БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра физиологии и биохимии растений

Т. И. Дитченко

КУЛЬТУРА КЛЕТОК,

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ

РАСТЕНИЙ

Методические рекомендации к лабораторным занятиям,

задания для самостоятельной работы

и контроля знаний студентов МИНСК 2007 УДК ББК Д 49 Рекомендовано Ученым советом биологического факультета Белорусского государственного университета 11 мая 2007 г., протокол №8 Р ец енз ен ты:

Ведущий научный сотрудник Отдела биохимии и биотехнологии растений Центрального ботанического сада НАН Беларуси, кандидат биологических наук Е.В. Спиридович;

доцент кафедры микробиологии, кандидат биологических наук О.В. Блажевич Белорусского государственного университета.

Дитченко, Т. И.

Д 49 Культура клеток, тканей и органов растений: Метод. рекомендации к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / Т. И. Дитченко. – Минск: БГУ, 2007. – 46 с.

Пособие включает ряд лабораторных работ, охватывающих основные разделы специального курса «Культура клеток, тканей и органов растений», а также задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов. Цель пособия – закрепить знания, полученные студентами в лекционном курсе, активизировать самостоятельную работу студентов.

Пособие предназначено для студентов биологического факультета специальности 1-31 01 01 «Биология» направления 1-31 01 01-03 «Биотехнология».

УДК ББК © Дитченко Т. И., © БГУ, © БГУ,

ОТ АВТОРА

Представленные методические рекомендации к лабораторным занятиям, а также задания для контроля самостоятельной работы студентов входят в состав учебнометодического комплекса по специальному курсу «Культура клеток, тканей и органов растений». Лабораторные занятия и задания для самостоятельной работы определяются программой данного курса и охватывают его основные разделы.

Цель пособия – сформировать у студентов практические навыки соблюдения условий асептики при проведении работ с культурами клеток и тканей растений, освоить правила введения растительных объектов в культуру in vitro, а также получения и пассирования каллусных тканей и клеточных суспензий. Пособие содержит тестовые задания, охватывающие все разделы специального курса, которые могут быть использованы студентами для самопроверки полученных знаний.

Автор выражает глубокую благодарность рецензентам за доброжелательный конструктивный анализ рукописи и ценные критические замечания, а также сотрудникам Управления редакционно-издательской работы БГУ за помощь при подготовке рукописи к печати.

РАЗДЕЛ I

ПРОГРАММА СПЕЦИАЛЬНОГО КУРСА

«КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ

РАСТЕНИЙ»

ВВЕДЕНИЕ

Культура клеток, тканей и органов растений: предмет, задачи. История развития методов культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений. Значение культуры клеток, тканей и органов растений для решения фундаментальных проблем биологии. Культура клеток и тканей как основа биотехнологии растений.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КЛЕТОК

И ТКАНЕЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Условия асептики при выполнении работ по культивированию растительных объектов in vitro. Методы и приемы стерилизации растительного материала при введении в культуру. Питательные среды. Регуляторы роста растений и их применение для культивирования растительных клеток и тканей in vitro. Влияние физических факторов на физиологическое состояние изолированных клеток и тканей растений.

Каллусные культуры. Роль каллусной ткани в интактном растении.

Получение каллусных тканей in vitro. Молекулярно-физиологические основы процесса дедифференциации клеток. Типы каллусных культур и их характеристика. Субкультивирование каллусов. Показатели роста каллусных культур. Использование каллусных тканей в фундаментальных исследованиях и биотехнологии.

Суспензионные культуры. Основные преимущества культивирования клеточных суспензий. Способы получения суспензионных культур.

Типы клеточных суспензий. Факторы, влияющие на степень их агрегированности. Основные параметры суспензионных культур.

Способы культивирования клеточных суспензий.

Культивирование отдельных клеток. Методы изолирования одиночных клеток. Методы выращивания in vitro одиночных клеток (метод культуры – няньки, метод плейтинга, метод микрокультуры). «Фактор кондиционирования». Значение культуры отдельных клеток для доказательства тотипотентности растительной клетки.

Культуры гаплоидных клеток. Методы получения гаплоидных растений in vitro. Основные пути андрогенеза. Факторы, влияющие на эффективность андрогенеза. Метод культуры пыльников и метод культуры пыльцы, их преимущества и недостатки. Гиногенез in vitro. Способы идентификации гаплоидов.

Культуры изолированных протопластов. Использование изолированных протопластов для решения теоретических и прикладных проблем биологии. Методы получения протопластов. Условия и способы культивирования протопластов. Методы слияния протопластов, механизм слияния протопластов.

БИОЛОГИЯ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

Основные перестройки, происходящие при переводе клеток растений в культуру in vitro. Сравнительная характеристика соматических клеток интактных высших растений и клеток, культивируемых в условиях in vitro. Морфологическая и генетическая гетерогенность популяций длительно культивируемых клеток высших растений. Сохранение эпигенетических особенностей растения донора. Асинхронность клеточных культур.

Рост клеток в культуре in vitro. Характеристика фаз ростового цикла.

Способы синхронизации клеточных культур.

Дифференцировка клеток к культуре in vitro. Типы дифференцировки.

Молекулярно-физиологические основы процесса дифференциации. Основные типы дифференцировки. Гистогенез в культуре in vitro. Физиологические аспекты стимуляции флоэмо- и ксилемогенеза. Морфогенез in vitro. Прямой и непрямой морфогенез. Морфофизиологическая характеристика ризогенеза, флорального и стеблевого органогенеза. Факторы, определяющие возможность и направленность процесса органогенеза.

Соматический эмбриогенез. Регенерация растений in vitro.

БИОТЕХНОЛОГИИ НА ОСНОВЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ

Клеточные технологии получения экономически важных биологически активных веществ растительного происхождения. Преимущества использования клеточных культур в качестве продуцентов БАВ по сравнению с интактными растениями. Особенности вторичного метаболизма в культурах изолированных клеток высших растений. Факторы, влияющие на накопление вторичных метаболитов культивируемыми клетками растений.

Ферментерное выращивание биомассы клеток-продуцентов, конструктивные особенности биореакторов. Режимы культивирования растительных клеток в биореакторах. Этапы работ по созданию промышленных технологий для получения биологически активных веществ с помощью культивируемых клеток растений. Преимущества и перспективы использования иммобилизованных растительных клеток в биотехнологических производствах. Основные направления использования культивируемых растительных клеток для биотрансформации.

Биотехнологии клонального микроразмножения и оздоровления растений. Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами вегетативного размножения растений. Области применения микроразмножения. Требования к объектам, используемым для клонального микроразмножения растений in vitro. Способы микроклонирования растений. Характеристика основных этапов микроразмножения. Физиологические особенности регенерантов и необходимость в создании особых условий их адаптации ex vitro. Факторы, влияющие на эффективность процесса микроклонального размножения растений. Методы получения безвирусного посадочного материала, возможности и перспективы их использования.

Культура изолированных клеток и тканей в селекции и генетической инженерии растений. Общая характеристика технологий на основе культивируемых растительных клеток, применяемых в селекции и генетике растений.

Использование метода эмбриокультуры для преодоления in vitro прогамной и постгамной несовместимости при скрещивании таксономически отдаленных партнеров. Культивирование незрелых гибридных зародышей. Экспериментальная гаплоидия. Основные преимущества и направления использования гаплоидов в генетической и селекционной работах. Сомаклональная вариабельность растительных клеток и ее использование в биотехнологии. Мутагенез и клеточная селекция растений в культуре in vitro. Гибридизация соматических клеток (межвидовая и межродовая) и ее роль в селекционном процессе. Цибридизация. Перенос клеточных органелл.

Генететическая трансформация растений. Основные направления в создании трансгенных растений. Общие принципы разработки конструкций для генетической трансформации растений. Характеристика методов введения чужеродного генетического материала в растительные клетки.

Генетическая трансформация растений in vitro с помощью Agrobacterium spp. Баллистический метод генетической трансформации растений.

Использование культур растительных клеток для сохранение генофонда высших растений. Необходимость и проблемы сохранения генофонда растений. Особенности методов сохранения растительных культур in vitro. Характеристика пересадочных коллекций. Депонирование культур клеток, тканей и органов растений. Основные этапы технологии криоконсервации растительных объектов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Биотехнология растений: культура клеток. М. : Агропромиздат, 1989.

2. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. М. : ФБК–ПРЕСС, 1999. 160 с.

3. Валиханова, Г. Ж. Биотехнология растений / Г.Ж. Валиханова. Алматы : «Конжык», 1996. 272 с.

4. Егорова, Т. А. Основы биотехнологии: учеб. пособие / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. М. : Изд. Центр «Академия», 2003.

5. Калинин, Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наукова думка, 1980. 356 с.

6. Картель, Н. А. Биотехнология в растениеводстве: учебник / Н.А. Картель, А.В. Кильчевский. Мн.: Технология, 2005. 310 с.

7. Муромцев, Г. С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. М.:

Агропромиздат, 1990. 384 с.

8. Першина, Л. А. Культивирование изолированных клеток и тканей высших растений: учеб. пособие. Ч. 1. / Л.А. Першина. Новосибирск :

НГУ, 2000. 46 с.

9. Шевелуха, В. С. Сельскохозяйственная биотехнология: учебник / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин [и др.]. М.: Высш.

шк., 2003. 469 с.

10. Endreb R. Plant Cell Biotechnology. / R. Endreb. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1994. 353 p.

1. Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1987. 302 с.

2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М. : Мир, 2002. 589 с.

3. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции и биотехнологии. Т. 1–2. М. : Агропромиздат, 1990.

РАЗДЕЛ II

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Тема 1. ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ

КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ НА ИСКУССТВЕННЫХ

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Приготовление питательных сред для культивирования Компоненты питательной среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов:

макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, регуляторы роста.

Основой всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимые соли К+, Na+, Са2+, Мg2+.

Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

В качестве источника углерода при выращивании гетеротрофных культур (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20–60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом или другими полисахаридами.

Для стимуляции биохимических реакций в культивируемых клетках используют витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Для индукции каллусогенеза в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины (вызывающие клеточную дедифференцировку) и цитокинины (индуцирующие деление дедифференцированных клеток). В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов может быть снижено или они могут быть полностью исключены. На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» ткани. Автономность по отношению к обоим классам гормонов или к одному из них связана со способностью этих клеток продуцировать гормоны.

В качестве ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) в концентрациях 0,1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л. Для индукции каллуса обычно необходимы высокие концентрации ауксинов (чаще это 2,4-Д), но при последующих пересадках их уменьшают.

В качестве цитокининов искусственные питательные среды могут содержать кинетин, бензиламинопурин (БАП), зеатин в концентрациях 0,001-10 мг/л. БАП и зеатин более активны по сравнению с кинетином в отношении поддержания роста изолированных тканей и индукции органогенеза.

Кроме ауксинов и цитокининов, отдельные питательные среды включают гибберелловую кислоту (ГК). Присутствие ГК в среде не является обязательным, но в некоторых случаях она стимулирует рост изолированной ткани.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин, а также соединения с цитокининовой активностью (NN-дифенилмочевину).

Для культивирования растительных клеток и тканей in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. Обычно к среде добавляют 0,7-0,8 % агара. Иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели).

Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, ШенкаХильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4 оС.

Витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты лучше хранить при -20 оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками. Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточный раствор хелата железа готовят и хранят отдельно от других солей. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция и магния.

Концентрированные растворы витаминов готовят каждый отдельно путем растворения соответствующих навесок в дистиллированной воде.

Фитогормоны, как правило, плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 10 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-1 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCI или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 10 мл объема (1 мл содержит 1 мг гормона). В холодильнике их можно хранить при температуре 4 С не более 1 мес.

Цель работы – на основе маточных растворов макросолей, микросолей, витаминов приготовить питательную среду Мурасиге-Скуга.

Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 10 мл до 1 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитка, магнитная мешалка, маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, мезоинозит, глицин, сахароза, агар-агар.

Протокол приготовления питательной среды:

1. Для приготовления 1 л жидкой среды в стакан объемом 1 л помещают 30 г сахарозы, доливают дистиллированной водой примерно до 400 мл.

2. После растворения сахарозы добавляют необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей, мезоинозита, глицина, витаминов (таблица).

Cостав Молярность в Концентрация Объем храня- Условия кислота 3. Дистиллированной водой доводят объем до 950 мл.

4. Измеряют рН раствора. С помощью 0,1 н NaOH или НСI доводят его до уровня 5,7–5,8.

5. Переносят среду в мерный цилиндр или колбу объемом 1 л и доводят объем до метки дистиллированной водой.

6. Разливают среду порциями (100–250 мл) в чистые конические колбы, добавляют агар, закрывают сверху алюминиевой фольгой и автоклавируют.

Контрольные вопросы.

1. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какие функции они выполняют в культуре клеток и тканей растений in vitro?

2. Каковы особенности приготовления и хранения маточных растворов основных компонентов питательных сред?

3. В чем заключается порядок приготовления культуральных сред?

Методы стерилизации при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений Одним из условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов растений является соблюдение строгой стерильности, поскольку на искусственных питательных средах хорошо развиваются микроорганизмы, что представляет двойную опасность. Во-первых, в результате жизнедеятельности микроорганизмов может существенно измениться состав питательных сред, во-вторых, изолированные от растения ткани, клетки и в особенности протопласты легко повреждаются микроорганизмами. Поэтому все опыты проводят в стерильных условиях – ламинар-боксах. Стерилизации подвергается ламинар-бокс, инструменты, посуда, питательные среды, растительный материал.

Стерилизация ламинар-бокса. Ламинар-боксы предназначены для культуры изолированных клеток, тканей и некоторых других работ, требующих стерильности. Стерильность обеспечивается с помощью бактериальных фильтров, установленных в ламинар-боксе, через которые нагнетается воздух. За 20 мин до начала работы внутренний объем ламинар-бокса облучают ультрафиолетовыми лампами. Предварительно в ламинаре размещают спиртовую горелку, фарфоровый стакан с 96 %-ным спиртом, колбы либо пробирки с питательной средой, которые протирают 70 %-ным спиртом. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат, руки обрабатываю 70 %-ным спиртом.

Стерилизация посуды. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов либо раствора двухромовокислого калия в серной кислоте. Вымытую посуду ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают в оберточную бумагу (у стаканов и колб достаточно обернуть алюминиевой фольгой только горлышко). Затем посуду помещают в сушильный шкаф и прогревают при 160 С в течение 2 ч (с момента установки нужной температуры). За это время погибают не только бактерии, но и их споры. Еще более строгой стерилизации можно добиться под давлением в автоклаве, поскольку влажный жар более губителен для микроорганизмов и спор. Автоклавирование проводят под давлением 2 атм в течение 25-30 мин.

Стерилизация инструментов. Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и т.д.) заключается в нагревании сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 ч при 140 С. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под действием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в ее процессе инструменты (пинцеты, скальпели, микробиологические петли) еще раз стерилизуют в ламинар-боксе, помещая их в фарфоровый стакан с 96 %ным этиловым спиртом и обжигая в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Перед повторным употреблением его следует снова простерилизовать спиртом и обжечь.

Стерилизация питательных сред. Питательные среды, не содержащие термолабильные компоненты, стерилизуют автоклавированием либо путем двукратного кипячения с интервалом в одни сутки. Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм.

Стерилизация растительного материала. Процесс получения стерильного растительного материала (свободного от эпифитных и ризосферных микроорганизмов) состоит из нескольких этапов.

Первый этап – предварительная стерилизация. Условия обработки материала варьируют в зависимости от объекта. Хранящиеся органы (например, клубни картофеля) промывают тщательно водопроводной водой, фрагменты стебля, корня или листа также промывают проточной водопроводной водой и помещают в спирт (70 %-ный раствор на 1 мин).

Предварительная стерилизация семян – более длительная процедура, зависящая от степени их загрязненности. Выделяют три группы семян: 1 – с очень незначительной зараженностью поверхности микроорганизмами, 2 – с зараженностью только наружной поверхности семян, 3 – с присутствием микроорганизмов на поверхности и внутри семени.

Первую группу легко обеззаразить любой стерилизующей обработкой. Чаще всего это семена пшеницы, сорго, капусты. Вторая группа требует более тщательной поверхностной очистки. Семена промывают в мыльной воде, в растворе KМnO4, 70 %-ном спирте; некоторые семена обрабатывают гипохлоритом натрия или кальция с последующей отмывкой стерильной водой. Эта группа включает латук, шпинат, редис, томат, кукурузу, морковь и т.п. Наконец, третья группа не может быть очищена до тех пор, пока внутренние ткани не будут обеззаражены. Это семена риса, подсолнечника, соевых бобов, сосны и некоторые другие. Процент семян с внутренним заражением микроорганизмами варьирует в зависимости от вида растения, продолжительности и условий хранения семян.

Второй этап – стерилизация. Предварительно простерилизованные ткани или органы погружают в стерилизующий раствор. Все процедуры, связанные с использованием стерилизующих веществ, проводят в асептических условиях (ламинар-боксе). Стерилизующий агент и продолжительность его воздействия подбирают в зависимости от объекта. При этом важно не только обеспечить достаточную степень чистоты растительного материала, но и сохранить его жизнеспособность. Одним из наиболее безвредных и эффективных агентов считается гипохлорит кальция или натрия (обычно используют растворы, в которых концентрация активного хлора составляет 0,5-1 %). Наряду с ними применяют также 2-10 %-ные растворы хлорамина; 0,1-1 %-ные растворы сулемы;

5 %-ный раствор формалина; 10 %-ный раствор CuSO4; 5 %-ный раствор фенола; 13–18 %-ные растворы перекиси водорода; 70 %-ный раствор этанола и т.п. Для стерилизации можно также использовать хлорсодержащие растворы отбеливателей, например, средство Белизна» (разведение 1:2, 1:3) или дезинфицирующее средство «Domestos». Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (например, ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин в концентрациях 10-80 мг/л, ампициллин – 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.

Третий этап – отмывание объекта от стерилизующего раствора (постстерилизация). При этом растительный материал промывают 3- порциями стерильной дистиллированной воды, выдерживая его в каждой порции в течение 10-15 мин.

Цель работы – освоить правила поддержания асептики при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений, получить стерильные семена пшеницы или моркови и вырастить из них асептические растения.

Материалы и оборудование. Семена моркови и пшеницы, ламинар-бокс, сушильный шкаф, пробирки с питательной средой МС, пинцеты, скальпели, флаконы с 96 % спиртом и 70 % спиртом, спиртовка, стерильная вата, колбы объемом 200- мл, чашки Петри, стаканчики на 100 мл, дистиллированная вода, гипохлорит натрия, хлорамин, дезинфицирующее средство «Domestos».

Задание 1. Простерилизовать инструменты, посуду и питательные среды, необходимые для проведения работ по выращиванию стерильных проростков.

1. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов, промыть 8- раз проточной водой. При необходимости поместить на несколько часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной водой.

2. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 1 час при температуре 100-130 С.

3. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, либо завернуть в бумагу.

4. Металлические инструменты, а также чашки Петри, завернутые в плотную бумагу, поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при температуре 160 С в течение 2 часов.

5. Штативы с пробирками или колбы, заполненные питательной средой, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой), вату марлю завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав, автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 0,5 атм.

6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

Задание 2. Освоить технику работы в ламинар-боксе.

Перед началом работы поместить в ламинар-бокс инструменты, посуду и материалы, необходимые для работы. Включить УФ-лампу. Через 20 минут выключить УФ и включить биофильтры. Зажечь спиртовку.

Протереть руки и рабочую поверхность ламинар-бокса 70 %-ным раствором спирта.

При работе со стерильной посудой и материалом необходимо помнить о том, что нельзя проносить руки над открытой стерильной поверхностью. Колбы и другие сосуды, закрытые крышками из фольги и бумаги, необходимо открывать следующим образом: бумагу снимают до внесения колбы в ламинар-бокс. Фольгу обжигают, пронося горло сосуда над пламенем спиртовки, затем осторожно разворачивают края фольги с помощью стерильного пинцета и снимают ее. Закончив работу, закрывают сосуд: обжигают горло сосуда, стерильным пинцетом берут крышку из фольги, обжигают с двух сторон и закрывают горло колбы. Когда фольга остынет, прижимают ее плотно к горлу сосуда. После этого сосуд можно вынести из ламинар-бокса, сверху покрыть фольгу бумагой.

Задание 3. Провести стерилизацию семян для получения асептических проростков.

Семена моркови, а также пшеницы промыть мыльной водой; воду слить, а семена поместить в светло-розовый раствор KМnO4. Через мин слить раствор и залить семена 70%-ным этанолом на 1 мин. Все последующие процедуры проводят в ламинар-боксе.

Предварительно простерилизованные семена поместить в стаканчики, содержащие по 30 мл различных стерилизующих растворов (3 % -ного гипохлорита натрия, 10 %-ного хлорамина, дезинфицирующего средства «Domestos» разведение 1:2). Продолжительность стерилизации – 15 мин.

По истечении указанного времени слить стерилизующие растворы, налить в стаканчики немного стерильной воды. Затем слить воду и налить новую ее порцию. Промывание водой продолжается в течение 1 ч со сменой через каждые 15 мин.

Проращивание семян может осуществляться двумя способами:

1. Семена прорастают на питательной среде, где затем продолжают свой рост. В этом случае работу выполняют следующим образом. Пинцет прокалить в пламени спиртовки, остудить и с его помощью перенести по 4–5 штук стерильных семян в пробирки, содержащие агаризованную среду МС без гормонов. Стерильно закрыть пробирки алюминиевой фольгой. Пробирки с семенами поместить в термостат при температуре 25 С. Через 4–6 суток проверить чистоту посева и всхожесть семян. После прорастания семян перенести пробирки в условия фитостата с освещением 1000 лк и комнатной температурой.

2. Семена проращивают на фильтровальной бумаге, смоченной водой, затем их переносят на питательную среду. Для этого необходимо смочить стерильной водой фильтровальную бумагу в стерильной чашке Петри, затем прокаленной и остуженной лопаткой перенести семена в чашку, разместить их более-менее равномерно, закрыть чашку и герметизировать ее клейкой лентой для уменьшения испарения. Чашку с семенами поместить в термостат при температуре 25 С. Через 4–5 сут после прорастания перенести семена стерильным пинцетом в пробирки с агаризованной питательной средой МС без гормонов и поместить в фитостат.

Второй способ дает возможность выращивать в пробирке 1-2 растения, обеспечивая их нормальное питание, однако дополнительные операции по проращиванию семян и пересадке растений увеличивают вероятность заражения.

Сравнить эффективность разных способов стерилизации и проращивания семян. Определить процент инфицирования в результате неудовлетворительной стерилизации и процент прорастания семян.

Результаты оформить в виде таблицы.

Сделать вывод об эффективности использованных в работе стерилизующих агентов и эффективности разных способов проращивания семян.

Контрольные вопросы.

1. Каким образом осуществляется стерилизация посуды и инструментов для работы с растительными объектами в условиях in vitro?

2. Перечислите способы стерилизации питательных сред, содержащих и не содержащих термолабильные компоненты.

3. Каким образом осуществляется подготовка к работе ламинар-бокса?

4. Назовите основные правила работы в условиях ламинар-бокса.

5. Охарактеризуйте основные этапы проведения стерилизации растительных объектов.

Получение каллусной ткани табака и ее субкультивирование Культура каллусных тканей – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов растений. Образование и рост каллусной ткани контролируются фитогормонами из группы ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов происходит дедифференцировка, а под влиянием цитокининов – интенсивное деление, в результате которого образуется каллус. Каллусную культуру можно инициировать из разных частей растения: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей и др. Такие фрагменты называются эксплантами.

Табак – классический объект для получения каллусных тканей и дальнейших ее исследований. Клетки табака легко дедифференцируются и переходят к делению, образуя быстрорастущую каллусную ткань. При получении каллусов из листовых эксплантов табака наиболее активное каллусообразование наблюдается у основания листьев, особенно в зоне, примыкающей к средней жилке.

Кривая роста каллусной ткани, также как и суспензионной культуры имеет S-образный характер. Она состоит из следующих фаз: начальной (лаг-фазы), логарифмического роста, во время которой идет активное деление клеток, замедление роста, стационарной и деградации. Для того чтобы сохранить способность к делению и дальнейшему росту, кусочек каллусной ткани переносят на свежую питательную среду. Этот прием носит название пассирования или субкультивирования тканей. Пассировать ткань можно неограниченное число раз. Однако при многократном его повторении возможно «привыкание», которое выражается в приобретении автономности по отношению к гормонам и утрате или к значительному ослаблению способности каллусных клеток к регенерации целого растения.

Цель работы – освоить технику получения каллусных тканей и их субкультивирования.

Материалы и оборудование. Асептические растения табака, каллусная культура табака, стерильные чашки Петри, скальпель, пинцет, ножницы, спиртовка, спички, флаконы с 96%-ным и 70%-ным этанолом, чашки Петри со стерильной питательной средой МС, содержащей 2,4-Д (2 мг/л) и кинетин (0,2 мг/л) или ИУК (2 мг/л) и кинетин (0,2 мг/л), стерильная вода.

В условиях ламинар-бокса необходимо с помощью стерильных ножниц отпрепарировать листья асептического растения табака и поместить их в стерильную чашку Петри. Для предотвращения подвядания листьев при последующей изоляции эксплантов рекомендуется добавить в чашку Петри небольшое количество стерильной воды. Простерилизованным скальпелем вырезать фрагменты у основания листьев, прилегающие к средней жилке, длиной 1,5-2 см, шириной 1 см. Для лучшего каллусообразования сделать надсечки (поранения) по всей поверхности листовых сегментов. Перенести подготовленные листовые экспланты в чашки Петри с питательными средами, содержащими в качестве ауксина 2,4-Д или ИУК. Чашки Петри запечатать парафилмом и поместить их в термостат при температуре 24,5 С. Через 4 недели рассмотреть результаты, сравнивая каллус, полученный на среде с 2,4-Д и на среде с ИУК. Результаты записать и зарисовать в тетради.

2. Для пересадки первичного каллуса или поддержания культуры используют лопатку или скальпель, с помощью которых в чашке Петри необходимо отделить старые некротизированные участки. Затем разделить каллусную ткань на равные кусочки размером 1,51,5 см и перенести их в чашки Петри со свежей питательной средой, соблюдая строгую стерильность. В каждую чашку поместить 5-7 кусочков каллуса.

Чашки Петри заклеить парафилмом или пищевой пленкой и поместить в термостат при температуре 24,5 С на 3-4 недели. В конце этого срока провести наблюдения и зарисовать чашки Петри с каллусной тканью.

Контрольные вопросы.

1. Дайте определение понятия «каллусная ткань»?

2. Перечислите основные факторы необходимые для индукции процесса каллусогенеза?

3. Что такое дедифференциация? Какую роль играют ауксины и цитокинины в данном процессе?

4. Какое из соединений с ауксиновой активностью 2,4-Д или ИУК в большей степени способствует образованию каллуса?

5. Чем обусловлена необходимость пассирования каллусной культуры на свежую питательную среду?

6. С какой частотой обычно осуществляется субкультиврование каллусов?

7. Какие правила необходимо соблюдать при пересадке каллусной ткани на свежую питательную среду?

Определение морфологических и ростовых показателей Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают рыхлые с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.

Рост каллусных культур можно охарактеризовать с помощью следующих показателей: индекс роста, удельная скорость и время удвоения биомассы.

Индекс роста определяют по формуле:

где Wo – начальная масса каллуса, г;

Wt – масса каллуса в конце цикла выращивания, г.

Удельная скорость роста определяется согласно выражению:

где t – продолжительность культивирования, сут.

Время удвоения биомассы рассчитывают по формуле:

Цель работы – охарактеризовать каллусные культуры разных видов растений по морфологическим признакам и показателям роста.

Материалы и оборудование. Каллусные культуры разных видов растений в конце цикла выращивания, для которых известна начальная масса каллусов, весы, скальпель, пинцет.

Задание 1. Охарактеризовать каллусные культуры различных видов растений с учетом таких признаков как цвет, возраст, плотность. Результаты представить в виде таблицы.

Проанализировать взаимосвязь между плотностью каллусов и продолжительностью их субкультивирования.

Задание 2. Произвести учет показателей роста каллусных культур.

Для этого необходимо определить массу каллусов в конце цикла выращивания. На основании имеющихся данных о начальной и конечной массе каллусных тканей произвести расчет индекса роста, удельной скорости роста и времени удвоения биомассы. Результаты оформить в виде таблицы.

Сделать вывод о скорости ростовых процессов разных каллусных культур.

Контрольные вопросы.

1. Как определяется индекс роста, удельная скорость роста и время удвоения биомассы каллусных культур?

2. Какие преимущества имеет использование удельной скорости роста для характеристики ростовой активности каллусных тканей по сравнению с учетом индекса роста?

3. Как взаимосвязаны удельная скорость роста и время удвоения биомассы каллусов?

Тема 3. КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ Получение и субкультивирование суспензионной культуры Суспензионные культуры получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, и выращивают в колбах на качалке (100-120 оборотов в минуту). Рекомендуется использовать жизнеспособную, интенсивно пролиферирующую каллусную культуру, которая легко распадаться на небольшие клеточные агрегаты и отдельные клетки.

Максимальный объем инокулята (критическая концентрация клеток в суспензии), обеспечивающий клеточное размножение в суспензии, обычно составляет 10-20 % от общего объема суспензии в начале культивирования. Повышенные количества инокулята приводят к угнетению роста клеточной популяции вследствие недостатка кислорода и накопления в среде токсических продуктов метаболизма.

Длительность первого цикла выращивания суспензии обычно равна 15-20 дней в зависимости от вида растения, из которого она была получена, состава среды, скорости вращения качалки. В течение этого времени часть клеток отмирает, происходит дезагрегация каллуса и интенсивное деление живых клеток. Последующие циклы сокращаются до 2 недель. Суспензию надо пересаживать после появления на стенках колбы ободка из живых клеток.

Цель работы – освоить технику инициирования суспензионной культуры из каллусной ткани рыхлого типа и произвести субкультивирование клеточной суспензии на свежую питательную среду.

Материалы и оборудование: рыхлая каллусная ткань табака, суспензионная культура табака в стационарной фазе роста, ламинар-бокс, стерильные колбы с жидкой средой MС, содержащей ИУК (3 мг/л), 2,4-Д (0,04 мг/л) и кинетин (0,008 мг/л), скальпель, пинцет, стерильные стаканы объемом 50-100 мл, воронка, сито с диаметром пор 500 мкм.

Работу проводят в асептических условиях. Для получения первичной суспензии кусочки каллуса перености прокаленной и остуженной лопаткой в колбу с жидкой средой MС: 3-5 г ткани на 50-100 мл среды. Необходимо использовать только молодой, активно растущий, светлый каллус, отбрасывая побуревшие старые участки. Объем суспензии должен составлять 10-20 % объема колбы (например, в колбу объемом 500 мл наливают 50-100 мл среды).

Колбу после переноса каллуса закрыть предварительно обожженной крышкой из фольги, а сверху крышкой из целлофана или бумаги, подписать и поместить на качалку со скоростью перемешивания 120 об/мин в термостат с температурой 24,5 С. Если в течение первых нескольких суток среда становится мутной, это признак бактериального заражения во время инокуляции.

Пересев суспензии можно осуществлять одним из следующих способов:

1. Дать отстояться суспензии 1-2 мин, чтобы осели крупные агрегаты, и отлить 5-10 мл в колбу со свежей средой.

2. Поставить суспензию на 1-2 мин. Стерильной пипеткой взять несколько миллилитров суспензии из верхней части ее объема и перенести в колбу со свежей питательной средой.

3. Профильтровать суспензию через сито с диаметром пор 500 мкм либо нейлоновый фильтр. После оседания клеток слить надосадочную жидкость, а к оставшейся суспензии добавить свежую питательную среду.

Пересадив суспензию одним из перечисленных способов, обжечь горлышко колбы, закрыть ее предварительно обожженной фольгой, а сверху бумагой или целлофаном и поставить колбу на качалку до следующей пересадки.

Контрольные вопросы.

1. Назовите основные способы получения суспензионных культур.

2. Какие требования предъявляются к каллусным тканям, используемым для инициирования суспензионных культур растительных клеток?

3. Какова средняя продолжительность ростового цикла суспензионных культур?

4. Каким образом осуществляется субкультивирование клеточных суспензий?

Оценка жизнеспособности клеток и степени агрегированности При работе с суспензиями необходимо учитывать ее жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы, по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности ферментов и др. Прижизненные красители, такие как метиленовый синий, клетки не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились. При определении жизнеспособности клеток с помощью нейтрального красного происходит окрашивание живых клеток в розовый цвет. Мертвые клетки при этом имеют оранжевую окраску аналогично фону среды, к которой предварительно добавляют небольшое количество слабого раствора щелочи.

Для количественного определения жизнеспособности суспензии используют вещества, участвующие в метаболизме клетки: флуоресцеиндиацетат расщепляется в клетке эстеразами с образованием флуоресцеина, дающего флуоресценцию цитоплазмы живых клеток. Активность эстеразы определяют на спектрофотометре. Окрашивание клетки солями тетразоля позволяет определить интенсивность дыхания клетки.

В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты. Степень агрегированности определяют, подсчитывая клетки в нескольких полях зрения на временных препаратах под малым увеличением микроскопа (не менее 1000 клеток).

Цель работы – определить жизнеспособность клеток и степень агрегированности суспензионных культур.

Материалы и оборудование: суспензионная культура табака, 0,1 % -ный раствор метиленового синего или нейтрального красного, пипетка, стеклянная палочка, камера Горяева, микроскоп.

Приготовить препарат суспензии: встряхнуть суспензию в колбе, пипеткой отобрать небольшое ее количество, поместить каплю суспензии в счетную камеру, добавить каплю красителя, накрыть покровным стеклом, излишки жидкости убрать фильтровальной бумагой. Поместить препарат на столик микроскопа под малое увеличение объектива и подсчитать клетки и агрегаты в 3-х полях зрения (просмотреть не менее трех препаратов). Результаты записать в таблицу.

одиночные клетки мелкие агрегаты (2-5 клеток) средние агрегаты (6-20 клеток) крупные агрегаты (21-50 клеток) очень крупные агрегаты (более 50 клеток) Примечание: о – окрашенные клетки и агрегаты, Один препарат зарисовать, описать морфологию клеток суспензии (форму, величину). Сделать вывод о степени агрегированности суспензии (какие фракции преобладают, %) и жизнеспособности суспензии.

Контрольные вопросы.

1. Каким образом можно определить жизнеспособности растительных клеток?

2. Назовите типы суспензионных культур в зависимости от степени их агрегированности.

3. Какие факторы оказывают влияние на степень агрегированности суспензионных культур?

Тема 4. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

РАСТЕНИЙ

Влияние фитогормонов на направление морфогенеза в культуре Существуют различные типы морфогенеза: соматический эмбриогенез и органогенез, который, в свою очередь, подразделяется на стеблевой, корневой и флоральный. При соматическом эмбриогенезе из каллусных клеток формируются биполярные зародышеподобные структуры, у которых развиваются стебелек и корешок. В случае стеблевого органогенеза образовавшийся побег пересаживают на среду с повышенным содержанием ауксинов. Если же морфогенез пошел по типу корневого органогенеза, то получить из корней побеги не удается.

Индуцировать морфогенез в культуре каллусной ткани можно с помощью различных факторов: света, температуры, состава питательной среды, и в первую очередь – изменения соотношения фитогормонов. В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило СкугаМиллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

Каллусы с высоким морфогенетическим потенциалом обычно матовые, компактные, структурированные, имеют зеленые хлорофиллсодержащие участки, которые представляют собой зоны морфогенеза. Впоследствии там формируются побеги или растения-регенеранты. Рыхлые каллусы либо совсем не способны к органогенезу, либо формируют только корни. Появление корней свидетельствует о сдвиге гормонального баланса в сторону ауксинов, что препятствует образованию побегов.

Цель работы – изучить влияние разных соотношений ауксинов и цитокининов в питательной среде на направление морфогенеза в культуре клеток табака.

Материалы и оборудование: асептически выращенные растения и каллусная культура табака, ламинар-бокс, стерильные чашки Петри с питательными средами MC, содержащими ИУК (2 мг/л) и БАП (0,1 мг/л), а также ИУК (0,1 мг/л) и БАП (2, мг/л), пинцеты, скальпели, флаконы с 96 % и 70 % спиртом, спиртовка, стерильная вата.

Работа проводится в асептических условиях. Производят изоляцию эксплантов из листьев стерильных растений табака и асептически переносят их на чашки Петри с агаризованными средами MС, различающимися по содержанию ауксинов и цитокининов. Аналогичные варианты питательных сред также используют для субкультивирования каллусных тканей табака, различающихся по возрасту.

Чашки Петри заклеивают, подписывают и помещают в термостат, в котором поддерживается температура 24,5 С, инкубируют в течение 4- недель. По истечении указанного времени проводят анализ различных морфогенетических реакций, обусловленных разным соотношением гормонов с ауксиновой и цитокининовой активностью в питательной среде.

Результаты оформить в виде таблицы.

ИУК БАП

Сделать вывод о влиянии фитогормонов на направление морфогенеза в культуре клеток табака, а также морфогенетической способности каллусных тканей в зависимости от продолжительности культивирования.

Контрольные вопросы.

1. Назовите основные типы дифференцировки в культуре клеток растений.

2. Какие факторы оказывают влияние на направление морфогенеза в культуре клеток и тканей растений?

3. Каково значение процессов стеблевого органогенеза и ризогенеза для регенерации растений in vitro?

МЕТОДИЧЕСКАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Кузьмина, Н. А. Основы биотехнологии: учебное пособие для студентов биологического факультета / Н.А. Кузьмина. www.biotechnolog.ru 2. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания / под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Издво МСХА, 1996. 90 с.

3. Мокроносов, А. Т. Малый практикум по физиологии растений: Учеб.

пособие / А.Т. Мокроносов. М.: Изд-во МГУ, 1994. 184 с.

4. Сорокина, И. К. Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие / И.К. Сорокина, Н.И. Старичкова, Т.Б. Решетникова, Н.А. Гринь. 2002. 45 с.

РАЗДЕЛ III

КОНТРОЛЬ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

СТУДЕНТОВ

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КЛЕТОК

И ТКАНЕЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1. Культура клеток как модель для исследования физиологических процессов растений.

2. История развития методов культивирования растительных объектов in vitro.

3. Применение регуляторов роста для выращивания культур растительных клеток и тканей in vitro.

4. Физиолого-биохимические механизмы влияния экзогенных факторов на изолированные клетки, ткани и органы растений.

5. Морфологические, физиологические, биохимические и генетические характеристики каллусов.

6. Питательные среды и физические факторы культивирования каллусных тканей.

7. Морфологические, физиологические, биохимические и генетические характеристики суспензионных культур растительных клеток.

8. Физиолого-биохимические характеристики культивируемых растительных клеток на разных фазах ростового цикла.

9. Изолированные протопласты растений - объект и модель для физиологических исследований.

10. Использование изолированных протопластов в фундаментальных исследованиях и биотехнологии.

11. Основные подходы и условия культивирования in vitro одиночных растительных клеток.

12. Практические аспекты использования культур гаплоидных клеток.

13. Метод культуры пыльников: питательные среды и физические факторы культивирования.

14. Метод культуры пыльцы: питательные среды и физические факторы культивирования.

15. Получение гаплоидных растений методами гиногенеза in vitro.

1. Какие компоненты питательных сред нельзя стерилизовать автоклавированием?

А) 1, 2, 5. Б) 2, 3, 6. В) 3, 4, 5. Г) 2, 4, 5. Д) 2, 3, 5. Е) 3, 5, 6.

2. После использования какого из стерилизующих агентов не требуется тщательного промывания растительных тканей стерильной дистиллированной водой?

3. Для какого из указанных растительных объектов продолжительность инкубации в растворе одного и того же стерилизующего агента должна быть наименьшей?

4. Какое из перечисленных соединений с ауксиновой активностью легко окисляется под действием специфической оксидазы, содержащейся в тканях экспланта, вследствие чего инактивируется?

5. Какое из перечисленных соединений не относится к природным ауксинам?

А) индолил-3-ацетальдгид;

Б) индолил-3-пировиноградная кислота;

Г) фенилуксусная кислота;

Д) нафтилуксуная кислота;

Е) 4-хлориндолил-3-уксусная кислота.

6. Расположите указанные соединения с ауксиновой активностью в порядке ее возрастания:

А) 2, 1, 3. Б) 3, 1, 2. В) 1, 2, 3. Г) 2, 3, 1. Д) 3, 2, 1. Е) 1, 3, 2.

7. В каких пределах должен лежать рН питательных сред для культивирования растительных объектов in vitro до автоклавирования?

8. Культивирование каких растительных объектов in vitro может осуществляться с участием абсцизовой кислоты?

А) каллусных культур;

Б) суспензионных культур;

В) одиночных клеток;

Г) гаплоидных клеток;

Д) культуры протопластов;

Е) все ответы верны.

9. Выберите неправильные утверждения:

1) в ходе дедифференциации в клетках экспланта накапливаются запасные питательные вещества;

2) при дедифференцировке происходят изменения в активности генов и белковом аппарате растительных клеток;

3) в клетках растений существует двойной гормональный контроль деления;

4) ауксины необходимы для перехода клеток из G2-фазы к митозу;

5) если в питательной среде присутствуют только ауксины, то растительные клетки не делятся, а начинают расти растяжением;

6) для индукции каллусогенеза требуются гораздо более низкие концентрации ауксинов, чем для поддержания дальнейшего роста полученных каллусных культур.

А) 1, 3, 5. Б) 1, 4, 6. В) 2, 4, 5. Г) 2, 5, 6. Д) 3, 5, 6. Е) 4, 5, 6.

10. Выберите правильное утверждение:

А) первичный каллус, как правило, относится к каллусам рыхлого Б) для получения плотных каллусов необходимо использовать каллусы рыхлого типа;

В) для того, чтобы «разрыхлить» каллус необходимо повысить концентрацию Са2+ в питательной среде;

Г) темная окраска каллусов свидетельствует об их высоком биосинтетическом потенциале;

Д) плотные каллусы могут содержать зоны с трахеиподобными Е) гетерогенность каллусов по клеточному составу не связана с гетерогенностью исходного экспланта.

11. «Привыкшие» ткани – это …….:

А) каллусные культуры, прекратившие свой рост;

Б) каллусные ткани, из которых невозможно инициировать суспензионную культуру;

В) каллусные ткани, которые не способны давать нормальный органогенез;

Г) каллусные ткани, которые способны расти на средах без сахарозы;

Д) гормоннезависимые каллусные ткани;

Е) каллусные культуры, которые имеют миксотрофный способ 12. Чему равны индекс роста и удельная скорость роста каллусной культуры, если масса каллуса в начале цикла ивыращивания равна 2 г, в конце – 10 г, а продолжительность культивирования составляет 13. Выберите правильное утверждение относительно суспензионных культур:

А) существенно отличаются по своим питательным потребностям Б) характеризуются более высокими скоростями роста по сравнению с каллусными культурами;

В) являются гормононезависимыми;

Г) имеют более продолжительный ростовой цикл;

Д) клетки не способны переходить к дифференцировке;

Е) состоят из одиночных клеток, выращиваемых в жидкой питательной среде во взвешенном состоянии.

14. Какой из способов культивирования основан на принципе отбора определенной части клеточной суспензии через определенные интервалы времени и разбавления оставшейся части свежей средой?

А) накопительное культивирование;

Б) непрерывное культивирование в открытом проточном режиме;

В) непрерывное культивирование в закрытом проточном режиме;

Г) непрерывное культивирование в полупроточном режиме;

Д) культивирование в режиме турбидостата;

Е) культивирование в хемостатном режиме.

15. Какую роль играет «фактор кондиционирования»?

А) способствует реализации клеточной тотипотентности;

Б) стимулирует процессы получения гаплоидных растений путем андрогенеза и гиногенеза;

В) увеличивает скорость роста суспензионной культуры;

Г) индуцирует деление одиночной клетки;

Д) повышает синтез биологически активных соединений культивируемыми клетками;

Е) служит в качестве альтернативного источника сахарозы в питательной среде.

16. Укажите основное направление использования культур одиночных клеток:

А) получение протопластов;

Б) изучение механизмов соматического эмбриогенеза;

В) анализ генетической и физиологической стабильности при выращивании клонового материала;

Д) оздоровление растений.

17. Выберите неправильные утверждения относительно условий получения и культивирования протопластов:

1) рекомендуется использовать в качестве доноров растений, выращенных в условиях низкой освещенности;

2) необходимо вводить в среду выделения и культивирования осмотический стабилизатор;

3) свет высокой интенсивности способствует повышению выхода жизнеспособных протопластов;

4) растения с бутонами наиболее пригодны для получения протопластов;

5) изолированные протопласты гораздо более чувствительны к колебаниям температуры, чем интактные клетки;

6) по питательным потребностям изолированные протопласты 18. Какие из перечисленных соединений используются в качестве индукторов слияния протопластов?

А) 1, 2, 3. Б) 1, 3, 4. В) 1, 4, 5. Г) 3, 5, 6. Д) 2, 5, 6. Е) 1, 3, 5.

19. Какие факторы способствуют повышению эффективности процесса андрогенеза?

1) использование при приготовлении плотных питательных сред 2) снижение концентрации сахарозы до 1-2 %;

3) отсутствие гормонов в питательной среде;

4) добавление в состав среды активированного угля;

5) инкубация пыльников при повышенных температурах;

6) использование в качестве добавки эндосперма кокосового 20. Выберите неправильное утверждение относительно процесса гиногенеза:

А) эффективность гиногенеза повышается при обработке семяпочек холодом;

Б) гиногенетические зародыши развиваются из синергид;

В) зародышевый мешок способен к индукции спорофита на всех Г) при гиногенезе образующийся зародыш наследует только признаки материнского организма;

Д) путем гиногенеза можно получить гаплоиды у мужских стерильных растений;

Е) средняя частота образования гаплоидов при гиногенезе составляет 2 растения на 1000 семяпочек.

БИОЛОГИЯ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

IN VITRO

1. Тотипотентность и типы дифференциации растительных клеток в культуре in vitro.

2. Основные этапы дифференцировки. Компетентное и детерминированное состояния клеток.

3. Дедифференциация тканей высших растений in vitro и каллусообразование.

4. Молекулярно-биологические характеристики и биохимические маркеры дифференцировки растительных клеток in vitro.

5. Физиологические аспекты стимуляции флоэмогенеза и ксилемогенеза в культурах in vitro.

6. Первичный и адвентивный, прямой и непрямой морфогенез in vitro.

7. Морфофизиологическая характеристика ризогенеза и стеблевого органогенеза.

8. Условия индукции флорального органогенеза in vitro.

9. Регенерация растений in vitro.

10. Асинхронность и генетическая гетерогенность популяций длительно культивируемых клеток высших растений.

1. Кем впервые была выдвинута гипотеза о тотипотентности растительной клетки?

2. Что из перечисленного не относится к цитогенетическим особенностям популяций культивируемых in vitro растительных клеток?

А) асинхронность;

Б) сохранение эпигенетических особенностей растения-донора;

В) повышение генетической гетерогенности в результате мутагенного воздействия регуляторов роста;

Г) более высокая степень морфологической гетерогенности клеток суспензионных культур по сравнению с каллусными;

Д) повышение уровня плоидности клеток в результате увеличения продолжительности культивирования;

Е) увеличение продолжительности митотического цикла.

3. Выберите неправильное утверждение относительно причин нестабильности генома клеток растений in vitro:

А) генетическая гетерогенность исходных эксплантов;

Б) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения;

В) аномалии митотического цикла клеток in vitro;

Г) мутагенное действие экзогенных регуляторов роста;

Д) переход на гетеротрофный способ питания;

Е) длительное субкультивирование, приводящее к накоплению в популяции генетически измененных клеток и клонов.

4. Повышенная активность, какого фермента может быть использована в качестве маркера процесса ксилемогенеза в каллусных тканях?

Б) ксантиноксидазы, Д) фенилаланинаммиаклиазы;

В) ФЕП-карбоксилазы; Е) АЛК-синтетазы.

5. Какой тип дифференцировки может иметь место как в каллусных, так и суспензионных культурах?

В) стеблевой органогенез; Е) флоэмогенез.

6. При каких условиях наблюдается индукция образования адвентивных побегов?

1) в присутствии в питательной среде 2,4-Д в качестве ауксина;

2) при полном исключении цитокининов;

3) при высоком соотношении между цитокининами и ауксинами 4) в присутствии только цитокининов;

5) при высоком соотношении между ауксинами и цитокининами;

6) при отсутствии регуляторов роста в среде культивирования.

7. Выберите неправильное утверждение:

А) из листьев, вычлененных из зрелых растений эчеверии, развиваются только стеблевые почки;

Б) с увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек;

В) из сегментов стебля, изолированных из базальной части, формируются вегетативные почки;

Г) при действии голубым светом индуцируется побегообразование в культуре ткани топинамбура;

Д) увеличение содержания кислорода при культивировании тканей моркови приводит к образованию корней;

Е) стресс-факторы подавляют процессы морфогенеза in vitro.

8. При каком условии наблюдается стимуляция соматического эмбриогенеза в суспензионных культурах растительных клеток?

А) в присутствии в питательной среде 2,4-Д;

Б) при полном исключении цитокининов;

В) при высоком соотношении между цитокининами и ауксинами;

Г) в присутствии только цитокининов;

Д) при отсутствии регуляторов роста в среде культивирования.

9. Какие из перечисленных характеристик относятся к клеткам, находящимся в стационарной фазе роста?

1) увеличение объема цитоплазмы;

2) повышение активности дыхания;

3) активация оксидаз и гидролаз;

4) максимальный объем вакуоли;

5) максимум синтеза РНК и белка;

6) синтез ферментов, ключевых для вторичного метаболизма.

А) 1, 3, 6. Б) 2, 3, 4. В) 3, 4, 5. Г) 3, 4, 6. Д) 3, 5, 6. Е) 4, 5, 6.

10. Укажите способы синхронизации клеточных культур:

1) использование 5-оксиметилмочевины;

2) увеличение концентрации ауксинов в питательной среде;

3) исключение из среды сахарозы;

4) создание условий гипоксии;

5) добавление в питательную среду абсцизовой кислоты;

6) действие пониженных температур.

А) 1, 3, 6. Б) 2, 3, 4. В) 3, 4, 5. Г) 3, 4, 6. Д) 3, 5, 6. Е) 4, 5, 6.

БИОТЕХНОЛОГИИ НА ОСНОВЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ

1. Культура клеток и тканей как основа биотехнологии растений.

2. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения.

3. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений.

4. Конструктивные особенности биореакторов для культивирования клеток растений.

5. Преимущества и ограничения использования иммобилизованных растительных клеток в биотехнологических производствах.

6. Использование процессов биотрансформации в производствах, основанных на культивировании клеток высших растений.

7. Культуры клеток и тканей лекарственных растений и перспективы их использования в фармации.

8. Типы регенерации, используемые для клонирования растений in vitro.

9. Физиологические особенности регенерантов и необходимость в создании особых условий для их адаптации ex vitro.

10. Особенности и перспективы методов получения безвирусного посадочного материала.

11. Основные способы клеточной селекции.

12. Мутагены и их применение на клеточных культурах.

13. Виды соматических гибридов и их анализ.

14. Природа и механизмы возникновения сомаклональной изменчивости.

15. Разнообразие сомаклональных вариантов и их практическое использование.

16. Векторы переноса генетической информации у растений.

17. Экспрессия чужеродных генов и ее регуляция в трансгенных растениях.

18. Отбор трансформированных клеток и регенерация растений.

19. Конструирование трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам.

20. Конструирование трансгенных растений, устойчивых к вирусам.

21. Конструирование трансгенных растений, устойчивых к насекомым и другим вредителям.

22. Конструирование трансгенных растений, устойчивых к гербицидам.

23. Конструирование трансгенных растений, устойчивых к окислительному и солевому стрессам.

24. Конструирование трансгенных растений-продуцентов целевых белков.

25. Получение трансгенных растений с измененной пищевой ценностью.

26. Получение трансгенных растений с измененным вкусом и внешним видом плодов, окраской цветков.

27. Экологические риски применения генетически трансформированных растений.

28. Оценка риска возможных неблагоприятных эффектов генноинженерных организмов на здоровье человека.

29. Проблема сохранения генофонда высших растений и пути ее решения.

30. Криоконсервация клеток растений.

1. Выберите неправильные утверждения относительно особенностей вторичного метаболизма в культурах растительных клеток?

1) преимущественное протекание биосинтетических процессов в хлоропластах и эндоплазматическом ретикулуме;

2) эффективная секреция БАВ в среду культивирования;

3) относительно невысокое содержание вторичных метаболитов в клетках, находящихся в состоянии активного роста;

4) одинаковая биосинтетическая способность клеток как в стационарной, так и логарифмической фазах роста;

5) зависимость биосинтетической активности от степени дифференцировки клеток;

6) возможность снижения эффективности синтеза вторичных метаболитов с увеличением продолжительности культивирования.

2. Какие факторы не способствуют повышению выхода БАВ в культурах растительных клеток?

1) повышение уровня сахарозы в питательной среде;

2) снижение уровня сахарозы в питательной среде;

3) добавление в среду культивирования предшественников вторичных метаболитов;

4) уменьшение концентрации фосфатов;

5) уменьшение концентрации 2,4-Д;

6) увеличение концентрации 2,4-Д.

3. Выберите неправильное утверждение относительно хемостатного режима культивирования растительных клеток в биореакторах:

А) если скорость разбавления меньше удельной скорости роста клеток, то происходит неограниченное накопление биомассы;

Б) роль лимитирующего фактора играет один из компонентов питательной среды;

В) в стационарном состоянии удельная скорость роста культуры равна скорости подачи свежей среды;

Г) если скорость разбавления больше удельной скорости роста культуры, то происходит вымывание клеток;

Д) хемостатный режим наиболее приемлем для медленно растущих культур растительных клеток.

4. Какой из способов микроклонального размножения в наименьшей степени обеспечивает получение растений, идентичных исходному?

А) прямой соматический эмбриогенез;

Б) непрямой соматический эмбриогенез;

В) активация развития боковых почек путем снятия апикального Г) индукция возникновения адвентивных побегов непосредственно из тканей экспланта;

Д) индукция возникновения адвентивных побегов в каллусной 5. Что из перечисленного не относится к преимуществам соматического эмбриогенеза как одного из способов микроклонального размножения растений?

1) отсутствие необходимости в укоренении получаемых регенерантов;

2) возможность получения искусственных семян;

3) стабильно высокие показатели размножения;

4) отсутствие возможности развития сомаклональных вариантов;

5) высокая эффективность и экономичность;

6) отсутствие возможности проявления мутагенной активности повышенных концентраций цитокининов.

А) 1, 2. Б) 2, 3. В) 3, 4. Г) 3, 5. Д) 4, 5. Е) 4, 6.

6. Каковы основные причины увядания и гибели пробирочных растений на этапе адаптации к почвенным условиям произрастания?

1) слабое функционирование фотосинтетического аппарата;

2) плохо выраженная способность к образованию корневых волосков;

3) отсутствие в среде фитогормонов;

4) слабое развитие устьичного аппарата;

5) поражение почвенными патогенами;

6) высокий осмотический потенциал почвенного раствора.

7. Выберите неправильное утверждение:

А) ювенильный материал наиболее пригоден для повышения эффективности микроклонального размножения;

Б) для изоляции эксплантов лучше использовать растения в генеративной фазе развития;

В) однодольные травянистые растения характеризуются менее выраженным морфогенетическим потенциалом по сравнению с двудольными травянистыми видами;

Г) оптимумы температуры, рН и освещения при микроклональном размножении должны соответствовать таковым для естественных условий произрастания данного вида;

Д) направление морфогенеза не зависит от соотношения уровней ауксинов и цитокининов в питательной среде.

8. Какие из перечисленных технологий на основе культивируемых клеток растений служат для создания генетического разнообразия как основы селекционной практики?

1) оплодотворение in vitro;

2) эмбриокультура;

3) соматическая гибридизация;

4) экспериментальная гаплоидия;

5) индуцированный мутагенез;

6) получение сомаклональных вариантов.

9. Укажите причины постгамной несовместимости таксономически отдаленных партнеров при скрещивании?

1) отсутствие секрета рыльца пестика материнского растения;

2) блокирование роста пыльцевой трубки вследствие тканей несовместимости партнеров;

3) несоответствие во времени созревания пыльцы отцовского и материнского растений;

4) несоответствие в темпах развития зародыша и эндосперма;

5) токсичность метаболитов тканей материнского растения для 6) несоответствие по длине столбика пестика и пыльцевой трубки.

10. Выберите неправильные утверждения относительно метода эмбриокультуры:

1) для культивирования недифференцированных зародышей требуются сложные по составу питательные среды;

2) преодоление постгамной несовместимости, обусловленной физиологическими причинами, осуществляется путем получения гибридного каллуса и растений-регенерантов на его основе;

3) культивирование полностью сформированных зародышей не требует добавления витаминов и растительных экстрактов в питательные среды;

4) постгамная несовместимость таксономически отдаленных партнеров является непреодолимой;

5) культивирование тканей летальных гибридных зародышей позволяет получать сомаклональные варианты.

11. Какая из указанных характеристик не относится к сомаклональной изменчивости?

А) более высокая (в 100-1000 раз) частота возникновения по сравнению с частотой спонтанных мутаций;

Б) уникальность;

В) возможность существенного ускорения процесса создания новых сортов растений;

Г) обусловлена адаптацией клеток in vitro к разным условиям существования;

Д) полное сохранение у растений-регенерантов всех генетических вариаций, выявленных на клеточном уровне.

12. Какой способ клеточной селекции in vitro основан на избирательной гибели неустойчивых делящихся клеток дикого типа на минимальных средах?

А) неселективный отбор; Г) тотальная селекция;

Б) визульная селекция; Д) негативная селекция.

В) позитивняа селекция; Е) нет правильного ответа.

13. Для каких факторов обнаружена прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro?

1) низких температур;

2) высоких температур;

4) высоких концентраций тяжелых металлов;

5) высоких концентраций алюминия;

А) 1, 3, 4. Б) 1, 3, 5. В) 1, 4, 6. Г) 2, 3, 5. Д) 2, 4, 5. Е) 2, 4, 6.

14. В чем заключается основное отличие соматических гибридов, полученных в результате слияния протопластов, от гибридов, полученных половым путем?

А) в большинстве случаев не являются фертильными;

Б) двуродительское наследование цитоплазматических генов;

В) наличие в клетках двух ядер;

Г) высокая частота возникновения альбинизма;

Д) наследование хлоропластного и митохондриального геномов только одной из родительских форм.

15. Какую роль играют репортерные гены при генетической трансформации растений?

А) позволяют судить о том, произошло встраивание чужеродного гена в геном реципиента или нет;

Б) приводят к изменению фенотипа трансгенного растения;

В) активируют транскрипцию введенных генов в ответ на действие специфического индуктора;

Г) облегчают экспрессию перенесенных генов;

Д) нет правильного ответа.

16. Какие гены чаще всего используются в качестве маркерных генов?

1) гены устойчивости к различным антибиотикам;

2) гены глюкоуронидаз;

3) гены биосинтеза антоцианов;

4) гены устойчивости к гербицидам;

5) регуляторные участки гена 35S белка из генома вируса цветной А) 1, 2. Б) 1, 3. В) 2, 3. Г) 1, 4. Д) 1, 5. Е) 3, 4.

17. Что из перечисленного не входит в состав Т-ДНК Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens?

1) гены синтеза опинов;

2) гены катаболизма опинов;

3) гены синтеза ауксинов;

4) гены синтеза цитокининов;

6) сайт инициации репликации А) 1, 2, 6. Б) 1, 5, 6. В) 2, 3, 4. Г) 3, 4, 5. Д) 3, 4, 6. Е) 2, 5, 18. Какие трансгенные растения получают в результате переноса генов ингибиторов протеиназ и амилаз?

А) устойчивые к окислительному стрессу;

Б) устойчивые к солевому стрессу;

В) устойчивые к насекомым-вредителям;

Г) устойчивые к грибам;

Д) устойчивые к вирусам.

19. Какие способы лимитирования роста используются при депонировании культур растительных клеток и тканей?

1) уменьшение концентрации макро- и микросолей в питательной 2) увеличение атмосферного давления;

3) снижение температуры до 1-10 °С;

4) повышение концентрации сахарозы в питательной среде;

5) создание условий гипоксии;

6) добавление в питательную среду гиббереллинов.

А) 1, 3, 5. Б) 1, 4, 6. В) 2, 3, 4. Г) 3, 4, 5. Д) 3, 5, 6. Е) 4, 5, 6.

20. В какой фазе ростового цикла культивируемые растительные клетки наименее пригодны для использования с целью криосохранения?

Б) логарифмической фазе;

В) фазе линейного роста;

Г) фазе замедления роста;

Д) стационарной фазе.

ОТ АВТОРА

РАЗДЕЛ I. ПРОГРАММА СПЕЦИАЛЬНОГО КУРСА «КУЛЬТУРА

КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ» ………………………. РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ……………………….. Тема 1. Техника культивирования изолированных клеток и тканей растений на искусственных питательных средах ……………………… Лабораторная работа № 1. Приготовление питательных сред для культивирования растительных клеток и тканей in vitro …………….. Лабораторная работа № 2. Методы стерилизации при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений ……….. Тема 2. Культура каллусной ткани ………………………………………. Лабораторная работа № 3. Получение каллусной ткани табака и ее субкультивирование …………………………………………………….. Лабораторная работа № 4. Определение морфологических и ростовых показателей каллусных культур …………………………………. Тема 3. Культура клеточных суспензий ……………………….………… Лабораторная работа №5. Получение и субкультивирование суспензионной культуры ……………………………………………………….. Лабораторная работа № 6. Оценка жизнеспособности клеток и степени агрегированности суспензионных культур ……………………… Тема 4. Дифференцировка в культуре клеток растений ………………. Лабораторная работа № 7. Влияние фитогормонов на направление морфогенеза в культуре клеток табака ………………………………… Методическая литература ………………………………………………

РАЗДЕЛ III. КОНТРОЛЬ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

СТУДЕНТОВ ………………………………………………………………... Глава 1. Методы культивирования in vitro клеток и тканей высших растений ……………………………………………………..……………….. Глава 2. Биология клеток высших растений in vitro ………………...…. Глава 3. Биотехнологии на основе культивируемых клеток, тканей и органов растений …………………………………………………………… Дитченко Татьяна Ивановна

КУЛЬТУРА КЛЕТОК,

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ.

Методические рекомендации к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов Ответственный за выпуск Т. И. Дитченко Подписано в печать. Формат 6084/16.

Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.

Усл. печ. л. 2,56. Уч.-изд. л. 2,33.

Белорусский государственный университет.

Лицензия ЛВ № 315 от 14.07.98.

220050, Минск, проспект Независимости, Отпечатано с оригинал-макета заказчика.