На правах рукописи

ШУБА Анастасия Александровна

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ БИОПРОБ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ

ДЕТЕКТИРОВАНИЯ МАССИВОМ ПЬЕЗОСЕНСОРОВ

ЛЕГКОЛЕТУЧИХ АМИНОВ РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ

И АЛИФАТИЧЕСКИХ КИСЛОТ

02.00.02 – Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Воронеж 2013

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: Кучменко Татьяна Анатольевна – доктор химических наук, профессор (ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»)

Официальные оппоненты: Евтюгин Геннадий Артурович – доктор химических наук, профессор (ФГБОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет») Ревельский Александр Игоревич – доктор химических наук, доцент (ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им.

М.В..Ломоносова»)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Липецкий государственный технический университет»

Защита диссертации состоится « 13 » июня 2013 г. в часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212.035.05 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «ВГУИТ».

Автореферат размещен в сети Интернет Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ru и ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» http://www.vsuet.ru Автореферат разослан « » апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.035.05 В.А. Седых

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для решения многих задач современного анализа важно изучение гетерогенных равновесий на границе раздела фаз «сорбент – газ», так как такие системы широко применяются для подготовки проб (выделение и концентрирование целевых компонентов), для извлечения микропримесей, детектирования с предварительным накоплением аналита и в хроматографии. Одним из подходов в анализе газовых сред является применение химических пьезосенсоров, для которых приоритетна информация об особенностях сорбции газов и паров пленками сорбентов малых масс.

Состояние биообъекта и происходящие в нем процессы с участием патогенных или полезных микроорганизмов характеризуются уникальным химическим составом, в том числе фракции легколетучих органических соединений – маркеров этих процессов (брожение, гниение, окисление и т.д.).

Поэтому, совокупность газов-маркеров в равновесной газовой фазе над пробой может служить косвенным критерием для оценки состояния объекта по основным квалификационным уровням (группам), которые определяются в зависимости от вида биообъекта по ограниченному числу критериев. В качестве критериев могут выступать показатели естественного ненарушенного состояния живых систем. Нормативные показатели устанавливаются на основе специальных исследований или в результате экспертных оценок.

Косвенная оценка выраженности тех или иных процессов, присутствия и активности микроорганизмов оправдана в случае получения дополнительной информации быстро, с большой достоверностью и без дорогих реактивов и оборудования. Чаще всего в оценке состояния биопроб нуждаются при медицинском осмотре для получения дополнительной или диагностической скрининг информации о пациенте, в пищевой промышленности – для контроля качества и порчи продуктов, в экологическом мониторинге – для получения информации об экологических показателях и прогнозирования состояния экосистемы. Целевыми веществами, несущими информацию о состоянии живой системы*, являются, в частности, амины и кислоты различного строения, поэтому детектирование их в газовой фазе над объектом является важной практической задачей.

Работа выполнена в рамках научного направления кафедры «Теоретическое обоснование, разработка инновационных решений для совершенствования технологических процессов, средств их контроля и оценки экологической безопасности», № ГР 01201253870; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», г/к № П2264, ФЦП «Инновации России», подпрограммы «У.М.Н.И.К» г/к № №9833р/14306, «Старт» г/к № 7641р/1049.

* под живыми системами будем понимать открытые системы, имеющие структурную сложность, т.е.

биопробы, полученные в результате жизнедеятельности человека или иного живого организма, в которых протекают процессы метаболизма с участием органических веществ.

Цель работы – изучение особенностей сорбции паров аминов различного строения, алифатических кислот на селективных пленках сорбентов и разработка способов идентификации их с применением массивов пьезосенсоров для оценки состояния биопроб.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

изучить особенности сорбции алифатических, ароматических, циклических аминов, алифатических кислот нормального и изомерного строения из воздуха на тонких пленках стандартных хроматографических и других фаз с повышенной избирательностью;

оценить влияние природы растворителя фаз на кинетические и количественные характеристики сорбции аналитов и мешающее влияние сопутствующих нативных и патогенных компонентов при микровзвешивании смесей аминов и кислот;

оценить возможность идентификации отдельных легколетучих азотсодержащих соединений (амины и аммиак) и алифатических кислот в смесях;

применить хемометрические методы обработки многомерных данных массива пьезосенсоров для раздельного детектирования аминов различного строения в смесях;

разработать способы оценки состояния биопроб по результатам детектирования в равновесных газовых фазах (РГФ) над ними аминов различного строения и алифатических кислот с применением массивов пьезосенсоров с многоуровневой обработкой данных по принципу «от простого к сложному».

Научная новизна:

Систематически оценены сорбционные свойства тонких пленок универсальных и селективных хроматографических и других фаз с повышенной избирательностью (кислотно-основные индикаторы) по отношению к парам аминов (алифатические, циклические, ароматические), аммиака, алифатических кислот С2-С5.

Оценено влияние и участие остаточного растворителя на эффективность, селективность, кинетику сорбционных взаимодействий в системах «пары аминов – тонкие пленки полиэтиленгликолей (ПЭГ) и его эфиров, нанесенных из этанольных и ацетоновых растворов». Квантовохимическими расчетами и пьезокварцевым микровзвешиванием установлено содержание ацетона в расчете на мономерное звено полимера.

Предложен подход по формированию массива сенсоров на основе универсальных и селективных пленок для повышения избирательности определения в многокомпонентных смесях аминов, кислот нормального и изомерного строения, с учетом чувствительности, селективности микровзвешивания, кинетических особенностей сорбции.

Предложен новый критерий пьезокварцевого микровзвешивания (параметр эффективности сорбции Aijmax), позволяющий в совокупности с традиционными характеристиками идентифицировать амины, кислоты, аммиак в модельных смесях и реальных объектах.

Предложены критерии для ранжирования состояния биопроб по результатам детектирования паров аминов и кислот массивом пьезосенсоров.

Практическая значимость:

Оценены эксплуатационные свойства и обоснован массив пьезосенсоров на основе тонких пленок универсальных (интегральное микровзвешивание) и избирательных фаз (дифференциальное микровзвешивание) для широкого практического применения в оценке состояния живых систем.

Разработаны методики идентификации аминов, кислот, аммиака в смесях и равновесной газовой фазе над биопробами по новым расчетным параметрам эффективности сорбции Aijmax и методами хемометрики (метод главных компонент (МГК) и регрессии на главные компоненты (РГК)).

Применен метод РГК для построения модели, позволяющей дифференцировать возбудителей патогенных состояний в биопробах по результатам микровзвешивания паров в их равновесных газовых фазах.

Разработаны и апробированы способы экспресс-оценки состояния биопроб различной природы (биоптат человека, экскременты птицы, пищевой продукт) с применением массива пьезосенсоров.

На защиту выносятся:

Особенности сорбции паров аминов различного строения (алифатических, ароматических, циклических) и алифатических кислот С2-С5 нормального, изомерного строения на тонких пленках универсальных хроматографических и селективных фаз.

Результаты по оценке влияния растворителя на сорбционные характеристики тонких пленок ПЭГ и его эфиров, нанесенных из ацетоновых и этанольных растворов. Результаты квантово-химических расчетов остаточного содержания ацетона в пленках сорбентов.

Способ идентификации аминов различного строения, алифатических кислот и аммиака в газо-воздушных смесях и равновесной газовой фазе над реальными объектами с применением новых расчетных параметров эффективности сорбции Aijmax.

Результаты применения методов хемометрики (МГК, РГК) для обработки регистрируемых и расчетных параметров пьезокварцевого микровзвешивания смесей паров массивом пьезосенсоров для идентификации газов-маркеров состояния живых систем.

Три способа оценки состояния биопроб различной природы по результатам идентификации аминов и кислот с применением массива пьезосенсоров на основе универсальных и дифференцирующих покрытий по предлагаемым критериям наличия патогенных газов-маркеров и результатам обработки данных методами хемометрики.

Структура и объем диссертации представлена введением, 4 главами, выводами, списком цитируемой литературы (279 ист.) и приложением (материалы Роспатента, акты апробации, протоколы испытаний). Работа изложена на 225 стр. машинописного текста, содержит 44 рис., 47 табл.

Публикации. Основные положения и результаты диссертационной работы изложены в 13-ти статьях, в том числе 3 из них опубликовано в журналах из списка ВАК, тезисах 22-х докладов, 3-х изобретениях.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на 20ти конференциях различного уровня, в том числе: II Междунар. симпозиуме по сорбции и экстракции (Владивосток, 2009), IV Междунар. конф. «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010), Междунар. молодеж. научном форуме «ЛОМОНОСОВМосква), V Всерос. конф. студентов и аспирантов с международ. участием «Химия в современном мире», «Менделеев» (Санкт-Петербург, 2011, 2012), II Международ. научно-практич. конф. «Актуальные проблемы химической науки, практики и образования» (Курск, 2011), VIII Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА – 2011» (Архангельск, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), III Всерос. симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), I и III-ей Международ. межвуз. конф. «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания» (Москва, 2010, 2012), ежегодных отчетных конференциях преподавателей и аспирантов ВГУИТ (2009 -2012).

Личный вклад автора состоял в постановке и выполнении эксперимента, активном участии в интерпретации результатов, написании статей, заявок на изобретения, подготовке докладов и выступлении на конференциях, апробации разработанных способов и внедрении методик анализа.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи, научная новизна и практическая значимость работы.

В 1-ой главе рассмотрены методы для экспрессной оценки состояния биопроб: прямые (иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР), серологический и культуральные методы) и косвенные (хроматографические и сенсорные методы), применение которых основано на детектировании продуктов жизнедеятельности бактерий, микроорганизмов или деструкции биомакромолекул – газов-маркеров состояния, в том числе алифатических, ароматических и гетероциклических аминов, короткоцепочечных алифатических карбоновых кислот, спиртов, эфиров и кетонов, раздельное определение которых в газовой фазе над пробой необходимо для правильной оценки состояния биообъекта (экологических, медицинских и пищевых систем).

Во 2-й главе представлены характеристики объектов исследования, которые выбраны, в соответствии с решаемыми задачами:

1) для подбора эффективных модификаторов сенсоров и оптимальных условий детектирования газов-маркеров в смесях на уровне микроконцентраций; выбора критерия для возможного качественного анализа и классификации смесей применяли индивидуальные соединения (алифатические и ароматические амины, карбоновые кислоты, спирты, ацетон, этилацетат) и их смеси.

2) Для апробации разработанного подхода детектирования тествеществ выбраны реальные биопробы различной природы:

биоптат – цервикальная слизь женщин здоровых и с различными моноинфекциями (кандидоз, хламидиоз, гарднереллез, уреаплазмоз, вирус папилломы человека), а также их сочетаниями (микст-инфекция);

пищевые продукты – на примере колбасы вареной «Докторская»

различных производителей;

экскременты кур – помет 3-х групп птиц с различными режимами кормления и наступления дисбиоза по фазам откорма (I фаза откорма – с до 27, II – с 28 по 42 день жизни).

Характеристика модификаторов электродов ПКР. Для изучения сорбции аминов выбраны стандартные хроматографические и другие фазы:

поливинилпирролидон, ПВП; дициклогексан-18-Краун-6, ДЦГ-18-К-6;

15-Краун-5, 15-К-5; полиоксиэтилен сорбитан-моноолеат, TWEEN 40; пчелиный воск, ПчВ; динонилфталат, ДНФ; октилполиэтоксифенол (тритон Х-100), ТХ-100; полиэтиленгликоль 2000, ПЭГ-2000 и его эфиры – сукцинат, ПЭГСк; адипинат, ПЭГА; себацинат, ПЭГСб; фталат, ПЭГФ; а также многослойные углеродные нанотрубки, МУНТ.

Для повышения чувствительности и селективности пьезосенсоров к кислотам, аминам в качестве сорбентов применяли кислотно-основные индикаторы, относящиеся к сульфофталеинам и азосоединениям: бромкрезоловый синий, БКС; бромтимоловый синий, БТС; бромфеноловый синий, БФС; метиловый красный, МК.

Сорбцию индивидуальных тест-веществ и их смесей исследовали в статических условиях с инжекцией паров в ячейку детектирования анализатора газов «МАG-8» (Воронеж). В программном обеспечении “MAGSoft” фиксировали частоты колебаний сенсоров (Fi, Гц), относительные их изменения (Fi, Гц) во времени с шагом 1 с в виде хроночастотограмм, а также аналитические сигналы (Fmax, Гц), проводили статистическую обработку.

В качестве аналитических сигналов мультисенсорной системы применяли: сигналы отдельных сенсоров Fmax, Гц, «визуальные отпечатки»

максимумов – строятся по максимальным сигналам всех пьезосенсоров в матрице, кинетические «визуальные отпечатки» и их площадь (Sв.о., Гцс).

Площадь полного аналитического сигнала массива сенсоров является основной количественной характеристикой содержания легколетучих веществ в пробе, которые сорбируются выбранными покрытиями.

Применяли другие методы: для изучения поверхности пленочных покрытий электродов до и после взаимодействия с аналитами – метод атомно-силовой микроскопии (Solver P47-PRO), для описания особенностей взаимодействия пленок полимеров с тест-веществами и растворителем – квантово-химические расчеты (Gaussian 03). Исходную характеристику состояния биопроб оценивали по результатам стандартных клинических методов (ПЦР-анализ “Rotor-Gene” 6000, микроскопия, ИФА ImmunochemУЗИ, микробиологический метод). Для пищевых продуктов – стандартных методик по определению содержания влаги, жира, белка и органолептической оценки (запаха, вкуса) в соответствии с ГОСТами (9793Для обработки многомерного массива данных, применяли методы главных компонент (МГК), регрессии на главные компоненты (РГК) с оценкой правильности моделей методами кросс-и тест-валидации (The Unscrambler v. 10.0.0).

В 3-ей главе обсуждаются особенности сорбции паров аминов и карбоновых кислот на тонких пленках модификаторов ПКР и их идентификация в газо-воздушных смесях на фоне других газов и воды.

Рассчитана массовая чувствительность микровзвешивания паров алифатических, циклических, ароматических аминов на тонких пленках стандартных модификаторов ПКР. Установлено, что на пленках изологического ряда полиэтиленгликоля и его эфиров максимальная чувствительность микровзвешивания паров алифатических аминов достигается на пленке ПЭГА и уменьшается ПЭГСб > ПЭГФ > ПЭГСк > ПЭГ-2000 за исключением аммиака, анилина и 2,4-диметиланилина.

Высокие значения массовой чувствительности к парам аминов характерны для пленок Tween и ПВП, к парам пиперидина и ароматических аминов – для пленки ДЦГ-18-К-6.

Максимальная чувствительность к парам карбоновых кислот нормального строения среди стандартных хроматографических фаз характерна для пленок ПВП и ТХ-100, меньше чувствительность для пленок Tween, ПЭГА. Наибольшая чувствительность к парам кислот изомерного строения установлена для пленок ДЦГ-18-К-6, ПЭГ-2000, ПЭГСк. Это связано с особенностями строения аналитов и сорбентов – стерическим фактором, благоприятном для образования электронносопряженных структур, водородных связей.

На основании массовой чувствительности и коэффициентов селективности для определения аминов и карбоновых кислот в смесях выбраны сенсоры с пленками ПЭГ-2000, ПЭГА, ТХ-100, ДЦГ-18-К-6, Tween, а также фазы многослойных углеродных нанотрубок.

Растворитель фаз оказывает существенное влияние на сорбционные параметры (кинетические и эффективность) тонких пленок. Особенности их изменения позволяют получить идентификационные параметры для селективного обнаружения аналитов в смесях и пробах сложного состава. В качестве растворителей полиэтиленгликоля и его эфиров изучены этанол и ацетон. С учетом воспроизводимости сигналов, величины дрейфа базовой линии сенсоров, различий в сорбции аналитов в качестве оптимального выбран ацетон.

С применением квантово-химического моделирования методом Хартри-Фока в базисе 6-31+G(d,p) рассчитаны оптимизированные структуры, образующиеся при взаимодействии ацетона с мономерными звеньями изологического ряда полиэтиленгликоля и его эфиров (рис. 1), наибольшая энергия взаимодействия с молекулами ацетона характерна для мономерного звена ПЭГА.

Установлено, что в межмолекулярных -0, взаимодействиях, в том числе в образовании O карбонильных группах эфирных фрагменH тов полимера и атомы Н в молекулах ацето- +0,320 H увеличение зарядов на атомах О (-0,645) и атомах Н (+0,356). Мономерное звено ПЭГ- Фрагмент полимера 2000 взаимодействует с 1-ой, ПЭГСк и Рис. 1. Схема взаимодействия ПЭГФ – с 2-мя, ПЭГСб – с 3-мя, с ПЭГА – с ацетона с фрагментом полимерного сорбента 4-мя молекулами ацетона.

Результаты квантово-химических расчетов согласуются с результатами ПКМ тонких пленок этих сорбентов различных масс.

Не установлено каких-либо корреляций между стандартными характеристиками хроматографических фаз (полярность, коэффициенты селективности) и результатами пьезокварцевого микровзвешивания.

Поэтому для оценки влияния остаточного растворителя в пленке рассчитан эффективный гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) мономерного сольватированного звена по Дэвису, который сопоставлен с мольной удельной чувствительностью микровзвешивания паров аминов (рис. 2).

Smolуд, Гц м3/моль мкг Рис. 2. Зависимость мольной удельной чувствительности ( S mol ) ПКМ паров аминов от эффективного ГЛБ сорбентов: ПЭГСб (1), ПЭГ-2000 (2), ПЭГФ (3), ПЭГСк (4), ПЭГА (5) Для алифатических циклических и гетероциклических аминов резкое увеличение S mol наблюдается при значениях параметра ГЛБ для сорбента боуд лее 13. Так как ГЛБ изучаемых аминов больше 12, то взаимодействие с более гидрофильными фазами тем эффективнее, чем больше полярность молекулы аналита, поэтому S mol микровзвешивания паров анилина больше, чем паров триэтиламина или пиперидина. Показано, что в первом приближении ГЛБ с учетом остаточного растворителя может быть применен в качестве прогнозирующего фактора при выборе сорбентов для селективного микровзвешивания паров аминов.

Особенности кинетики сорбции аминов и кислот на тонких пленках стандартных хроматографических фаз можно проследить по характеру выходных кривых пьезосенсоров – хроночастотограммам, по которым для большинства систем «пары амина – пленка сорбента» наблюдается накопительная сорбция. На пленках полиэтиленгликолей устанавливается нестабильное термодинамическое равновесие (ПЭГ-2000) с дальнейшей самопроизвольной десорбцией сорбата после первых 2-6 с сорбции (ПЭГСк).

При сорбции паров триэтиламина, циклогексиламина, пиперидина, N-метиланилина на пленке ПЭГСк наблюдается быстрая самопроизвольная десорбция молекул веществ с поверхности пленки в околосенсорное пространство, что объясняется более высокой энергией взаимодействия ассоциатов в газовой фазе «сорбтив-сорбтив», чем в системе «сорбат-сорбент» и согласуется с результатами квантово-химических расчетов. Вид сорбционных кривых зависит от концентрации аналита, поэтому по форме кинетического «визуального отпечатка» возможно установить присутствие отдельных аминов при их большом содержании в смесях. Так, при сорбции смеси пиперидина и триэтиламина на пленке ПЭГСк регистрируется хроночастотограмма с самопроизвольной десорбцией, и поэтому «визуальный отпечаток» сигналов сенсоров соответствует «закручивающейся» форме (рис. 3 а).

Для смеси паров аммиака и бензиламина и пленки ПЭГА, наоборот, характерна накопительная сорбция, поэтому форма «визуального отпечатка» соответствует «раскучивающейся» (рис. 3 б).

Определение отдельных классов аминов (алифатические, ароматические) в газо-воздушных смесях, с учетом особенностей кинетики сорбции, возможно с применением массива сенсоров с пленками ПЭГ-2000, ПЭГА, ПЭГСк, ПчВ, ТХ-100, а также покрытием из МУНТ.

Рис. 3. Типичный вид кинетических «визуальных отпечатков» при самопроизвольной десорбции после максимальной сорбции (а) и нарастающей сорбции (б) аналитов на пленках модификаторов ПКР. По радиальной оси отложен текущий сигнал Для надежного раздельного определения кислот различного строения необходимо учитывать особенности кинетики их сорбции на тонких пленках Tween-40, ПЭГА.

Сорбция аминов на тонких пленках специфических покрытий.

Учитывая основную природу аминов, в качестве модификаторов электродов ПКР изучены рН-индикаторы. Предложено называть такие избирательные пленки – дифференцирующие.

Изучено влияние кислотности сульфофталеиновых индикаторов (количественная характеристика – pKa) на эффективность сорбции аминов (Fmax, Гц) (рис. 4).

Установлено, что уменьшение кислотных свойств индикаторов при сорбции аминов различной основности приводит к закономерному увеличению аналитического сигнала пьезосенсоров.

С увеличением рКа индикатора почти в 2 раза наблюдается более, чем 3-х кратное увеличение эффективности сорбции слабоосновных аминов.

Для сильноосновных аминов предпочтительнее применять индикаторы с ярко выраженным кислотным характером (БФС, БКС, МК).

Кинетика сорбции паров аминов на пленках рН-индикаторов.

Ацетон и этанол в качестве растворителей сорбционных фаз по-разному влияют на кинетические особенности взаимодействия аминов с пленками кислотно-основных индикаторов. Количественные параметры кинетики и эффективности взаимодействия паров аминов с тонкими пленками рНиндикаторов сопоставлены в табл. 1.

Таблица 1. Время достижения максимального отклика (max, с) и аналитический сигнал (Fmax, Гц) пьезосенсоров с пленками кислотноосновных индикаторов в парах аминов; (n = 3, P = 0,95) (этанол) (ацетон) (ацетон) (ацетон) (ацетон) * - доверительный интервал; sr**- относительное стандартное отклонение.

Возможно раздельное определение аминов с применением нескольких пьезосенсоров на основе различных пленок кислотно-основных индикаторов. Особенности кинетики сорбции аминов на тонких пленках специфических покрытий, нанесенных из ацетоновых растворов, обобщены в табл. 2.

Таблица 2. Типичные кинетические «визуальные отпечатки» сигналов сенсоров с пленками специфических сорбентов в парах аминов Триэтиламин (ТЭА), циклогексиламин 2,4-диметиланилин (2,4-ДМА) ЦГА, А, N-метиланилин (N-МА), 2,4-ДМА БКС диметилформамид (ДМА ДМФА), БА *- жирным выделены аналиты, детектирование которых сильно изменяет свойства сенсора с соответствующими пленками рН-индикаторов.

Выбор измерительных элементов массива «электронного носа»

для раздельного детектирования аминов и кислот. Для создания алкалиселективных сенсоров и дифферецирующего микровзвешивания аминов в качестве модификаторов предложены кислотно-основные индикаторы:

БТС.– полярные ароматические амины, БКС – алифатические неполярные, БФС.– циклические, МК – гетероциклические.

Для селективного определения паров карбоновых кислот нормального и изомерного строения необходимо включить в массив измерительных элементов ацидиселективные сенсоры с пленками ПЭГА, ПЭГ-2000, ТХДЦГ-18-К-6 и Tween.

Оценено мешающее влияние паров веществ, наиболее вероятно присутствующих в реальных объектах и живых системах (этанол, бутанол, ацетон, этилацетат). Показано, что их присутствие в газовой смеси не влияет на сигналы выбранных сенсоров.

Оценка возможности качественного анализа смесей кислот и аминов методом ПКМ. Сопоставлены 3 способа (по принципу «от простого к сложному») получения информации о составе проб по матрице данных массива сенсоров: 1) способ сравнения геометрии «визуальных отпечатков», 2) применение идентификационных параметров Аij, 3).применение различных хемометрических методов обработки регистрируемой и расчетной информации для массива пьезосенсоров.

Предложены и обоснованы параметры эффективности сорбции паров индивидуальных соединений Аij, рассчитываемые как отношение анаmax литических сигналов двух сенсоров: Аijmax = Fmax,i/Fmax,j. Для идентификации отдельных изученных легколетучих веществ (триэтиламина, аммиака, уксусной кислоты, 2,4-диметиланилина), относящихся к приоритетным маркерам состояния живых систем, в смесях выбраны сенсоры, сигналы которых применены для расчета этих параметров.

Оценены интервалы ненадежности, пределы обнаружения, выборочные вероятности ошибок I ( ) и II ( ) рода при идентификации веществ. Для параметров Аij рассчитаны характеристичность G, наличие сигнала присутствия S и критерии совпадения d.

Возможность идентификации веществ по параметрам Аij оценивали на примере анализа 16-ти модельных смесей четырех веществ (триэтиламина, 2,4-диметиланилина, уксусной кислоты, аммиака). Параметры Аij расmax считывали для всех смесей и сопоставляли с аналогичными параметрами Аij для индивидуальных веществ. По совпадению значений хотя бы для одного из совокупности параметров Аij вещество считается идентифиmax цированным.

При сопоставлении результатов идентификации по параметрам Аij с max истинными составами смесей установлено, что аммиак и триэтиламин обнаружены правильно во всех случаях. Рассчитаны значения чувствительности (Ч) и специфичности (Сп) предлагаемого подхода идентификации для выбранных аналитов (табл. 3).

Специфичность данного подхода идентификации для всех аналитов высокая (более 0.90), чувствительность ниже (от 0.5 до 0.85). Пределы обнаружения для решения задач идентификации аммиака, триэтиламина и уксусной кислоты составляют (г/м3): 0.135, 0.112, 0.037 соответственно на выбранном массиве сенсоров (1 - ПЭГ-2000, 2 – МУНТ, 3 ДЦГ-18-К-6, 4 – ТХБКС, 6- МК, 7 – ПчВ, 8 - ПЭГА).

При увеличении содержания в РГФ этих соединений достигается достоверность идентификации более 99 %. Предложена методика проведения анализа с идентификацией соединений по результатам пьезокварцевого микровзвешивания массивом сенсоров РГФ над объектами.

Таблица 3. Значения идентификационных параметров Аij, критерия совпадения d, чувствительность, специфичность и выборочные оценки вероятностей ошибок I и II рода при идентификации аналитов в смесях (С, г/м3) слота (610-3) Оценены эксплуатационные характеристики пьезосенсоров с активными пленками сорбентов универсальных и с сорбаториентированными свойствами. Наиболее устойчивыми к взаимодействиям являются пленки сорбентов: ПЭГ-2000, ПЭГСк, ПчВ, БКС.

После сорбции воспроизводимость свойств поверхности пленок наиболее селективных сорбентов к парам аминов и карбоновых кислот оценивали методом атомно-силовой микроскопии.

Установлено, что при взаимодействии паров сорбата с пленками модификаторов ПКР происходит уменьшение/увеличение высоты профиля в зависимости от природы сорбента, что связно с их перестройкой на поврехности ПКР с учетом остаточного растворителя в пленке. При большом количестве сорбционно-десорбционных взаимодействий параметры шероховатости поверхности воспроизводятся лучше, что подтверждает необходимость тренировки пленок в парах аналитов перед их эксплуатацией для анализа реальных объектов.

Для классификации смесей аминов и кислот различного строения по результатам ПКМ массивом сенсоров построена модель классификации модельных смесей (рис. 5), по которой в отдельные группы выделяются кислоты, амины, анилин (выделено областями, рис. 5) и выбраны оптимальные параметры микровзвешивания для обработки методом главных компонент.

индивидуальных тест-веществ с применением сей, но можно выделить оптимального набора переменных всех компонентов. По ГК-3 возможно дифференцировать присутствие ароматических и алифатических аминов, а также аммиака в смесях.

В 4-й главе представлены новые способы анализа живых систем, разработанные по результатам исследований сорбционных свойств систем «тонкие пленки сорбентов – смеси паров аминов и кислот».

Для анализа биопроб в зависимости от целей исследования и полноты требуемой информации предложена схема, с различным уровнем детализации данных о состоянии биопробы (рис. 6).

1-ый уровень. «Визуальный отпечаток» максималь- Ранжирование проб на ных откликов сенсоров [Fmax,i, Sв.о.] – в большей сте- 2 группы (есть/нет) пени количественный анализ 2-ой уровень. Кинетический «визуальный отпечаток», Fi,, Aijmax - качественный и количественный анализ внутри групп 3-й уровень. Метод главных компонент (обработка Максимальная диффенаиболее значимых из выбранных качественных и ко- ренциация проб на личественных параметров) – максимальная аналитиче- группы ская информация о составе Рис. 6. Общая схема способов анализа биопроб различного происхождения РАЗРАБОТАН СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ, ИППП (кандидоз, К; хламидиоз, Х; мико- и уреаплазмоз, М и У, гарднереллез, Г; вирус папилломы человека, ВПЧ) по результатам анализа РГФ над биопробой (цервикальной слизью) массивом пьезосенсоров с селективными пленками и различным уровнем визуализации данных.

работа выполнена в рамках гранта ФЦП «Инновации России» (подпрограмма «СТАРТ-2010», г/к № 7641р/1049).

В идентичных условиях по описанному способу проведен анализ проб цервикальной слизи по различным уровням обработки данных.

Визуализация матрицы данных для гинекологического материала по 1-му уровню. По форме «визуальных отпечатков» максимумов для проб невозможно выделить группы «условно здоровые», «больные» с различными диагнозами, хотя значения площадей «визуальных отпечатков», отражающее общее содержание ЛЛВ существенно отличаются (рис. 7).

ности, рассчимаксимальных сигналов (б) массива сенсоров в РГФ над биопробами. По круговой оси отложено время взаимодействия танная в прос) (а) и номера сенсоров в массиве (б) граммном обеспечении «MAG-Soft», составляет от 50 до 70 %. Для проб из групп «хламидиоз», «уреаплазмоз», «кандидоз» различия в геометрии «визуальных отпечатков» на выбранном массиве сенсоров менее 20 %, что отражает близкий качественный и количественный состав РГФ над биопробами при анализе на выбранном массиве сенсоров. По 1-му уровню визуализации невозможно идентифицировать вид возбудителя, т.к. по этим показателям пробы дифференцируются неоднозначно, кроме задачи идентификации «микстинфекций».

Визуализация матрицы данных для гинекологического материала по 2-му уровню. В качестве дополнительных параметров для идентификации отдельных газов-маркеров в РГФ применены параметры эффективности сорбции Аij. По этим параметрам в РГФ над цервикальной слиmax зью возможно обнаружить уксусную кислоту, аммиак, триэтиламин, а следовательно, возбудителей кандидоза, хламидиоза, гарднереллеза, и оценить состояние с однозначным диагностическим параметром «пролеченные».

Для получения максимальной диагностической информации применена регрессионная модель для классификации образцов по 3-му уровню обработки информации (рис. 6). Многомерное моделирование проводили в две стадии – калибровка и предсказание. В качестве выходных параметров для обработки объединены качественные ( Аij ) и количественные (Fmax,i, Sв.о.) параметры пьезокварцевого микровзвешивания (рис. 8).

ПЦР ИФА

Традиционные методы анализа Рис. 8. Схема применения хемометрических методов для детектирования возбудителей Оптимизацию разделения образцов на группы на графиках счетов РГК-модели проводили в соответствии с полученными результатами традиционных методов анализа для биопроб, в результате чего получили модель с хорошими прогнозирующими свойствами и погрешностью 10 % для 3-х ГК (рис. 9).

«Условно Рис. 9. Графики счетов для 1 и 2 главных компонент (PC-1– соответственно, что PC-2), полученных по РГК, для биопроб из обучающей выборки больше критического значения ZT,кр. = 2,59 при вероятности 95 %.

Различия между группами «больные» и «условно здоровые» статистически значимы и с помощью регрессионной модели возможно ранжирование проб.

Проверка правильности способа получения диагностической скрининг-информации. Оптимизированную регрессионную модель применили для прогнозирования фактора «здоровые» при анализе РГФ над 64мя биопробами, не вошедшими в обучающую выборку, которые также продиагностированы по результатам традиционных методов анализа. Для уточнения вида возбудителя ИППП проведено МГК моделирование результатов анализа проб из группы «больные» (рис. 10).

ГК-2 (16 %) Рис. 10. График счетов, полученный по МГК, для биопроб из группы «больные»

На графике счетов выделяются две большие группы: «моноинфекции»

объединяет пробы пациентов с диагнозами «кандидоз», «уреаплазмоз», «ВПЧ». Состав РГФ над цервикальной слизью проб соответствует РГФ над чистыми культурами данных возбудителей и они могут надежно диагностироваться при отсутствии других инфекций. Группа «микст-инфекции»

объединяет наибольшее количество образцов, содержащих в РГФ газымаркеры как индивидуальных, так и смешанных инфекций. Внутри этой группы можно выделить подгруппы с доминантным возбудителем.

При скрининге на ИППП процент совпадения результатов, полученных с применением массива 8-ми пьезосенсоров с обработкой данных по оптимизированной РГК-модели, с результатами традиционных методов исследования составляет 95 %. Для каждого метода диагностики совпадение оценки состояния биопроб составляет: микроскопия мазка – 97 %, ПЦРанализ – 93 %, ИФА – 98 %. Чувствительность и специфичность предлагаемого способа детектирования возбудителей инфекций мочеполовой системы составляет 87,5 % и 100,0 % соответственно.

РАЗРАБОТАН СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЙ КИШЕЧНИКА птиц, по которому исследованы 3 группы кур с различными режимами кормления и наступления дисбиоза.

Учитывая параметры селективности пленок сенсоров, оценена методом нормировки массовая доля отдельных классов соединений в РГФ над всеми пробами, по которым рассчитан условный показатель дисбиоза (ПД).– соотношение максимальных сигналов сенсоров с пленками ПВП к БТС (ПД = FПВП / FБТС ), отражающих соотношение содержания свободной воды к аминам в РГФ над пробой. Значения ПД сопоставлены с результатами микробиологических исследований (табл. 4).

Таблица 4. Результаты микробиологического исследования биопроб кур и При равном или избыточном содержании аммиака и аминов по сравнению с парами воды в РГФ над пробой проявляется дисбиозное состояние ЖКТ, вследствие большого количества бактерий в помете и активной деструкции ими остаточных белков, при этом ПД 1. При нормализации микрофлоры кишечника кур содержание паров воды преобладает над содержанием аминов в РГФ над биопробами, и показатель дисбиоза увеличивается до 1,50. В качестве критического значения принят ПД = 1,10 ± 0,05, уменьшение ПД ниже критического значения свидетельствует о наличии дисбиоза ЖКТ, при увеличении ПД выше 1,10 состояние ЖКТ кур соответствует норме.

Результаты анализа биопроб и оценка состояния кур по ним на наличие/отсутствие у них дисбиоза согласуется с результатами микробиологического исследования биопроб на дифференциально-диагностических средах (табл. 4).

Продемонстрирована возможность оценки качества пищевых продуктов на примере проб колбасы вареной «Докторская» (ГОСТ Р 52196представленная 11-тью производителями. Все пробы оценены в сертификационной лаборатории по основным показателям качества. Разработан способ оценки качества и воспроизводимости технологии продукта из мясного сырья по результатам обработки многомерных данных анализатора газов «MAG-8» методом главных компонент. Построена оптимизированная МГК модель для классификации образцов колбасы. Объясненная дисперсия для первых двух главных компонент модели составляет 95 %, что свидетельствует о хороших дискриминационных свойствах модели. На графике счетов выделяются три группы проб, объединенных по идентичности технологии производства (рис. 11).

ГК- (номера соответствуют номерам проб производителей) колетучих кислот, несвязанной влаги) в РГФ над пробами. Производители этих проб объединены по соответствию рецептуры изделия традиционной и идентичности технологии производства. Стандартные физико-химические показатели для этих проб соответствуют требованиям ГОСТ, однако для некоторых проб различается дегустационная оценка запаха.

Пробы II-й группы характеризуются завышенным содержанием легколетучих веществ в РГФ, при этом дегустационная комиссия отметила для этих проб завышенное содержание специй и содержание влаги находится на границе допустимой нормы.

В III-ю группу объединены пробы с существенно завышенным содержанием влаги. Для этих проб также характерна, по оценке дегустаторов, высокая интенсивность кислого аромата. В сочетании с большим содержанием в РГФ несвязанной влаги это может быть связано с экссудативным пороком исходного сырья PSE.

Предлагаемый подход по анализу биопроб с применением массивов пьезосенсоров не уступает существующим традиционным методам анализа (табл. 5).

Таблица 5. Сравнение традиционных методов анализа биопроб и сравнения По ДНК пато- По микроскопи- По подсчету ко- По составу Чувствительность, % Специфичность, % Разработанные способы апробированы в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

ВЫВОДЫ

1. Систематически оценены сорбционные свойства тонких пленок универсальных, селективных хроматографических и других фаз (кислотноосновные индикаторы) по отношению к парам алифатических, циклических, ароматических аминов, аммиака, алифатических кислот С2-С5.

2. С учетом эксплуатационных характеристик разработан подход по формированию массив пьезосенсоров широкого практического применения в оценке состояния живых систем с многоуровневой обработкой данных по принципу «от простого («визуальные отпечатки» максимумов) к сложному (применение методов хемометрики – МГК, РГК)».

3. Квантово-химическими расчетами и ПКМ установлены особенности влияния растворителей (этанол и ацетон) сорбентов (полиэтиленгликоля и его эфиров) на эффективность, селективность и кинетику в сорбционных взаимодействиях в системах «сорбат-тонкая пленка сорбента». Этанол нивелирует различия в особенностях сорбции аминов, ацетон способствует их дифференцированию при взвешивании. Рассчитаны число молекул ацетона, удерживаемое в пленке сорбента в расчете на одно мономерное звено, и эффективный ГЛБ этих комплексов, который может быть применен в качестве прогнозирующего фактора при выборе сорбентов для селективного микровзвешивания аминов.

4. Обосновано применение нового критерия пьезокварцевого микровзвешивания (параметр эффективности сорбции Aijmax), позволяющего в совокупности с традиционными характеристиками ПКМ идентифицировать амины, кислоты, аммиак в модельных смесях и реальных объектах.

5. По результатам обработки многомерной матрицы данных от массива сенсоров построена регрессионная модель, по которой дифференцируются возбудители патогенных состояний в биопробах.

6. Разработаны и апробированы способы экспресс-оценки состояния биопроб различной природы по предложенным критериям на основании детектирования газов-маркеров состояния массивом пьезосенсоров: оценки наличия возбудителей ИППП в цервикальной слизи; оценки дисбиозного состояния кишечника кур по введенному показателю дисбиоза; оценки качества и идентичности технологии производства продуктов питания (на примере колбаса «Докторская»).

Основное содержание диссертации изложено в статьях:

1. Умарханов, Р. У. Особенности сорбции паров органических веществ на тонких полимерных пленках с кислотно-основными индикаторами и углеродных наноструктурах [Текст] / Р.

У. Умарханов, Ю. Х. Шогенов, А. А. Мишина (Шуба), Т. А. Кучменко // III Международный симпозиум по сорбции и экстракции с заочным участием. Владивосток, 2009. С. 125-128.

2. Мишина, А. А. Унифицированная система на основе наноструктурированных индикаторных элементов для диагностики гинекологических заболеваний [Текст] / А. А. Мишина (Шуба), Р.У. Умарханов // Сборник тезисов III Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». Белгород, 2010. С. 97-100.

3. Кучменко, Т. А. Особенности сорбции паров аммиака на тонких пленках кислотно-основных индикаторов [Текст] / Т.А. Кучменко, А. А. Мишина (Шуба) // Журнал аналитической химии. 2011. Т. 66, № 8. С. 816-823.

4. Мишина, А. А. Раздельное определение аминов различного строения и карбоновых кислот в газо-воздушных смесях [Текст] / А. А. Мишина (Шуба), Т.А. Кучменко // Сборник статей II Международной научно-практической конференции, посвященной Международному году химии «Актуальные проблемы химической науки, практики и образования». Курск: ЮЗГУ, 2011. С. 142-145.

5. Кучменко, Т.А. Пример решения идентификационных задач в методе пьезокварцевого микровзвешивания смесей некоторых органических соединений [Текст] / Т.А. Кучменко, А. А. Шуба, Н. В. Бельских// Аналитика и контроль, 2012. Т. 16, № 2. С. 151 -161.

6. Шуба, А. А. Повышение экспрессности диагностики некоторых инфекций, передаваемых половым путем, с применением «электронного носа» на пьезовесах [Текст] /А. А.

Шуба, Т. А. Кучменко, И. А. Тюркин, В. В. Битюкова //XXX Международной научнопрактической конференции «Современная медицина и фармацевтика: актуальные проблемы и перспективы развития», Лондон, 2012. Электронный ресурс: http://www.gisap.

eu/ru/node/1136.

7. Шуба, А. А. Оценка качества и воспроизводимости технологии производства вареных колбасных изделий по результатам обработки данных массива газовых сенсоров методом главных компонент [Текст] / А. А. Шуба, Т. А. Кучменко, Д. А. Порядина // Сборник материалов III Международной мужвузовской конференции «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания, посвящ. памяти д.х.н., проф., Заслуженного деятеля науки и техники РФ Ю.А. Клячко». Москва, 2012. С. 139 – 144.

8. Кучменко, Т. А. Применение мультисенсорной системы для оценки состояния проб крови по составу равновесной газовой фазы [Текст] / Т. А. Кучменко, А. А. Шуба, Т. Ю. Ковалева // Вестник Воронеж. гос. ун-та инж. технол., 2013. № 1. С. 122-126.

9. Кучменко Т.А. Применение методов главных компонент и дискриминантного анализа с помощью регрессии на латентные структуры для идентификации легколетучих органических соединений в газовых смесях по параметрам пьезокварцевого микровзвешивания [Текст] / Т. А. Кучменко, Д. А. Погребная, А. А. Шуба // Журнал аналитической химии. 2013. Т. 68, № 7 (в печати).

10. Пат. № 2441233 Россия, МПК G 01 N 33/00, 27/12. Способ раздельного определения аминов различного строения в газо-воздушных смесях / Кучменко Т. А., Мишина А. А.

(Шуба) - № 2010143917/15; Заявл. 26.10.2010; опубл. 27.01.2012.

11. Пат. № 2458139 Россия, МПК С12Q 1/04, А61В 5/00, С12N 1/00, С12N 7/00 Способ диагностики хламидиоза, гарднереллеза, трихоманиаза, уреаплазмоза, микоплазмоза по составу равновесной газовой фазы над цервикальной слизью / Кучменко Т.А., Мишина А. А. (Шуба), Тюркин И. А., Битюкова В. В. - № 2010154802/10, заявл. 30.12.2010, опубл. 10.08.2012 г.

12. Неинвазивный способ определения активности Helicobacter pylori и воспаления в желудочно-кишечном тракте / Кучменко Т. А., Мишина А. А. (Шуба), Умарханов Р. У. Решение о выдаче патента. Заявл. № 2011108911/14(012838) от 09.03.2011.

а также доложены и представлены в тезисах 22 докладов.

Работы № 3, 5, 8 опубликованы в изданиях, входящих в список ВАК.

По семейным обстоятельствам считать публикации Мишиной А.А. публикациями Шуба А.А.

Соискатель благодарит за консультации, материалы, помощь на разных этапах выполнения работы Умарханова Р.У., Порядину Д.А., Тюркина И.А., Черемушкину И.В.

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет