На правах рукописи

Маркина Татьяна Николаевна

ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ И ЗАДЕРЖКА КЛЕТОЧНОГО

ЦИКЛА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ

ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ

03.01.01 - радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2011 2

Работа выполнена на базе ФГУН – Уральского научно-практического центра радиационной медицины, г. Челябинск

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор заслуженный деятель науки РФ, Аклеев Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пелевина Ирина Ивановна доктор химических наук, профессор Серебряный Александр Маркович

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова.

г. Москва

Защита диссертации состоится «_2 »_июня_2011 г. в « 14.00_» на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан «_» 2011 г.

Учный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возрастающий риск облучения человека, связанный с бурно развивающейся атомной энергетикой и широким применением в медицине радиоизотопных методов диагностики и лечения приводит к необходимости исследования эффектов радиационного воздействия. После крупных радиационных инцидентов прошлых лет: атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки, аварии на ЧАЭС, радиоактивного загрязнения вод р. Теча, ставшего результатом деятельности ПО «МАЯК», а также в связи с произошедшей в 2011 году радиационной аварией на Фукусиме-1, – особое место занимает проблема отдаленных эффектов радиационного воздействия на человека.

Известно, что ионизирующие излучение индуцируют комплекс цитогенетических, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека (Пелевина И. И. и др., 2003, Бурлакова Е. Б. и др., 1996), в том числе изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидатной защиты, систем репарации, клеточного цикла (Пелевина И. И. и др., 2000, Серебряный А. М. и др., 2004). Один из основных механизмов «радиационной защиты» клетки направленных на предотвращение деления клеток с повреждениями ДНК - блок клеточного цикла (Кудряшов Ю. Б., 2004). В случае нарушения этого защитного механизма, повреждения ДНК, возникающие при длительном облучении, могут быть реализованы в виде соматических мутаций, что, в конечном счете, может привести к продукции пула дефектных, структурно и функционально неполноценных клеток (Veremeyeva G.A. et.

al., 2010). Особенно актуально это в отношении радиочувствительных гемопоэтических клеток красного костного мозга (ККМ).

В ряде экспериментальных работ показано, что у хронически облученных животных выявлено изменение митотического цикла клеток ККМ (красного костного мозга) и их пролиферативной активности. Однако вопрос об экспрессии белка Chk (как маркера блока клеточного цикла) у хронически облученных людей ранее не рассматривался.

У пострадавших при атомных бомбардировках в Японии (Kyoizumi S. et. al., 1990), ликвидаторов ЧАЭС (Замулаева И. А. и др., 2006), у работников атомной промышленности (Смирнов и др. 2005; Костюк С. В. и др. 2008) выявлено увеличение частоты мутаций в генах Т-клеточного рецептора (TCR). Но пока остатся неясным какова частота мутаций в генах TCR у хронически облученных людей в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия (более 60 лет). В связи с этим особый интерес может представлять изучение частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ), пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови (ПК) и частоты CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленные сроки. Район реки Теча является единственным регионом в мире, где, начиная с 1949 г., в результате производственной деятельности комбината "Маяк" сложились аварийные условия многолетнего облучения значительного по численности контингента населения в широком диапазоне доз (Аклеев А. В., 2005). Особенно актуально, оценить данные параметры в период, когда большая часть облученных людей достигла пожилого возраста, характеризующегося снижением адаптационных резервов, ослаблением систем контроля клеточного цикла, репарации, спонтанным увеличением частоты соматических мутаций.

Цель исследования – оценить пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частоту лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ) и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у людей, проживавших в прибрежных селах р. Теча и подвергшихся хроническому радиационному воздействию В задачи работы входило:

1. Исследовать пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ методом проточной цитометрии (по экспрессии белков Chk2 и Ki-67), а также частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия.

2. Оценить пролиферативную активность, долю лимфоцитов с БКЦ, и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ).

3. Проанализировать пролиферативную активность и долю лимфоцитов с БКЦ, частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленные сроки радиационного воздействия.

4. Оценить зависимость пролиферативной активности и доли лимфоцитов с БКЦ, частоты CD3-CD4+ лимфоцитов от дозы облучения ККМ и мощности дозы в период максимального радиационного воздействия.

Научная новизна исследования. Впервые у жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому комбинированному облучению, в том числе у лиц, перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению в отдаленный период радиационного воздействия, исследована пролиферативная активность ЛПК и частота клеток с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белков ki-67 и Chk2.

Проведен анализ влияния дозы и мощности дозы облучения ККМ на пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ, а также частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленный период после начала радиационного воздействия.

Впервые изучена зависимость между содержанием лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови и пролиферативной активностью, а также блоком клеточного цикла ЛПК у облученных людей в отдаленные сроки после радиационного воздействия.

Практическая значимость работы. Оценка пролиферативной активности и частоты клеток с БКЦ, позволит обосновать и разработать критерии формирования групп риска в отношении отдаленных гемопоэтических эффектов.

Разработанная методика оценки доли (%) ЛПК с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белка Chk2, совместно с исследованием пролиферативной активности ЛПК (белок Ki-67) рекомендуется для прогнозирования ответа системы гемопоэза на стимулирующее воздействие при лечении цитопенического синдрома, с применением регенеративной терапии.

Положения, выносимые на защиту 1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение - 1,11±0,06 Гр) у лиц пожилого и старческого возраста в периферической крови отмечено увеличение уровня CD3-CD4+ лимфоцитов на фоне повышения пролиферативной активности лимфоцитов и клеток с блоком клеточного цикла. Частота лимфоцитов с блоком клеточного цикла в периферической крови и пролиферативная активность лимфоцитов зависят от мощности дозы облучения ККМ в период максимального облучения. Частота клеток с блоком клеточного цикла после инкубации и -облучения зависит от дозы облучения ККМ.

2. У лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь, не выявлено изменений пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови, уровня клеток с блоком клеточного цикла, а также изменения частоты CD3-CD4+ лимфоцитов.

3. Наибольшее увеличение пролиферативной активности лимфоцитов и частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла выявлено у людей имеющих признаки лейкопении в отдаленные сроки хронического радиационного воздействия.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на 12 International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina. 2008), 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. (Santa Fe, NM., 2009), на 54 th Annual Meeting of the Health Physics Society (Minneapolis, USA, 2009), на 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на 1 международной научно-практической конференции «Постгеноные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз» (г. Челябинск, 2010).

Публикации. По материалам работы опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, приложения. Работа изложена на станицах, иллюстрирована 10 рисунками, и 32 таблицами. Библиографический указатель содержит 210 источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика обследованного контингента. В результате сброса радиоактивных отходов ПО «Маяк» в речную систему Теча-Исеть-Тобол с 1949 по 1956 гг.

население прибрежных сел р. Теча подвергалось хроническому низкоинтенсивному комбинированному облучению (внешнему и внутреннему). Наибольшая мощность дозы наблюдалась в первые 6 лет. Основной вклад в формирование внутренней дозы облучения приходился на 90Sr, поэтому ККМ стал критическим органом радиационного воздействия (Аклеев А. В. и др., 2001).

Исследование частоты клеток с БКЦ, пролиферативной активности лимфоцитов и частоты CD3-CD4+ лимфоцитов проводилось с 2007 по 2010 г.г. на базе Уральского научно-практического центра радиационной медицины. Было обследовано облученных жителей прибрежных сел р. Теча. Контрольную группу составили 61 человек с нормальным клеточным составом крови, проживающие на незагрязненных радионуклидами территориях. Среди обследованных облученных лиц были выделены 2 подгруппы – люди, имеющие изменения гемопоэза в ранний период – лица, перенесшие ХЛБ (25 человек), и в отдаленный период от начала облучения – лица, имеющие лейкопению (30 человек).

Возраст обследованных облученных людей в среднем составил 70 лет (58– года), в группе сравнения 67,1 лет (59–80 лет), в группе людей перенесших ХЛБ – 73,64 лет (58–83 года), и в группе облученных с лейкопений – 68,89 лет (59–81 год).

Во всех обследованных группах преобладали женщины.

Информацию об индивидуальных накопленных дозах была получена из базы данных УНПЦРМ TRDS-2009. Средняя доза облучения ККМ для группы всех облученных людей составила 1,11±0,06 Гр (0,06–4,46 Гр), средняя мощность дозы 0,28±0,02 Гр\год (0,03-1,25 Гр\год), у облученных лиц с лейкопе-нией 1,07±0,19 Гр (0,06–4,46 Гр), средняя мощность дозы 0,27–0,06 Гр\год (0,04–1,25 Гр\год). В группе лиц, перенесших ХЛБ, средняя доза и мощность дозы облучения ККМ была меньше и составила 0,87±0,10 Гр (0,23–2,70 Гр) и 0,24±0,04 Гр\год (0,04–0,88Гр\год) соответственно.

Методы исследования. На первом этапе работы мы оценили уровень лейкоцитов периферической крови (ПК). Подсчет общего количества лейкоцитов ПК проводили на гематологическом анализаторе Abacus Junior B (Австрия). Подсчет лейкоцитарной формулы проводился – в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимза (Меньшиков В. В, 1987).

Объект исследования – лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека, выделяли на градиенте плотности в стерильных условиях по стандартной методике (Хейфец Л. Б.и др.,1973). Для оценки частоты лимфоцитов с БКЦ в периферической крови – оценивали исходный уровень клеток, экспрессирующих белок сверочных точек – Chk2 (Nyberg K. A. et. al., 2002). Оценивали частоту лимфоцитов с БКЦ после инкубации с митогеном (ФГА), что позволяет судить о доле клеток, несущих скрытые повреждения ДНК, которые регистрируются белками сверочных точек только при прохождении клеток через точку рестрикции. Анализ частоты данного показателя после нагрузочного теста в виде острого -облучения в дозе 1 Гр, позволил судить об эффективности работы системы сверочных точек. Облучение культуры ЛПК проводили в дозе 1 Гр на установке Игур-1 (60Со), (мощность дозы 0,75 Гр/мин.) через 22 ч.

инкубации, затем культуру ЛПК снова инкубировали на протяжении 2 ч. для накопления клеток с задержкой клеточного цикла.

При исследовании пролиферативной активности мы оценивали долю лимфоцитов в ПК, экспрессирующих белок Ki-67 (спонтанно пролиферирующие лимфоциты), что позволило выявить процессы нарушения пролиферации (Lopez F. et. al. 1991) и пролиферативный потенциал, оцененный по частоте лимфоцитов (экспрессирующих ki-67), ответивших на митогенной стимул.

Инкубацию клеток проводили по стандартной методике в культуральной среде с митогеном при 37С0, 24 ч. (для оценки клеток с БКЦ) и 42 ч. (для оценки пролиферативной активности) (Lopez F. et. al. 1991). Суспензию клеток фиксировали с применением набора Cyto\Fix (Beckton Dickenson, США), и окрашивали по стандартной методике (Prussin C. et.al., 1995). Для выявления клеток с БКЦ применяли первичные антитела anti-Chk2 (Beckton Dickenson, США) и вторичные FITC-меченные антитела (Beckton Dickenson, США), а также PI/RNAsa (Beckton Dickenson, США). Для оценки пролиферативной активности набор anti-ki (Beckton Dickenson, США) и PI/RNAsa (Beckton Dickenson, США).

Частоту мутаций в генах TCR оценивали по количеству лимфоцитов с генотипом CD3-CD4+. Для этого лимфоциты периферической крови окрашивали с применением моноклональных антител CD3-FITC, CD4-PE, Ig 1-FITC\Ig 1-PE (Beckton Dickenson, США).

Анализ клеток экспрессирующих белки Chk2 и ki-67, а также CD3-CD4+ лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 нм мощностью 15 мВт).

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакетов прикладных программ Microsoft Excel, STATISTICA 6.0. Использовались общепринятые методы вариационной статистики с вычислением средней арифметической величины, ее стандартной ошибки (M±m), характер распределения величин (тест Колмогорова-Смирнова), степень достоверности различий (U-теста Манна и Уитни).

Зависимость от дозы и мощности дозы, а также зависимость между показателями оценивали с помощью методов регрессионного анализа для линейной модели (Y=a+bx) и многофакторного дисперсионного анализа (Гланц C., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота CD3-CD4+лимфоцитов у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию У облученных людей в отдаленный период (через 59-61 год) после начала радиационного воздействия исходная доля лимфоцитов с БКЦ достоверно увеличена 0,60% (p=0,008), по сравнению с контролем – 0,39% (рис.1.).

Рис. 1. Доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла в группе облученных людей (%), *р – достоверные различия с контролем (p=0,008) Частота клеток с БКЦ после инкубации с ФГА увеличилась в обеих группах. Несмотря на более высокие значения в группе облученных лиц (3,08%) по сравнению с группой контроля (2,93%) достоверных различий между ними не выявлено. После инкубации и дополнительного облучения культуры лимфоцитов мы также не отметили различий между группами облученных и необлученных людей по частоте клеток с БКЦ.

Увеличение частоты лимфоцитов с БКЦ в периферической крови у облученных лиц по сравнению с необлученными, вероятно, обусловлено повышением частоты клеток с дефектами ДНК (Nyberg K. A.et. al. 2002), о чем свидетельствует выявленное ранее увеличение частоты лимфоцитов с хромосомными аберрациями и клеток с микроядрами (Аклеев А. В., 2005). Увеличение доли лимфоцитов в ПК с дефектами ДНК в отдаленный период после начала радиационного воздействия может быть обусловлено нестабильностью генома гемопоэтических клеток ККМ (Пелевина И. И.и др., 1996; Little J. B. et. al., 1998), а также, возможно, результатом дефектов ДНК долгоживущих лимфоцитов (Галактионов В. Г., 1998).

У жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному облучению, частота лимфоцитов пролиферирующих в ПК достоверно выше (2,15%, p=0,02) значений у необлученных лиц (1,26%) (рис. 2).

Рис. 2. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе облученных людей (%), * р – достоверные различия с контролем (p=0,02) После митогенной стимуляции и инкубации культуры лимфоцитов доля пролиферирующих ЛПК увеличилась в обеих группах. У облученных людей частота пролиферирующих ЛПК была ровна 13,49%, тогда как в группе контроля – 10,32%.

Значимых различий между группами облученных и необлученных людей не отмечено.

Анализ пролиферативной активности у облученных лиц выявил увеличение доли (%) пролиферирующих лимфоцитов в ПК на фоне нормального пролиферативного ответа на митогенную стимуляцию (значения сопоставимы с контрольными).

Эти данные могут указывать на повышение концентрации факторов способных стимулировать ЛПК к делению в периферической крови облученных людей. Такими факторами могут быть ИЛ-2 и ИЛ-6, концентрация которых в сыворотке облученных жителей прибрежных сел р. Теча повышена (Аклеев А. В., и др., 2009) В группе облученных людей мы также выявили достоверное увеличение частоты CD3-CD4+ лимфоцитов (0,19%, p=0,01), по сравнению со значениями у необлученных людей (0,10%). Увеличение частоты лимфоцитов мутантных по генам TCR, может быть обусловлено нестабильностью генома гемопоэтических клеток ККМ (Бычковская И. Б. и др., 2005; Цыб А. Ф.и др., 2005).

Мощность дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия может повлиять на изменение пролиферативной активности ЛПК, частоты лимфоцитов с БКЦ, а также на частоту CD3-CD4+ лимфоцитов в отдаленный период после радиационного воздействия. Однако методом регрессионного анализа не выявлено линейной зависимости частоты лимфоцитов с БКЦ (r=-0,12; p=0,12 – для исходного уровня, r=-0,11; p=0,23- после инкубация с ФГА, и r=-0,16; p=0,07- после инкубации и -облучения) от дозы (0,06-4,46 Гр) и мощности дозы облучения ККМ (0,03Гр\год) (r=-0,16; p=0,16; r=-0,14; p=0,12 и r=-0,13; p=0,14, соответственно). Также спонтанная пролиферативная активность ЛПК (r=-0,08; p=0,45) и индуцированная (r=p=0,62) не зависит от дозы, и мощности дозы облучения ККМ (r=0,009; p=0,93;

r=0,06; p= 0,58, соответственно). Частота CD3-CD4+ лимфоцитов, также не зависит (линейная модель) от дозы (r=0,34; p=0,09) и мощности дозы облучения ККМ (r=p=0,08).

Зависимость пролиферативной активности и частоты лимфоцитов с БКЦ, частоты Частота CD3-CD4+ лимфоцитов F=2,42; p=0,7 F=3,8; p=0, Примечание: F- коэффициент дисперсии На основании результатов дисперсионного анализа установлено, что слабо коррелирует с дозой облучения только доля лимфоцитов с БКЦ после инкубации и дополнительного -облучения (F=2,90; p=0,03) (таблица 1).

От мощности дозы облучения ККМ зависит исходная частота лимфоцитов с БКЦ (F=2,91; p=0,03) и частота лимфоцитов пролиферирующих в ПК (F=3,28;

p=0,002).

Таким образом, в отдаленные сроки (более 60 лет) от начала радиационного воздействия у хронически облученных жителей прибрежных селах р. Теча (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр), пролиферативная активность ЛПК и частота CD3-CD4+ лимфоцитов не имеет линейной зависимости от дозы облучения ККМ. Но доза облучения ККМ влияет на частоту лимфоцитов с БКЦ после инкубации и дополнительного -облучения культуры ЛПК. Вероятно, облучение в период максимального радиационного воздействия (индивидуальная мощность дозы облучения ККМ в исследуемой выборке достигала 0,6 Гр\год) привело к накоплению клеток с дефектами в ДНК. Последнее могло способствовать развитию нестабильности генома клеток ККМ в отдаленный период после радиационного воздействия, о чем свидетельствует в частности увеличение частоты мутаций в гене Тр53 ( Veremeyeva G. A. et. al., 2009), лимфоцитов с хромосомными аберрациями (Аклеев А. В., 2005).

Повреждение ДНК, как правило, ингибирует пролиферативную активность клеток, вызывая блок клеточного цикла (Kara K. A. et. al. 2002). Поэтому увеличение доли лимфоцитов с БКЦ может оказать влияние на количество пролиферирующих лимфоцитов. Однако статистический анализ не выявил зависимости между долей лимфоцитов пролиферирующих в ПК и долей лимфоцитов с БКЦ (r=0,04, при p=0,7).

Увеличение частоты TCR-мутантных лимфоцитов и доли лимфоцитов с БКЦ может быть следствием, в том числе и нестабильности генома гемопоэтических клеток ККМ (Little J. B. et. al., 1998), поэтому между этими параметрами возможна корреляционная зависимость. Однако проведенный статистический анализ не выявил зависимости между этими параметрами (r=0,14; p=0,6).

2. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота CD3-CD4+лимфоцитов у лиц, перенесших ХЛБ Группу людей, перенесших ХЛБ, принято считать группой развития риска отдаленных последствий облучения, что обусловлено, в том числе наличием цитопений в ранний период облучения (максимального радиационного воздействия) (Аклеев А.

В. и др., 2001). Из группы облученных людей без ХЛБ и группы лиц, перенесших ХЛБ, были исключены лица, имеющие лейкопению в отдаленный период.

Для людей, перенесших ХЛБ, мы не отметили значимых изменений абсолютного количества клеток периферической крови по сравнению с контролем (таблица.

2.) Количественный состав лейкоцитов периферической крови в группе облученных лиц, перенесших ХЛБ, (M± SE (min-max), 109\л) Люди, пе- 6,15±0,35 2,10±0,17 3,35±0,36 0,45±0,05 0,03±0,01 0,22±0, ренесшие (4,73–9,90) (0,87–3,12) (0,24–6,30) (0,11–0,99) (0–0,13) (0–0,84) n= Облучен- 6,14±0,19 2,07±0,08 3,37±0,12 0,37±0,02 0,08±0,008 0,19±0, ные без (3,05–11,3) (0,75–4,09) (1,26–8,13) (0,06–1,31) (0,03–0,26) (0–1,19) n= Необлучен 6,82±0,23 2,25±0,11 3,94±0,17 0,39±0,07 0,03±0,005 0,21±0, ные люди (4,38–11,6) (0,82–4,16) (2,1–7,19) (0,05–0,98) (0–0,16) (0–0,77) n= Рис. 3. Доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла в группе облученных людей, перенесших ХЛБ (%), *p – достоверные различия с контролем Одной из причин угнетения гемопоэза в ранний период радиационного воздействия, которое отмечалось у лиц, перенесших ХЛБ, было нарушение процессов пролиферации, клеточного цикла гемопоэтических клеток ККМ, увеличение доли мутантных клеток ККМ (Аклеев А. В. и др., 2007). Поэтому, актуальным было оценить данные показатели в отдаленный период у лиц, перенесших ХЛБ.

Исходная доля лимфоцитов с БКЦ в группе людей, перенесших ХЛБ, статистически не отличается от таковой в группе контроля. Тогда как у облученных людей без ХЛБ мы отметили статистически достоверное увеличение исходной доли лимфоцитов с БКЦ (0,62%, p=0,005) по сравнению с контролем (0,39%) (рис. 3.).

Инкубация культуры лимфоцитов с ФГА способствовала увеличению доли клеток с БКЦ в изучаемых группах. Достоверных различий между показателями лиц, перенесших ХЛБ, и облученных людей без ХЛБ не выявлено. Также не отмечено статистически значимых различий между показателями у облученных людей и у необлученных людей. Не выявлено статистически значимых различий по доле лимфоцитов с БКЦ между людьми, перенесших ХЛБ, облученными без ХЛБ и необлученными после инкубации и дополнительного -облучения (1Гр) культуры лимфоцитов.

Анализ пролиферативной активности ЛПК показал, что в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия у лиц, перенесших ХЛБ, доля пролиферирующих лимфоцитов в ПК не отличается от значений контроля. Однако у облученных людей без ХЛБ мы отметили значимое увеличение пролиферирующих клеток (2,05%, p=0,04) по сравнению с контролем (1,08%).

Рис. 4. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе людей, перенесших ХЛБ (%), *р – достоверные различия с контролем (p=0,04).

Пролиферативный потенциал, оцененный по доле пролиферирующих ЛПК после их инкубации в культуре с митогеном, в группе людей, перенесших ХЛБ, также статистически не отличался от значений контроля. Сравнение групп облученных людей с ХЛБ и без ХЛБ не выявило различий между ними как по доле спонтанно пролиферирующих ЛПК, так и по доле митогенстимулированных ЛПК.

Статистический анализ частоты CD3-CD4+ лимфоцитов не выявил изменения частоты мутаций в генах TCR как в группе людей, перенесших ХЛБ (0,24±0,09%), так и у облученных лиц без ХЛБ (0,16±0,03%) по сравнению с показателями необлученных людей (0,10±0,01%). Также не отмечено различий по данному показателю между группами облученных людей.

Таким образом, у людей перенесших ХЛБ в ранний период радиационного воздействия не выявлено изменений показателей клеточного цикла и частоты CD3-CD4+ лимфоцитов по сравнению со значениями у необлученных людей и у облученных лиц без ХЛБ.

3. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота CD3-CD4+лимфоцитов у облученных лиц, имеющих лейкопению.

Облученные люди с лейкопенией претерпели наибольшие изменения со стороны гемопоэза. Дефицит зрелых клеток ПК у этих людей может быть результатом блока и \или нарушения клеточного цикла гемопоэтических клеток ККМ, и как следствие их пролиферации, поэтому анализ показателей клеточного цикла и частоты CD3CD4+ лимфоцитов в данной группе представляет особый интерес.

У облученных людей в отдаленный период от начала радиационного воздействия (59-61 год) снижение уровня лейкоцитов (3,81109\л, p=0,0001), обусловлено снижением количества как лимфоцитов (1,50109\л, p=0,0001), так и нейтрофилов периферической крови (1,93109\л, p=0,0001) (таблица 3).

Также выявлено снижение абсолютного количества моноцитов 0,27109\л, (p=0,002), и эозинофилов 0,08109\л (p=0,0007).

Проведенный анализ доли лимфоцитов с БКЦ выявил ряд особенностей в группе облученных людей с лейкопенией (рис.5.). У облученных людей с лейкопенией отмечено статистически значимое увеличение исходной доли лимфоцитов с БКЦ по сравнению с группой контроля (1,30%, p=0,05). В группе облученных людей без лейкопении данный показатель также увеличен по сравнению с контрольными значениями (0,39%), и составил 0,52% (p=0,02).

Причем, у облученных людей, имеющих лейкопению, частота клеток с БКЦ достоверно выше, чем у облученных лиц без лейкопении (1,30%, p1=0,003, и 0,52%, соответственно). Также у людей с лейкопенией частота лимфоцитов с БКЦ в исходном уровне достоверно превышает (1,30%, р=0,02) значения людей, перенесших ХЛБ (0,46%).

Количественный состав лейкоцитов периферической крови в группах параметр люди с лей- (3,17-4,01) (0,75-2,54) (1,26-2,45) (0,07-0,58) (0-0,15) (0-0,32) Облученные 6,62±0,17 2,12±0,08 3,50±0,13 0,41±0,02 0,04±0,005 0,21±0, люди без (4,43-11,3) (0,85-4,09) (1,26-8,13) (0,07-1,19) (0-0,23) (0-1,19) Необлучен- 6,82±0,23 2,25±0,11 3,94±0,17 0,39±0,07 0,03±0,005 0,21±0, ные люди, (4,38-11,6) (0,82-4,16) (2,1-7,19) (0,05-0,98) (0-0,16) (0-0,77) Примечание: p- достоверные различия с необлученными людьми;

p1-достоверные различия с группой «облученные без лейкопении»

Рис. 5. Доля лимфоцитов с БКЦ в группе облученных людей с лейкопенией (%), *р – достоверные различия с контролем (р=0,05), **р – достоверные различия с контролем (р=0,02) и достоверные различия с группой облученных Не выявлено статистически значимых различий по доле лимфоцитов с БКЦ после инкубации с митогеном при сравнении групп облученных людей (с лейкопенией и без) с группой контроля, а также при сравнении значений групп облученных людей между собой. Также не отмечено статистически значимых различий по данному показателю между исследуемыми группами после инкубации и дополнительного облучения культуры лимфоцитов.

Таким образом, для облученных лиц, имеющих наиболее выраженные изменения со стороны гемопоэза (снижение абсолютного количества нескольких типов лейкоцитов) отмечена наибольшая частота лимфоцитов с БКЦ. Данный факт может указывать на то, что БКЦ, возникающий в ответ на повреждение ДНК (в том числе следствие нестабильности генома), может быть одной из причин дефицита клеток в периферической крови.

У облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленный период после радиационного воздействия, уровень спонтанно пролиферирующих лимфоцитов (3,72% p=0,009) был достоверно выше значений контроля (1,26%) (рис.6.). Значимое увеличение данного показателя отмечено и для группы облученных лиц без лейкопении (2,03%, p=0,04). Однако не выявлено различий между группами облученных людей между собой по частоте пролиферирующих лимфоцитов.

Не выявлено достоверных различий между спонтанной пролиферативной активностью ЛПК у облученных лиц с лейкопенией (3,72%) и у лиц, перенесших ХЛБ (1,60%). Частота пролиферирующих ЛПК после митогенной стимуляции в группе облученных лиц с лейкопенией статистически не отличается от значений облученных лиц без лейкопении, облученных, перенесших ХЛБ и необлученных людей (рис. 6).

Рис. 6. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе облученных людей с лейкопенией (%), *р – достоверные различия с контролем (p=0,009), **р – достоверные различия с контролем (p=0,04) Таким образом, у облученных лиц на фоне снижения абсолютного количества лейкоцитов ПК выявлено увеличение частоты лимфоцитов, пролиферирующих в ПК.

Полученные результаты подтверждают выдвинутое предположение о компенсаторном увеличении пролиферативной активности ЛПК в ответ на снижение абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что в группе людей, перенесших ХЛБ, в которую были включены люди без признаков угнетений гемопоэза (лейкопении и лимфопении) в отдаленный период, не выявлено увеличение доли спонтанно пролиферирующих ЛПК.

У облученных людей, имеющих в отдаленный период лейкопению, не выявлено изменения частоты CD3-CD4+ лимфоцитов (0,14±0,02%) по сравнению со значениями у облученных лиц без лейкопении (0,18±0,03%) и у необлученных лиц (0,10±0,01%). Сравнительный анализ полученных данных по частоте СD3-CD4+ лимфоцитов для разных групп облученных людей также не выявил статистически значимых различий между ними.

У лиц, имеющих лейкопению в отдаленный период, не выявлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов от дозы (r=0,19, p=0,3) и мощности дозы облучения ККМ (r=0,21, p=0,4), а также частоты лимфоцитов с БКЦ от дозы (r=0,25, p=0,4) и мощности дозы (r=0,28, p=0,4). Не установлена линейная зависимость от дозы (r=-0,23, p=0,7) и мощности дозы облучения ККМ для лимфоцитов (r=-0,25, p=0,9), мутантных по генам TCR.

4. Зависимость абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов от абсолютного количества клеток с БКЦ и абсолютного количества пролиферирующих лимфоцитов у облученных и необлученных людей.

У облученных людей на фоне снижения абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов ПК отмечается увеличение доли лимфоцитов с БКЦ и спонтанно пролиферирующих ЛПК. Для лиц с еще более глубоким угнетением гемопоэза (снижено несколько типов лейкоцитов), исследуемые показатели имели максимальные значения. Полученные эффекты могут указывать на взаимосвязь между абсолютным количеством лейкоцитов, лимфоцитов ПК и показателями клеточного цикла. Мы отметили слабую линейную положительную зависимость только между абсолютным количеством лимфоцитов ПК у облученных людей и абсолютным количеством лимфоцитов с БКЦ в исходном уровне (r=0,21; p=0,02). Не отмечено таковой зависимости для группы необлученных людей (r=0,30; p=0,14). Не выявлено зависимости между количеством лейкоцитов ПК и лимфоцитов с блоком клеточного цикла у облученных (r=-0,01;

p=0,90) и необлученных людей (r=0,17; p=0,40).

Абсолютное количество ЛПК у облученных и у необлученных людей, также не зависит от количества лимфоцитов с БКЦ после инкубации (r=0,15; p=0,1 и r=0,27;

p=0,17, соответственно) и инкубации с облучением (r=0,08; p=0,4 и r=0,30; p=0,13 соответственно). Аналогичные результаты получены и при анализе зависимости между частотой лимфоцитов с БКЦ после инкубации с дополнительным -облучением и абсолютным количеством лейкоцитов ПК.

Абсолютное количество ЛПК не имеет линейной зависимости от количества лимфоцитов, пролиферирующих в ПК у облученных (r=0,02, p=0,85) и необлученных людей (r=0,33; p=0,16). Также не отмечено зависимости между спонтанной пролиферацией лимфоцитов и уровнем лейкоцитов в ПК у облученных (r=0,02; p=0,85) и необлученных людей (r=0,35; p=0,12). Напротив, выявлена слабая линейная зависимость между содержанием лимфоцитов (рис.7.) и лейкоцитов (r=0,24; p=0,02) в ПК и количеством пролиферирующих лимфоцитов после инкубации с ФГА в группе облученных лиц.

Абсолютное количество лимфоцитов в периферической крови, 109\л Рис.7. Корреляция между абсолютным количеством ПК у облученных людей и абсолютным количеством пролиферирующих лимфоцитов после митогенной стимуляции.

Аналогично отмечена слабая линейная корреляция между абсолютным количеством лейкоцитов(r=0,25, p=0,02), лимфоцитов (r=0,51, p=0,05) и количеством пролиферирующих лимфоцитов после инкубации с ФГА у необлученных людей.

Таким образом, у облученных лиц и необлученных лиц отмечается слабая корреляция между абсолютным количеством лимфоцитов\лейкоцитов ПК и их пролиферативной активностью.

ВЫВОДЫ

1. У жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленный период (59-61 год), после начала хронического радиационного воздействия (дозы облучения красного костного мозга составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение 1,11±0,06 Гр) выявлено статистически значимое увеличение в периферической крови числа пролиферирующих лимфоцитов, лимфоцитов с блоком клеточного цикла и CD3–CD4+ лимфоцитов по сравнению с показателями у необлученных людей.

2. Не установлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов, доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла и количества CD3–CD4+ лимфоцитов от дозы облучения красного костного мозга у людей в отдаленный период после начала хронического радиационного воздействия. Выявлена слабая положительная зависимость частоты лимфоцитов периферической крови с блоком клеточного цикла после дополнительного острого -облучения в дозе 1 Гр от дозы облучения ККМ, а также исходной частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла и спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (0,03-1,25 Гр; среднее значение 0,28±0,02Гр).

3. У людей, проживающих в прибрежных селах р. Теча и перенесших хроническую лучевую болезнь (дозы облучения красного костного мозга 0,23-2,70 Гр;

среднее значение 0,87±0,10Гр), в отдаленные сроки от начала облучения не отмечено изменений пролиферативной активности и числа лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также количества CD3-CD4+ лимфоцитов по сравнению с показателями необлученных людей.

4. У облученных людей, имеющих в отдаленные сроки лейкопению (дозы облучения красного костного мозга 0,06–4,46 Гр; среднее значение 1,07±0,19 Гр), наблюдается увеличение пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови и доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла по сравнению с контролем и с группой облученных людей, не имеющих лейкопению.

5. Пролиферативная активность и доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также частота CD3-CD4+ лимфоцитов не имеют зависимости от накопленной дозы и мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (0,04–1,25 Гр\год; 0,27±0,06 Гр\год) у облученных людей, имеющих в отдаленный период лейкопению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи 1. Почухайлова Т.Н., Веремева Г.А, Аклеев А.В. Пролиферация и состояние клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – Т. 10. – № 3. – С. 52–54.

2. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O., Akleyev A. Long-term cellular effects in humans chronically exposed to ionizing radiation // Health Physics. – 2010. – Vol. 97. – P. 204- 3. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота мутаций в генах TCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Вопросы радиационной безопасности. – 2011. – №1. – С.

41- 4. Маркина Т.Н., Аклеев А.В., Веремеева Г.А. Пролиферативная активность и клеточный цикл лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия \\ Радиация и риск. – 2011. – Т. 20. – Вып. 1. – С. 50- 1. Веремеева Г.А., Акушевич И.В., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Площанская О.Г., Варфоломеева Т.А., Худякова О.И., Аклеев А.В. Особености внутриклеточных процессов при хроническом облучении человека // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9ноября 2010г. – Челябинск, 2010. – С. 2. Веремеева Г.А., Е.А. Блинова, Т.Н. Почухайлова, А.В. Аклеев. Влияние хронического облучения на апоптоз лимфоцитов периферической крови человека/ Чернобыльские чтения-2008 // Материалы международной научно-практической конференции. – 24 – 25 апреля 2008 г. – Гомель, 2008. – С. 52-57.

3. G. Veremeyeva, I. Akushevich, E. Blinova, T. Pochukhailova and A. Akleyev.

The Role of Apoptosis in the Development of Radiation-Induced Genome Instability under Chronic Radiation Exposure // Radioprotection. – 2008. – Vol. 43. – No.5., – P. 4. G.Veremeyeva, T.Varfolomeyeva, A.Vozilova, E.Blinova, T.Pochukhailova, S.Pushkaryov, A.Akleyev. Genomic instability at late time after chronic radiation exposure // Poster presentation at the 12th International Congress of the International Radiation Protection Association. –19-24 October 2008. – Buenos Aires, Argentina, 2008. – P. 92-93.

5. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Frequency of genomic abnormalities and peculiarities of physiological processes in blood cells under chronic radiation exposure in man: Bridging the Experimental and Epidemiologic Divide // Georgetown University Hotel & Conference Center. – 4-6 May 2009. – Washington, USA, 2009. – P. 37.

6. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Long-term Cellular Effects in Humans Chronically Exposed to Ionizing Radiation // Presentation at 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. – 10-14 May 2009. – Santa Fe, USA, 2009. – P.101.

7. Akleyev A.V., Pochukhailova T., Blinova E. Proliferation. Cell cycle and Apoptosis in Blood Lymphocytes at Late Time after Chronic Radiation Exposure in Man // 54th Annual Meeting of the Health Physics Society. – 12–16 July 2009. – Minneapolis, USA, 2009. – P. 8. Почухайлова Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Пролиферация и состояние клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Материалы 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России. – 13-14 апреля 2010. – Томск, 2010. – С. 105- 9. Димов Г.П., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Веремеева Г.А., Аклеев А.В.

Оценка показателей клеточного цикла лимфоцитов периферической крови как метод прогнозирования ответа системы гемопоэза на регенеративную терапию // Материалы 1 международной научно-практической конференции постгеноные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. – 17-19 ноября 2010. – Москва, 2010. – С. 10. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Пролиферация и задержка клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». – 9-11 ноября 2010г. – Челябинск, 2010. – С.37.