или снижение абсолютного количества CD4 лимфоцитов менее 350 клеток в мкл и/или уровень РНК ВИЧ в плазме более 55 000 копий в 1 мл [DHHS Guidelines, 2002].

Терапевтическая схема включала два препарата из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы – ламивудин (3ТС) по 150 мг 2 раза в сутки и ставудин (d4T) по 40 мг 2 раза в сутки (при массе больного менее 60 кг – 30 мг (лопинавир/ритонавир) по 400/100 мг 2 раза в сутки или типрановир с ритонавиром по 500/200 мг 2 раза в сутки.

Период наблюдения составил 6 месяцев. Обследование больных проводили до начала терапии и через 4, 12 и 24 недели лечения. При каждом визите осуществляли физикальный осмотр пациента, забор крови для исследования:

анализ периферической крови, биохимический анализ крови, определение количества CD4 лимфоцитов, вирусной нагрузки, а также исследование экспрессии иммунологических маркеров. Методом проточной цитометрии (проточный цитометр Epics XL, Beckman Coulter) с использованием моноклональных антител (Iotest, Beckman Coulter) определяли процентное CD4+CD45Ro+, CD8+CD28+, CD8+CD38+, CD8+CD57+ клеток в популяции лимфоцитов, а также процент CD4 и CD8 лимфоцитов, несущих каждый из вышеуказанных маркеров, процент CD4, ко-экспрессирующих CD45Ra и CD62L («наивные» клетки) и процент CD3, ко-экспрессирующих CD8 и CD57. На всех визитах с пациентами проводили консультирование, направленное на повышение приверженности лечению. Критерием эффективности лечения было снижение количества РНК ВИЧ в плазме ниже уровня, определяемого тест-системой (менее 400 копий/мл, Amplicor HIV-1 Monitor, Roche), а также прирост CD4 лимфоцитов.

Для сравнения методик определения количества CD4 лимфоцитов использовали образцы цельной крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Для сравнения одно-платформенного и двух платформенного методов подсчета абсолютного количества CD4 было исследовано 106 образцов свежей цельной крови, для изучения возможности отсроченного исследования был проанализирован 51 образец крови в день забора и через 72 часа (на 3 сутки) после забора. Содержание CD4 лимфоцитов определяли с использованием трехцветного анализа с гейтированием по CD45 (моноклональные антитела Iotest, Beckman Coulter) Для оценки методики PLG ОП было исследовано 106 образцов свежей крови, PLG ДП - 100 образцов.

Для статистического анализа использовали критерии Стьюдента, МаннаУитни, парный критерий Стьюдента и критерий Уилкоксона, в зависимости от характера распределения значений выборки. Согласие методов определения количества CD4 лимфоцитов оценивали при помощи регрессионного анализа, анализа Блэнда-Алтмана (БА) и выявления процентного сходства (определяли среднее процентное сходство, среднюю процентную разницу - MPD, коэффициент вариации - CV). Статистическую обработку данных осуществляли при помощи компьютерных программ GraphPadPrizm 4 и Microsoft Excel.

Результаты исследования и их обсуждение При сравнении одно-платформенного и двух-платформенного методов подсчета абсолютного количества CD4, анализ Блэнда-Алтмана показывает отсутствие систематического расхождения и относительно небольшой разброс значений (0,7+76,5 кл/µ). Среднее процентное сходство составило 102%, MPD=2+12%, CV=12%. Сравнительный анализ значений, полученных при исследовании образцов непосредственно после забора крови и на 3 сутки, показал почти полное отсутствие систематического расхождения (1 кл/µ). При этом разброс абсолютных значений также был относительно небольшим (+81 кл/µ).

Анализ процентного сходства дал очень хорошие результаты: среднее процентное сходство составило 99,8%, MPD=0,2+4%, CV=4%.

Методика PLG ОП по сравнению с трехцветным протоколом в сочетании с одно-платформенным методом подсчета CD4-лимфоцитов показала небольшие систематическое расхождение (-16 кл/µ) и разброс значений. Анализ процентного сходства дал хорошие результаты: среднее процентное сходство составило 102%, MPD=2+4,6%, CV=4,5%. Основным преимуществом вышеперечисленных методик является возможность исследований образцов в течение 72 часов.

Результаты наших исследований показали, что при хранении образцов при комнатной температуре анализ на третьи сутки дает надежный результат, в то время как использование двух-платформенного ограничивает сроки хранения образцов 6-12 часами.

При сравнении методики PLG ДП и стандартного метода стандартное расхождение и разброс значений был несколько выше и составил -24+85 кл/µ.

При этом показатели анализа процентного сходства были достаточно неплохими:

среднее процентное сходство составило 103%, MPD=3+7,9%, CV=7,6%.

Таким образом, оптимальными методиками для определения количества CD4 Т-лимфоцитов можно считать трех и четырехцветный анализ с гейтированием по CD45 и методику PLG с одно-платформенным методом подсчета абсолютного количества при наличии постоянного мониторинга скорости потока частиц.

Использования современных стандартизованных лабораторных методов исследования позволяет получить объективную оценку нарушений в системе иммунитета у больных ВИЧ-инфекцией, а также осуществлять мониторинг эффективности антиретровирусной терапии.

Наиболее сложным этапом нашей работы было изучение динамики количества CD4 лимфоцитов и экспрессии Т-клетками иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной терапии.

Высокоактивная антиретровирусная терапия была назначена 45 пациентам, 44 из которых завершили 24 недели лечения. Один пациент самостоятельно прервал терапию после 4 недели.

За время наблюдения ни у одного из больных клинических признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции выявлено не было. Состояние больных оставалось удовлетворительным, большинство пациентов отмечало улучшение общего самочувствия.

На фоне терапии у 68% пациентов были нежелательные явления, чаще всего - диспептические расстройства, проявлявшиеся тошнотой, жидким стулом.

Данные симптомы, как правило, имели легкое течение, транзиторный характер и самостоятельно купировались через 10-14 дней лечения. Однако у одного пациента диарея на протяжении всего периода терапии требовала медикаментозной коррекции.

У пациентов, имеющих маркеры гепатитов С и В, клинических и лабораторных признаков ухудшения течения хронического заболевания печени не было.

Больные с проявлениями вторичных заболеваний на фоне лечения отмечали улучшение самочувствия. У пациента с остроконечными кондиломами в перианальной области их рост прекратился. У больных, страдавших кандидозом слизистых полости рта до начала ВААРТ, отметили исчезновение клинической симптоматики после короткого курса флуконазола и в дальнейшем, в процессе ВААРТ, не наблюдали рецидивов заболевания. У двух пациентов, антиретровирусной терапии не отмечали возникновения его рецидивов.

Исследование поверхностных иммунологических маркеров у ВИЧинфицированных пациентов показало значительные изменения фенотипа CD4 и CD8 лимфоцитов по сравнению с ВИЧ-негативными лицами. Необходимо отметить, что определение процентного содержания клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры, в популяции CD4 и CD8 лимфоцитов было более информативным, чем исследование этих клеток в общей популяции лимфоцитов, поскольку истинные тенденции были часто завуалированы уменьшением количества CD4 или увеличением числа CD8 лимфоцитов.