На правах рукописи

ИМБС Татьяна Игоревна

ПОЛИСАХАРИДЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ

НЕКОТОРЫХ МАССОВЫХ ВИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ МОРЕЙ

ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ. СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ

ПЕРЕРАБОТКИ ВОДОРОСЛЕЙ.

02.00.10 биоорганическая химия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 2010 Диссертация выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток

Научный руководитель: Звягинцева Т.Н., доктор химических наук, профессор;

Официальные оппоненты: Каминский В.А., доктор химических наук, профессор;

Ермак И.М., доктор химических наук, главный научный сотрудник;

Ведущая организация: Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159;

Защита состоится_19 февраля_2010г. в часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ.

Факс: (4232) 314050;

e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г.Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159, ДВГИ) Автореферат разослан “_”_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Калинин В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современном обществе растет внимание к проблемам здоровья и долголетия. Это определяет все возрастающий спрос на продукты морского происхождения, в число которых входят морские водоросли, а также лечебнопрофилактические препараты на основе водорослей. Бурые водоросли являются богатым и возобновляемым сырьем для получения ценных биологически активных полисахаридов фукоиданов, ламинаранов и альгиновых кислот. Содержание йода, макро- и микроэлементов, маннита и свободных аминокислот в бурых водорослях выше, чем в наземных растениях. Практически неисчерпаемым источником бурых водорослей являются прибрежные воды морей Дальнего Востока России. К сожалению, в России в настоящее время этот биологический ресурс используется очень ограниченно, а его химический состав изучен недостаточно.

Широкое применение полисахаридов бурых водорослей, как терапевтических агентов, сдерживается проблемами получения продуктов со стандартными характеристиками, поскольку содержание и структура полисахаридов меняются в зависимости от вида, стадии развития водоросли, места произрастания, а методы их выделения и фракционирования недостаточно эффективны. Изучение сезонных изменений состава и строения отдельных полисахаридов и низкомолекулярных веществ бурых водорослей имеет практическое значение для определения оптимальных сроков сбора водорослей с целью стандартизации препаратов как полисахаридов, так и низкомолекулярных веществ и создания способа их комплексной переработки.

Традиционно основное внимание уделялось исследованию химического состава бурой водоросли Laminaria japonica, в то время как данные о составе, структуре и сезонной динамике полисахаридов, а также биологически активных низкомолекулярных веществ, ряда других массовых видов дальневосточных бурых водорослей, прежде всего Costaria costata, Undaria pinnatifida, Fucus evanescens весьма ограниченны.

Цель работы. Целью данной диссертационной работы было установление закономерностей в изменении состава и структуры полисахаридов и низкомолекулярных метаболитов в зависимости от сезона сбора некоторых видов бурых водорослей, условий их выделения для получения продуктов со стандартными характеристиками, а также разработка способа комплексной переработки бурых водорослей для получения препаратов для медицины, косметологии, сельского хозяйства.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) исследовать влияние сезонасбора на состав и структурные характеристики полисахаридов из C. costata и U. pinnatifida; 2) оценить биологическую активность фукоидана из C. costata; 3) исследовать влияние температурного режима экстракции на выход и фракционирование фукоиданов из C. costata и F. evanescens, имеющих различное строение полисахаридной цепи; 4) исследовать состав низкомолекулярных метаболитов C.

costata, Laminaria cichorioides и F. evanescens и оценить биологическую активность водноэтанольных экстрактов из этих водорослей; 5) определить оптимальные условия экстракции фукоидана из F. evanescens; 6) разработать схему комплексной переработки массовых видов бурых водорослей.

Научная новизна. Впервые установлены закономерности изменения состава и структуры полисахаридов бурых водорослей C. costata и U. pinnatifida в зависимости от сезона и стадии жизненного цикла водоросли. Показано, что в июле в C. costata содержится больше ламинарана, фукоидана и альгинатов, чем в апреле-мае. Обнаружено, что максимальное количество фукоидана в C. costata и U. pinnatifida содержится в период спороношения. Показано, что фертильные C. costata и U. pinnatifida содержат более сульфатированный и менее гетерогенный по моносахаридному составу фукоидан, чем стерильные растения. Впервые определены структурные характеристики полисахаридов из C. costata. Показано, что ламинаран представляет собой 1,3;1,6--D-глюкан (1,3:1,6 как 5:1), а фукоидан является сульфатированным по С2 и С4 и частично ацетилированным галактофуканом. Определено, что фукоиданы в C. costata и F. evanescens представляют собой смесь различных структурных типов этих полисахаридов. Впервые показано, что фукоидан из C. costata, препятствует старению кожи под действием УФ облучения.

Исследовано изменение состава низкомолекулярных веществ Laminaria cichorioides, C.

costata в зависимости от сезона сбора. Впервые показана зависимость противоопухолевого действия водно-этанольных экстрактов из этих водорослей от сезона сбора. Впервые определены оптимальные условия экстракции фукоидана из F. evanescens.

На основе этих исследований предложен универсальный способ комплексной переработки бурых водорослей и создана технология получения БАД на основе фукоиданов.

Практическая ценность работы. Установлены периоды сбора водорослей C. costata и U. pinnatifida для выделения полисахаридов со стандартными характеристиками.

Показана перспективность использования фукоидана из C. costata в качестве протектора кожи от действия УФ облучения и как противовирусного препарата при заражении ВКЭ.

Показана перспективность использования экстракта F. evanescens для разработки противоопухолевых препаратов, а экстракта L. japonica в качестве стимулятора роста сои.

Определены оптимальные условия выделения и очистки фукоидана из бурой водоросли F.

evanescens. Разработан способ комплексной переработки бурых водорослей, который защищен патентом РФ № 2240816 и международным патентом № WO2005/014657. Этот способ положен в основу технологии получения первых российских БАД к пище на основе фукоидана «Фуколам-С» (свидетельство о гос. рег. № 77.99.23.3.У. 1549.3.07) и «Фуколам» (свидетельство о гос. рег. № 77.99.23.3.У.739.1.06) и водно-спировых экстрактов бурых водорослей для использования в косметике «Фуколам-Э. Экстракт бурой водоросли жидкий» (сан.-эпид. заключение № 25.ПЦ.01.744.Т.000842.07.07).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ой Международной конференции «Морские и прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», Архангельск, 2005; на региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической технологии и биотехнологии», Владивосток, 2006; на 3-ей Международной конференции «Морские и прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», Владивосток, 2008; на объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008;

на Симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств», Москва, 2008; на Международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений», Ташкент, 2009.

Публикация результатов исследования. Основные результаты исследования опубликованы в 6 статьях, 3 патентах РФ, 1 международном патенте, 5 тезисах докладов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 119 стр., содержит 24 таблицы и 18 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, раздела, посвященного обсуждению результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, который включает 305 работ, в том числе 228 иностранных источника, и приложения, где приведены свидетельства о гос. регистрации БАД. В ведении приводится обоснование актуальности исследования, сформулированы его цели и задачи.

Литературный обзор посвящен изучению химического состава бурых водорослей, а также существующим способам выделения и очистки полисахаридов бурых водорослей и их комплексной переработке. Более подробно рассмотрены сульфатированные полисахариды фукоиданы, их структурное разнообразие и проявляемая ими биологическая активность.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. Звягинцевой Т.Н. Автор благодарит к.х.н. Шевченко Н.М., к.х.н. Назаренко Е.Л. за консультации и помощь в работе, сотрудников контрольно-аналитической лаборатории, к.х.н. Исакова В.В. за получение ЯМР спектров, к.ф.-м.н. Глазунова В.П. за получение ИК спектров.

Сокращения и условные обозначения. ВКЭ вирус клещевого энцефалита, САК свободные аминокислоты, ЛВ липофильные вещества, PL полярные липиды, W+НС воска и углеводороды, ЖК жирные кислоты, ПНЖК полиненасыщенные ЖК, UVB ультрафиолетовое излучение с =280-320нм, ММР-1 матричная металлозависимая пептидаза 1, Fтабл. и Fэксп. критерий Фишера, FLM водорастворимые полисахариды, F фукоидан, L ламинаран, M маннуронан, A альгинат натрия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Главное внимание в настоящем исследовании уделено изучению закономерностей в изменении содержания и структуры фукоиданов из C. costata и U. pinnatifida в зависимости от сезона, выбору условий экстракции и очистки фукоидана из C. costata и F.

evanescens, исследованию состава низкомолекулярных веществ некоторых бурых водорослей и созданию универсального способа их комплексной переработки.

1 Влияние сезона на состав полисахаридов C. costata Полисахариды выделяли из талломов C. costata последовательной экстракцией (Рис. 1). Были получены фракции низкомолекулярных веществ и полисахаридов из образцов C. сostata, собранных в различные сезоны: апрель (фракции Э4, FLM4, A4) – максимальное развитие водоросли; май (фракции Э5, FLM5, A5) –подготовка водоросли к спорогенезу; июнь (фракции Э6, FLM6, A6) – спорогенез и июль (фракции Э7, FLM7, A7) – начало разрушения слоевища. Изменение выхода выделенных фракций в зависимости от месяца сбора водоросли представлено на рисунке 2.

Экстракция 3% и 1,5% р-ром Na2CO3, 60°С, 8 ч, разбавление водой, центрифугирование Концентрирование, диализ, осаждение этанолом Растворение в воде, подкисление HCl до pH 2, центрифугирование Фракция А (Альгинат натрия) Рис. 1. Схема выделения полисахаридов из бурой водоросли C. costata.

1.1 Влияние сезона на содержание и состав альгинатов C. costata Основная часть полисахаридов С. costata представлена альгинатами (фракции A4A7), их содержание увеличилось от 15,6% в апреле до 20,6% в июле (рис. 2). В спектрах С-ЯМР этих фракций присутствовали интенсивные сигналы с химическими сдвигами 101,2 (С1), 70,6 (С2), 72,6 (С3), 79,2 (С4), 77,3 (С5) и 176,1 (С6) м.д., соответствующие 1,4связанным остаткам -D-маннуроновой кислоты (FM), а также менее интенсивные сигналы с химическими сдвигами 102,4 (С1), 66,0 (С2), 70,5 (С3), 80,7 (С4) и 69,8 (С5) м.д., соответствующие 1,4-связанным остаткам -L-гулуроновой кислоты (FG). Сезон сбора водоросли существенно влиял на мономерный состав альгинатов. Величина отношения маннуроновой и гулуроновой кислот (FM/FG), содержание которых рассчитано из спектров Н-ЯМР, изменилась от 2,64 в апрельском образце до 1,87 в июльском, а средняя молекулярная масса альгинатов из С. costata увеличилась до 710 кДа (табл. 1).

выход от сухого веса водоросли, % Влияние сезона на молекулярный вес, моносахаридный состав и структуру альгинатов (А) из С. costata.

Mm – средняя весовая молекулярная масса, определена методом ВЭЖХ (Shodex Asahipak GS-520 HQ, 7,5 х 300 мм); FG содержание L-гулуроновой кислоты; FM D-маннуроновой кислоты; FMM, FGG, FMG+GM – рассчитано из 1Н-ЯМР-спектров альгинатов.

Соотношение моносахаридов и их распределение в цепи полимера в виде FMM-, FGG-, FMG- и FGM-блоков определяют способность альгиновых кислот к гелеобразованию и их биологическую активность. Ранее было показано, что гель не образуется, если содержание L-гулуроновой кислоты в полисахариде меньше 20-25%. Наши данные показывают, что в июле C. costata содержит значительные количества способного к гелеобразованию высокомолекулярного альгината натрия, в структуре которого более 30 % составляют FGGблоки. В апреле и мае из водоросли можно выделить альгинат, обогащенный полиманнуроновыми блоками. Альгинаты из C. costata давали неокрашенные растворы.

Эта их особенность, наряду с высоким выходом, делает альгинат натрия из C. costata привлекательным сырьем для использования в медицине и пищевой промышленности.

1.2 Влияние сезона на состав фракций водорастворимых полисахаридов C. costata.

Структурные характеристики и биологическая активность полисахаридов Суммарный выход фракций водорастворимых полисахаридов (FLM4-FLM7), состоящих из ламинарана, фукоидана и уронана был невелик; в апреле он составил 1,2 %, а в июле увеличился до 3,4 %. В период с апреля по июль доля уронана во фракциях FLM резко снизилась с 36,0 до 2,5%, а фукоидана, наоборот, увеличилась с 4,4 до 21,5% (рис.

2). В спектре 13С-ЯМР препарата FLM4 преобладали сигналы с химическими сдвигами 101,2, (С1), 71,3 (С2), 72,7(С3), 79,3 (С4), 77,2 (С5) и 176,4 (С6) м.д., характерные для полиманнуроновой кислоты. Сигнал с хим. сдвигом при 17,08 м.д типичный для -Lфуканов, был незначительным. Сигнал при 85,5 м.д., характерный для ламинаранов, отсутствовал. Молекулярная масса фракции FLM4 находилась в интервале от 430 до кДа. Таким образом, в апреле водорастворимые полисахариды C. costata представлены практически чистой полиманнуроновой кислотой, в то время как в июле количество маннуронанов уменьшилось более чем на порядок (рис. 2). Из раствора препарата FLM при рН 2,0 высадили маннуронан (фракция М5) с молекулярной массой 200 кДа и характерным для полисахаридов этого класса спектром 13С-ЯМР. Фракция FLM5, наряду с водорастворимым маннуронаном, содержала заметные количества фукоидана (рис.2). С апреля по июль содержание фукоидана в C. costata увеличилось в 5 раз (рис. 2);

одновременно происходили существенные изменения в молекулярно-массовом распределении, моносахаридном составе и заряде фукоидана. В апреле и мае вегетативные растения синтезировали небольшие количества низкосульфатированного гетерогенного по моносахаридному составу фукоидана (рис. 3), в котором присутствовали Fuc, Gal, Man и Rha в отношении 1,0:0,27:0,38:0,19. Этот фукоидан имел молекулярную массу в интервале от 200 до 800 кДа (рис. 4).

Содержание, % моносахаридов Fuc, Gal, Man, Rha, Xyl, Glc во фракциях FLM (% от суммы нейтральных моносахаридов) и сульфатов С апреля по июль в фукоидане увеличилось содержание Fuc и Gal (с 60 до 80 мол % в сумме), а содержание Man и Rha значительно уменьшилось (рис. 3). Отношение между Fuc и Gal в фукоидане на протяжении наблюдаемого периода практически не менялось.

В июне-июле из генеративных растений выделили фукоидан, представляющий собой галактофукан (Fuc:Gal:Man:Rha как 1:0,29:0,08:0,06). В июле содержание сульфатов в полисахаридах увеличилось в 5 раз по сравнению с апрелем (рис. 3). Впервые показано, что по мере роста C. costata молекулярная масса фукоидана значительно уменьшилась и к июлю находилась в интервале от 20 до 300 кДа (рис. 4), что особенно интересно в связи с тем, что полисахариды с низкой молекулярной массой предпочтительнее в качестве биологически активных веществ. Таким образом, из C. сostata, собранной в июне-июле, выделили фукоидан с меньшей молекулярной массой, более сульфатированный и менее гетерогенный по моносахаридному составу, чем из водоросли, собранной в апреле-мае.

Было исследовано ингибирующее действие фукоидана из C. costata майского сбора на UVB-индуцируемую экспрессию матричной металлозависимой пептидазы 1 (MMP-1) в клетках кератиноцитов человека HaCaT. Предварительная обработка клеток фукоиданом ингибировала экспрессию MMP-1 и активацию ее промотера на 37,3, 53,3 и 58,5% при концентрациях 0,01, 0,1 и 1 мг/мл соответственно. Этот фукоидан может быть предложен как перспективное терапевтическое средство для предотвращения старения кожи под действием ультрафиолетового облучения.

Содержание ламинарана в C. costata с апреля по июль увеличилось в 3,5 раза, но не превысило 1% от фракции водорастворимых полисахаридов (FLM) (рис. 3). Изучение строения ламинарана (L7) показало, что он является типичным представителем этой группы полисахаридов 1,3;1,6--D-глюканом. В спектре 13С-ЯМР этой фракции присутствовали сигналы с химическими сдвигами 103,9 (С1), 74,6 (С2), 85,6 (С3), 69, (С4), 77,3 (С5) и 62,1 (С6) м.д., которые характерны для 1,3-связанных остатков -D-глюкопиранозы, и сигналы с химическими сдвигами 70,1 (С6), 75.9 (С5) и 71.0 (С4) м.д., свидетельствующие о присутствии 13,6- и 1,6-связанных остатков глюкозы.

Отношение между 1,3- и 1,6-связанными остатками -D-глюкопиранозы составило 5:1.

Молекулярная масса ламинарана находилась в интервале 4-5 кДа.

Во фракции фукоидана F7 основными моносахаридами были Fuc и Gal в отношении 1,0:0,29. В спектре 13С-ЯМР фракции F7 (рис. 5) имелись сигнал при 16,9 м.д., характерный для CH3-группы фукопиранозы, и сигналы при 21,66 м.д. и 173,9 м.д., указывающие на присутствие О-ацетильных групп. Сигналы при 62,56 и 176,06 м.д.

указывали на присутствии в образце, соответственно, гексопираноз с незамещенными СН2ОН-группами, а также уроновых кислот.

В ИК-спектре фракции F7 наблюдались полосы поглощения при 1731 (С=О связь), 1264 (S=О связь) и 823 см-1 с плечом при 846 см-1(S-O-C связи). Последнее характерно для сульфатных групп, находящихся, соответственно, в аксиальном (при С4) и в экваториальном положениях (при С2). Математический анализ контура полосы при см-1 показал, что она состоит из двух компонентов с частотами колебаний при 846 и см-1. Отношение площадей S846 /S818 составило 1,23. Следовательно, сульфатные группы в фукоидане находятся в положении С4 (80%) и в положении С2 (20%). Таким образом, фукоидан фракции F7 представлял собой сульфатированный по С4 и С2, частично ацетилированный галактофукан.

Было исследовано противовирусное действие фукоидана F7 на культуре клеток почек эмбриона свиньи, зараженных вирусом клещевого энцефалита (КЭ) (штамм Р-73).

Установлено, что фукоидан в концентрациях 100, 500 и 1000 мкг/мл ингибировал репродукцию и развитие цитопатического действия вируса КЭ, однако, дозозависимого действия выявлено не было. Фукоидан цитотоксического действия не оказывал.

Таким образом, максимальные количества ламинарана, фукоидана и альгинатов содержались в генеративной C. costata, собранной в июне-июле. Для выделения альгината, обогащенного маннуроновой кислотой, водоросль рекомендуется собирать в мае, а высокомолекулярного альгината, обогащенного гулуроновой кислотой, и низкомолекулярного, сульфатированного и частично ацетилированного галактофукана – в летние месяцы.

2 Влияние сезона на содержание и моносахаридный состав фукоидана U. pinnatifida Водоросль U. pinnatifida имеет морфологически разграниченные части таллома:

вегетативную (пластина) и репродуктивную (спорофиллы). Листовая пластина составляет основную часть таллома в период с апреля по июнь. В июле, в период спороношения, спорофиллы составляют до 76% от веса цельного таллома водоросли.

Содержание фукоидана в U. pinnatifida с апреля по июль увеличилось в 5 раз (рис. 6), достигнув максимума, когда спорофиллы составляли основную часть таллома водоросли.

Значительно изменился моносахаридный состав фукоидана: содержание Gal увеличилось, Man уменьшилось, а содержание Fuc практически не изменилось (рис. 7). Мольное отношение Fuc:Gal изменилось от 1,0:0,34 в апреле до 1,0:0,69 в июле. В апреле U.

pinnatifida синтезировала гетерофукан примерно с одинаковым содержанием маннозы и галактозы, а в июне-июле фукоидан, представляющий собой галактофукан.

обезжиренной водоросли Содержание, % от сухой Рис. 6. Изменение содержания фукоидана Рис. 7. Изменение моносахаридного из U. pinnatifida в зависимости от сезона. состава фукоидана из U. pinnatifida в 3 Влияние стадии жизненного цикла C. costata и U. pinnatifida на содержание и моносахаридный состав фукоидана Спорангии у C. costata образуются на поверхности пластины, а U. pinnatifida имеет спорофиллы специализированный орган, где формируются и созревают споры, которые можно отделить от основного растения. Июньские сборы водоросли C. costata содержали фертильные и стерильные особи. Фракция водорастворимых полисахаридов FLM6ферт из фертильных растений содержала в своем составе больше всего фукоидана (28,3%), по сравнению с фракциями FLM5 (стерильные особи: 13,4%) и FLM6 (смесь фертильных и стерильных особей: 16%). В случае U. pinnatifida в мае были отобраны взрослые растения с развитыми спорофиллами, но имеющие разный репродуктивный статус: фертильные, имеющие спорофиллы с развитыми сорусами, и вегетативные, спорофиллы которых не содержали парафиз или спорангиев. В спорофиллах фертильных особей содержание фукоидана (15%) было в 5 раз выше, чем вегетативных (3%). Очевидно, что имеется прямая связь между увеличением содержания фукоидана в C. costata и U. pinnatifida и началом спороношения.

При переходе C. costata к спороношению в фукоидане увеличилось содержание Fuc с 47,4 до 65,2 мол %, Gal с 13,1 до 18,0 мол %, значительно уменьшилось содержание Man и Rha (рис. 8), отношение Fuc:Gal:Man:Rha изменялось от 1,0:0,27:0,38:0,19 до 1,0:0,27:0,05:0,03.

Для U. pinnatifida также наблюдались изменения в составе нейтральных моносахаридов при переходе водоросли к спороношению: в фукоидане из спорофилл содержание Gal увеличилось с 27,0 до 42,8 мол%, содержание Fuc не изменилось, содержание Man уменьшилось в 4,7 раза (рис. 9), отношение Fuc:Gal изменялось от 1,0:0,51 до 1,0:0,80.

Таким образом, при переходе водорослей к спороношению моносахаридный состав фукоидана как в C. costata, так и в U. pinnatifida, существенно изменялся. В вегетативных растениях содержались преимущественно гетерополисахариды, построенные из Man, Fuc, Rha и Gal, а в генеративных – полисахариды, состоящие, в основном, из Gal и Fuc.

Изменение состава моносахаридов фукоидана показывает, что не только содержание, но и структура этого полисахарида связаны с развитием органов размножения и выходом спор.

нейтральных моносахаридов Содержание, % от суммы 4 Сравнительное исследование состава водно-этанольных экстрактов L. cichorioides, C. costata, L. japonica и F. evanescens и их биологической активности Существующие технологии получения полисахаридов из водорослей зачастую предполагают предварительную обработку сырья этанолом. Для расширения области использования бурых водорослей были исследованы состав и свойства низкомолекулярных веществ водно-этанольных экстрактов из L. cichorioides, C. costata, F.

evanescens, L. japonica, которые являются побочными продуктами при выделении полисахаридов. F. evanescens была собрана в июле, L. cichorioides, L. japonica (2-ого года развития) и C. costata были собраны в мае. Состав экстрактов представлен в табл. 2.

Состав водно-этанольных экстрактов бурых водорослей.

Сухие вещества экстракта (% 28,0 ± 1,66 39,0 ± 0,97 32,0 ± 1,28 29,0 ± 2, от веса сухой водоросли) (г/100 мл) Минеральные вещества составляли примерно половину от сухих веществ экстрактов, больше всего их было в экстракте из C. сostata. Качественный состав минеральных веществ экстрактов исследуемых водорослей был очень близок (табл. 3). Во всех экстрактах преобладали ионы одновалентных металлов: в экстрактах водорослей порядка Laminariales больше всего содержалось ионов калия, в экстракте из F. evanescens – натрия.

Содержание ионов кальция и магния в экстрактах было значительно меньше, чем ионов одновалентных металлов. (табл. 3). Экстракт из F. evanescens отличался высокой концентрацией ионов железа, кобальта, марганца и никеля.

Состав макро- и микроэлементов экстрактов бурых водорослей.

Содержание макроэлементов (% от сухих веществ экстракта, х10 ) Содержание микроэлементов (% от сухих веществ экстракта, х 10-6) Бурые водоросли – природный источник йода. Высокое содержание йода обнаружено в экстрактах из L. cichorioides (9,0 мг/г) и L. japonica (5,4 мг/г). Значительную долю органических веществ в бурых водорослях составлял маннит, который легко экстрагируется из водоросли этанолом. Высокое содержание маннита найдено в экстрактах из L. cichorioides и L. japonica (табл. 2). Фукоиданы и уронаны в экстрактах практически отсутствовали: не более 1 и 0,5% соответственно.

Азотистые вещества водорослей представлены, главным образом, белками и свободными аминокислотами (САК). В этанольный экстракт переходят практически все САК. Больше всего САК извлекалось из L. japonica (табл.2). В экстрактах мы обнаружили 18 аминокислот, среди них 7 незаменимых: Val, Leu, Тре, Ile, Lys, Tyr, Phe, доля которых составила 5,2, 13,3, 6,0 и 1,3% от суммы САК для C. costata, F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica соответственно. Основная часть САК – это глутаминовая кислота (наибольшее ее содержание, 77% от суммы САК, в экстракте из L. japonica), и аланин (наибольшее его содержание, 50% от суммы САК, в экстракте из C. costata).

Больше всего липофильных веществ (ЛВ) содержалось в экстракте из C. costata (табл. 2), главными ЛВ были PL (в основном, гликолипиды) и W+НС (табл. 4). В экстрактах ламинариевых водорослей PL составили 50% от общих ЛВ, больше, чем в экстракте фукуса. В экстракте из F. evanescens обнаружено наибольшее количество стеринов, среди них на долю фукостерина приходилось 73%, а холестерина и метиленхолестерина лишь 17,7 и 5,7% соответственно. Из ламинариевых наибольшее количество стеринов обнаружено в экстракте из L. japonica, главным из которых был метиленхолестерин (78%).

Состав липофильных веществ (ЛВ) водно-этанольных экстрактов бурых водорослей.

F. evanescens L. japonica PL – полярные липиды, FFA свободные жирные кислоты, ST – стерины, TG – триглицериды, W+HC – воска и углеводороды, FAE – этиловые эфиры жирных кислот.

Состав основных ЖК (% от суммы) водно-этанольных экстрактов бурых водорослей.

Жирные кислоты F. evanescens L. cichorioides L. japonica C. costata Основными насыщенными жирными кислотами (ЖК) в экстрактах водорослей были 14:0 и 16:0 (табл. 5). Уровень 18:1n-9, которую относят к главным ЖК бурых водорослей, в экстракте из C. costata достигал 16,5%, а уровень С18-20 полиненасыщенных ЖК (ПНЖК) около 50% от суммы ЖК. В экстракте из L. cichorioides отмечено самое высокое содержание 20:5n-6 и 18:4n-3 (табл. 5). Во всех экстрактах преобладали ПНЖК n-3 серии, соотношение n-3/n-6 для экстрактов водорослей составило 1,2-2,4.

Сравнительное изучение состава водно-этанольных экстрактов водорослей показало, что при качественном сходстве состава между ними существуют значительные количественные различия. Значительный интерес представлял экстракт из F. evanescens, который обогащен веществами белковой природы, тирозином, фенилаланином и полифенольными соединениями. В этом экстракте определили высокий уровень ионов натрия, железа, марганца, никеля, липофильных веществ и производных хлорофилла.

5 Влияние сезона на состав водно-этанольных экстрактов бурых водорослей L. cichorioides и C. costata Доля органических веществ в экстрактах возрастала с мая по сентябрь. Для L.

cichorioides содержание маннита в экстрактах сентябрьских образцов была в 2 раза больше (53,6%) по сравнению с майскими образцами (табл. 2). Экстракты из сентябрьских образцов L.cichorioides и C. costata содержали больше полифенольных соединений (5,5 и 2,7% соответственно) и хлорофилла (2,2 и 3,1% соответственно) по сравнению с экстрактами из майских сборов (табл. 2). В экстрактах из L. сichorioides, C. Costata, F.

evanescens среди САК было отмечено присутствие таурина в июльских образцах. В экстракте из июльского образца C. costata уровень ЛВ был вдвое ниже (6,5%) по сравнению с майским (12,0%), а уровень ЛВ в экстракте из майского образца L.

cichorioides составил 4,6%, резко упал до 1,4% в июльском, и вновь увеличился до 4,9% в сентябрьском образце. Очевидно, что при сборе водоросли следует учитывать сезонную зависимость содержания биогенных веществ в водно-этанольных экстрактах.

6 Биологическая активность водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Для изучения противоопухолевой активности экстрактов было исследовано их действие на раковые клетки кишечника человека HT-29 и DLD-1. В концентрации мкг/мл наиболее сильным ингибирующим действием обладал экстракт из F. evanescens, который угнетал рост колоний клеток DLD-1 и HT-29 на 67 и 63% соответственно. Для L.

cichorioides и C. costata наиболее сильное ингибирующее действие показали экстракты этих водорослей, собранных в июле, они ингибировали рост клеток DLD-1 на 64 и 56%, а клеток HT-29 на 50 и 44% соответственно. Поскольку наибольшее ингибирующее действие показали экстракты из генеративных водорослей, они являются перспективными объектами для дальнейшего выяснения их действующего начала.

Для изучения рострегулирующей активности экстрактов было исследовано их действие на проростки сои Glycine max. Все экстракты в концентрации 100 мкг/мл стимулировали рост как корневой системы проростка, так и стебля. Наиболее сильное ростстимулирующее действие показали экстракты из L. japonica и F. evanescens, которые увеличивали рост корня на 20 и 24%, а стебля на 26 и 15% соответственно.

Предварительная обработка семян сои всеми экстрактами в концентрации 2 мг/мл приводила к повышению урожайности. Наибольший прирост урожайности на 15,6 и 11,7% наблюдали при обработке семян экстрактами из L. japonica и F. evanescens соответственно. Целесообразно рекомендовать экстракты в качестве стимулятора роста при выращивании сои на полях.

В заключение следует отметить, что исследование химического состава водноэтанольных экстрактов показало, что они могут быть рекомендованы как для получения отдельных веществ (фукостерина, полифенольных соединений, маннита), так и для изготовления на их основе композиций для медицины и сельского хозяйства.

7 Оптимизация условий выделения фукоиданов из бурых водорослей 7.1 Влияние температурного режима экстракции бурых водорослей C. сostata и F. evanescens на выход и фракционирование фукоиданов, имеющих различное строение полисахаридной цепи Для выделения фукоиданов обезжиренные водоросли C. costata и F. evanescens июльского сбора последовательно экстрагировали 3 ч раствором HCl (рН 2) при 20°С (холодная экстракция, фракции F1), а затем при 60°С (горячая экстракция, фракции F2).

Остаток водоросли F. evanescens дополнительно экстрагировали 12 ч при 60°С (фракция F3). Выходы и характеристики полученных фракций фукоиданов приведены в таблице 6.

Для C. costata выход фракций фукоидана СсF1 был примерно в 2 раза выше, чем выход фракции СсF2. Для F. evanescens наибольший выход был получен при горячей экстракции (табл. 6). Было отмечено высокое содержание уронанов и пониженное содержание белка во фракции F2 для обеих водорослей (табл. 6).

Выходы и характеристики фракций фукоиданов, выделенных экстракцией при рН 2 из C. costata и F. evanescens при 20°С (F1) и 60°С (F2 и F3).

* % от веса сухой обезжиренной водоросли, ** % от веса фракции Наличие глюкозы в составе нейтральных моносахаридов указывало на присутствие во фракциях F1 и F2 ламинарана. Следует отметить, что содержание ламинарана в обеих водорослях невелико (табл. 6). Из F. evanescens при разных температурах были выделены сульфатированные фуканы (фракции FeF1 и FeF2), практически не отличающиеся по моносахаридному составу, содержанию сульфатов и молекулярным массам.

Дополнительная экстракция F. evanescens при высокой температуре с небольшим выходом дала фракцию фукоидана FeF3 с высоким содержанием Man (26% от суммы нейтральных моносахаридов) и уроновых кислот (50% от фракции) (табл. 6).

Молекулярно-массовое распределение фукоиданов во фракции CcF1 из C. costata было неоднородным, находилось в интервале от 20 до 600 кДа с главным максимумом при 300 кДа и двумя пиками меньшей интенсивности при 80 и 560 кДа. Фракция CcF содержала полисахариды с меньшей молекулярной массой с максимумом при 70 кДа и незначительными пиками при 33 и 240 кДа.

Сравнительная оценка содержания сульфатных групп в фукоидане фракций СсF1 и СсF2 проводилась по сравнению отношений величин интенсивностей полос поглощения валентных колебаний сульфатных групп при 1260-1264 см-1 и скелета сахарного кольца при 1082 см-1 (ИК-спектры). Сравнение полученных величин отношений показало, что содержание сульфатных групп во фракции CcF1 было на 25% больше, чем во фракции CcF2, т.е. при холодной экстракции был получен более сульфатированный фукоидан.

Кроме того, фракция фукоиданов (CcF2) содержала меньше Gal, но больше Man, чем фракция CcF1 (табл. 6).

При последовательной экстракции C. costata были получены разные по составу и молекулярной массе фракции фукоиданов. В то же время, аналогичные фракции фукоиданов FeF1 и FeF2 из F. evanescens практически не различались (табл. 6). Однако, при дополнительном экстрагировании F. evanescens в более жестких условиях (60°С, 12 ч) была получена фракция фукоидана FeF3, свойства которой (высокое содержание альгиновых кислот и значительная доля Man в составе моносахаридов, низкое содержание сульфатов) были близки к свойствам фракции СсF2 из C. costata (табл. 6). Это позволяет предположить, что фракции фукоиданов СсF2 и FeF3 извлекаются при разрушении клеточных стенок, причем для F. evanescens этот процесс требует более жестких условий.

Для детальной характеристики полисахаридов C. costata фракцию CcF1 очищали гидрофобной хроматографией от примеси ламинарана, получили фракцию фукоидана CcF1-f, которую дополнительно разделяли ионообменной хроматографией. Получили подфракции CcF1-f-0,5 и CcF1-f-1,5, характеристики которых приведены в таблице 7.

Подфракция СсF1-f-0,5 содержала низкосульфатированный гетерогенный по моносахаридному составу фукоидан с высоким содержанием маннозы и глюкуроновой кислоты (табл. 7). В этой подфракции присутствовали примерно в равных количествах фукоиданы с молекулярными массами 40 и 620 кДа. Высокосульфатированная подфракция СсF1-f-1,5 составляла около 70% от исходного фукоидана (СсF1-f) (табл. 7).

Около 90% от суммы моносахаридов этой подфракции были представлены Fuc и Gal в соотношении 1,0:0,28. Основную часть подфракции СсF1-f-1,5 составили фукоиданы с молекулярной массой 160 кДа, в меньшем количестве с молекулярной массой 70 кДа.

Следовательно, фракция СсF1 содержала два структурных типа фукоиданов слабозаряженный уронофукоманнан и высокосульфатированный галактофукан в весовом соотношении 1:2.

Характеристика подфракций СсF1-f-0,5 и СсF1-f-1,5, полученных хроматографией на DЕАЕ-целлюлозе фракции фукоидана СсF1-f из C. costata.

* % от веса фракции фукоидана. н.о. не определяли Таким образом, показана гетерогенность состава фукоиданов C. costata и F.

evanescens и возможность фракционирования нативных фукоиданов, используя разные температурные режимы экстракции.

7.2 Оптимизация условий выделения фукоидана из бурой водоросли F. evanescens F. evanescens содержала наибольшее количество фукоидана, представлявшего собой практически чистый сульфатированный фукан. Для оптимизации условий выделения фукоидана использовали в качестве сырья сухую обезжиренную водоросль F. evanescens, которая после удаления низкомолекулярных соединений и солей содержала 14% фукоидана (далее по тексту сырье). Вместе с фукоиданом из сырья экстрагируются ламинаран и уронаны, а также низкомолекулярные вещества и соли, которые не полностью экстрагировались водным этанолом. Поэтому необходимо подбирать оптимальные условия экстракции для получения однородного по составу продукта с наибольшим выходом. Мы предлагаем комплексную переработку водоросли, поэтому нашими критериями были максимальный выход фукоидана, селективность его выделения и снижение потерь альгиновой кислоты, которая будет выделяться на следующей стадии.

В предварительных экспериментах были выбраны следующие условия экстракции фукоидана из сырья: средний размер частиц сырья 5 мм, кислотность экстракционной среды рН 2,5, отношение водоросль: экстрагент 1:15, температура – 50°С, кратность экстракций – 2. Для проверки степени влияния каждого из этих факторов на процесс экстракции фукоидана был проведен оптимизационный эксперимент по типу дробной реплики с двумя уровнями пяти переменных (25-2) с определяющими контрастами. Задача оптимизации сводилась к определению значений условий экстракции, обеспечивающих максимальный выход фукоидана и минимальное содержание сопутствующих веществ.

План и результаты факторного эксперимента приведены в таблице 8.

План и результаты факторного эксперимента (с двумя уровнями пяти переменных) по оптимизации экстракции фукоидана из F. evanescens.

опыта Х Выход процесса Yi (функция отклика) определили, как Y1 - выход фукоидана (% от содержания в сырье); Y2 - выход экстрактивных веществ (% от веса сырья); Y3 - выход водорастворимых полисахаридов (% от веса экстрактивных веществ); Y4 - выход фукоидана (% от веса водорастворимых полисахаридов). Независимыми переменными (Xi) были: Х0 - соотношение сырье: экстрагент; Х1 - значение рН; Х2 - кратность, раз; Х3 продолжительность, ч; Х4 - температура, °С; Х5 - степень измельчения сырья, мм.

Для определения ошибки эксперимента было поставлено 4 опыта в нулевых условиях (опыты 9-12, табл. 8).

По результатам факторного эксперимента описание функции отклика в виде линейных уравнений регрессии имели вид:

Y1= 59,6 – 2,1 Х1 + 10,7 Х2 + 5,8 Х3 + 9,9 Х4 + 7,1Х5 (1) Y3= 69,8 + 13,1 Х1 + 4,3 Х2 + 0,8 Х3 + 2,5 Х4 + 6,5 Х5 (3) Y4= 62,4 – 12,8 Х1 + 3,3 Х2 + 2,2 Х3 + 3,3 Х4 – 2,8Х5 (4) Проверка значимости коэффициентов при факторах Хi в уравнениях (1-4) по критерию Стьюдента (с надежностью 95%) показала, что в уравнении (1) и (2) значимо отличны от нуля только коэффициенты при Х2, Х4 и Х5, а в уравнениях (3) и (4) при Х1.

Это означает, что в выбранном диапазоне увеличение кратности (Х2) и температуры экстракции (Х4) должно приводить к увеличению выхода фукоидана (Y1) и экстрактивных веществ (Y2). При увеличении рН среды (Х1) следует ожидать повышения доли полисахаридов в экстрактивных веществах (Y3) и уменьшения доли фукоидана во фракции полисахаридов (Y4). Поскольку уменьшение размера частиц сырья (Х5) при статическом режиме экстракции не приводило к повышению выхода фукоидана, рекомендовано сырье измельчать до размера 1-3 см.

Как показали результаты регрессионного анализа уравнения (1), оно удовлетворительно описывает выход фукоидана в процессе экстракции.

Экспериментальная проверка модели в условиях иных, чем те, которые использовались для получения уравнения (1), подтвердила адекватность ее применения для описания процесса (Fэксп. = 5,42; Fтабл. = 5,79; p = 0,05).

Для масштабирования процесса экстракции фукоидана из F. evanescens необходимо учитывать следующие закономерности. На выход фукоидана положительно влияло повышение температуры экстракции. Однако, учитывая, что экстрагирование проводят при достаточно низких значениях рН, повышение температуры выше 70°С может привести к частичному кислотному гидролизу фукоидана. Увеличение кратности экстрагирования также положительно влияло на выход фукоидана, но при многократном экстрагировании водоросли (более 2 раз) при температуре >60°С извлекался гетерогенный по составу фукоидан и уменьшалась селективность экстракции. Изменение рН в заданном интервале (1,5-3,5) влияло на выход фракции водорастворимых полисахаридов и содержание фукоидана в этой фракции. Варьируя значение рН от 1,5 до 3,5 и выше можно получать фракцию полисахаридов с разным содержанием фукоидана и альгината. Для получения фракции полисахаридов, обогащенной фукоиданом, экстракцию следует проводить при рН 2,0-2,5.

Мы провели 3-х кратную экстракцию сырья при 65°С, результаты которой даны в таблице 9. Составы 1 и 2 экстрактов практически идентичны и их следует объединять.

При необходимости получения гетерогенного фукоидана можно проводить 3-ю экстракцию, выход которой составляет 12% от суммарного.

По результатам оптимизации были выбраны условиях экстракции фукоидана: рН 2,5;

при 65±5°С; два раза по 3 ч, гидромодуль 1:15; при этом содержание фукоидана в сумме экстрактивных веществ составило от 40 до 50%.

Для очистки фукоидана бурой водоросли F. evanescens от ламинарана и низкомолекулярных примесей мы использовали ультрафильтрацию на мембранах с пределом удерживания 5 кДа. Одновременно с очисткой экстракта происходило его концентрирование. Конечный продукт получали осаждением фукоидана из концентрата этиловым спиртом. Характеристика экстрактов приведена в таблице 10. В результате очистки был получен препарат полисахаридов, содержащий 86,7% фукоидана (табл. 10).

Характеристика экстрактов, выделенных из F. evanescens при рН 2,5; 65°С; 3 часа.

* % от веса сухой обезжиренной водоросли; ** % от экстрактивных веществ Характеристика экстрактов (до и после очистки на ультрафильтрационной установке) и конечного продукта из F. evanescens.

Водорастворимые полисахариды, %* 13,4 ± 1,0 12,6 ± 0,7 0,8 11,3 ± 0, * % от веса сухой обезжиренной водоросли;

** содержание фукоидана (% от экстрактивных веществ).

Характеристика фукоидана и полисахаридной композиции (БАД «Фуколам-С»), полученных из F. evanescens.

* % от веса сухой обезжиренной водоросли; ** % от экстрактивных веществ Выход фукоидана составил 75-78% от содержания в сырье. Выбранные условия экстрагирования и очистки были использованы для получения полисахаридной фракции, содержащей фукоидан и альгинат из бурой водоросли F. evanescens, которая зарегистрирована как «Фуколам-С – сырье для пищевой промышленности и производства БАД к пище» (табл. 11). На основе этой композиции была создана БАД к пище «Фуколам». Показана эффективность включения БАД «Фуколам» в комплексную терапию с целью коррекции липидного и углеводного обмена. «Фуколам-С» апробирован в качестве основы для иммуноэнтеросорбента, рекомендованного для лечения ожоговых больных и больных с гнойно-септическими заболеваниями.

7.3 Способ комплексной переработки бурых водорослей Наша работа показала, что из бурых водорослей можно получить различные продукты: водно-этанольный экстракт, содержащий биологически активные низкомолекулярные вещества, водорастворимые полисахариды (ламинараны, фукоиданы, маннуронаны), которые можно выделить и использовать и как смеси, и как индивидуальные продукты, и альгинат натрия (рис. 10).

Рис. 10. Технологическая схема комплексной переработки бурых водорослей.

Оптимизация условий получения фукоидана из F. evanescens позволила определить влияние параметров экстракции на качество и количество фукоидана. На основе проведенных исследований разработан способ комплексной переработки бурых водорослей, который защищен патентом РФ и международным патентом. Данный способ обладает универсальным характером и позволяет получать различные продукты из разных видов бурых водорослей.

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности изменения состава и структуры полисахаридов бурых водорослей Costaria costata и Undaria pinnatifida в зависимости от сезона и стадии жизненного цикла. В C. costata содержание альгинатов с апреля по июль увеличилось в 1,5 раза, отношение в них маннуроновой и гулуроновой кислот уменьшилось в 1,4 раза, а доля маннуронанов на порядок. В U. pinnatifida и C. costata содержание фукоиданов с апреля по июль увеличилось в 5 раз, достигнув максимума в спороносящих растениях.

Показано, что стерильные водоросли синтезировали низкосульфатированные гетерофуканы, а фертильные растения – высокосульфатированные галактофуканы.

2. Установлено, что водоросли C. costata и Fucus evanescens содержат фукоиданы различных структурных типов. Предложен способ их разделения последовательной экстракцией при разных температурах.

3. Определены состав полисахаридов и структурные характеристики ламинарана и фукоидана из генеративной C. costata. Ламинаран представлял собой 1,3;1,6--D-глюкан (1,3:1,6 как 5:1) с молекулярной массой 4-5 кДа, а фукоидан частично ацетилированный галактофукан, сульфатированный по С2 и С4, который ингибировал репродукцию и развитие цитопатического действия вируса клещевого энцефалита in vitro.

4. Исследован состав низкомолекулярных веществ C. costata, Laminaria cichorioides, L. japonica и F. evanescens. Показана зависимость состава низкомолекулярных веществ C.

costata и L. cichorioides от сезона сбора водоросли.

5. Установлено ингибирующее действие экстрактов C. costata, L. cichorioides и F.

evanescens на раковые клетки кишечника человека. Показана зависимость биологической активности экстрактов от сезона сбора водоросли. Обработка экстрактами L. japonica, C.

costata, L. cichorioides и F. evanescens семян сои увеличивала ее урожайность до 15%.

6. Для F. evanescens определены оптимальные условия экстракции фукоидана, составлена адекватная система уравнений зависимости качества и количества продукта от параметров экстракции. Разработан эффективный метод очистки фукоидана от низкомолекулярных примесей.

7. Предложен способ комплексной переработки бурых водорослей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Фильченков А.А., Завелевич М.П., Храновская Н.Н., Запорожец Т.С., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Изучение способности фукоиданов из дальневосточных бурых водорослей модулировать апоптоз клеток МТ-4 лейкоза человека in vitro // Росс.

биотерапевтический журнал. 2006. Т. 5. № 4. С. 30-37.

2. Фильченков А.А., Завилевич М.П., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н., Запорожец Т.С.

Повышение чувствительности злокачественных лимфоидных клеток человека к этопозиду при действии фукоидана полисахарида бурых водорослей // Эксперим. онкология. 2007. Т. 29. № 3. С. 181-185.

3. Имбс Т.И., Красовская Н.П., Ермакова С.П., Макарьева Т.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование химического состава и противоопухолевой активности водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaria costata и Fucus evanescens // Биол. моря. 2009. Т. 35. № 2. С. 140-146.

4. Moon H.J., Park K.S., Ku M.J., Lee M.S., Jeong S.H., Imbs T.I., Zvyagintseva T.N., Ermakova S.P., Lee Y.H. Effect of Costaria costata Fucoidan on Expression of Matrix Metalloproteinase-1 Promoter, mRNA, and Protein // J. Nat. Prod. 2009. V. 72. P. 1731-1734.

5. Имбс Т.И., Шевченко Н.М., Суховерхов С.В., Семенова Т.Л., Скрипцова А.В., Звягинцева Т.Н. Влияние сезона на состав и структурные характеристики полисахаридов бурой водоросли Costaria costata // Хим. прир. соед. 2009. № 6. С. 661-665.

6. Майстровский К.В., Запорожец Т.С., Федянина Л.Н., Каленик Т.К., Моткина Е.В., Имбс Т.И. Влияние иммуномодулятора фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens на показатели антиокcидантной системы, липидного и углеводного обмена у мышей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. № 3. С. 103–105.

7. Имбс Т.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Технология комплексной переработки бурых водорослей с различным полисахаридным составом // Тез.докл. Второй Международной научно-практ. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, безпозвоночные и продукты их переработки». М.: Изд-во ВНИРО. 2005. С. 189-192.

8. Имбс Т.И., Красовская Н.П., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование водноэтанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaria coctata, Fucus evanescens // Тез. докл. Третьей Международной научно-практ. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Владивосток: ТИНРОЦентр. 2008. С. 317.

9. Майстровский К.В., Раповка Ю.В., Запорожец Т.С., Звягинцева Т.Н., Имбс Т.И., Раповка В.Г. Коррекция липидного и углеводного обмена у больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей сульфатированным полисахаридом из бурой водоросли Fucus evanscens. Тез. докл. Объед. иммунол. форума. Санкт-Петербург // Росс.

иммунологический журнал. 2008. Т. 2 (11). № 2-3. С. 323.

10. Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н., Кузнецова Т.А., Звягинцева Т.Н., Имбс Т.И., Шевченко Н.М.. Cульфатированные полисахариды из бурых водорослей основа для разработки лекарственных препаратов // Тез. докл. Симпозиума «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств».

М.: «Слово». 2008. С. 89.

11. Имбс Т.И., Герасименко Н.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Состав веществ бурой водоросли Costaria costata // Тез. докл. II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» Владивосток. ДВО РАН. 2006. С. 67.

12. Патент РФ № 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии / Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Урванцева А., Кусайкин М.И., Корниенко В.Г., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. // БИМП № 33, С. 444-445. 2004.

13. WO2005/014657 Method of processing seaweed / Shevchenko N., Imbs T., Urvantseva А., Kusaikin M., Kornienko V., Zvyagintseva T., Eleakova L. // Internat. Bureau WIPO. 2005.

14. Патент РФ 2315487. Биологически активный продукт из бурой водоросли, биологически активная добавка к пище, безалкогольный напиток, парфюмерно-косметическое средство / Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н., Кусайкин М.И., Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н., Гафуров Ю.М., Рассказов В.А. Таран В.Н. // Бюл. № 3. 2008.

15. Патент РФ №2329864. Пористый сорбент с гепатопротекторными свойствами / Коненков В.И., Любарский М.С., Рачковская Л.Н., Бгатова Н.П., Беседнова Н.Н., Бородин Ю.И., Кузнецова Т.А., Имбс Т.И., Кусайкин М.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Таран В.Н. // Бюл. № 21. 2008.