[ ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2010. №1. С. 21–26.
Биополимеры растений
УДК 577.114+57.021
ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕКТИНОВ И ИХ
ГАЛАКТУРОНАНОВОГО КОРА*
П.А. Марков**, С.В. Попов, И.Р. Никитина, Р.Г. Оводова, Ю.С. Оводов
©
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия). E-mail: [email protected] Установлено, что в зависимости от структуры пектиновые полисахариды из различных растений либо способны защищать стенку кишки млекопитающих от повреждения и ингибировать развитие воспаления, либо, напротив, обладают противоспалительным действием. При этом показано, что галактуронан, выделенный из любого пектина и представляющий главную углеводную цепь (кор) его макромолекулы, проявляет выраженный противовоспалительный эффект.
Снижение количества нейтрофилов в стенке кишки после индукции воспаления указывает на то, что в основе противовоспалительного действия пектинов может лежать их влияние на функциональную активность лейкоцитов.
Ключевые слова: галактуронан, пектин, противовоспалительный эффект, колит
Работа выполнена в соответствии с планами НИР Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН на 2003–2005 гг. (ГР №01.200107401) и поддержана грантом ведущих научных школ (№ НШ-5796.2006.4), грантом РФФИ (№06-04-48079), программами президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные наук
и – медицине».
Введение Ранее установлено, что пектины при пероральном введении ингибируют развитие воспаления стенки кишки у экспериментальных животных, при этом исследования противовоспалительного действия пектинов при повреждении кишечной стенки проводились с использованием коммерческих пектинов, главным образом цитрусового и яблочного [1–4]. Данный подход не учитывает всего структурного разнообразия пектинов, встречающихся в природе. В то же время в ряде работ показано, что макромолекула пектинов, выделенных из разных растений, различается структурой линейной и разветвленной области [5–8].
Ранее было найдено [5], что действие пектинов на воспаление зависит от строения линейной и разветвленной области их макромолекулы. Так, например, галактуронановый фрагмент макромолекулы комарумана CP ингибирует развитие воспаления [9], а апиогалактуронан, фрагмент разветвленной области макромолекулы лемнана LM, оказывает провоспалительное действие [10].
Связь между особенностями строения макромолекулы пектинов и их действием на воспаление кишечника не исследована.
Цель исследования – получить дополнительную информацию о действии пектинов на воспаление и выявить область макромолекулы пектинов, обусловливающую их противовоспалительную активность при повреждении кишечника у мышей.
Экспериментальная часть Объект исследования. Пектины были выделены из разных растений и охарактеризованы сотрудниками Лаборатории гликологии и Лаборатории биотехнологии ИФ Коми НЦ УрО РАН. В работе использовали следующие * Статья рекомендована к публикации оргкомитетом научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания учебно-научного центра «Физико-химическая биология» в Республике Коми.
** Автор, с которым следует вести переписку.
22 П.А. МАРКОВ, С.В. ПОПОВ, И.Р. НИКИТИНА, Р.Г. ОВОДОВА, Ю.С. ОВОДОВ пектины: вакциниуман из ягод брусники Vaccinium vitis-idaea L. (VV), бергенан из листьев бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (BC), лемнан из ряски малой Lemna minor L. (LM), силенан из вегетативной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris L. (SV), зостеран из морской травы Zostera marina L. (ZM) и алиуман из чеснока Allium sativum L. (АС). Выделение проводили по ранее описанной методике (патент РФ №2149642). Для сравнения использовали коммерческие пектины (МР Biomedicals): яблочный (АР) и цитрусовый (РС).
Галактуронановый фрагмент макромолекулы был выделен из следующих пектинов: комарумана СР, раувольфиана RS, лемнана LM, силенана SV и пектина яблочного АР. Для получения галактуронана пектин (1 г) подвергали частичному кислотному гидролизу 2 М TFA (200 мл) в течение 5 ч при 100 °C. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, промывали 96% этанолом, растворяли в водном растворе аммиака, доводя рН раствора до 4,0–4,5. Полученный раствор диализовали в ультрафильтрационных ячейках (Millipore, США) через мембрану (полисульфон, 100 kDa) против постоянно сменяемой дистиллированной воды до полного отсутствия углеводов в диализате. Раствор после диализа лиофилизовали. Получили 250–270 мг галактуронана, []D20 = + 237,6 (с 0,17; вода), содержание галактуроновой кислоты 99%, следы рамнозы (менее 0,5%), метоксильные группы и примеси белка отсутствуют.
Животные. Исследования проводили на самках и самцах половозрелых белых лабораторных мышей A/HeJ массой тела 25–30 г, полученных из специализированного питомника «Рапполово» (ФГУП, РАМН).
Животных содержали на диете с неограниченным доступом к воде и корму. Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с рекомендациями по обращению с экспериментальными животными Комитета по биоэтике Коми НЦ УрО.
Введение полисахаридов животным. Навеску полисахаридов растворяли в воде непосредственно перед введением. Введение производили перорально (200 мг/кг) через пластиковый зонд (5 см), однократно утром, натощак, за два дня до индукции колита. Контрольные животные получали воду.
Индукция кишечного воспаления и его оценка. Воспаление толстой кишки у мышей вызывали разовым ректальным введением 5% уксусной кислоты (0,1 мл). Введение кислоты производили через мягкий катетер на 3 см проксимальней ануса [11]. Мышей умерщвляли через сутки и изолировали 5-сантиметровый фрагмент толстой кишки проксимальней ануса. Фрагмент кишки вскрывали, промывали от содержимого в физрастворе. С помощью светового микроскопа (20) определяли степень и площадь поражения. Степень поражения выражали в баллах, используя при этом следующую шкалу: 0 – нет признаков воспаления, 1 – гиперемия, без язв и эрозий, 2 – поверхностные язвы без разрушения слизистой, 3 – язвы с разрушением слизистой, 4 – глубокие некротические язвы [12]. Площадь поражения выражали в процентах от общей площади фрагмента кишки. В качестве положительного контроля использовали преднизолон (5 мг/кг).
Определение активности миелопероксидазы (МПО). Изолированный фрагмент кишки очищали от содержимого, взвешивали и гомогенизировали в фосфатно-буферном растворе (PBS). Гомогенат центрифугировали при 10000g в течение 20 мин, для анализа отбирали надосадочную жидкость (0,1 мл). Содержание МПО определяли спектрофотометрически. Полученный супернатант вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. К образцам добавляли 0,1 мл субстрата – раствора фосфатно-цитратного буфера, содержащего орто-фенилендиамин (0,4 мг/мл) и 0,015% Н2О2 [13]. Определяли оптическую плотность образцов при 492 нм с помощью спектрофотометра Power Wave 200 (Bio-Tek Instruments, USA). Активность МПО рассчитывали, используя калибровочный график, построенный для пероксидазы хрена (ПХ), и выражали в ед/мг сырой ткани.
Статистический анализ. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Достоверность различий оценивалась по U-критерию Манна-Уитни, с использованием программного обеспечения «Statistica 6.0» (Stat Soft. Inc).
Результаты и их обсуждение Исследовано действие пектинов на воспаление стенки толстой кишки у мышей, индуцированное уксусной кислотой. Установлено, что ряд пектинов оказывает действие только на отдельные параметры повреждения кишки. Так, например, алиуман AS снижает активность МПО в стенке кишки и уменьшает площадь поражения, но не действует на степень повреждения (рис. 1–3). Вакциниуман VV уменьшает степень и площадь поражения, но не действует на активность МПО в стенке кишки (рис. 1–3).
Обнаружено, что лемнан LM и силенан SV способствуют увеличению площади поражения стенки толстой кишки. Однако активность МПО и степень повреждения остаются на уровне, характерном для мышей, получавших до индукции воспаления воду.
«