На правах рукописи

Туманов Юрий Васильевич

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ

И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово-2011 2

Работа выполнена в ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Аутеншлюс Александр Исаевич доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Беклемишев Анатолий Борисович доктор биологических наук, профессор Загребельный Станислав Николаевич доктор биологических наук, профессор Толстикова Татьяна Генриховна

Ведущая организация:

ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва

Защита состоится «7» октября 2011 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, р. п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.: (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « »2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространенность инфекционновоспалительных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, трудности их специфической индикации (диагностики) обусловливают необходимость поиска и разработки новых методов, позволяющих выявить возбудитель и активность процесса. Среди заболеваний инфекционной природы туберкулез и вирусные гепатиты устойчиво занимают доминирующее положение (Онищенко Г.Г., 2010). По оценке, в мире ежегодно отмечается 1,5 миллионов клинических случаев гепатита А.

[www.who.int/immunization (HebA_Rus.pdf)]. Гепатит А, проявляющийся нарастанием симптомов с начала заболевания, сейчас встречается в более позднем возрасте. Больные с бессимптомной формой заболевания, оставаясь нераспознанными, являются основным источником заболевания. В связи с тем, что они поступают в медицинские учреждения в более поздние сроки развития инфекции, антиген ВГА не всегда выявляется, поэтому наиболее достоверным маркером для постановки диагноза гепатита А является выявление иммуноглобулинов класса М (IgM). Разработка и внедрение в практику здравоохранения методов диагностики гепатита А является одним из актуальных направлений профилактики и лечения этой широко распространенной инфекции.

Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида M. tuberculosis, в России инфицированность превышает 80 %, а по заболеваемости и числу больных туберкулезом Россия, попрежнему, входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулезу (WHO, 2008). Заболеваемость туберкулезом не зависит от социальной принадлежности и охватывает все слои современного общества.

В общей системе мер борьбы с туберкулезом является современная и достоверная диагностика. Имеющиеся в настоящее время диагностические тесты не всегда отвечают предъявляемым требованиям. Многие из них весьма трудоемки и не всегда отличаются достоверностью. Особенностью туберкулеза, как одной из хронических инфекций, является преобладание латентных форм и случаев бактерионосительства. Традиционные методы диагностики туберкулеза, такие как рентгенография и бактериологический анализ мокроты, туберкулинодиагностика не всегда эффективны. Нередко для постановки окончательного диагноза требуется сравнение результатов, полученных разными методами. Развитие методов определения клеточного иммунитета напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови (Pai M., 2006; Lalvani A., 2007, 2001;

Bellete B., 2002; Clark S.A., 2007). Высокая разрешающая способность этих методов позволяет оценивать антиген-стимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа.

Таким образом, разработка новых технологий, в том числе на основе выявления Т-клеточных маркеров, является крайне важной для нашей страны и в настоящее время входит в разряд наиболее актуальных проблем современной медицины.

Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен по всему миру (Murakami K. et al., 2011; Acaite J. et al., 2007; Храмцов В.В. с соавт., 2005;

Смирнов П.Н., 2007). В РФ, по данным Прихватиловой Л.Б. с соавт. (1998);

Гулюкиной М.И. и соавт., (2003), лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующее место и составляет 57 % от других нозологий. 60 % инфицированных животных не имеют клинических признаков инфекции (Kettmann R. et al., 1994), и только выявление специфических антител серологическими методами или выявление провирусной ДНК с использованием молекулярно-биологических методов позволяет идентифицировать заболевание. Большинство структурных белков вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) проявляет иммуногенность, что позволяет с достаточной достоверностью выявлять антитела у инфицированных животных. C середины 70-х годов активно разрабатывались различные тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота посредством ферментов с использованием цитопатогенных свойств вируса, а также для непосредственного обнаружения вирусного генома (Graves D.C. et al., 1977); с помощью полимеразной цепной реакции (Fechner H. et al., 1996;

';

Бусол В.А. и др., 1999; Mullis K.B. et al., 1986; Naif H.M. et al., 1992; Kuckleb urg C.J. et al., 2003). В ГНЦ ВБ «Вектор» создание диагностических средств для выявления вирусных и бактериальных инфекций включает фундаментальные исследования вирусных белков и составляет одно из ведущих направлений деятельности центра. Высокая значимость для общественного здравоохранения и ветеринарии создания новых эффективных средств диагностики явилось основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: разработка наборов и тест-систем, основанных на определении клеточного и гуморального иммунного ответа на антигены вирусного гепатита А, туберкулеза легких и вируса лейкоза для выявления этих заболеваний у человека и крупного рогатого скота.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать биоконъюгаты моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработать и стандартизовать диагностические иммуноферментные тест-системы для выявления маркеров вирусного гепатита А.

2. Сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis. Провести оценку полученных полипептидов на пригодность их для использования в диагностике туберкулеза у человека.

3. Разработать и стандартизовать диагностические тесты с использованием гибридных полипептидов и с применением методов определения способности клеток крови продуцировать IFN- для выявления туберкулеза человека.

4. На основе использования рекомбинантного белка р24 разработать диагностический набор для выявления вируса лейкоза КРС. Сравнить результаты анализа, полученные с использованием разработанного набора, с референс-тест-системами.

Научная новизна Впервые были получены и охарактеризованы биоконъюгаты крысиных моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А.

Разработаны и стандартизованы иммуноферментные тест-системы для выявления и дифференциальной диагностики вирусного гепатита А, обладающие высокой чувствительностью (85–95 %) и специфичностью (90– 100 %).

рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis, такие как rESAT-6, rCFP10 и rMPT64. Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм E. coli BL позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих глутатионтрансферазы (GST) в качестве белка-носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.

Впервые полученные рекомбинантные белки – rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 – можно использовать при разработке тест-систем нового поколения для диагностики туберкулеза.

При проведении иммуноферментного и функционального анализа (IFNанализа, для выявления туберкулеза и подтверждения (опровержения) диагноза использованы рекомбинантные белки, содержащие на N-конце аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве вспомогательного белка.

Сравнение с помощью расчетных программ, предсказывающих Вклеточные эпитопы антигенов, показало хорошее совпадение вторичных структур соответствующих районов природных и рекомбинантных белков, что позволило прийти к заключению о полноценном взаимодействии последних со специфическими иммуноглобулинами без отщепления GSTпоследовательности.

Впервые разработана схема диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе серологических методов – ИФА и РИД – с применением рекомбинантного антигена р24, которые использованы в ветеринарии на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции ВЛКРС.

Практическая значимость работы Получены и сконструированы опытные и экспериментальнопроизводственные серии тест-систем, которые были аттестованы в отделе биологического и технического контроля НПО «Вектор» и испытаны в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1990–1991 гг. На разработанную диагностическую тест-систему утверждена научно-техническая документация (ВФС 42-331ВСэксперименально-производственный регламент (ЭПР) 373-92. «Тестсистема иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-А-IgM». Инструкция по применению «Тестсистемы иммуноферментной для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-А-IgM».

Разработана экспериментальная коммерческая тест-система для выявления ВГА двухстадийным вариантом, которая обладает 100 % чувствительностью и специфичностью и позволяет определять вирусный антиген в природных биологических объектах, в лизате инфицированных клеток. Применение крысиных моноклональных антител в диагностике позволяет значительно увеличить специфичность и чувствительность тестсистем.

Разработана и запатентована технология получения рекомбинантных видоспецифических белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 M. tuberculosis для диагностики туберкулеза.

Разработанные методы иммунологического мониторинга туберкулезной инфекции, использующиe Т-клеточные технологии, позволяют усовершенствовать диагностику туберкулеза.

Создана схема комплексной диагностики ВЛКРС в хозяйствах на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции ВЛКРС на основе иммуноферментного анализа (ИФА) и радиальной иммунодиффузии (РИД).

Положения, выносимые на защиту 1. Разработанные и стандартизованные компоненты диагностических иммуноферментных наборов для выявления маркеров вирусного гепатита А позволили создать высокоэффективные диагностические тестсистемы.

2. Плазмиды pTSE6, pTB232 и pTB323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки M.

tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки E. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулеза.

3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, а также полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающие экспрессирующий штамм BL21, могут быть представлены в виде технологической схемы для разработки лабораторного регламента по производству этих белков.

4. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 применимы в качестве компонентов в иммуноферментном анализе, -интерфероновом анализе и в -интерфероновом ELISPOT-тесте при диагностике туберкулеза без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка. Исследование клинического материала позволило оценить возможности гибридных белков в диагностике туберкулеза.

5. Комплексная диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием серологических тестов (РИД, ИФА) позволяет с большей эффективностью проводить обследование хозяйств с различной степенью инфицированности лейкозом крупного рогатого скота.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 347 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 545 работ. Работа иллюстрирована рисунками и включает 39 таблиц.

Апробация работы и публикации Материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены на следующих международных и научно-практических конференциях:

«Инфекционной службе г. Новосибирска – 90 лет». Научно-практическая конференция Новосибирск, 1994; конференция «Проблемы биологической и экологической безопасности», Оболенск, 2000 г.; 8-я международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 2000 г.; International Conference American Thoracic Society San Francisco, California, 2001; 11th ERS Annual Congress Berlin, Germany, 2001;

Всероссийская научно-практическая конференция, г. Иркутск, 2002; «VII Российский съезд фтизиатров», Москва, 2003 г.; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2004 г.; «Актуальные вопросы ветеринарии: Сибирская. международная научно-практическая конференция», Новосибирск, 2004; Keystone Symposia “Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology”; Whistler, British Columbia, Canada, 2005; Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: III Российская научная конференция с международным участием, Новосибирск, 2006 г. ; The International Simposium “EU-Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framеwork Programme”, StPetersburg, Russia, 2006; Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007 г.; II Российско-германская конференция форума Коха – Мечникова. «Туберкулез, спид, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении», Томск, 2007 г.; Vaccine Congress, Amsterdam, the Netherlands, 2007; Международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», Минск, 2007;

«Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России», Научно-практическая конференция, Ставрополь, 2007; “New Technology in medicine and experimental biology”, Pattaya-Bangkok, Thailand, 2007.

Работа выполнена в 1989–2009 гг. в рамках научных тем организации и международных проектов: грант МНТЦ № 1983р; грант МНТЦ № 2019р;

грант МНТЦ № 1980р; проект МНТЦ № 2311; проект МНТЦ № 2641.

По теме диссертации опубликовано 18 научных статей, из них 12 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, 40 тезисов докладов, монография, 1 методическое указание. Получено 2 патента Российской Федерации, один из которых удостоен диплома в номинации «100 лучших изобретений России».

Личный вклад соискателя В диссертации обобщены результаты экспериментальных исследований, проведенных в 1989–2009 гг. соискателем в ВНИИ МБ, ГНЦ ВБ «Вектор», ЗАО «Вектор-Бест». Автор принимал активное участие в развитии и внедрении новых технологий в диагностике социально-значимых вирусных и бактериальных инфекций в СССР и РФ. Автор принимал личное участие в планировании и проведении основного комплекса исследований, результаты которых представлены в диссертационной работе. За помощь, оказанную в проведении диссертационных исследований, автор выражает благодарность Тюнникову Г.И., Майданюку А.Г., Аммосову А.Д., Болдыреву А.Н., Смирновой О.Ю., Разумову И.А., Локтеву В.Б., Азаеву М.Ш., Носаревой О.В., Лебедеву Л.Р., Двоеглазову Н.Г., Храмцову В.В., Смирнову П.Н. Вклад в работу других авторов отражен в совместных публикациях по теме диссертации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирус гепатита А, штаммы МБ-7 и HAS-15, адаптированные к клеточной культуре 4647, а также моноклональные антитела наработаны и моноклональных антител, меченные пероксидазой хрена, получены по методу Накане (Nakane P.K., 1974).

При постановке иммуноферментного анализа использовали ОСО антиВГА IgM+ (ОСО 28-42/62-88) и ОСО анти-ВГА IgM_ (ОСО 28-42/63-89) и стандартный набор сывороток (ОСО суммарных антител к ВГА – ОСО 42-28и аналогичный международный стандарт ВОЗ (МСО).

В качестве референс-диагностических наборов для выявления маркеров вирусного гепатита А использовали коммерческие наборы: HAVAB-MEIA (Abbott, CША); Anti-HAV-IgM EIA (La Roche, Швейцария); «Диагнагеп»

(Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Россия).

В работе использовали питательные среды RPMI-1640, производства ГНЦ ВБ «Вектор». Вакцину BCG, полученную из НИИ вакцин и сывороток (Ставрополь), и штамм H37Rv из коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича использовали для получения антигенов микобактерий. В качестве нуклеотидной матрицы использовали ДНК M. tuberculosis H37Rv при проведении ПЦР. В качестве референс-диагностических наборов для выявления антител к микобактериальным антигенам применяли коммерческие тест-системы «Анти-Туб-IgG» (НИИЭМ им. Пастера, СПб) и «АТ-Туб-БЕСТ-стрип» (Вектор-Бест, Новосибирская область, п. Кольцово).

Выделение геномной микобактериальной ДНК проводили согласно методике (van Embden J.D. et al., 1993). Геномную ДНК анализировали ЭФ в 1 % агарозном геле. Концентрацию геномной ДНК измеряли на спектрофотометре Gene Quant pro (Amersham Bioscience, США) при 260 нм.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методике, адаптированной нами для мини-варианта, с последующей депротеинизацией (Маниатис Т. и др., 1984).

Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях по Лэммли (Laemmly W.K., 1970). Гель окрашивали раствором Кумасси (Reisner A.H. et al., 1975 или Reisner A.H., 1984), затем отмывали 10 % раствором уксусной кислоты.

Иммуноблотинг белков. Белки лизатов E. coli BL21, разделенные ЭФ в SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (Amersham, США), согласно процедуре (Towbin Н. et al., 1979) в модификации. Перенос белков осуществляли в БПБ1 при напряжении 100 В в течение 1 ч. Контроль переноса белков осуществляли окрашиванием полоски мембраны 0,3 % раствором пунцовым С в течение 1 мин и отмывкой красителя дистиллированной водой до видимого исчезновения белковых полос.

Образование иммунных комплексов выявляли в буферном растворе, содержащим 2 красителя (BCIP и NTB). Ферментативную реакцию останавливали перенесением мембраны в дистиллированную воду.

Секвенирование клонированной нуклеотидной последовательности.

Секвенирование клонированных генов в составе рекомбинантных ДНК проводили с использованием набора для секвенирования CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, согласно прописи изготовителя, за исключением того, что в секвенирующей реакции (V = 5 мкл) были использованы оба праймера (в каждой из секвенирующих реакций для одной плазмиды – или прямой FpGEX, или обратный RpGEX), не входящие в набор и предназначенные специально для секвенирования клонированных НП в плазмиды серии pGEX. ТВП секвенирующей реакции – 1 [94 °C – 2 мин], 30 [96 °C – 20 с, 44 °C – 20 с, 60 °C – 4 мин]. Секвенирующие реакции выполняли на амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) или Mastercycler gradient (Eppendorf), а разделение продуктов реакции проводили в автоматическом секвенаторе Beckman СЕQ (Beckman Coulter).

использованием аффинной хроматографии в микроколонке путем многократного центрифугирования при 600 g. Белок GST-P анализировали ЭФ и иммуноблотингом. Концентрацию общего белка после элюции определяли по формуле Варбурга (Warburg C.):

C = 1,55·A280 – 0,76·A260, где С – концентрация белка в мг/мл, А – оптическая плотность раствора при длине волны, указанной в нижнем индексе, и длине оптического пути кюветы 1 см (http://www.kiskerbiotech.com/deutsch/nano-photometer-methods.htm).

Определение IFN- (IFN--анализ) в супернатантных клетках цельной крови проводили с использованием коммерческих наборов (BD OptEIA Reagent), согласно инструкции производителя.

IFN--ELISPOT-анализ проводили с использованием набора IFNBD™ ELISPOT Set (BD Biosciences, США). Пятна, различающиеся по размеру, после высыхания лунок подсчитывали с помощью автоматического ELISPOT-ридера (KS Immunospot analyzer, Карл-Цейс, Германия) или визуально с помощью стереомикроскопа.

Образцы сывороток, крови и мокрот. В настоящей работе были использованы образцы крови, полученныe от различных групп пациентов и собранные за период с 2001 по 2007 гг. Первая группа включала больных с активным неспецифическим процессом в легких со следующими формами:

очаговый туберкулез легких (12 человек), фиброзно-кавернозный ( человек), диссеминированный туберкулез (22 пациента), инфильтративный (19 человек), больные ТБ (290 человек). Вторая группа – лица, у которых туберкулез легких был выявлен при профосмотрах (нелеченые АБП, 101 человек). Третья группа – ВИЧ-ассоциированный туберкулез (27 человек). Четвертая группа – условно здоровые лица (650 человек) – доноры. Возраст пациентов составлял 24–45 лет, находящихся на лечении в городском противотуберкулезном диспансере. Диагноз туберкулез легких устанавливался врачами противотуберкулезных учреждений на основании клинико-лабораторных данных.

В другой выборке обследовано 66 больных туберкулезом легких, из них мужчин – 49, женщин – 17 в возрасте 25–65 лет, госпитализированных для лечения в городскую клиническую туберкулезную больницу № г. Новосибирска в 2000–2005 гг. (Аутеншлюс А.И.).

Клинические изоляты культур клеток M. tuberculosis. В работе использованы клинические изоляты M. tuberculosis, предоставленные НИИ специализированных видов медицинской помощи «Фтизиатрия»

(г. Новосибирск) в рамках выполнения совместного проекта МНТЦ № 1980.

Всего получено 1350 изолятов культур клеток микобактерий. Проведение проекта № 1980 было одобрено этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор»

28 мая 2001 г. (протокол № 2 от 28 мая 2001 г.).

Клинический материал был получен из областной клинической туберкулезной больницы г. Томска. Из этой же клиники получены изоляты мокрот, соответствующие образцам крови от пациентов с подозрением на туберкулез легких (всего 38 изолятов). Исследование одобрено этическим комитетом ГОУ ВПО СибГМУ (протокол № 24 от 06.12.2004). Клинический материал цельной крови получен в ГБУЗ НСО «Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями». У больных туберкулез и ВИЧ были диагностированы лабораторным анализом. Наличие микобактерий туберкулеза в мокроте было определено методом посева и подтвержденo рентгеноскопией. При анализе данных в случае сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза преобладала инфильтративная форма туберкулеза, фибрознокавернозный туберкулез диагностирован у 2 пациентов (16,7 %). Развитие ВИЧ-инфекции проходило на фоне клинически леченого туберкулеза у (42 %) больных. У 3 больных диагностирован, кроме ВИЧ/ТБ, вирусные гепатиты В и С, хламидийная инфекция. Забор материала для исследований проводили в соответствии с этическими нормами при обязательном получении согласия испытуемых. При проведении работ по диагностике туберкулеза руководствовались нормативным документом, регламентирующим деятельность противотуберкулезной службы РФ (Приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003 г. № 109 «О совершенствовании про тивотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»).

Статистическую обработку полученных данных проводили используя пакет программ статистической обработки данных Microsoft Excel 2007 и www.biometrica.tomsk.ru. Результаты исследования обрабатывались статисти чески с использованием критериев Стьюдента (t), Вилкинсона-Манна-Уитни (U) и коэффициента корреляции по программе StatGraphicsPlus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител IgM к вирусу гепатита А. Разработка тест-системы основана на использовании культивируемого ВГА на культуре клеток 4647, выделении вируса, иммунизации животных вирусной суспензией, выделении иммуноглобулинов из гипериммунной сыворотки к ВГА, получении конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена, сорбции антител против иммуноглобулинов класса М человека на планшете с оптимизацией всех стадий проведения иммунохимического анализа. Получение и очистку поликлональных антител из морских свинок против очищенного антигена ВГА для использования их в ИФА проводили после 3-кратной иммунизации морских свинок очищенным антигеном ВГА с полным адъювантом Фрейнда с последующим забором крови, выделением суммарной фракции иммуноглобулинов и очисткой их на сефадексе ДЭАЭ-А-25, согласно соответствующие пику иммуноглобулинов G, объединяли и диализовали против 2- смен фосфатного буфера (рН 7,5 ± 0,1) в течение 18 ч.

Концентрацию белка после проведения диализа определяли при =280 нм спектрофотометрически и доводили ФСБ до концентрации 1 г/л.

Получение конъюгатов антител анти-ВГА с пероксидазой хрена осуществляли периодатным методом. Рабочий титр полученных конъюгатов составил 1/3200. Активность конъюгата сохраняется не менее 12 месяцев при хранении при температуре 2–4 oС. Нами были получены конъюгаты МКА с пероксидазой хрена (табл. 1). Сравнение конъюгатов проводили согласно следующим критериям: их чувствительность и специфичность в иммуноанализе. После отбора моноклональных конъюгатов собирали экспериментальные серии тест-систем «Вектогеп-А-IgM-МКА» и проводили оценку их специфичности и чувствительности. Для этого использовали панель положительных сывороток от переболевших гепатитом А людей, а также набор сывороток от пациентов, не имевших в анамнезе заболевание гепатитом А. Отсутствие ложноположительных результатов свидетельствова ло о высокой специфичности тест-системы (табл. 2).

Сравнение набора экспериментальной серии «Вектогеп-А-IgM» на основе конъюгата МКА и пероксидазы хрена проводили с коммерческими тест-системами. В табл. 3 представлены результаты сравнения основных характеристик тест-систем отечественного и зарубежного производства при выявлении IgM к ВГА. Тест-система «Вектогеп-А-IgM-МКА» по своим Характеристика конъюгатов поликлональных и моноклональных антител против ВГА Определение антител IgM, специфичных к ВГА (проверка кроссреактивности тест-системы) Панели Количество «Вектогеп-А-IgM» (поликлональные/МКА сывороток образцов конъюгаты) Антигены ВГВ показателям (чувствительности и специфичности) практически ничем не отличалась от референс-тест-системы Abbott (США) и набора La Roche (Швейцария).

Таким образом, модифицированная «Вектогеп-А-IgM-МКА» отличалась от исходной более высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении антител класса М к ВГА в сыворотках человека. Опытные и экспериментально-производственные серии тест-систем были аттестованы в ОБТК НПО «Вектор» и испытаны в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1990- гг. По результатам испытаний тест-система для выявления IgM к ВГА соответствовала проекту ВФС. В результате проведенных исследований три серии тест-систем «Вектогеп-А-IgM» были рекомендованы к проведению государственных испытаний на базе ГИСК им. Л.А.Тарасевича, согласно утвержденным программам испытаний. В качестве референс-тест-системы при проведении испытаний использовали иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу гепатита А класса М «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс» (СП СССР – Швейцария). Качественные характеристики референтной тест-системы по специфичности и чувствительности были предварительно установлены с применением стандартов ОСО «АнтиВГА IgM ДИАГНАГЕП» отечественного производства. При проведении государственных испытаний были сформированы две группы панелей сывороток. Основную опытную группу составили сыворотки больных с различными формами гепатита А (взрослые и дети), сыворотки лиц, находившихся в контакте с больными вирусным гепатитом А (всего было представлено 101 сыворотка). Сыворотки здоровых взрослых и детей, не болевших гепатитом А в течение 2 лет перед обследованием (всего сывороток), составили первую контрольную группу. Вторая контрольная группа (выборка 77 человек) сформирована из больных вирусным гепатитом А, другие нозологические формы заболевания (болезнь Жильбера, Сравнительные характеристики диагностических тест-систем для выявления анти- IgM к ВГА № п/п Фирма, тест-система Время анализа, Количество Чувствительность «Вектогеп-А-IgMМКА»

Институт полиомиелита энцефалитов (Россия), механическая желтуха, ОРВИ, иерсиниоз, пищевая токсикоинфекция, грипп и ряд других инфекций) – всего 33 человека. При проведении государственных испытаний были использованы 270 образцов сывороток, которые были зашифрованы и хранились в замороженном виде при минус (20 ± 2) оС. В процессе проведенных испытаний было установлено, что из образца сывороток от больных ВГА с подтвержденным клиническим диагнозом наличия антител класса М к ВГА и подтвержденной в референстест-системе «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс» тест-система «Вектогеп-АIgM» выявила 96, а «Анти-ВГА IgM ДИАГНАГЕП» – 63 сыворотки, что составило соответственно 95,4 % и 62,3 %. При этом процент положительных результатов при использовании разработанной нами тест-системы «ВектогепА-IgM» практически не отличался от референтной тест-системы «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс». Диагностический набор «Анти-ВГА IgM ДИАГНАГЕП» выявил 7 ложноположительных сывороток в группе больных вирусным гепатитом А, тогда как разработанная нами тест-система «Вектогеп-А-IgM» не выявила ни одной ложноположительной сыворотки.

Совпадение результатов референс-тест-системы и «Вектогеп-А-IgM»

составила 98,1 %. Значение коэффициента корреляции тест-системы «Вектогеп-А-IgM», находящегося в пределах от 0,96 до 0,98, свидетельствует о высокой степени сопоставимости результатов по отношению к референстест-системе. Таким образом, результаты проведения госиспытаний тестсистемы «Вектогеп-А-IgM» для ранней диагностики ВГА показали диагностическую эффективность вновь разработанной тест-системы и сопоставимость полученных результатов с данными референтной тестсистемы. Тест-система «Вектогеп-А-IgM» была использована в клиникодиагностических лабораториях при выявлении антител IgM на территории СССР. Тест-система сохраняла свою специфическую активность в течение месяцев при температуре хранения не выше минус 8 оС. Время проведения анализа 2–4,5 часов.

Таким образом, на основании результатов проведения госиспытаний тест-система «Вектогеп-А-IgM» для ранней диагностики ВГА была рекомендована для внедрения в практику здравоохранения. На разработанную диагностическую тест-систему была утверждена НТД (ВФС 42-331ВС-92), экспериментально-производственный регламент (ЭПР) 373-92.

Разработка тест-системы иммуноферментной для выявления антител IgG к вирусу гепатита А Определение IgG к ВГА может быть использовано для оценки эпидемиологической ситуации по гепатиту А, для оценки эффективности вакцинации, а также при проведении специфической гамма-глобулиновой профилактики в школьных и дошкольных учреждениях среди детей, имевших контакт с больными гепатитом А. Этапами исследования являлось изучение и определение чувствительности разрабатываемой тест-системы «Вектогеп-А-антитела», сравнение с референс-тест-системой «ИФА антиВГА». При проведении титрования стандартных образцов сывороток, содержащих антитела к ВГА (ОСО 42-28-151-89), откалиброванного в международных единицах, была определена аналитическая чувствительность тест-системы «Вектогеп-А-антитела», которая составила 9,8 ± 1,2 мМЕ/мл, при этом аналитическая чувствительность референс-тест-системы «ИФА анти-ВГА» составила 11,8 ± 1,6 мМЕ/мл. Аналогичные показатели зарубежных тест-систем соответствовали 10 – 20 мМЕ/мл. Диагностические характеристики разработанной тест-системы «Вектогеп-А-антитела», такие как cпецифичность и чувствительность, составили – 82 % и 98–99 % соответственно, а вероятность получения положительного диагноза – 95– 96 %, вероятность установления отрицательного диагноза – 98 %. Общий показатель совпадения результатов составил 96 %. Специфичность при проверке отрицательных сывороток стандартной панели предприятия, не содержащих иммуноглобулины класса G к ВГА, составила 100 %.

Чувствительность при проверке положительных сывороток стандартной панели предприятия, содержащих иммуноглобулины класса G к ВГА, составила 100 %. Контрольные образцы готовы к использованию и не требуют дополнительного разведения. Неспецифические компоненты тестсистемы (РПРС, ФСБ-Т, СБР, ОФД, стоп-реагент), взаимозаменяемы во всех выпускаемых наборах ЗАО «Вектор-Бест».

Роль МКА в диагностике маркеров ВГА Представленные выше результаты при определении антител IgM к ВГА показали высокую эффективность применения крысиных моноклональных антител в качестве противовирусных конъюгатов. Следующий этап работы включал использование очищенных МКА-анти-ВГА в коммерческих тестсистемах «Вектогеп-А-антиген» производства «Вектор-Бест» при выявлении ВГА в различных образцах. В качестве подложки для захвата антигена были использованы МКА, представленные в табл. 4.

Характеристика МКА к ВГА, применяемых в коммерческих тест-системах «ВекторБест»

Но – не определяли На рис. 1 показано, что МКА 6C7 и 4С6 при сорбции на планшеты в концентрации 1,25 мкг/мл обеспечивают более высокую реакционную емкость подложки при минимальном уровне фонового сигнала, чем поликлональные иммуноглобулины, полученные от иммунизированных Рис. 1. Результаты титрования очищенных МКА, используемых в качестве подложки для захвата антигена в тест-системе «Вектогеп А-антиген». По оси абсцисс – концентрация иммуноглобулинов (мкг/мл), сорбированных на планшетах; по оси ординат – значения ИФА (ОП 492 нм). Образцы антител: 1 – МКА 4С6; 2 – МКА 6С7; 3 – МКА 5Е1; 4 – МКА 6Н6; 5 – 1D8; 6 – иммуноглобулины морских свинок, иммунизированных ВГА; 7 – иммуноглобулины нормальной крысиной сыворотки (отрицательный контроль) Рис. 2. Результаты титрования ВГА в различных модификациях тест-системы «Вектогеп А-антиген». По оси абсцисс – обратная величина титра антигена ВГА; по оси ординат значения ИФА (ОП 492 нм). 1 – подложка – МКА анти-ВГА и поликлональный конъюгат против ВГА; 2 – подложка – поликлональный IgG-анти-ВГА и поликлональный конъюгат против ВГА (тест-система «Вектогеп-А-антиген»); 3 – подложка – МКА анти-ВГА и моноклональный конъюгат 9В12-ПХ против ВГА; 4 – подложка – поликлональный IgGанти-ВГА и моноклональный конъюгат 9В12-ПХ против ВГА животных. Титрование антигена ВГА проводили с применением МКА- и поликлонального конъюгатов, а также очищенных препаратов моноклональных и поликлональных антител, используемых в качестве подложки. Титр вируса определяли по наибольшему разведению положительных образцов, ОП которых в 2,1 раза превышала ОП фона (не более 0,2). МКА, сорбированные на поверхности планшет, при выявлении антигена и биоконъюгаты на основе МКА с пероксидазой хрена повышают чувствительность иммуноанализа в 8–16 раз (рис. 2). Нами были приготовлены экспериментально-производственные серии тест-систем для выявления ВГА на основе противовирусного конъюгата МКА с пероксидазой (МКА9В12-ПХ) и поликлональных антител, используемых в качестве подложки.

Результаты выявления ВГА в положительных и отрицательных образцах в тест-системе «Вектогеп А-антиген»

* – Отношение общего количества отрицательных проб к числу отрицательных проб, выявляемых данной тест-системой. ** – Отношение общего количества положительных проб к числу положительных проб, выявляемых данной тест-системой.

Специфичность иммуноанализа в экспериментальной серии наборов оценивали по результатам взаимодействия полученного конъюгата с контрольными материалами, в которых отсутствовали специфические антигены. Неспецифическое связывание отсутствовало в исследованных образцах, содержащих гетерологичные антигены вирусов осповакцины, клещевого энцефалита, вируса простого герпеса (ВПГ-1, ВПГ-2), гепатита В, ЦМВ человека. В табл. 5 представлены результаты определения чувствительности экспериментальной серии «Вектогеп А-антиген», которая составила 100 %. Рабочее разведение вируса, определяемого в позитивных образцах, составило 1/64–1/256 и 1/512–1/4096 при использовании коммерческой и экспериментальной серий тест-системы. При этом чувствительность экспериментальной серии «Вектогеп-А-антиген» при использовании биоконъюгата на основе МКА была в 8 раз выше чувствительности исходной тест-системы. В качестве подложки применяли поликлональные антитела к ВГА. Показано, что разработанная тест-система обладает 100 %-й чувствительностью и специфичностью и позволяет определять вирусный антиген в природных биологических объектах и лизате инфицированных клеток. Разработка компонентов диагностического набора непосредственно связана с применением консервантов. Среди разнообразия описанных в литературе и широко используемых антимикробных соединений интерес представляли биоциды (рис. 3 А и В). Дитиазолы, входящие в состав биоцидов, нашли широкое применение в качестве противовирусных и антибактериальных соединений (Affatato S., 2004). Эти консерванты (5-хлор-2-метил-2,3-дигидроизотиазол-3-он и 2-метил-2,3дигидроизотиазол-3-он) являются бактерицидами и обладают высокой антимикробной активностью (Supelco ProClin, 1996), что позволило применить их в качестве консервантов компонентов диагностических наборов: буферных растворов, содержащих антитела, антигены и меченные ферментом конъюгаты антител и ряда других биоконъюгатов. Растворы биоконъюгатов на основе МКА или их биотинилированных производных, Рис. 3. Химическая структура биоцидов, применяемых в качестве консервантов в диагностических наборах. А – 5-хлор-2-метил-4-изотиазолин -3-он, В – 2-метил-4изотиазолин-3-он, С – тимеросал содержащих ферментативную метку (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), в присутствии консервантов показали высокую стабильность при хранении и функциональную активность в ИФА в течение 2 лет при рН 6,8– 7,4 (рис. 4) при температуре 4 оС. Поликлональные козьи антитела, направленные против IgG, IgA, IgM человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена, были стабилизированы протеиновым раствором. В качестве консерванта растворов конъюгатов с ферментативной меткой нами были использованы 0,01 % раствор метилизотиазолона или 0,01 % раствор бромнитродиоксана. При этом срок хранения компонентов набора составлял не менее 30 месяцев в виде раствора.

% активности Рис. 4. Результаты определения активности конъюгатов в ИФА в различных буферных растворах, содержащих стабилизатор ProClin 300. 1 – Трис (рН 8,2); 2 – ФСБ-Т, рН 7,4, 3 – ФСБ, рН 7,4; 4 – контроль, концентрат ФСБ с аминокислотами и БСА Разработка методов диагностики туберкулеза с использованием рекомбинантных белков M. tuberculosis. Выбор высокоспецифичных белков для серологической диагностики туберкулеза Из всего многообразия антигенов M. tuberculosis, применяющихся в серологической диагностике туберкулеза, необходимо выбрать белки, удовлетворяющие следующим требованиям:

1. Высокой специфичностью при проведении лабораторного анализа;

2. Высокой чувствительностью при выявлении туберкулеза.

Данная работа была разделена на 2 этапа. На первом проводили создание генетических конструкций, каждая из которых, будучи введенной в клетки бактерий E. сoli, обеспечивала возможность клеткам продуцировать рекомбинантный видоспецифичный белок (рис. 5), содержащий в C-концевой части аминокислотную последовательность целевого белка M. tuberculosis – ESAT-6, CFP10 или MPT64 (полный и не содержащий лидерного пептида белок). На втором этапе использовали эти белки в ИФА и IFN--анализе на образцах клинических изолятов, полученных от больных туберкулезом.

Первые два белка уникальны тем, что гены, кодирующие эти белки, присутствуют в геноме патогенных микобактерий, вызывающих туберкулез у человека, и отсутствуют во всех вакцинных штаммах M. bovis BCG (Harboe М. et al., 1998; Srensen A.L. et al., 1995). Третий, несмотря на высокую иммуногенность, как и у первых двух, кодируется геном, который отсутствует лишь в нескольких вакцинных штаммах (Behr M.A. et al., 1999).

Предполагалось, что комбинация третьего с одним из первых или с обоими белками позволит дифференцировать больных туберкулезом от вакцинированных лиц.

Дизайн последовательности олигодезоксирибонуклеотидов для синтеза ампликонов, содержащих гены, кодирующие интересуемые белки, проводили по программе на сайте http: //www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.

html, используя НП генов, найденные на сайте http: //genolist.pasteur.fr/Tuber cuList. Белку ESAT-6 соответствует ген esxA, CFP10 – esxB и MPT64 – mpt64. Синтез олигонуклеотидов, содержащих, кроме видоспецифичной НП, дополнительную – для сайтов эндонуклеаз рестрикции (ЭР) BamHI (в прямом праймере) и EcoRI (в обратном праймере), был выполнен научным сотрудником Центра Ю.А. Горбуновым. В качестве матрицы для синтеза ампликонов с помощью ПЦР использовали геномную ДНК штамма M.

tuberculosis H37Rv и Taq-полимеразу производства «Сибэнзим»

(г. Новосибирск). Для амплификации интересуемых генов были использованы праймеры:

для ESAT-6:

Fesat – 5/-GAGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGG-3/, Resat – 5/-GCGAATTCTAAACACGAGAAAGGGCG-3/;

Fcfp – 5/-GAGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC-3/, Rcfp – 5/-GCGAATTCTATTAGCGGGTCAGAAGC-3/;

для MPT64 и MPT64:

Fmpt64 – 5/-СGGGATCCGCGCCCAAGACCTACTG-3/, Fmpt64-5/-СGGGATCCGTGCGCATCAAGATCTT-3/, Rmpt64-5/-СGGAATTCGTCCTCGCGAGTCTAGG-3/ – общий для двух ампликонов.

Рис. 5. Кольцевые рестрикционные карты полученных рекомбинантных плазмид. pTSE обеспечивает синтез rESAT-6, pTB232 – rCFP10 и pTB323 – синтез rMPT64 (rMPT64 без лидерного пептида длиною 23 N-концевых а.о.). Толстой стрелкой на карте отмечено положение гена, кодирующего рекомбинантный белок. Карта плазмиды pTSM64 не приводится, так как рекомбинантный белок не был обнаружен в растворимой форме (для http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) Ампликоны (рис. 6) обрабатывали одновременно рестриктазами BamHI и EcoRI и клонировали в составе вектора по BamHI- и EcoRI-сайтам.

Эффективность протекания лигазной реакции контролировали с помощью ПЦР. Обнаружение ампликона в геле агарозы размером, большим на 160 п.н., чем длина искомого клонируемого гена, являлось основанием для использования лигазной смеси для трансформации компетентных клеток E.

coli. Особенность этой реакции в том, что праймеры гибридизуются с нуклеотидной последовательностью векторной молекулы по разные стороны от нуклеотидной последовательности полилинкера (рис. 7). Поэтому образование ожидаемого ампликона в ПЦР возможно только после объединения нуклеотидной последовательности вектора и клонируемого ДНК-фрагмента. Поиск интересуемых клонов проводили непосредственно из колоний, внесением небольшого количества клеток в реакционную смесь (colony PCR), содержащую те же праймеры, что и для контроля лигазной реакции, – FpGEX и RpGEX. Такой подход облегчает скрининг большого числа клонов, минуя операцию выделения рекомбинантной ДНК, необходимую для обнаружения вставки с помощью ПЦР или рестрикционного анализа. С помощью электрофореза по Лэммли анализа лизатов, полученных из этих культур, выбирали клон, обеспечивающий максимальный выход белка. Аналогичным способом отбирали клоны для продукции остальных белков. В качестве маркерных белков на начальном Рис. 6. Результаты электрофоретического разделения в 1,2 % агарозном геле амплификатов генов 1А – esxB, 3А – esxA и 1Б – mpt64, полученных с помощью ПЦР. 2А и 2Б – МФ (маркeры длины фрагментов ДНК в п.н.), Пр – не использованные в реакции праймеры 841 ccagcaagta tatagcatgg cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc 901 atcctccaaa atcggatctg gttccgcgtG GATCCCCGGG AATTCatcgt gactgactga 961 cgatctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 1021 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt Рис. 7. Участок нуклеотидной последовательности векторной плазмиды pGEX-2T, прилегающий к полилинкеру (выделен прописными буквами). Курсивом с подчеркиванием выделены нуклеотидные последовательности праймера FpGEX и комплементарной последовательности обратного праймера, RcpGEX. Нумерация нуклеотидов соответствует нумерации в плазмиде pGEX-2T (U13850) этапе для определения местоположения искомого белка использовали смесь двух стандартных белков – овальбумина (44 kDа) и химотрипсиногена А (24 kDа) (рис. 8). Далее в большинстве случаев ориентировались по расположению клеточных белков конкретного штамма E. coli.

Секвенированием по Сэнгеру определяли нуклеотидную последовательность клонированного гена на соответствие природной, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК, выделенную из соответствующего клона. Все рекомбинантные плазмиды, выделенные из отобранных штаммовпродуцентов, содержали нуклеотидную последовательность клонированных генов, идентичных нуклеотидной последовательности этих генов из штамма M. tuberculosis H37Rv.

Уровень синтеза рекомбинантного белка существенно зависел от времени и температуры культивирования индуцированной культуры (см.

рис. 8Б). Рекомбинантные белки rCFP10 и rMPT64 синтезировали в E. coli в условиях, незначительно отличающихся от условий для rESAT-6. Отличие было во времени культивирования, увеличенное до проведения индукции Рис. 8. А. Положение rESAT-6 в геле: Овальбум – овальбумин, Химотрип – химотрипсиноген А. Б. Оптимизация продукции белка rESAT-6 в штамме E. coli BL (исследуемые параметры – время и температура культивирования индуцированной культуры). На дорожках 12 % ПАА-геля (денатурирующие условия) слева направо показаны белки лизатов: 1,2 – исходного штамма BL21 (бесплазмидный вариант); 3–6 – он же, содержащий векторную плазмиду pGEX-2T; 7–10 – он же, содержащий рекомбинантную плазмиду pTSE6. Лизаты, полученные из клеток, индуцированной ИПТГ культуры, после их культивирования в течение различного времени и при разных температурах. BL21: 1 – 3 ч; 2 – 6 ч без индукции; BL21/pGEX-2T: 3 – 3 ч, 28 С; 4 – 6 ч, 28 С; 5 – 3 ч, 37 С; 6 – 6 ч, 37 С; BL21/клон № 1: 7 – 3 ч, 28 С; 8 – 6 ч, 28 С; 9 – 3 ч, 37 С; 10 – 6 ч, 37 С. Подобранные оптимальные условия для культивирования – подчеркнуты (для достижения средней логарифмической фазы роста требовалось ~ 2,5– 3 ч) и после – до 5–6 ч. В ходе электрофоретического анализа лизатов штаммов, несущих плазмиды pTB232 (rCFP10) и pTB323 (rMPT64), не было замечено видимой деградации рекомбинантных белков. Последние нарабатывались с высоким выходом: положение их на электрофореграммах соответствовало расчетным значениям м.м. (см. рис. 9А и 10А). Перенесение этих белков из геля на фильтр и проведение иммуноблотинга с МКА 2H3- к GST выявило дополнительно несколько минорных полос, которые (рис. 9Б и 10Б) соответствовали белкам с м.м. большей, чем м.м. GST, но меньшей, чем м.м. рекомбинантного белка. По-видимому, ограниченной протеолитической деградации, хотя и в незначительной степени, подвергается только C-концевая часть рекомбинантных белков rCFP10 и rMPT64, и только rESAT-6 деградирует значительно сильнее (рис. 9Б).

По результатам электрофоретического анализа молекулярные массы исходного и целевых рекомбинантных белков (GST и rESAT-6, rCFP10, rMPT64) соответствовали расчетным значениям – 26, 32, 40 и 48,8 kDа.

Уровень их синтеза в клетках штамма E. coli BL21, за исключением rESAT-6, составил около 20 % суммарного клеточного белка, что позволило получать до 2,5 мг рекомбинантного антигена с 1 л культуральной среды. Уровень продукции rESAT-6 составил 2–4 % суммарного клеточного белка. Что касается рекомбинантного белка rMPT64, то он не был обнаружен в достаточном количестве в цитоплазматической фракции, т.е. в растворимом состоянии. По этой причине его не использовали в исследованиях и место локализации также не устанавливалось. Можно предположить, что из-за наличия в нем лидерного пептида полноразмерный MPT64 накапливался преимущественно в мембранной фракции. Если бы в конечном препарате каждого рекомбинантного белка присутствовали только продукты его ограниченного протеолиза, то на электрофореграмме они располагались бы в виде дискретных полос так же, как и на одном из блотов (см. рис. 9 Б и 10 Б), Рис. 9. Детекция рекомбинантных продуктов экспрессии клонированных генов esxA (белок rESAT-6) и esxB (белок rCFP10) M. tuberculosis в штамме E. coli BL21.

А – электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 – BL21, 2 – BL21/pGEX-2T (GST), 3 – BL21/pTB232 (rCFP10), 4 – BL21/pTSE6 (rESAT-6).

Б – иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с моноклональными антителами к белку-носителю GST: 1 – BL21, 2 – BL21/pGEX-2T (GST), 3 – BL21/pTB232 (rCFP10), 4 – BL21/pTSE6 (rESAT-6) чего нами не наблюдалось. Электрофорез в SDS-полиакриламидном-геле гибридных белков, показал, что молекулярная масса неочищенных белков составила для ESAT-6 – 32 kDa и CFP10 – 40 kDa, т.е. отличалась от нативных белков наличием GST (рис. 13). Согласно денситометрии, чистота Рис. 10. Детекция рекомбинантных продуктов экспрессии клонированных генов esxB (белок rCFP10) и укороченного mpt64 (белок rMPT64) M. tuberculosis в штамме E. coli BL21. А – электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 – BL21, 2 – BL21/pGEX-2T (GST), 3 – BL21/pTB232 (rCFP10), 4 – BL21/pTB323 (rMPT64). Б – иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с моноклональными антителами к белку-носителю GST: 1 – BL21, 2 – BL21/pGEX-2T (GST), 3 – BL21/pTB232 (rCFP10), 4 – BL21/pTB323 (rMPT64) антигенного препарата не менее 95–98 % после одностадийной аффинной хроматографии. После первой элюции с колонки смывается не менее 66 % адсорбированного белка, после второй – 27 %, третьей – 7 % (рис. 11 и 12) На рис. 14 и 15 представлена электрофореграмма гибридных, слитных с С-концевой последовательностью GST-белков, полученных в работе. Hа рис. 16 представлена технологическая схема получения, выделения и очистки такого типа белков. В качестве микобактериальных антигенов для исследований были использованы туберкулин (PPD), культуральные фильтраты (CF) M. tuberculosis H37Rv были выделены из месячных культур Рис. 12. Дробная элюция 2-х партий (1-я, дорожки 1–4, и 2-я, дорожки 5–8) рекомбинантного белка rCFP10 с глутатионсефарозы. Электрофореграмма ПААГ, показывающая этапы выделения белка: рекомбинантный белок после n-й элюции с одной колонки: дорожки 1, 5 – после 1-й, 2, 6 – 2-й, 3, 7 – 3-й, 4, 8 – 4-й.

Рис. 13. Электрофореграмма Рис. 14. Детекция продуктов экспрессии лизатов клеток штамма E. coli клонированных генов esxB и mpt64 M. tuberculosis в BL21 (исходного и несущего E. coli BL21. А – электрофорез по Лэммли клеточных плазмиды), продуцирующих лизатов: 1 – лизат E. coli BL21, 2 – лизат E. coli/pGEXнативную глутатион-S- 2T, 3 – лизат E. coli/pGEX-2T/CFP10, 4 – лизат E. coli/ трансферазу и рекомбинантные pGEX-2T/MPT64. Б – иммуноблот лизатов с МКА к белки, после эл.фореза в 12 % белку носителю GST: 1 – лизат E. coli BL21, 2 – лизат ДСН-ПААГ: 1 – исходный E. coli/pGEX-2T, 3 – лизат E. coli/pGEX-2T/CFP10, 4 – штамм-реципиент; продукция лизат E. coli/ pGEX-2T/MPT64. С – белков: 2 – GST; 3 – rCFP10; 4 – электрофореграмма аффинно очищенного rESAT-6; 5 – rMPT Рис. 16. Принципиальная технологическая схема получения и очистки рекомбинантного белка GST-P микобактерий, выращенных на средах Сотона и Миддлбрука. Из наработанной суспензии клеток микобактерий M. tuberculosis H37Rv или ее биомассы, суспендированной в буфере, при озвучивании получали ультразвуковые дезинтеграты (УЗД) белковых антигенов. После осветления не разрушенной ультразвуком клеточной массы с помощью ультрацентрифугирования получали соникаты. Цельноклеточные суспензии вакцинного штамма BCG и УЗД BCG в концентрации 8 мкг/мл были использованы для сенсибилизации на иммунологических планшетах. В качестве вторых антител в нашей работе использованы видоспецифические моноклональные конъюгаты против IgG, IgM и IgA человека, меченные пероксидазой хрена.

Испытание рекомбинантных видоспецифичных белков M. tuberculosis в ИФА, IFN--анализе на клинических образцах В данном блоке работы необходимо было оценить возможности использования гибридных белков ESAT-6 и CFP10 M. tuberculosis в серологической диагностике туберкулеза. Исследование включало в себя использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике туберкулеза на образцах крови, полученных от больных туберкулезом. Была проведена оценка рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 в ИФА на панели из сывороток, собранных от пациентов, больных туберкулeзом. Контрольная группа включала сыворотки 470 пациентов, не болеющих туберкулeзом и не имевших туберкулез в анамнезе. Рекомбинантный белок rMPT64 проверяли на выборке из 147 сывороток.

Забор крови проводили у больных туберкулезом пациентов ( образцов) и здоровых доноров (149 образцов). Для определения чувствительности и специфичности рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 с помощью IFN--анализа при выявлении туберкулеза лeгких были получены образцы крови от 67 пациентов с установленной формой заболевания.

Для испытания рекомбинантных белков в IFN--анализе от пациентов с подозрением на туберкулез были получены: 20 образцов цельной крови (табл. 11) и 18 образцов цельной крови (для выделения мононуклеарных клеток) (табл. 12) и 18 проб цельной крови от здоровых доноров. 38 изолятов мокрот, соответствующих образцам крови от пациентов с подозрением на туберкулез легких, были получены для подтверждения туберкулeза с помощью ПЦР. Возраст обследуемых первой выборки составлял 24–45 лет.

Все сыворотки предварительно были проанализированы с помощью референс-тест-систем «Анти-Туб-IgG» (СПб) и «АТ-Туб-БЕСТ-стрип»

Рис. 17. Результаты выявления IgG-антител к антигенам микобактерий среди различных групп. 1 – здоровые доноры, 2 – пациенты с активным туберкулезом. 3 – лица с подозрением на туберкулез (г. Новосибирск). Исследование наличия антител к GST в сыворотке здоровых доноров и больных туберкулeзом проводили двумя методами. В первом варианте GST сорбировали непосредственно на поверхности лунок.

Во втором – на поверхность лунки сначала наносили МКА к GST.

Очищенные антигены проверяли с помощью ИФА и IFN--анализа.

Иммуноферментным анализом в крови больных туберкулезом выявляли иммуноглобулины, а с помощью IFN--анализа определяли концентрацию IFN-, который секретируется Т-лимфоцитами в результате стимуляции их рекомбинантными белками.

Выявление антител к гибридным белкам в изучаемых сыворотках на подложке из гибридных белков rESAT-6 и rCFP10 проводили с помощью ИФА (рис. 17–18) С использованием антигенов rESAT-6 и rCFP10 выявляли содержание антител классов IgM, IgG, IgA. При этом наиболее высокое содержание антител – 70 % – наблюдалось при определении антител IgG, уровень антител IgA составил 31,4 %, а антител IgM – 11,8 %. Однако диагностическая значимость и эффективность анализа повышается при одновременном выявлении антител разных классов (IgM, IgG, IgA). Наличие антител IgG к M. tuberculosis в сыворотках было установлено в референс-тест-системе. сыворотки из 60 образцов были отрицательны: ОП 0,167 и ОП 0,192 при ОП крит. 0,280. Таким образом, чувствительность анализа с использованием испытуемых белков rMPT64 по отношению к референс-тест-системе составила 76,7 %.

В современных условиях, характеризующихся увеличением частоты остропрогрессирующих и полирезистентных к химиотерапии форм туберкулеза легких, сохраняет актуальность изучение состояния иммунного ответа организма на туберкулезную инфекцию (Владимирский М.А., 1993;

Салина Т.Ю., 2000; Стаханов В.А., 2001). Лабораторные критерии оценки состояния специфического процесса позволяют оценить не только степень активности туберкулеза легких на данный момент времени, но и, определяя уровень антител в динамике, дают возможность оценить эффективность лечебной терапии, что, в частности, имеет большое значение при решении вопроса о выборе срока оперативного вмешательства. Из обследованных больных туберкулезом легких (Аутеншлюс А.И.), кроме больных туберкулезом легких, уровни антител к микобактериальным антигенам M.

tuberculosis определялись у 11 здоровых лиц (доноров). Содержание антител к антигенам вакцины БЦЖ и штамма H37Rv в сыворотке крови определяли твердофазным иммуноферментным методом. В качестве антигена использовали ультразвуковой дезинтеграт (соникат) клеток вакцины БЦЖ и штамма H37Rv, а также очищенную из сониката белковую фракцию с применением методов ионообменной хроматографии. Белковые фракции анализировали с помощью электрофореза в 10 % ПААГ. Молекулярная масса использованных в работе белков Е-БЦЖ, Е-H37Rv находилась в диапазоне 40–70 kDa. В зависимости от степени выраженности туберкулезного процесса пациенты были разделены на группы по активности заболевания.

1 группа – с низкой степенью – 20 (30,3 %) человек, 2 группа – с умеренной – 27 (40,9 %) и 3 группа – с высокой степенью активности заболевания – (28,8 %).

Полученные значения содержания антител были разделены на низкие и высокие. По морфологическим признакам, которым была дана балльная оценка, определены 3 степени активности специфического воспаления: I – низкая, II – умеренная, III – высокая. Больные с низкой степенью активности имели средний бал 3,60 ± 0,35 (1–6), с умеренной – 9,70 ± 0,35 (7–12) и с высокой степенью активности процесса имели средний показатель – 15,64 ± 0,36 (14–20). Показатели уровней антител сопоставлены с данными патоморфологического исследования операционного материала, выполненного у 24 прооперированных больных. Гистологическим признакам, отражающим степень активности специфического процесса в легких (казеозный некроз, инфильтрация легочной ткани, полостные изменения, очаговые образования. фиброзно-склеротические процессы), также была дана балльная оценка согласно значимости того или иного признака. Низкая степень активности – 12,8 ± 0,1 балла (12–14), умеренная – 16,0 ± 0,2 балла (15–17), высокая степень активности – 20,2 ± 0,3 балла (18– 24). Это позволило судить об объективности предложенных балльных критериев клинических и рентгенологических лабораторных признаков заболевания. Установлена зависимость между характером морфологических изменений в легких и уровнями АТ к АГ МБТ. У лиц с I и II степенями активности процесса высокие уровни АТ встречались у 25 %, а при III степени активности у 75 % больных уровни АТ к соникату и протеину были высокими. Низкие значения уровней АТ имели прямую корреляционную связь с I и II степенями морфологической активности заболевания, что отражало адекватный гуморальный иммунный ответ на патологический процесс. При высокой степени активности туберкулезного воспаления низкие уровни АТ, встречающиеся в 25 % случаев, свидетельствовали о более глубоких нарушениях в иммунной системе, что, возможно, явилось следствием значительного экссудативно-некротического поражения легочной ткани. Таким образом, показатели гуморального иммунного ответа на соникат H37Rv и особенно на его протеин могут быть использованы в качестве дополнительного объективного критерия, отражающего степень активности туберкулезного процесса в легких.

Содержание антител к антигенам вакцины БЦЖ и штамма H37Rv у больных с различными формами туберкулеза легких в сравнении со здоровыми лицами представлены в табл. 7. Как видно из табл. 7, общая тенденция характеризуется тем, что у больных инфильтративной и фибрознокавернозной формами туберкулеза легких антитела класса G были достоверно выше по сравнению с таковыми у здоровых лиц ко всем изучаемым антигенам. Уровни антител класса М при инфильтративном туберкулезе также были достоверно более высокими по сравнению с аналогичными показателями здоровых лиц. Что же касается больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, то только при сравнении уровней антител класса М к С-H37Rv были получены достоверные различия с донорами. Кроме того, у больных 1-й группы по сравнению со 2-й уровни антител класса G к БЦЖ и Е-H37Rv были достоверно ниже. Таким образом, анализ полученных показателей гуморального иммунного ответа на различные антигены микобактерий позволил прийти к заключению о том, что отличительной особенностью больных инфильтративным туберкулезом легких и фиброзно-кавернозным туберкулезом легких являются достоверно высокие уровни антител класса G по сравнению с донорами. У больных инфильтративным туберкулезом легких содержание антител класса М были достоверно высокими, тогда как при фиброзно-кавернозном туберкулезе достоверно высокие уровни антител класса М (по сравнению с донорами) отмечались к одному антигену.

Результаты сравнительного выявления антител к антигенам M.

tuberculosis у больных туберкулезом легких с различной степенью активности процесса и у здоровых лиц показали, что по мере возрастания степени активности туберкулеза легких, а значит, и тяжести заболевания различия становятся достоверными. Достоверные различия показателей гуморального иммунного ответа выявляли между больными с низкой и высокой степенью активности – по уровню антител класса G, а по уровню антител класса М только – Е-БЦЖ и С-H37Rv, причем в последнем случае были выявлены достоверные различия при сравнении показателей больных с умеренной и высокой степенью активности.

Достоверные различия коэффициента корреляции отмечались между активностью процесса (выраженной в баллах) и уровнями антител класса G у больных туберкулезом легких независимо от формы процесса к Е-БЦЖ (r=0,367, p=0,002), к С-БЦЖ (r=0,430, p=0,003), к Е-H37Rv (r=0,427, p=0,003), к С-H37Rv (r=0,415, p=0,005), и только при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких отмечалась достоверная корреляция между уровнями, антител класса М к Е-H37Rv (r=0,446, p=0,043) и С-H37Rv (r=0,535, p=0,013) и степенью активности процесса.

Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа больных на использованные антигены с результатами патолого-гистологического Уровни антител к антигенам вакцины БЦЖ и штамма H37Rv у больных с различными формами туберкулеза легких и у здоровых лиц (М ± m) обследованных процесса, обследованных 1 – больные 9,08±0,67 35 2,48±0,14 2,46±0,13 3,95±0/19 3,69±0,19 1,44±0.15 2,14±0,19 1,73±0,15 1,72±0, туберкулезом 3 – здоровые лица - 11 1,78±0,09 1,81±0,12 3,16±0,36 2,58±0,24 1,04±0,03 1,60±0,08 1,37±0,08 1,27±0, Где: E-H37Rv и E-БЦЖ представляют собой очищенные фракции белков с применением методов ионообменной хроматографии; С-БЦЖ и С- H37Rv – ультразвуковой дезинтеграт (соникат) клеток вакцины БЦЖ и штамма H37Rv. Различия между группами считали достоверными при уровне значимости < 0, исследования выявил достоверные коэффициенты корреляции между уровнями антител класса G к С-БЦЖ (r=0,476, p 1,2–1,7 МЕ/мл), согласно литературным данным, считали положительными. Для другой группы пациентов с туберкулезной инфекцией результаты продукции IFNвыражали в МЕ/мл с применением калибровочного графика. Аналитическая чувствительность теста составила 1,2–1,7 МЕ/мл IFN- для отрицательного (нулевого) контрольного образца из плазмы крови исследуемых. Для проверки полученных нами рекомбинантных антигенов M. tuberculosis проводили исследование панели сывороток от лиц до верификации диагноза с помощью IFN--ИФА. В 20 образцах из этой панели уровень индуцированного IFN- выявляли с помощью реагентов BD Biosciences (пациенты под № 1–20), в 18 – с помощью набора реагентов «IFN--ИФАБЕСТ» (пациенты под № 21–38). Используя калибровочный график зависимости концентрации IFN- (в пг/мл и МЕ/мл) от значения оптической плотности, концентрацию IFN- определяли в каждой лунке.

В табл. 10 для демонстрации пригодности выделенных рекомбинантных белков (каждого в отдельности) для диагностики туберкулеза представлены результаты, полученные на образцах цельной крови от исследуемых лиц, в табл. 11 – результаты, полученные на образцах мононуклеарных клеток, выделенных предварительно из образцов цельной крови с помощью системы Histopaque 1119. Секреция IFN- (МЕ/мл) при стимуляции секреторными белками достоверно выше у больных туберкулезом (18,21 ± 9,39 МЕ/мл), чем в контроле (0,95 ± 0,7 МЕ/мл) (P < 0,001) или в контрольной группе 1,20– 1,47 МЕ/мл IFN-. IFN--ответ к PPD сравнивали с IFN--ответом к индивидуальным антигенам M. tuberculosis (rESAT-6, rCFP10 и rMPT64).

Детектируемый уровень IFN- определялся производителем тест-системы и составил > 20 пг/мл или 1,2 МЕ/мл. На основе анализа, представленного в табл. 10, можно сделать вывод, что у пациентов под № 9–11 при испытании всех трех рекомбинантных белков результаты были отрицательные.

Пациенты под № 6 и 15 по уровню IFN- располагаются практически на пограничной линии – на верхней границе при использовании rESAT-6 и нижней – при использовании rCFP10. Результат с такими значениями IFNтребует повторения анализа и в случае совпадения с предыдущим результатом его следует оценивать как положительный. Пациента под № так же следует присоединить к группе пациентов с сомнительным результатом (№ 6 и 15), хотя уровень IFN- соответствует пограничному значению, полученному только при использовании rCFP10 (по результату, полученному с помощью белка rESAT-6, пациента под № 8 следовало бы отнести к лицам с неподтвержденным диагнозом туберкулез). Этот пример показывает, что далеко не всегда достаточно проведения анализа по одному белку. Для полного анализа табличных данных также интересен результат, полученный для пациента под № 14: по белку rESAT-6 – пациент с подтвержденным диагнозом туберкулез, тогда как по белку rCFP10 – диагноз Результаты IFN--анализа при туберкулезе легких при стимуляции гибридными белками выбранному из двух определяющих белков (rESAT-6 и rCFP10) могут оказаться неоднозначными.

Из табл. 11 видно, что у пациентов под № 23, 33 и 35 при испытании всех трех рекомбинантных белков диагноз туберкулез не подтверждается, несмотря на положительный результат, полученный с помощью классического культурального метода. Однако если исходить из значений IFN- при стимуляции PPD, то этих пациентов, за исключением № 35, следовало бы отнести к больным туберкулезом. Повышенное содержание IFN- в анализируемой пробе при использовании PPD можно объяснить тем, что выделение IFN- стимулируется не только видоспецифичными к туберкулезу белками, присутствующими в составе PPD и среди которых имеются, кстати, нативные ESAT-6 и CFP10, но – и за счет неспецифичных, дающих перекрестные иммунологические реакции и имеющих отношение к белкам других видов микобактерий. Индивидуальный IFN--ответ к PPD сравнивали с IFN--ответом к другим антигенам M. tuberculosis (rESAT-6, rCFP10 и rMPT64). Крайне низкий уровень IFN- при использовании в качестве индуктора PPD у пациента под № 35, который сравним с Результаты IFN--анализа при использовании мононуклеарных клеток периферической крови при стимуляции их рекомбинантными белками rESAT-6, rCFP10, rMPT M(s) M±m M(s) к M±m к доноры, (п=18) Концентрацию IFN- > 300 пг/мл считали положительными, результаты подсчитывали из среднего значения концентрации IFN- в трех лунках ( 0, 01) и выражали в пг/мл, используя калибровочный график.

концентрацией IFN-, полученной в результате стимуляции смесью рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10, может свидетельствовать не только об отсутствии туберкулезного процесса, более того, – об отсутствии инфицированности организма пациента микобактерией вида M. tuberculosis.

Стимуляция мононуклеарных клеток PPD свидетельствует о весьма низкой специфичности туберкулина при использовании его как суммарного антигена при диагностировании туберкулеза с помощью IFN--ИФА. Она также подтверждается сравнением концентрации IFN- при стимуляции PPD с содержанием IFN-, полученного при стимуляции известными митогенами – конканавалином А и фитогемагглютинином, которые, как известно, вызывают неспецифическую активацию Т-лимфоцитов, не обусловленную связыванием с антиген-распознающими рецепторами. Пациенты под № 26, 28 и 36, как и остальные, являются больными туберкулезом, хотя туберкулез у 26- и 36-го выявляются однозначно только по гибридному белку rCFP10, а у 28-го – только по гибридному белку rESAT-6 и одновременно при использовании смеси рекомбинантных белков rESAT-6 + rCFP10. Значение концентрации IFN-, полученное при испытании в качестве индуктора rMPT64, не является определяющим, поскольку, как уже отмечалось ранее, ген, кодирующий этот белок, присутствует как в патогенном, так и в вакцинном штамме, применяемом в России. Таким образом, полученные результаты по какому-то одному выбранному из двух определяющих белков (rESAT-6 и rCFP10) могут оказаться неоднозначными. Для интерпретации результатов рекомендуется использовать процент специфического ответа (табл. 10 и рис. 18). Процент специфического ответа для применяемого антигена рассчитывали по формуле:

где: N = IFN- (МЕ/мл) для нулевого (отрицательного) контроля;

Ag = IFN- (МЕ/мл) для применяемого антигена;

М = IFN- (МЕ/мл) для митогенного контроля.

% специфического иммунного ответа Рис. 18. Гистограмма специфического иммунного ответа мононуклеарных клеток из образцов периферической крови, стимулированных PPD (синий цвет), ESAT6 (красный цвет), CFP10 (желтый цвет) Используемый метод позволяет определять количество IFN- в диапазоне 0,10–150 МЕ/мл с точностью ± 10 %. (внешний и внутренний коэффициент вариации не превышает 10 %).

Продукция IFN- при стимуляции периферической крови среди пациентов с туберкулезом легких в процессе противотуберкулезной терапии Был изучен иммунный ответ при туберкулезе на разных этапах антибиотиковой химиотерапии при использовании комплекса микобактериальных белков (M. bovis BCG, белки культурального фильтрата (ST-CF) и очищенных рекомбинантных антигенов (rESAT-6, rCFP10, rMPT64). Клинико-рентгенологические и лабораторные исследования проводили после применения курса интенсивной химиотерапии через 2 и месяцев. Эффективность лечения препаратами оценивали в Т-клеточном ответе при стимуляции видоспецифическими антигенами и белками культурального фильтрата по продукции IFN-. Процент позитивного ответа после проведенной терапии через 2 месяца составил 51,5 % для антигена rESAT-6 и 48,4 % для белка rCFP10. В 5 случаях для больных туберкулезом (диссеминированный туберкулез, инфильтративная форма туберкулеза) и Ш84 наблюдали расхождения по результатам теста между двумя антигенами.

Эти данные вызывают необходимость дополнительного проведения анализа с использованием альтернативных методов и повторной постановки теста. Все больные имели положительные показатели по данным культурального и микроскопического тестов до проведения антитуберкулезной терапии. У пациентов после курса проведенной терапии наблюдалась выраженная положительная динамика процесса. У больных с генерализованной инфекцией и диссеминированным туберкулезом практически отсутствовала секреция IFN-, что связано с иммуносупрессией. Согласно литературным данным, у подобного рода пациентов продукция IFN- может не происходить вообще или проходить на низком уровне (Bua A. et al., 2004; Kobashi Y.

et al., 2008).

Применение технологии ELISРОТ для оценки специфического иммунного ответа на туберкулезную инфекцию ELISPOT-анализ в настоящее время является одним из эффективных методов для детекции и подсчета индивидуальных клеток, секретирующих специфические цитокины в результате стимуляции специфическими белковыми антигенами или синтетическими пептидами in vitro. Технология ELISPOT-анализа применяется для мониторинга ВИЧ-вакцинированных пациентов, онкологических заболеваний, вирусных гепатитов В и С, аутоиммунных заболеваний, для оценки Th1/Th2-иммунного ответа, при разработке вакцин и лекарственных препаратов, выявлении специфического иммунного статуса, для эпитопного картирования и определения гуморального иммунитета (Gaines H., Andersson L. 1996; Pathan A.A., 2001;

Chee C., 1997; Arlen P., 2000; Mashishi T., 2002). ELISPOT-анализ включал Рис. 19. ELISPOT-анализ различных образцов крови. А–D (1–2) – контрольные отрицательные образцы; A – свежеприготвленная кровь при стимуляции антигеном ESATздоровых доноров (буферный раствор, нулевой контроль); B (3–4) – стимуляция антигеном ESAT-6 больного туберкулезом (свежеприготовленная кровь), 2,0х105 IFNSFC; C (3–4) – стимуляция антигеном ESAT-6 больного туберкулезом (криоконсервированная кровь) с добавлением IL-7 10 мкг/мл, 2,5х105 IFN- SFC; D (3–4) – стимуляция антигеном ESAT-6 больного туберкулезом (криоконсервированная кровь), 2,0х105 IFN- SFC Рис. 20. Митогенная стимуляция образцов свежей крови и криоконсервированной у пациентов с активным туберкулезом. 2, 3, 5, 7, 9, 11 – стимуляция свежей цельной крови ФГА; 1, 4, 6, 8, 10, 12 – стимуляция криоконсервированной цельной крови ФГА использование в качестве твердой фазы 96-луночных планшет, имеющих дно лунок из нитроцеллюлозы. Из периферической крови человека выделяли центрифугированием на смеси фиколл-гепака мононуклеарные клетки.

Суспензию мононуклеарных клеток крови, содержащей полную среду RPMIс 5 % FCS, с концентрацией 2,0х106, 2.5х106 или 2.5х105 в мл раскапывали по лункам, вносили антигены rESAT-6 и rCFP10 M. tuberculosis, митогены и инкубировали 12–24 ч при 37 °С в присутствии 5 % СО2. После инкубации клетки удаляли промыванием лунок PBS с 0,05 % Tween 20. Затем вносили в каждую лунку биотинилированные поликлональные антитела (вторичные антитела), специфические к выбранному цитокину. После Рис. 21. Гистограмма стимуляции митогенами образцов крови, представленных на рис. Рис. 22. Типичная картина выявления туберкулезной инфекции IFN--ELISPOT-анализом.

1(А–В) – положительный контроль (митогенная стимуляция, 48 ч, 2,0х106 клеток/мл), 1(G–H) – отрицательный контроль (стимуляция, 48 ч). Положительные образцы, n= отмывки от несвязавшихся биотинилированных антител добавляли конъюгат пероксидазы хрена (щелочной фосфатазы) и стрептавидина. Несвязавшийся фермент удаляли промыванием и вносили хромогенный субстрат BCIP/NTB.

В ходе ферментативной реакции образовывался окрашенный преципитат в виде сине-черных пятен в местах локализации антигена, где каждое отдельное пятно представлено индивидуальной клеткой, секретирующей цитокиновую продукцию в процессе стимуляции. Пятна, различающиеся по размеру, после высыхания лунок подсчитывали с помощью автоматического ELISPOT-ридера или визуально с помощью микроскопа. Реакцию считали положительной, если на 106 МКПК насчитывается не менее формирующих пятен. Было установлено, что около 70 % жизнеспособных клеток способны продуцировать IFN- при стимуляции антигенами M. tuberculosis. Оставшиеся после первичной стимуляции клетки способны секретировать IFN- при проведении вторичного ELISPOT-анализа из тех же самых образцов. Жизнеспособность клеток после выделения определяли с использованием стандартной процедуры с окрашиванием Trypan Blue в течение 1 ч до проведения ELISPOT-анализа и затем использовали их при проведении анализа на туберкулезную инфекцию (рис. 19 и 20). Клетки культивировали в присутствии IL-7 (10 нг/мл) или IL-15 (20 нг/мл) в течение 4–7 дней. Жизнеспособность клеток 70 % рассматривали в качестве положительного контроля при проведении теста. Коммерческие тесты с использованием рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP10 и синтетических пептидов M. tuberculosis (например, SPOT-TB-тест) также позволяют выявлять M. tuberculosis со специфичностью 99,8–100 %. При этом чувствительность ELISPOT-IFN--анализа с использованием ESAT-6 и CFP10 антигенов превышает IFN--анализ и составляет 95,7 % при исследовании туберкулеза (Lalvani A. et al., 2001, 2007).

Диагностика ВЛКРС Изучение диагностической ценности разных коммерческих наборов и разработанных нами методов позволило применить их в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Работа была выполнена на базе лаборатории лейкозов ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и лаборатории биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор». Рекомбинантный антиген р24 к ВЛКРС и специфические моноклональные антитела получены в лаборатории лейкозов (Файззулин Р.З., Чекишев В.М., 1993). Исследования проводили на материале от 120 коров в возрасте 3–7 лет: интактных, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом. Животные принадлежали хозяйствам Новосибирской области. Получение сыворотки проводили по общепринятой методике. По результатам реакции иммунодиффузии (РИД) в агарозном геле и гематологических исследований животных разделили на 3 группы: больные (в эту группу вошли гематологически больные животные и реагирующие на антиген р24 в РИД), РИД(+) и РИД(-) – табл. 12. Антитела к ВЛКРС выявляли с помощью РИД, используя набор для серологической диагностики лейкоза КРС производства Курской биофабрики, согласно наставлению производителя, а также методом ИФА в соответствии с временным наставлением по применению набора для выявления антител к ВЛКРС производства НПО "Нарвак" (Россия).

Результаты сравнительных серологических, гематологических и ПЦРметодов исследования крови коров Представленные результаты (рис. 23) выявления антител IgG с использованием разных по природе антигенов и с различной степенью очистки показывают, что выявление антител к ВЛКРС зависит от чистоты антигена (очищенный антиген р24 – 1) и способа нанесения белкового антигена на иммунопланшет (МКА/очищенный рекомбинантный антиген р – 4). Так, при использовании рекомбинантных белков с МКА процент выявления позитивных сывороток был наиболее высоким (80–92 %), тогда как коммерческий антиген позволял выявлять антитела к ВЛКРС с низкой эффективностью (54–67 %). Уровень антител в ИФА с использованием разных по природе антигенов соответствовал следующему ряду: 4 > 5 > 1 > > 6 > 3 (см. рис. 23). Как показывают результаты анализов, оба метода, и РИД и ИФА, позволяют эффективно диагностировать антитела к ВЛКРС.

Диагностическая чувствительность и специфичность ИФА для рекомбинантных белков разной степени очистки по сравнению с РИД составила 70–93 %. Суммарная реактивность антигенов, используемых в работе, составила 90 % от общего числа тестируемых сывороток.

Образцы ДНК исследовали в ПЦР при помощи набора для экспрессиндикации ДНК профага вируса лейкоза КРС методом ПЦР, согласно инструкции по применению производства «ЛАГИС» (Россия). Праймерная пара еnv (envelope), используемая в наборе, фланкирует фрагмент оболочечного гена длиной 346 п.н. и предназначена для скрининговой детекции всех вариантов ДНК BЛКРС, являясь маркером профага.

Амплификацию проводили в реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и праймеров и 0,3 мкл Taq-полимеразы под 20 мкл минерального масла в пластиковых пробирках объемом 0,5 мл.

Смесь помещали в амплификатор «Терцик» с заданной программой температурно-временных циклов. Как видно из табл. 12, при исследовании больных лейкозом коров (первая группа) и в ИФА, и в ПЦР были получены положительные результаты в 100 % случаев, что подтверждает наличие вируса и антител против него в сыворотке и крови животных. По литературным данным, с помощью ИФА можно выявлять антитела в разведении более чем 1:131000–1:220000 (Trono K.G., 2001).

Рис. 23. Результаты выявления антител к ВЛКРС методом ИФА среди РИД(+) и РИД(-) сывороток с использованием разных по природе антигенов. Цифрами по оси абсцисс обозначены разные по природе и степени очистки антигены (АГ): 1 – рекомбинантный очищенный АГ р24; 2 – рекомбинантный АГ р24; 3 – коммерческий АГ (из набора для постановки РИД); 4 –МКА/рекомбинантный очищенный АГ р24; 5 – МКА/рекомбинантный АГ р24; 6 –МКА/коммерческий АГ; 7 – контроль (т/с НПО «Нарвак»). По оси ординат – оптическая плотность при длине волны 450 нм.

Из 51 животного второй группы только 32 дали положительные результаты в ПЦР. При рутинном использовании ПЦР-диагностики возникают сложности в интерпретации результатов, так как совпадение данных ИФА, РИД и ПЦРанализа по выявлению ДНК ВЛКРС составляет 60–100 %, а для РНК – 60 %, (Dube S. et al., 1997; Kubis P. et al., 1996). Компьютерный анализ тест-систем для выявления ВЛКРС посредством ПЦР показал, что применяемые в разных лабораториях праймеры характеризуются различной степенью гомологии.

Использование праймеров с невысокой степенью гомологии (90 % и менее) может существенно понижать чувствительность и специфичность ПЦРанализа и приводить к появлению ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Теми же причинами, по-видимому, можно объяснить несовпадение результатов сравнительного анализа ИФА и ПЦРдиагностики ВЛКРС, проведенного на большом экспериментальном материале (Kubis P. et al., 1996). Однако в ПЦР нами были довыявлены 5 коров-вирусоносителей, которых ни с помощью РИД, ни ИФА не выявили.

На рис. 24 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР.

Многочисленные данные, свидетельствующие о преимуществах ПЦР в сравнении с серологическими методами (более раннее выявление вируса, чем антител против антигенов ВЛКРС в РИД и ИФА на 1–8 недель, и выявление животных в случае скрытого вирусоносительства), а также данные, полученные нами, характеризуют ПЦР как эффективный метод диагностики ВЛКРС. Напротив, ИФА зарекомендовал себя как высокоэффективный альтернативный или дополняющий РИД серологический метод, который можно, на наш взгляд, успешно использовать для диагностики лейкоза уже сегодня, особенно в хозяйствах на завершающих этапах оздоровления от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи ВЛКРСинфекции. Сравнительное выявление маркеров гуморального иммунного ответа у животных, инфицированных ВЛКРС, и молекулярных маркеров лейкозной инфекции приведено в табл. 13. Как показывают результаты, приведенные в табл. 13, 64 животных были диагностированы как позитивные по результатам нескольких тестов. Нами не было идентифицировано ни одного случая ложноположительного животного. Из 64 инфицированных ВЛКРС животных у 6 (9,4 %) не подтвердился диагноз ни одним из методов.

ИФА с использованием рекомбинантных антигенов подтвердил позитивный результат у 56 животных. Из 39 негативных было выявлено 10 с диагнозом заболевания ВЛКРС с применением ИФА и ПЦР, 3 животных оказались позитивными при использовании трех методов (ИФА с рекомбинантными белками и серологических и референсных методов – РИД и ИФА), однако дали отрицательный ответ в ПЦР. Процент выявления позитивных животных с помощью ПЦР и ИФА оказался существенно выше, чем при использовании методов ИФА и РИД. Чувствительность и специфичность ИФА составила 87,4 % и 93,5 % соответственно, что сравнимо с результатами ПЦР-теста.

Удовлетворительные результаты были получены нами при диагностике ВЛКРС на разных стадиях развития патологического процесса.

Необходимость новых подтверждающих тестов для выявления инфицированных и больных животных ВЛКРС, выявление маркеров гуморального иммунного ответа с целью профилактики, позволяет с более высокой достоверностью осуществлять контроль племенных стад КРС. И это является одним из путей в развитии диагностики ВЛКРС. Полученные результаты послужили основой для исследований по созданию диагностических тест-систем, в которых основным элементом являются рекомбинантные или нативные антигены, содержащие иммунодоминантные эпитопы в своей структуре. Использование рекомбинантного антигена р Сравнение результатов, характеризующих клинический статус и иммунореактивность животных в диагностике ВЛКРС рек.белки) (референстесты) кол-во позволяет применять его для оценки параметров гуморального иммунного ответа на стадии природного инфицирования животных, а также после проведения вакцинирования. При этом чувствительность антигена р ВЛКРС в ИФА к чувствительности белка р53 составляет 97 %, что согласуется с литературными данными (Molloy J. et al., 1990). Что касается РИД, этот показатель составил 96 %. Таким образом, открываются перспективы совершенствования новых направлений в диагностике инфекционных заболеваний и их практического применения. Как видно из приведенных результатов, новые методы, применяемые в диагностике инфекционных заболеваний, могут эффективно дополнять друг друга, развивая, таким образом, систему доказательной ветеринарии в диагностике инфекционных заболеваний животных.

4. ВЫВОДЫ 1. Разработана диагностическая тест-система «Вектогеп-А-IgM» для выявления антител класса M к вирусу гепатита А методом ИФА. По аналитическим характеристикам (чувствительности – 98–97 %, специфичности – 100 %, времени проведения анализа – 2–2,5 ч) тест-система сопоставима с тест-системами зарубежных фирм Abbott (CША) и La Roche (Швейцария). Тест-система по результатам проведения Госиспытаний, рекомендована Ученым советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитетом по производству иммунобиологических препаратов (МИБП) к регистрации.

2. Разработан набор компонентов «Вектогеп-А-антитела» для выявления IgG-антител к ВГА с чувствительностью и специфичностью соответственно 98–99 % и 82 %. Аналитическая чувствительность диагностического набора составила 9,8 ± 1,2 мМЕ/мл, при этом чувствительность референс-тестсистемы «ИФА-анти-ВГА» составила 11,8 ± 1,6 мМЕ/мл.

3. Получены рекомбинантные штаммы E. сoli – продуценты химерных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 M. tuberculosis, которые депонированы в коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор». Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме.

4. На примере rESAT-6 и rCFP10 установлено, что с использованием рекомбинантных белков возможно выявлять антитела классов G, A и M среди разных групп обследуемых, но наиболее высокий показатель выявляемости иммуноглобулинов определен для антител класса G, который составил 70 % (для IgA – 31,4 %, IgM – 11,8 %).

5. Чувствительность и специфичность выявления IgG-антител методом иммуноферментного анализа к рекомбинантным антигенам rESAT-6, rCFP и rMPT64, оцененные по образцам сывороток от больных туберкулезом и здоровых доноров, составила 79 %, 65 %, 81 % и 92–98 %, 95–98 % и 76 % соответственно.

6. Определена корреляция между содержанием антител к антигенам микобактерий и активностью процесса. Показаны достоверные различия коэффициента корреляции между активностью процесса (выраженной в баллах) и уровнями антител класса G у больных туберкулезом легких независимо от формы процесса к Е-БЦЖ, к С-БЦЖ (соникат клеток), к ЕH37Rv, к С-H37Rv (соникат клеток), и только при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких отмечалась достоверная корреляция между уровнями антител класса М к Е-H37Rv и С-H37Rv и степенью активности процесса.

7. Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа больных на микобактериальные антигены с результатами патолого-гистологического исследования выявил достоверные коэффициенты корреляции между